METODE
Metode Penelitian
Alur penelitian dan metode yang digunakan dalam penelitian ini terdapat pada gambar 1. Metode tersebut terdiri atas 7 tahapan.
1. Filtrasi 2. Pencawanan
3. Pemurnian Fage 4. Produksi atau Perbanyakan Fage
Gambar 1 Diagram alir tahapan metode penelitian
Waktu dan Tempat
Penelitian ini dilaksanakan mulai bulan Juli 2008 sampai dengan Juni 2009, bertempat di Laboratorium Bioteknologi Hewan dan Biomedis, Pusat
Penelitian Sumber Daya Hayati dan Bioteknologi PPSHB, IPB Darmaga;
Peremajaan Isolat EPEC K1.1 dan E. coli non patogen
A. Isolasi dan Purifikasi Fage
D. Karakterisasi Protein Fage C. Kuantifikasi Fage
B. Penentuan Kisaran Inang
E. Pengamatan Morfologi Fage dengan Transmission Electron Microscope TEM
F. Efektifitas Lisis Sel EPEC K1.1 oleh Fage
Laboratorium Mikrobiologi, Departemen Biologi Fakultas MIPA IPB Darmaga; Laboratorium TEM dan Histologi Lembaga Eijkman Biologi Molekular; dan di
Laboratorium SEM LIPI Cibinong.
Bahan dan Alat
Bakteri yang digunakan ialah EPEC K1.1 yang merupakan koleksi Dr. dr. Sri Budiarti dan E. coli non patogen yang merupakan koleksi dari
Laboratorium Mikrobiologi, Departemen Biologi FMIPA IPB. Sampel untuk
isolasi bakteriofage berupa limbah cair rumah tangga daerah Babakan Raya, di Darmaga Bogor.
Media yang dipergunakan berupa media agar Luria Bertani LB yang terdiri atas 1 Bacto tryptone, 0.5 Bacto yeast extract, 1 NaCl, 2.5 Agar;
media kaldu Luria Bertani LB yang terdiri atas 1 Bacto tryptone, 0.5 Bacto yeast extract, 1 NaCl; media LB supplement, yaitu media LB yang ditambah
dengan 0.4 glukosa, 10 mM MgSO
4
. 7H
2
O; media H Agar media agar-agar cawan tanpa yeast extract yang terdiri atas 1 Bacto tryptone, 0.8 NaCl, 1.5
Agar; dan media Molten Top Agar yang terdiri atas 1 Bacto tryptone, 0.5 NaCl, 0.6 Agar. Alat yang dipergunakan shaker bath Certomat WR; sentrifuse
ukuran besar Beckman; sentrifuse ukuran kecil Eppendorf Centrifuge 5417C. Peremajaan Isolat
Isolat EPEC K1.1 dan bakteri E. coli non patogen, masing-masing ditumbuhkan dengan metode kuadran pada media agar cawan Luria Bertani LB
dan diinkubasi pada suhu 37 C selama 24 jam. Koloni tunggal yang terbentuk
diambil dan ditumbuhkan pada media agar miring Luria Bertani LB lalu diinkubasi pada suhu 37
C selama 12 jam. Hasil biakan disimpan pada suhu 4 C
untuk digunakan sebagai stok bakteri uji.
Isolasi dan Purifikasi Fage Filtrasi
Sebanyak 4.5 mL limbah dicampurkan dengan 0.5 mL dari kultur EPEC OD
600
=1 atau E. coli non patogen dalam media kaldu Luria Bertani LB dan 0.5
mL dari 10x LB. Campuran diinkubasi 24-48 jam pada suhu 37 C. Kultur
kemudian disentrifugasi dengan sentrifuse ukuran besar pada kecepatan 2500 rpm, suhu 4
C selama 20 menit. Sebanyak 3 ml supernatan diambil dengan 5 ml syringe dan difiltrasi dengan membran millipore 0.22 mikro. Supernatan yang
telah difiltrasi dimasukkan ke dalam tabung yang steril Pitt Gaston 1995.
Pencawanan
Koloni tunggal EPEC K1.1 dan E. coli non patogen, masing-masing ditumbuhkan ke dalam media kaldu LB supplement lalu diinkubasi pada shaker
bath dengan kecepatan 150-200 rpm pada suhu 37 C selama 5-7 jam sampai
OD
600
=1. Sebanyak 100 mikroliter dari pertumbuhan bakteri dicampurkan dengan 100 mikroliter supernatan yang telah difiltrasi dalam tabung yang steril diinkubasi
pada suhu 37 C selama 30 menit. Campuran ditambahkan 3 ml agarose cair
molten top agar yang bersuhu 47 C, dicawankan pada media agar-agar tanpa
yeast extract, diputar perlahan untuk meratakan sebaran dan dibiarkan memadat. Inkubasi dilakukan pada 37
C selama 12 jam Chibani-Chennoufi et al. 2004.
Pemurnian Fage
Beberapa fage yang menunjukkan penampakan plak berbeda, masing- masing dimurnikan dengan memindahkan plak yang terisolasi dengan baik
menggunakan pipet Pasteur kemudian plak tersebut dicampurkan dengan 2-3 ml 25 pelarut Ringers. Suspensi fage divortex dan dibiarkan selama 5-10 menit
pada suhu ruang. Suspensi tersebut kemudian difiltrasi menggunakan membran filter 0.45
µ. Tahap selanjutnya dilakukan penambahan 3-5 tetes kloroform yang mengandung 1 etanol dengan tujuan untuk membunuh beberapa bakteri yang
masih ada. Sentrifugasi dilakukan dengan sentrifuse ukuran besar pada kecepatan 2800 rpm, suhu 4
C, selama 20 menit. Supernatan disentrifugasi sebanyak 2 kali ulangan untuk meminimalkan adanya bakteri dan debris lainnya, kemudian
supernatan hasil sentrifugasi yang mengandung fage diambil dan disimpan untuk bahan produksi.
Produksi atau Perbanyakan Fage
Kultur inang disiapkan dengan cara menumbuhkan bakteri EPEC pada 1 vv media kaldu LB suhu 37
C, 150 rpm pada shaker bath selama 3-5 jam, Sebanyak 100 µl kultur EPEC diinfeksikan dengan fage dalam jumlah yang sama
pada suhu 37 C, 50 rpm pada shaker bath, selama 1 jam. Lima tetes kloroform
yang mengandung 1 etanol ditambahkan, kemudian disentrifugasi dengan sentrifuse ukuran besar pada kecepatan 2900 rpm, suhu 4
C, selama 30 menit. Supernatan dipisahkan dan ditambahkan PEG-8000 2.5 M NaCl sebanyak
seperempat dari volume supernatan yang diperoleh. Selanjutnya didinginkan pada suhu 0
C selama kurang lebih 1 jam dan disentrifugasi dengan sentrifuse ukuran besar pada kecepatan 2500 rpm, suhu ruang selama 30 menit. Supernatan dibuang,
pellet fage yang berada di dasar tabung diresuspensi 500-1000 µl STE buffer 1 M Tris pH 8, 0.5 M EDTA pH 8, 5 M NaCl lalu disentrifugasi dengan sentrifuse
ukuran kecil pada kecepatan 13000 rpm, suhu ruang, selama 20 menit. Supernatan yang diperoleh dipindahkan ke eppendorf baru dan ditambahkan 100 µl EDTA 5
mM, kemudian disimpan sebagai stok.
Penentuan Kisaran Inang Fage
Sebanyak 100 µl kultur bakteri EPEC K1.1 dan E. coli non patogen yang telah ditumbuhkan di media kaldu LB selama 3-4 jam, masing-masing
dicampurkan dengan stok fage dalam konsentrasi yang sama lalu diinkubasi pada suhu 37
C selama 15-30 menit. Sebanyak 3.5 ml molten top agar yang masih
bersuhu 42 C dicampurkan, selanjutnya dituang ke media agar cawan LB,
ditunggu hingga molten top agar memadat, kemudian diinkubasi pada suhu 37 C.
Kuantifikasi Fage Penentuan PFU
Plaque forming units PFU ml ditentukan berdasarkan metode dari Foschino et al. 1995, yaitu 100 µl larutan fage ditambahkan dengan 100 µl
kultur EPEC K1.1 yang telah diinkubasi selama 3-4 jam pada media LB. Suspensi diinkubasi selama 15 menit pada suhu 37
C, dicampurkan dengan 3 ml molten top agar yang masih bersuhu 50
C, dituang ke atas permukaan media cawan agar-agar tanpa yeast extract. Inkubasi dilakukan pada suhu 37
C, plak-plak yang terbentuk dihitung setelah diinkubasi selama semalam.
Karakterisasi Fage Hasil Isolasi
Karakterisasi Protein Stok fage diukur kadar proteinnya dengan menggunakan metode Bradford
1976. Langkah awal untuk menentukan konsentrasi protein sampel ialah membuat serial konsentrasi standar protein Bovine Serum Albumin BSA dari 0.1
hingga 1.0 mg ml. Masing-masing konsentrasi standar protein dan sampel diambil sebanyak 400 µl dan ditempatkan pada tabung reaksi. Masing-masing
tabung ditambahkan 4 ml pereaksi Bradford Lampiran 1. Campuran dihomogenkan dan diinkubasi pada 37
C selama 15 menit kemudian diukur absorbansinya dengan spektrofotometer pada
λ 595 nm. Nilai absorbansi dan konsentrasi protein dari standar BSA diplotkan pada
grafik cartesius dengan konsentrasi protein sebagai absis sumbu x dan absorbansi sebagai ordinat sumbu y, kemudian ditentukan persamaan garis
regresinya. Kurva yang terbentuk dijadikan sebagai kurva standar untuk menentukan konsentrasi protein sampel Lampiran 5.
Berat molekul isolat fage yang diperoleh dianalisis dengan Sodium Dodecyl Sulphate-Poly Acrilamide Gel Electrophoresis SDS-PAGE Laemmli
1970. Marker yang digunakan ialah lactate dehydrogenase, ovalbumin, bovine serum albumin, dan
β-galactosidase Fermentas dengan berat molekul berturut- turut adalah 35.0, 45.0, 66.2, dan 116.0 kDa.
Konsentrasi gel pemisah sebesar 12 poli akrilamida yang ditempatkan pada bagian bawah. Konsentrasi gel pengumpul sebesar 7.5 poliakrilamida yang
diletakkan di bagian atas setelah gel pemisah sudah menjadi benar-benar padat. Komposisi bahan untuk membuat gel pemisah maupun gel pengumpul tertera
pada Lampiran 2 dan komposisi larutan stok SDS-PAGE tertera pada Lampiran 3. Stok
fage dan
molecular weight marker, masing-masing dicampurkan dengan buffer sampel dengan perbandingan 4:1 4 bagian sampel dan 1 bagian
buffer sampel. Campuran disentrifugasi dengan sentrifuse ukuran kecil pada kecepatan 13000 rpm, suhu ruang, selama 20 menit dan dipanaskan dalam air
mendidih selama 5-10 menit, dimasukkan ke dalam sumur gel dengan volume 45 µl. Elektroforesis dijalankan dengan arus 20 mA dan tegangan 75 volt selama 3
jam. Elektroforesis diakhiri pada saat pewarna sampel mencapai batas 0.5 cm
hingga 1 cm dari bagian bawah gel. Setelah elektroforesis berakhir, gel diangkat dari lempeng kaca dan dilakukan pewarnaan perak silver stain. Bahan dan
prosedur untuk pewarnaan silver stain dapat dilihat pada Lampiran 4.
Pengamatan Morfologi Fage dengan Transmission Electron Microscope TEM
Preparasi untuk pengamatan sampel dengan menggunakan TEM dilakukan berdasarkan metode Bozzola dan Russell 1998. Stok fage diteteskan sebanyak
5µl pada grid menggunakan mikropipet, ditunggu selama 30 detik, selanjutnya dikeringkan dengan kertas saring. Sebanyak 5µl Uranyl Acetate 2 diteteskan
ke atas grid, ditunggu selama 1 menit. Grid dikeringkan dengan menggunakan kertas saring dan dibiarkan selama ± 60 menit agar benar-benar kering.
Grid-grid EM diletakkan pada holder, dibiarkan kering selama beberapa jam. Setelah spesimen kering, diperiksa dengan menggunakan Mikroskop
Elektron Transmisi model JEOL JEM-1010 yang dioperasikan 80kV pada perbesaran 50000x - 85000x.
Efektifitas Lisis Sel EPEC K1.1 oleh Fage
Sebanyak 100 µl kultur bakteri EPEC K1.1 yang telah ditumbuhkan di media kaldu LB sampai OD=1 diinfeksikan dengan 100 µl stok fage. Kontrol
positif ialah kultur EPEC K1.1 tanpa fage. Masing-masing kultur diamati pada masa inkubasi berturut-turut 0, 5, 10, 15, 21, dan 24 jam dengan pencawanan di
media Eosin Methylene Blue EMB, diinkubasi 24 jam pada suhu 37 C.
Pengamatan Morfologi Lisis EPEC K1.1 oleh Fage dengan Scanning Electron Microscope SEM
Sebanyak 250 µl kultur EPEC K1.1 yang telah ditumbuhkan di media kaldu LB sampai OD=1 ditambah 250 µl stok fage diinkubasi 25 dan 30 menit.
Sebagai kontrol positif ialah 500 µl kultur EPEC tanpa fage. Masing-masing kultur diamati dengan menggunakan SEM. Preparasi untuk pengamatan sampel
dengan menggunakan SEM dilakukan dengan metode Wendelschafer-crabb et al.
1975. Masing-masing campuran disentrifugasi hingga sel-selnya mengendap. Endapan direndam glutaraldehida 2 selama 2 jam. Glutaraldehida dipisahkan
dengan cara disentrifugasi, supernatan dibuang, direndam dalam larutan dapar caccodylate. Setelah direndam selama 10 menit, larutan dapar dibuang dengan
cara disentrifugasi, endapan direndam dengan osmium tetraoksida 1 selama 1 jam. Sampel disentrifugasi kembali, direndam dengan alkohol 50 selama 10
menit sebanyak 2 kali. Secara berturut-turut sampel ditambahkan alkohol 70, 80, 95, dan alkohol absolut dengan perendaman masing-masing selama 10
menit. Larutan alkohol dibuang dengan cara disentrifugasi, direndam t-butanol selama 10 menit sebanyak 2 kali sampai terbentuk suspensi dalam butanol. Cover
slip cover glass yang dipotong dengan ukuran 0.25 cm
2
dicuci dengan alkohol absolut, suspensi bakteri dioleskan di atasnya setelah cover slip kering. Sampel
dikeringbekukan dan dilapisi ion Au. Semua tahapan sentrifugasi dilakukan pada kecepatan 4000 x g selama 5 menit. Sampel diamati menggunakan mikroskop
elektron payaran bervakum rendah model JSM-5310LV pada perbesaran 10000x – 20000x.
HASIL DAN PEMBAHASAN
Hasil A. HASIL ISOLASI DAN POLA KERAGAMAN PLAK FAGE EPEC K1.1
Hasil isolasi fage yang diambil dari sampel limbah cair rumah tangga di sepanjang Babakan Raya Darmaga Bogor pada mulanya diperoleh 9-18 plak serta
adanya beberapa zona bening atau zona hambat lainnya di pinggir agar cawan yang ditumbuhi kultur EPEC K1.1. Plak yang terbentuk dari suatu kultur bakteri
yang ditumbuhkan di cawan petri merupakan satu parameter penting dari adanya fage pada siklus litik. Plak tersebut terlihat bening yang menandakan adanya zona
kerusakan sel.
a b
c d
Gambar 2 Pola keragaman plak fage. Isolat FB1 a, FB2 b, FB3 c, FB4 d masing-masing plak diberi tanda lingkaran.
Fage hasil isolasi dipilih menjadi 4 isolat fage secara random. Masing- masing isolat fage diberi nama FB1, FB2, FB3, dan FB4. Masing-masing isolat
fage tersebut satu sama lain memiliki pola keragaman plak yang berbeda, seperti terlihat pada Gambar 2. Pola keragaman plak terlihat dari ukuran dan bentuk zona
bening dari masing-masing fage. Fage FB4 cenderung memiliki ukuran lebih besar dan lebih beragam daripada ketiga isolat fage lainnya Gambar 2d.
B. HASIL PENENTUAN KISARAN INANG
