Variability Analysis of Several Genotipes of Durian (Durio zibethinus Murr.) using Morphological and Molecular (ISSR) Markers
i
ANALISIS KERAGAMAN BEBERAPA GENOTIPE DURIAN
(Durio zibethinus Murr.) MENGGUNAKAN PENANDA
MORFOLOGI DAN MOLEKULER (ISSR)
KARLINA SYAHRUDDIN
SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2012
PERNYATAAN MENGENAI TESIS DAN
SUMBER INFORMASINYA
Dengan ini saya menyatakan bahwa tesis yang berjudul Analisis
Keragaman Beberapa Genotipe Durian (Durio zibethinus Murr.) menggunakan
Penanda Morfologi dan Molekuler (ISSR) adalah karya saya dengan arahan dari
komisi pembimbing dan belum diajukan dalam bentuk apa pun kepada perguruan
tinggi mana pun. Sumber informasi yang berasal atau kutipan dari karya yang
diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks
dan dicantumkan dalam daftar pustaka di bagian akhir tesis ini.
Bogor, Juli 2012
Karlina syahruddin
NIM A.253090151
ABSTRACT
KARLINA SYAHRUDDIN. Variability Analysis of Several Genotipes of Durian
(Durio zibethinus Murr.) using Morphological and Molecular (ISSR) Markers. Under
guidance by SOBIR and NURUL KHUMAIDA.
Indonesia is one of the durian diversity center. Evaluation and
characterization activities should be conducted to identify the genotipes in order
to differentiate the individual plant in the spesies. Genetic variation of 21
collected genotipes of Indonesia Agency for Agricultural Research and
Development (IAARD) Cipaku orchard, Bogor was evaluated using
morphological and Inter Simple Sequence Repeat (ISSR) markers. Variability
analysis based on 22 morphological characters gained 64 (100%) polymorphism.
Molecular analysis using ten primers of ISSR amplified 48 locus. The 39 locus
(81.25%) were polymorphic and the 9 locus (18.75%) were monomorphic,
respectively. Both of the markers have different clustering, therefore they should
be analysed using Joint Analysis. The result of the study showed genetic
variability among 21 genotipes was grouped into 2 clusters on 0.51 similarity
coefficient. The first group (A) consisted of the genotipe from Indonesia and the
second group (B) consisted of Kanjau genotipe from Thailand with matrix
correlation value was 0.83. Kanjau genotipe was suggested as a candidate in
durian breeding programme, in order to increase Indonesian durian value in the
future.
Keywords : Durio zibethinus, Joint Analysis, genetic variation, Kanjau
RINGKASAN
KARLINA SYAHRUDDIN. Analisis Keragaman Beberapa Genotipe Durian
(Durio zibethinus Murr.) menggunakan Penanda Morfologi dan Molekuler
(ISSR). Dibimbing oleh SOBIR dan NURUL KHUMAIDA.
Indonesia merupakan pusat keragaman tanaman durian dengan sejumlah
besar sumber daya genetik yang belum banyak dimanfaatkan. Salah satu
pemanfaatan tanaman durian adalah dengan program pemuliaan dalam rangka
perbaikan genetik tanaman durian yang sangat bergantung pada sumber
keragaman genetik durian itu sendiri. Oleh karena itu koleksi plasma nutfah
durian Balai Pengkajian Teknologi Pertanian (BPTP), Kebun Percobaan Cipaku,
perlu dievaluasi keragaman genetiknya untuk kegiatan manipulasi genetik ke
arah perakitan kultivar unggul yang diinginkan. Kendala yang diperoleh dengan
hanya mengandalkan keragaman morfologi adalah terbatasnya karakter yang
diamati dan sangat bergantung pada lingkungan, oleh karena itu diperlukan alat
bantu yang lain yaitu dengan metode molekuler. Metode analisis molekuler
yang banyak digunakan saat ini adalah yang berbasis PCR. Salah satu penanda
yang dapat digunakan dengan metode tersebut yaitu penanda ISSR. Diharapkan
dengan kombinasi kedua penanda tersebut akan menghasilkan data yang lebih
akurat dalam mencari besar nilai keragaman dan pola hubungan genetik diantara
21 genotipe durian.
Karakter morfologi yang dapat diamati pada 21 genotipe yang diuji
adalah sebanyak 22 karakter. Berdasarkan karakter tersebut diperoleh 64 sub
karakter polimorfik (100%). Hasil analisis pengelompokan diperoleh koefisien
kemiripan genetik sebesar 0.34 hingga 0.83 dengan besar nilai keragaman
berkisar 7 hingga 66%. Hasil penelitian ini mengelompokkan 21 genotipe
durian dalam 2 kelompok pada koefisien kemiripan 0.34 yaitu kelompok A
meliputi Lokal cipaku, Layung, Tambleg, Kendil, Hepe, Sikoclak, Manalagi,
Pangkalan, Pingku, Pasirjati, Perwira, Mentega, Bulan, Tanjung mabah, Kuning
garing, Hejo, Aseupan, Semeng, Sunan dan kelompok B meliputi Kim dan
Kanjau. Pengelompokan terpisah berdasarkan perbedaan karakter bentuk ujung
daun, keadaan pinggir daun, keadaan permukaan daun dan warna daun.
Hasil amplifikasi DNA 21 genotipe durian dengan menggunakan 10
primer menghasilkan 659 pita DNA, dengan 48 lokus yang terdiri dari pola pita
polimorfik sebanyak 39 lokus dengan 470 pita atau sebesar 81.25 % dan pita
monomorfik sebanyak 9 lokus dengan 189 pita atau sebesar 18.75 %. Koefisien
kemiripan genetik 21 genotipe dari sepuluh primer ISSR berkisar antara 0.680.92, yang berarti keragaman genetik berkisar 8 sampai 32 %. Berdasarkan hasil
analisis pengelompokan diperoleh 2 kelompok pada koefisien kemiripan 0.68,
yaitu kelompok genotipe Indonesia dan genotipe Kanjau (Thailand).
Penggabungan data penanda morfologi dan molekuler, dapat
memberikan informasi baik secara fenotipik maupun genetik. Koefisien
kemiripan genetik 21 genotipe durian berdasarkan gabungan data morfologi molekuler (ISSR) berkisar antara 0.51 - 0.84 yang menunjukkan keragaman
genetik berkisar 16 - 49%. Hasil Analisis pengelompokan memisahkan 21
genotipe durian pada koefisien kemiripan 0.51 menjadi dua kelompok yaitu
v
kelompok A meliputi genotipe durian dari Indonesia meliputi Lokal cipaku,
Layung, Tambleg, Kendil, Hepe, Sikoclak, Manalagi, Pangkalan, Pingku, Pasirjati,
Perwira, Mentega, Bulan, Tanjung mabah, Kuning garing, Hejo, Aseupan, Semeng,
Sunan, Kim dan kelompok B meliputi dan Kanjau dari Thailand. Durian genotipe
Kanjau merupakan genotipe potensial untuk dijadikan tetua persilangan untuk
menghasilkan durian dengan karakter yang sesuai dengan kebutuhan pasar.
Kata kunci : Durio zibethinus, analisis gabungan, variasi genetik, Kanjau.
© Hak Cipta milik IPB, tahun 2012
Hak Cipta dilindungi Undang-undang
Dilarang mengutip sebagian atau seluruh karya tulis ini tanpa
mencantumkan atau menyebutkan sumbernya. Pengutipan hanya untuk
kepentingan pendidikan, penelitian, penulisan karya ilmiah, penyusunan
laporan, penulisan kritik, atau tinjauan suatu masalah dan pengutipan
tersebut tidak merugikan kepentingan yang wajar IPB
Dilarang mengumumkan dan memperbanyak sebagian atau seluruh karya
tulis dalam bentuk apa pun tanpa izin IPB
ANALISIS KERAGAMAN BEBERAPA GENOTIPE DURIAN
(Durio zibethinus Murr.) MENGGUNAKAN PENANDA
MORFOLOGI DAN MOLEKULER (ISSR)
KARLINA SYAHRUDDIN
Tesis
sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
Magister Sains pada
Mayor Pemuliaan dan Bioteknologi Tanaman
SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2012
Judul Tesis : Analisis Keragaman Beberapa Genotipe Durian (Durio zibethinus
Murr.) Menggunakan Penanda Morfologi dan Molekuler (ISSR).
Nama
: Karlina Syahruddin
NIM
: A.253090151
Disetujui
Komisi Pembimbing
Dr. Ir. Sobir, MSi
Ketua
Dr. Ir. Nurul Khumaida, MSi
Anggota
Diketahui
Ketua Mayor
Pemuliaan dan Bioteknologi Tanaman
Dekan Sekolah Pascasarjana
Dr. Ir .Trikoesoemaningtyas, MSc
Dr. Ir. Dahrul Syah, MSc. Agr
Tanggal Sidang :
Tanggal Lulus :
ix
Penguji Luar Komisi pada Ujian Tesis : Dr. Desta Wirnas, SP. MS
PRAKATA
Puji dan syukur penulis panjatkan kepada Allah SWT atas segala
karunia-Nya sehingga karya ilmiah ini berhasil diselesaikan. Judul penelitian
adalah Analisis Keragaman Beberapa Genotipe Durian (Durio zibethinus
Murr.) menggunakan Penanda Morfologi dan Molekuler (ISSR). Penelitian
dilaksanakan sejak bulan Agustus 2011 sampai dengan Januari 2011.
Ucapan terimakasih dan penghargaan yang setinggi-tingginya
penulis sampaikan kepada :
1. Dr. Ir. Sobir, MSi dan Dr. Ir. Nurul Khumaida, MSi selaku komisi
pembimbing yang telah memberikan arahan dan bimbingan sejak
perencanaan, pelaksanaan sampai penyelesaian penyusunan tesis.
2. Dr. Ir. Trikoesoemaningtyas, MSc selaku ketua Mayor Pemuliaan dan
Bioteknologi Tanaman SPs IPB dan Dr. Ir. Darda Efendi, MSi selaku
Sekretaris Mayor Pemuliaan dan Bioteknologi Tanaman SPs IPB.
3. Pusat Kajian Hortikultura Tropika IPB, yang telah memberikan izin
kepada penulis untuk melakukan penelitian di Laboratorium Molekuler.
4. Balai Pengkajian dan Pengembangan Teknologi Pertanian Bogor, Kebun
Percobaan Cipaku, yang telah memberikan izin kepada penulis untuk
melakukan penelitian morfologi.
5. Dr. Desta Wirnas, SP MSi selaku penguji luar komisi pembimbing.
6. Prof. Dr. Ir. Sudarsono, MSc yang meluangkan waktu untuk berdiskusi.
7. Bapak dan Ibu, kakak (Rika Fitriani, Silvana, Soraya, Fatah,
Jamaluddin), Adik (Sadly, Dian, Rian, Sofyan, Bella dan Devi) serta
seluruh keluarga besar atas restu dan doanya.
8. Erni seminar SP MSi, Dr. Wierny, Dr. Sumadi yang telah mendukung
penulis untuk melanjutkan studi.
9. Sulassih SP MSi, Rahmah Badaruddin, Dede safitri setiawan, Siti
Halimah, Amin Nur, Yusra, Nur Arifin, Vina, Vitri, Erwin, Ernila, Ina
Rahmawati, Sofie, Kristiana, Sulaiman, Cory, Sri Imriani Pulungan, Ira
Bahari, Ipit, Devina, Dina, Putri, Reni, Deden, Selvy, Ade Andry atas
kebersamaannya selama ini.
xi
10. Dosen-dosen mayor Pemuliaan dan Bioteknologi Tanaman atas ilmu dan
dukungannya.
11. Teman-teman di Faperta IPB atas doa dan dukungannya.
12. Teman-teman Mayor AGH, PBT 2008, 2009 dan 2010 atas
kebersamaannya.
13. Teman-teman Pondok Rizky atas doa dan kebersamaannya.
14. Adeel Abdulkarim Fadhl Altuhish atas dorongan dan motivasinya
selama penulis menyelesaikan penulisan tesis.
15. Teman-teman yang tidak bisa penulis sebutkan namanya satu-satu.
Terimakasih atas dukungan dan cintanya.
Semoga karya ilmiah ini dapat bermanfaat bagi pengembangan ilmu
pengetahuan dan ilmu pertanian masa depan.
Bogor, Juli 2012
Karlina Syahruddin
RIWAYAT HIDUP
Penulis dilahirkan di Makassar, 7 November 1983 dari pasangan
Alm. Bapak Syahruddin dan Ibu Nurmiaty Norma. Penulis adalah anak ke
empat dari sepuluh bersaudara. Tahun 2002 penulis lulus dari SMA Negeri
1 Makassar dan pada tahun yang sama penulis melanjutkan studi pada
program sarjana Agronomi, Teknologi Benih Fakultas Pertanian UNPAD.
Penulis berkesempatan melanjutkan pendidikan Program Magister Sains
pada Mayor Pemuliaan dan Bioteknologi Tanaman, Sekolah Pascasarjana
IPB pada tahun 2009.
DAFTAR ISI
Halaman
DAFTAR TABEL ........................................................................................
xiv
DAFTAR GAMBAR ...................................................................................
xv
DAFTAR LAMPIRAN ................................................................................
xvi
PENDAHULUAN
Latar Belakang ....................................................................................
1
Tujuan .................................................................................................
3
Kerangka Pemikiran ............................................................................
4
TINJAUAN PUSTAKA
Sejarah penyebaran, taksonomi dan botani tanaman durian ...............
7
Analisis keragaman genetik tanaman durian ......................................
9
Penanda Morfologi ..............................................................................
10
Penanda Molekuler Inter Simple Sequence Repeats (ISSR) ...............
11
METODOLOGI
Waktu dan Tempat ..............................................................................
13
Bahan dan Alat ....................................................................................
13
Metode ................................................................................................
14
Analisis Data .......................................................................................
20
HASIL DAN PEMBAHASAN
Keragaman Karakter Morfologi ..........................................................
23
Analisis Penanda Morfologi ...............................................................
23
Analisis Penanda Molekuler ...............................................................
37
Analisis Gabungan Penanda Morfologi dan Molekuler (ISSR)..........
47
SIMPULAN DAN SARAN
Simpulan .............................................................................................
51
Saran ...................................................................................................
51
DAFTAR PUSTAKA ..................................................................................
53
LAMPIRAN .................................................................................................
57
DAFTAR TABEL
Halaman
1. Nama genotipe tanaman durian koleksi Balai Pengkajian Teknologi
Pertanian (BPTP), kebun percobaan Cipaku dan daerah asalnya ........
13
2. Karakter pengamatan morfologi vegetatif sifat kualitatif pada 21
genotipe tanaman durian di BPTP kebun percobaan Cipaku...............
15
3. Karakter pengamatan morfologi vegetatif sifat kuantitatif pada 21
genotipe tanaman durian di BPTP kebun percobaan Cipaku...............
16
4. Nama dan susunan basa primer ISSR koleksi PKHT-IPB........................
19
5. Suhu dan waktu yang digunakan pada proses Polymerase Chain
Reaction ..............................................................................................
19
6. Keragaan primer dan lokus pada penanda molekuler ..........................
20
7. Karakter morfologi vegetatif sifat kualitatif dan proporsi subkarakternya
yang ditunjukkan pada 21 genotipe tanaman durian koleksi BPTP kebun
percobaan Cipaku ......................................................................................... 24
8. Proporsi karakter daun yang muncul pada 21 genotipe tanaman durian
yang diamati di BPTP kebun percobaan Cipaku ................................. 27
9. Karakter morfologi vegetatif sifat kuantitatif dan proporsi subkarakter
yang ditunjukkan pada 21 genotipe tanaman durian koleksi BPTP
kebun percobaan Cipaku ..................................................................... 31
10. Rekapitulasi karakter polimorfik penanda morfologi pada 21 genotipe
tanaman durian .....................................................................................
34
11. Hasil amplifikasi sepuluh primer ISSR pada 21 genotipe tanaman
durian....................................................................................................
38
DAFTAR GAMBAR
Halaman
1. Bagan alur penelitian analisis keragaman durian koleksi Balai
Pengkajian Teknologi Pertanian, kebun Percobaan Cipaku
berdasarkan penanda morfologi dan molekuler (ISSR). .....................
5
2. Wilayah amplifikasi Inter Simple Sequence Repeats (ISSR) ...........
12
3. Skematik pengukuran karakter kuantitatif daun durian ......................
16
4. Keragaan pinggir daun pada tanaman durian ......................................
26
5. Keragaan bentuk daun durian genotipe Kanjau ...................................
29
6. Dendogram koefisien kemiripan 21 genotipe tanaman durian
berdasarkan karakter morfologi vegetatif sifat kualitatif. ...................
32
7. Dendogram koefisien kemiripan 21 genotipe tanaman durian
berdasarkan karakter morfologi vegetative sifat kuantitatif ...............
33
8. Dendogram koefisien kemiripan 21 genotipe tanaman durian
berdasarkan karakter morfologi vegetatif ...........................................
35
9. Karakter daun pada genotipe durian Kim (A) dan Kanjau (B). ..........
36
10. Profil pita DNA yang dibentuk pada primer PKBT 4. ........................
41
11. Profil pita DNA yang dibentuk pada primer PKBT 10 .......................
40
12. Profil pita DNA yang dibentuk pada primer PKBT 9 .........................
40
13. Profil pita DNA yang dibentuk pada primer PKBT 12.......................
41
14. Perbedaan pola pita DNA genotipe kanjau dan genotipe Indonesia ...
43
15. Dendogram 21 genotipe tanaman durian berdasarkan profil pita
DNA ....................................................................................................
46
16. Dendogram 21 genotipe tanaman durian berdasarkan data gabungan
morfologi- molekuler (ISSR) ..............................................................
48
DAFTAR LAMPIRAN
Halaman
1. Koefisien kemiripan pada 21 genotipe tanaman durian berdasarkan
penanda morfologi vegetatif sifat kualitatif ........................................
57
2. Koefisien kemiripan pada 21 genotipe tanaman durian berdasarkan
penanda morfologi vegetatif sifat kuantitatif ......................................
58
3. Koefisien kemiripan pada 21 genotipe tanaman durian berdasarkan
penanda morfologi vegetatif ...............................................................
59
4. Koefisien kemiripan pada 21 genotipe tanaman durian berdasarkan
penanda molekuler (ISSR) ..................................................................
60
5. Koefisien kemiripan pada 21 genotipe tanaman durian berdasarkan
penanda gabungan ...............................................................................
61
6. Deskripsi morfologi vegetatif durian Lokal cipaku ............................
62
7. Deskripsi morfologi vegetatif durian Kendil ......................................
63
8. Deskripsi morfologi vegetatif durian Layung .....................................
64
9. Deskripsi morfologi vegetatif durian Pangkalan ................................
65
10. Deskripsi morfologi vegetatif durian Bulan........................................
66
11. Deskripsi morfologi vegetatif durian Pingku ......................................
67
12. Deskripsi morfologi vegetatif durian Hepe .........................................
68
13. Deskripsi morfologi vegetatif durian Tanjung mabah ........................
69
14. Deskripsi morfologi vegetatif durian Kuning garing ..........................
70
15. Deskripsi morfologi vegetatif durian Semeng ....................................
71
16. Deskripsi morfologi vegetatif durian Mentega ...................................
72
17. Deskripsi morfologi vegetatif durian Pasirjati ....................................
73
18. Deskripsi morfologi vegetatif durian Aseupan ...................................
74
19. Deskripsi morfologi vegetatif durian Kim ..........................................
75
20. Deskripsi morfologi vegetatif durian Tambleg ...................................
76
xvii
21. Deskripsi morfologi vegetatif durian Sunan .............................................. 77
22. Deskripsi morfologi vegetatif durian Sikoclak .......................................... 78
23. Deskripsi morfologi vegetatif durian Hejo ................................................ 79
24. Deskripsi morfologi vegetatif durian Perwira ............................................ 80
25. Deskripsi morfologi vegetatif durian Kanjau............................................. 81
26. Deskripsi morfologi vegetatif durian Manalagi ......................................... 82
PENDAHULUAN
Latar Belakang
Indonesia merupakan salah satu negara dengan kekayaan hayati yang
tinggi di dunia. Salah satu kekayaan hayati tersebut adalah tanaman durian.
Indonesia merupakan pusat keragaman tanaman durian, dimana 19 spesies
ditemukan di Kalimantan, 14 spesies diantaranya adalah endemik Kalimantan dan
7 spesies ditemukan di Sumatra (Subhadrabandhu S & Ketsa 2001). Enam spesies
dari 26 spesies Durio tersebut, merupakan spesies yang dapat dikonsumsi, namun
hanya Durio zibethinus Murr. yang banyak dikembangkan karena memiliki aroma
dan rasa yang khas. D. zibethinus ini kemudian tersebar ke seluruh wilayah
Indonesia dan berkembang menjadi genotipe-genotipe spesifik wilayah.
Program pemuliaan tanaman dalam rangka menghasilkan varietas unggul
untuk memenuhi kebutuhan pasar bergantung pada besarnya keragaman genetik yang
tersedia. Program multivarietas yang dicanangkan oleh pemerintah merupakan suatu
kegiatan eksplorasi dengan mencari plasma nutfah dari wilayah dimana terdapat
keragaman genetik yang tinggi yaitu tempat asal berkembangnya spesies tanaman
tertentu (center of origin) atau dari wilayah di mana tanaman tersebut dibudidayakan
secara intensif (center of diversity). Upaya pengkayaan plasma nutfah kemudian
dengan melakukan kegiatan koleksi, domestikasi dan introduksi (Baihaki et al. 1999).
Kegiatan koleksi bertujuan
untuk mengumpulkan plasma nutfah dengan
memanfaatkan variasi yang ada di alam. Koleksi plasma nutfah juga bertujuan untuk
mempelajari tingkat keragaman yang ada dengan kegiatan karakterisasi serta untuk
tujuan konservasi atau penyelamatan keragaman genetik (Syukur et al. 2009).
Menurut Seetharam & Prasad (1989), fungsi plasma nutfah tergantung pada
dua faktor : (1) evaluasi dan karakterisasi dan (2) identifikasi sumber gen yang
berguna. Oleh karena itu, koleksi plasma nutfah yang ada perlu dievaluasi keragaman
genetiknya untuk kegiatan pemuliaan yaitu mengidentifkasi karakter-karakter unggul
yang dimiliki tanaman.
Identifikasi keragaman dari tanaman durian yang dikoleksi penting untuk
dilaksanakan mengingat tanaman-tanaman tersebut membutuhkan identifikasi
yang tepat agar dapat membedakan individu dalam spesies. Data hasil identifikasi
dapat digunakan sebagai dasar dalam seleksi genotipe unggul. Ketersediaan
2
informasi mengenai keragaman jenis atau sumber plasma nutfah akan
menjadikan program pemuliaan lebih terarah sehingga dapat menghasilkan
genotipe unggul yang diinginkan.
Pendekatan untuk mempelajari keragaman genetik pada tanaman dapat
dilakukan melalui penggunaan penanda (marker) tertentu seperti penanda
morfologi, kimiawi dan molekuler (DNA). Menurut Asiedu et al. (1989) penanda
adalah karakter yang dapat diturunkan dan berasosiasi dengan genotipe tertentu.
Penanda morfologi dikembangkan dari karakteristik tanaman yang dapat
dibedakan satu sama lain dan terlihat secara langsung seperti bentuk pohon,
batang, daun, bunga dan buah. Pengembangan metode karakterisasi tanaman
durian ini telah diatur oleh International Plant Genetic Resources Institute
(IPGRI) (Bioversity International 2007).
Penggunaan penanda morfologi terkadang sulit dilakukan untuk
beberapa tanaman yang memiliki kekerabatan dekat sehingga sangat sedikit
penanda yang bisa didapatkan dari sifat morfologi. Penanda morfologi juga
bersifat kompleks karena merupakan hasil interaksi antara genotipe dan
lingkungan. Hal ini menyebabkan kesulitan dalam membedakan antara
karakter yang dibawa secara genetik atau hasil adaptasi terhadap lingkungan.
Di samping itu, pengamatan karakter bunga dan buah sering terkendala oleh
musim dan lingkungan. Kendala tersebut dapat diatasi dengan penggunaan
penanda molekuler yang berbasis DNA.
Penanda molekuler telah digunakan untuk menunjukkan bahwa gen-gen
dapat berkontribusi pada proses spesiasi organisme (Karp et al. 1997). Teknik
penanda molekuler telah banyak tersedia saat ini. Pendekatan berbasis Polymerase
Chain Reaction (PCR) banyak digunakan karena sederhana dan hanya
membutuhkan sedikit sampel DNA. Inter Simple Sequence Repeat (ISSR) adalah
salah satu penanda yang banyak digunakan saat ini. Penanda ISSR merupakan
penanda multilokus acak yang dihasilkan oleh amplifikasi PCR dengan primer
mikrosatelit (Zietkiewicz et al. 1994). Penanda ISSR dapat bersifat dominan dan
untuk beberapa kasus dapat bersifat kodominan (Reddy et all. 2001). ISSR
menguntungkan karena tidak memerlukan informasi genomik tanaman yang akan
dianalisis dan lebih sensitif dalam mendeteksi diversitas genetik pada tingkat yang
3
rendah. Selain itu, ISSR relatif lebih mudah dan sama ekonomisnya dengan RAPD
(Bradford 2008). Penanda ISSR juga berguna dalam mempelajari hubungan
interspesifik dan intraspesifik pada tanaman berkerabat.
Karekterisasi merupakan tahap awal dan sangat penting dalam menunjang
keberhasilan program pemuliaan selanjutnya. Karakterisasi berdasarkan morfologi
dan DNA bertujuan menemukan karakter-karakter spesifik dan unggul dari
tanaman serta dapat berfungsi sebagai DNA fingerprinting. Penelitian ini penting
dilaksanakan karena masih terbatasnya informasi mengenai keragaman genetik
tanaman durian, terutama tanaman durian yang telah dikoleksi oleh BPTP di
kebun percobaan Cipaku.
Tujuan
Secara umum penelitian ini bertujuan untuk mendapatkan informasi tentang
keragaman genetik tanaman durian koleksi Balai Pengkajian Teknologi Pertanian
(BPTP) di kebun percobaan Cipaku Jawa Barat, Departemen Pertanian.
Secara khusus penelitian ini bertujuan untuk :
1.
Mengidentifikasi
keragaman 21 genotipe tanaman durian berdasarkan
penanda morfologi stadia vegetatif.
2.
Mengidentifikasi keragaman 21 genotipe tanaman durian berdasarkan
penanda ISSR.
3.
Mengidentifikasi keragaman 21 genotipe tanaman durian berdasarkan data
gabungan penanda morfologi dan penanda ISSR
4
Kerangka Pemikiran
Indonesia memiliki sejumlah besar sumber daya genetik tanaman
durian, namun belum banyak dimanfaatkan. Salah satu pemanfaatan sumber
daya genetik tanaman durian adalah dengan program pemuliaan dalam rangka
perbaikan genetik tanaman durian yang sangat bergantung pada besarnya
sumber keragaman genetik durian itu sendiri. Oleh karena itu koleksi plasma
nutfah durian yang ada di Cipaku, perlu dievaluasi keragaman genetiknya
untuk kegiatan manipulasi genetik ke arah perakitan kultivar unggul yang
diinginkan. Kendala yang diperoleh dengan hanya mengandalkan keragaman
morfologi adalah terbatasnya karakter yang diamati dan sangat bergantung
pada lingkungan, oleh karena itu diperlukan alat bantu yang lain yaitu dengan
molekuler. Metode analisis molekuler yang banyak digunakan saat ini adalah
yang berbasis PCR. Salah satu penanda yang dapat digunakan dengan metode
tersebut yaitu penanda ISSR, yang merupakan penanda multilokus acak.
Kombinasi kedua penanda morfologi dan molekuler akan menghasilkan data
yang lebih akurat dalam mencari besar nilai keragaman dan pola hubungan
genetik di antara 21 genotipe durian. Berdasarkan latar belakang di atas,
maka disusun serangkaian percobaan identifikasi morfologi dan analisis
molekuler durian koleksi kebun Cipaku, Bogor. Hasil penelitian ditujukan
untuk mendapatkan karakter spesifik atau pembeda morfologi dan molekuler
pada durian lokal dan introduksi. Informasi mengenai tingkat keragaman
plasma nutfah durian di Cipaku dapat digunakan dalam pelestarian plasma
nutfah yang akan membantu program pemuliaan tanaman dan pengembangan
durian di wilayah Cipaku pada khususnya dan Indonesia pada umumnya.
Adapun alur pemikiran penelitian adalah sebagai berikut :
5
Durian lokal dan introduksi
Koleksi Kebun Percobaan Cipaku
Karakterisasi
Morfologi vegetatif
DNA
22 karakter
10 Primer ISSR
Skoring DATA Biner
Program NTSYS
Diperoleh
Besar nilai keragaman
Pola hubungan genetik
Besar nilai kemiripan antar genotipe
Kesesuaian Goodness of fit
Informasi Kebenaran genotipe
Seleksi genotipe unggul untuk kegiatan
pemuliaan yang terarah
Gambar 1.
Bagan alur penelitian analisis keragaman durian koleksi Balai Pengkajian
Teknologi Pertanian, kebun Percobaan Cipaku berdasarkan penanda
morfologi dan molekuler (ISSR).
6
TINJAUAN PUSTAKA
Sejarah Penyebaran, Taksonomi dan Botani Tanaman Durian
a. Asal-usul dan taxonomi durian
Nama durian (Durio Spp) diadopsi dari asal katanya “duri” (bahasa
Melayu). Genus durian diperkirakan berasal dari Asia Tenggara. Tanaman durian
tumbuh liar dan terpencar-pencar di hutan “Malesia” yang sekarang meliputi
daerah Malaysia, Sumatra, dan Kalimantan. Saat ini penanaman durian telah
menyebar ke daerah yang meliputi wilayah Sri Lanka dan India Selatan hingga
New Guinea (Prosea 1992).
Durian termasuk ke dalam ordo Malvaceae, famili Bombacaceae dan
genus Durio. Genus ini terdiri atas sekitar 28 spesies. Di Indonesia 19 spesies
ditemukan di Kalimantan dengan 14 spesies merupakan indigenous Kalimantan
dan 7 spesies ditemukan di Sumatra, namun tidak satupun merupakan indigenous
Sumatra. Kalimantan dikenal sebagai pusat asal-usul dari spesies Durio dengan
ditemukannya tetua (ancestor) dari Durio spesies yaitu D. Wyath smithii.
Sunaryono (1990) menyatakan bahwa pusat keragaman genetik durian berada di
Kalimantan Timur dan Kalimantan Tengah. Spesies durian yang dapat dikonsumsi
hanya D. zibethinus (Durian), D. dulcis (Lahong), D. graveolens (Tabelak), D.
grandiflorus (durian Monyet/Munjit), D. kutejensis (Lai) dan D. testudinarium
(durian Kura).
Spesies D. zibethinus merupakan spesies yang memiliki nilai ekonomi
penting dan banyak ditanam secara komersial. Spesies ini juga dikenal dengan
nama D. accunatissima. Beberapa klon-klon durian spesies D. zibethinus telah
banyak dikebunkan dan memiliki variasi bentuk morfologi pohon, daun, bunga
dan buah (Subhadrabandhu S & Ketsa 2001). Tanaman D. zibethinus bersifat
heterogenous, sehingga menunjukkan karakteristik sifat yang luas dalam bentuk
pohon, bentuk buah, kualitas aril, warna buah menyebar dari warna hijau hingga
kuning-krem, warna aril yang menyebar dari warna putih atau krem hingga
kuning emas, biji yang kecil hingga besar, biji yang kisut hingga bulat, perbedaan
waktu pembungaan dan pembentukan buah serta perbedaan dalam kemampuan
membentuk buah.
8
b. Morfologi tanaman durian
Durian tumbuh secara soliter sebagai tanaman tahunan. Durian sebagai
tanaman hutan hujan tropis, dapat tumbuh baik pada dataran rendah hingga
ketinggian 800 meter dpl dengan tinggi tanaman sekitar 30-40 meter dan
diameter batang 2-2.5 meter, tetapi untuk durian hasil grafting tumbuh tidak
lebih dari 12 meter (Brown 1997). Tanaman durian tumbuh optimal pada
daerah dengan curah hujan 1500 mm/tahun.
Tanaman durian memiliki arsitektur pohon Roux dengan bentuk batang
orthotropic monopodial dan cabang lateral plagiotropik. Kulit batang durian
berwarna coklat merah tua, dan mengelupas secara tidak teratur.
Daun durian tumbuh berselang-seling dan pertumbuhannya secara tunggal,
berbentuk jorong sampai lanset, berpangkal daun runcing atau tumpul, sementara
ujung daun melancip. Struktur daun agak tebal dengan permukaan daun atas
berwarna hijau mengkilap sedangkan bagian bawah berwarna coklat tembaga,
kuning keemasan hingga keperakan. Daun durian ditutupi bulu (trichoma) pada
bagian permukaan bawah daun (Widodo 1997).
Pohon durian mulai berbunga pada umur 6-7 tahun untuk tanaman asal
biji. Bakal bunga tumbuh pada titik-titik mata tertentu yang dari tahun ke tahun
akan
keluar pada tempat titik yang sama. Bentuk bunga durian indah, beraroma
wangi yang muncul pada bagian batang dan cabang yang kokoh (cauliflorus).
Keluarnya bunga lebih banyak dibagian dekat pangkal dahan atau tengah-tengah
dahan dibandingkan dibagian ujungnya (Brown 1997). Lama pembentukan bunga
dari mulai muncul bakal bunga hingga mekar adalah berkisar antara 40-60 hari
bergantung pada intensitas hujan yang terjadi.
Bunga durian tersusun dalam tangkai dan bergerombol. Setiap kuntum
bunga bermahkota lima helai yang terlepas satu sama lain dan memiliki benang
sari yang menyatu. Bunga durian adalah bunga sempurna, namun untuk membentuk buah, tanaman durian melakukan penyerbukan silang yang dibantu oleh angin
dan serangga dan hanya pada beberapa kultivar saja yang bisa menyerbuk sendiri
seperti Monthong dan Chanee. Bunga akan mekar mulai pada pukul 1600 sore dan
menyerbuk pada malam hari. Dengan tipe penyerbukan seperti ini menyebabkan
tingginya keragaman pada tanaman durian (Bumrungsri et al. 2009).
9
Bentuk buah durian bervariasi dari bulat hinga lonjong. Warna kulit buah
bermacam-macam dari hijau hingga kecoklatan. Tangkai buah berbentuk bulat
panjang dan terletak dipangkal buah dengan panjang berkisar 15 cm (Wiryanta
2002). Duri durian pun beragam dari mulai panjang meruncing berbentuk piramid
hingga tidak berduri. Setiap buah umumnya terdiri dari lima juring yang bersekat
kuat hingga tidak bersekat.
Warna daging buah bervariasi dari warna putih, kuning muda hingga
jingga (Verheij & Coronel 1991). Ketebalan, rasa dan tekstur daging buah sangat
bergantung pada jenis dan varietas durian. Jumlah biji durian dalam satu juring
bergantung juga pada jenis dan verietas durian. Bentuk dan ukuran biji bervariasi
dengan permukaan halus hingga mengkerut dan warna kulit biji coklat.
Analisis Keragaman Genetik Tanaman Durian
Durian memiliki jumlah kromosom sebanyak 2n=2x=56. Durian merupakan
tanaman dengan sistem penyerbukan silang (cross pollination). Oleh karena itu
progeny durian sangat heterozygous sehingga menghasilkan banyak rekombinasi baru
dan menghasilkan sifat yang beranekaragam (Brown 1997). Kebanyakan
perbanyakan tanaman durian di Indonesia dengan biji dari buah tanaman yang
tumbuh liar di hutan-hutan atau juga yang dilakukan oleh petani dengan cara
generatif atau dengan biji yang disemaikan (Sastrapradja 1979), sehingga banyak
tanaman durian Indonesia yang tidak teridentifikasi dan hanya beberapa diantaranya
yang baru dikarakterisasi secara sederhana dan dilepas menjadi varietas dan masih
terus dalam pengkajian lanjut.
Studi variasi genetik pada tumbuhan telah dilakukan selama beberapa
dekade berdasarkan karakter morfologi dan fisiologi. Karakter ini biasanya
produk dari ekspresi gen dan dipengaruhi oleh faktor lingkungan. Kondisi ini
sering membuat sulit untuk melakukan analisa dan menghasilkan kesimpulan
yang kurang jelas. Analisis berbasis DNA memberikan solusi untuk masalah ini,
karena tidak mengandalkan pada produk yang diekspresikan dari genom dan
independen dari pengaruh lingkungan atau tahap perkembangan. Oleh sebab itu
informasi tambahan secara genetik sangat diperlukan guna mendapatkan hasil
pengelompokan yang lebih akurat (Semagn et al. 2006)
10
Marka molekuler adalah upaya yang dilakukan dalam membedakan
karakteristik tanaman pada tingkat DNA. Penggunaan penanda molekuler
utamanya dilakukan untuk meminitor variasi pada susunan DNA didalam satu
spesies dan pada sejumlah spesies. Teknologi pada tingkat genetik ini menjadi
penting terkait dengan potensi utamanaya bagi pengembangan program
pemuliaan,
yaitu efektivitas
pengorganisasian plasma nutfah, pengujian
kemurnian genotipe atau klon dan perlindungan hak kekayaaan intelektual. Para
pemulia bisa melindungi genotipe temuannya tidak hanya teridentifikasi secara
morfologi namun juga secara genetika (Karp et al. 1997).
Analisis penanda molekuler menjadi penting karena karakter tanaman
pada dasarnya hasil interaksi antara faktor genetik dengan lingkungannya,
sehingga tanaman yang pada dasarnya masih satu jenis menjadi berbeda secara
fisik
karena
perbedaan
perlakuan
atau
lingkungan.
Salah
satu
cara
mengidentifikasi persamaan atau perbedaan jenis dibalik keragaman karakteristik
fisik adalah melihat variasi pada tingkat gen (Henry 1997).
Penanda Morfologi
Karakter morfologi tanaman adalah salah satu penanda yang sering
digunakan dalam mengidentifikasi keragaman tanaman. Penampilan morfologi
merupakan hasil dari interaksi antara genotipe dan lingkungan. Pemunculan
suatu fenotipe merupakan hasil ekspresi banyak gen melalui rangkaian proses
pengaturan yang kompleks, itu sebabnya keragaman dapat terjadi karena adanya
perbedaan lingkungan adaptasi (Allard 1960). Deskripsi durian unggul
menggambarkan karakter-karakter buah durian yang beragam. Tiap genotipe
memiliki deskripsi morfologi buah yang berbeda-beda (Dirjen Hort. 2008).
Penggunaan marka morfologi (berdasarkan pengamatan visual) dalam
tataran aplikasi lapangan mempermudah dalam mengidentifikasi suatu
genotipe tanaman, namun kadang sulit dilakukan untuk beberapa tanaman
yang memiliki kekerabatan dekat karena perbedaan karakter pada spesies yang
berkerabat dekat sangat sedikit, dan sangat dipengaruhi oleh lingkungan
sehingga mungkin akan menghasilkan informasi yang bias. Menurut
Poespodarsono (1988) karakter morfologi terdiri dari dua sifat yaitu kualitatif
11
dan kuantitatif. Sifat kualitatif dapat dibedakan secara tegas karena
dikendalikan oleh gen sederhana. Sedangkan sifat kuantitatif tidak dapat
dibedakan secara sederhana karena dikendalikan oleh banyak gen dan memiliki
distribusi kontinu. Kedua sifat tersebut saling mendukung dalam proses adaptasi
dan spesiasi suatu tanaman pada lingkungan tertentu.
Penanda Molekuler Inter Simple Sequence Repeats (ISSR)
Perkembangan teknik-teknik molekuler berdasarkan DNA merupakan salah
satu alat untuk menganalisis genom tanaman. Teknik ini berkembang karena dapat
mengurangi
keterbatasan sifat
dari
penanda
morfologi
yaitu rendahnya
polimorfisme, adanya pengaruh deleterious, pleiotropi dan epistasis (Weising et al.
2005). Sejak pertengahan 1980-an, identifikasi genom dan seleksi telah
berkembang pesat dengan bantuan teknologi PCR. Sejumlah besar protokol
penanda yang cepat dan membutuhkan hanya sedikit sampel DNA telah
dikembangkan. Tiga penanda berbasis PCR yang luas penggunaannya adalah
RAPD , SSR atau mikrosatelit, dan AFLP.
Setiap teknik penanda molekuler memiliki kekurangan dan kelebihan.
Penanda RAPD sangat cepat dan mudah dikembangkan karena sekuens primernya
bersifat acak, tetapi kurang reprodusibel (Virk et al. 1995). AFLP memiliki
reprodusibilitas yang sedang tetapi membutuhkan biaya operasional yang tinggi
(Karp et al. 1997). Mikrosatelit bersifat spesifik dan sangat polimorfik, namun
membutuhkan pengetahuan awal tentang sekuens genomik tanaman untuk
mendisain primer spesifiknya, sedangkan informasi sekuens genomik tanaman
terbatas hanya pada spesies yang bernilai ekonomi saja.
Pemilihan teknik penanda molekular bergantung pada reprodusibilitas dan
kesederhanaannya. Penanda terbaik untuk pemetaan genom, Marker Assisted
Selection (MAS), studi filogenik, dan konservasi tanaman harus menggunakan
biaya yang rendah dan tenaga kerja yang sedikit serta reliabilitasnya tinggi. Salah
satu penanda molekuler yang banyak digunakan sejak tahun 1994 (Zietkiewicz et
al. 1994) adalah ISSR, yang merupakan bagian mikrosatelite yang tidak mengkode
protein (non coding region).
12
Daerah mikrosatelit merupakan segmen DNA yang berulang yang dimiliki
oleh semua organism baik eukariot maupun prokariot. DNA repetitif paling
banyak ditemukan pada genom organisme eukariotik. Sekuens DNA berulang ini
merupakan sumber variasi di DNA kloroplas, mitokondria dan inti. Daerah ini
terdiri dari pengulangan daerah secara berpasangan dari beberapa nukleotida,
umumnya 2-6 nukleotida dengan perulangan mencapai ukuran sampai dengan 106
bp yang terdistribusi disepanjang genom dan terdapat pada genom eukariot
(Wolfe & Liston 1998). ISSR merupakan daerah di dalam DNA yang panjangnya
sangat bervariasi dalam suatu spesies yang sama (Salimath et al. 1995).
Karakteristik mikrosatelit sama di dalam genom seluruh organism, memiliki level
variasi alelik yang tinggi, bersifat kodominan, dan potensial untuk analisis yang
dapat diautomasi menjadikan daerah ini sebagai penanda molekuler yang unggul
(Trojanwska & Balibok 2004).
ISSR merupakan penanda semi acak yang diamplifikasi oleh PCR dengan
adanya satu primer yang komplementer terhadap suatu target mikrosatelit (Gambar
2). Penanda ini dikembangkan dari daerah di antara lokus mikrosatelit atau yang
disebut juga Single Sequence Repeat (SSR). Amplikasi daerah tersebut tidak
membutuhkan informasi sekuens genom dan menghasilkan pola multilokus dan
sangat polimorfik (Nagaoka & Ogihara 1997). Setiap pita mewakili sekuens DNA
yang dibatasi oleh dua mikrosatelit yang berbeda. Seperti halnya RAPD, penanda
ISSR cepat dan mudah dilakukan, namun memiliki reprodusibilitas seperti penanda
SSR karena primernya yang lebih panjang.
Gambar 2. Wilayah amplifikasi Inter Simple Sequence Repeats (ISSR).
(Zietkiewicz et al. 1994).
METODOLOGI
Waktu dan Tempat
Penelitian ini dilakukan mulai bulan September 2011 sampai Januari 2012
bertempat di Balai Pengkajian Teknologi Pertanian (BPTP), kebun koleksi
Cipaku Bogor dan Laboratorium Molekuler Pusat Kajian Hortikultura Tropika
(PKHT), Institut Pertanian Bogor (IPB).
Bahan dan Alat
Dalam penelitian ini digunakan 21 genotipe tanaman durian dari berbagai
daerah yang menjadi koleksi Balai Pengkajian Teknologi Pertanian (BPTP) Jawa
Barat di kebun Cipaku, Bogor (Tabel 1). Genotipe yang digunakan terdiri dari
varietas nasional (yang sudah dilepas) dan genotipe unggul daerah yang belum
dilepas.
Tabel 1. Nama genotipe tanaman durian koleksi Balai Pengkajian Teknologi
Pertanian (BPTP), kebun percobaan Cipaku dan daerah asalnya.
No
Nama genotipe Daerah asal
No
Nama genotipe
Daerah asal
1
Lokal cipaku
Bogor, Jabar
12
Pasir jati
Pasir jati, Jabar
2
Kendil
Brongkol, Jateng
13
Aseupan
Rancamaya, Jabar
3
Layung
Pandeglang, Jabar
14
Kim
Pandeglang, Jabar
4
Pangkalan
Kalbar
15
Tambleg
Ciapus, Jabar
5
Bulan
Ciawi, Jabar
16
Sunan
Boyolali, Jateng
6
Pingku
Bogor, Jabar
17
Sikoclak
Bogor, Jabar
7
Hepe
Jonggol, Jabar
18
Hejo
Bogor, Jabar
8
Tanjung mabah
Mabah, Kalbar
19
Perwira
Majalengka, Jabar
9
Kuning garing
Pandeglang, Jabar
20
Kanjau
Thailand
10
Semeng
Semeng, Kalbar
21
Manalagi
Malang, Jatim
11
Mentega
Kalbar
14
Bahan yang digunakan dalam pengamatan molekuler antara lain: pasir kuarsa,
merkaptoetanol, PVPP (polyvinylpolypyrrolidone), CTAB, aquades steril, CIAA
(Chloroform isoamylalcohol) (CIAA 24:1), alkohol absolute 70%, isopropanol,
agarose, air bebas ion, buffer TAE 1x, loading dye, PCR mix, Primer ISSR (10 primer),
ethidium bromide, tube 1.5 ml, tube 0.2µl, tip putih, tip kuning, tip biru dan kb ladder.
Alat-alat yang digunakan adalah mortal, micropipette, vortex, shaker,
freezer, centrifuge, waterbath, mesin PCR (Applied Biosystem 2720 thermal
cycler), bak elektroforesis, UV transluminator dan kamera digital.
Metode
a. Pengamatan Morfologi
Percobaan ini terdiri atas dua tahapan, Tahap pertama pemilihan tanaman
untuk analisis morfologi tanaman. Tanaman durian yang dipilih adalah tanaman
durian yang ditanam pada tahun 1996 - 2001. Dari beberapa tanaman durian yang
mewakili kultivar durian tertentu tersebut kemudian dipilih yang memiliki vigor
tinggi. Tahap kedua, tanaman durian terpilih kemudian diamati berdasarkan
karakter morfologi yang digambarkan dalam deskriptor. Pengamatan dilakukan
pada bulan September sampai dengan Desember 2011.
Contoh daun untuk analisis keragaman morfologi diambil secara acak
dalam 1 pohon induk durian pada cabang 1, 2 dan 3. Cabang terpilih adalah
cabang yang tidak ternaungi dan tidak terdapat serangan hama dan penyakit. Daun
contoh kemudian dipilih dalam satu ranting terpilih dimulai dari daun ke-tiga dan
diskor berdasarkan panduan descriptors for durian (Bioversity Internasional 2007).
Karakter yang diamati sebanyak 22 karaker meliputi karakter kualitatif sebanyak
14 karakter (karakter pohon, batang, dan daun) (Tabel 2) dan karakter kuantitatif
meliputi 8 karakter pengukuran (Tabel 3). Karakter pengamatan karakter daun
dari setiap genotipe kemudian ditabulasi. Hasil tabulasi yang memiliki nilai
dominan akan dijadikan sebagai karakter penciri untuk genotipe yang dievaluasi.
15
Tabel 2. Karakter pengamatan morfologi vegetatif sifat kualitatif pada 21 genotipe
tanaman durian di BPTP kebun percobaan Cipaku.
No
Penanda Morfologi Kualitatif
1.
Bentuk tajuk
2.
Habitus pertumbuhan batang
3.
Pola percabangan
4.
Tekstur kulit batang
5.
Warna daun
6.
Bentuk daun (BD)
7.
Bentuk ujung daun (BUD)
8.
Bentuk pangkal daun (BPD)
9.
Tekstur daun
10.
Peruratan daun atas
11.
Peruratan daun bawah
12.
Kerebahan daun
13.
Keadaan pinggir daun
14.
Keadaan permukaan daun
Kategori
Deskripsi
1.
2.
1.
2.
1.
2.
3.
4.
1.
2.
3.
1.
2.
3.
1.
2.
3.
1.
2.
3.
4.
5.
1.
2.
3.
1.
2.
1.
2.
1.
2.
1.
2.
1.
2.
3.
4.
1.
2.
Piramidal
Oblong
Lurus
Melilit
Erect
Semi-erect
Wide
Horizontal
Halus
Kasar
Mengelupas
Hijau muda
Hijau
Hijau tua
Obovate-lanceolate
Oval-oblong
Elliptic
Acuminate
Acuminate-acute
Cuspidate-acuminate
Acuminate-curve
Long acuminate
Obtuse
Acute
Cuneate-acute
Papery
Leathery
Jelas
Tidak Jelas
Menonjol
Tidak menonjol
Rebah 45o
Down vertically
Lengkung keluar
Keatas (V)
Datar
Lengkung kedalam (U)
Rata
Bergelombang
Sumber : Descriptors for durian (Bioversity International 2007).
16
Tabel 3. Karakter pengamatan morfologi vegetatif sifat kuantitatif pada 21 genotipe
tanaman durian di BPTP kebun percobaan Cipaku.
No
Penanda Morfologi Kuantitatif
1.
Panjang daun (cm)
2.
Lebar daun (cm)
3.
Panjang tangkai daun (cm)
4.
Panjang ujung daun (cm)
5.
Diameter tangkai besar daun (cm)
6.
Diameter tangkai kecil daun (cm)
7.
Kerapatan daun ( panjang
rangkaian daun (cm) / jumlah
daun (buah))
Jumlah vena primer (buah)
8.
Kategori
Deskripsi
1.
2.
3.
1.
2.
3.
1.
2.
3.
1.
2.
3.
1.
2.
3.
1.
2.
3.
1.
2.
3.
1.
2.
3.
14.06 ≤ PD < 14.85
14.85 ≤ PD < 15.82
15.82 ≤ PD
4.7 ≤ LD < 5.33
5.33 ≤ LD < 6.01
6.01 ≤ LD
1.75 ≤ PTD < 1.77
1.77 ≤ PTD < 1.83
1.83 ≤ PTD
1.25 ≤ PUD < 1.33
1.33 ≤ PUD < 1.52
1.52 ≤ PUD
0.284 ≤ DTB < 0.314
0.314 ≤ DTB < 0.35
0.35 ≤ DTB
0.191 ≤ DTK < 0.204
0.204 ≤ DTK < 0.212
0.212 ≤ DTK
1.78 ≤ KD < 1.97
1.97 ≤ KD < 2.25
2.25 ≤ KD
TD > 14
12 ≤ TD < 14
11 ≥ TD < 12
Panjang ujung daun
Lebar daun atas
Lebar daun tengah
Panjang daun
Panjang petiole
Lebar daun bawah
Sudut pusat daun
Lebar petiole tebal dan kecil
Gambar 3. Skematik pengukuran karakter kuantitatif daun durian (RIRDC 2009).
17
b. Pengamatan Molekuler
Tahapan pengerjaan molekuler meliputi dua kegiatan utama yaitu isolasi
DNA dan analisis ISSR. Persiapan template DNA dilakukan dengan
mengekstraksi DNA dari daun tanaman durian dilakukan pada bulan September November 2011. Analisis ISSR dilakukan selama bulan November 2011 - Januari
2012 dengan mengamplifikasi template DNA melalui mesin PCR. Seluruh
kegiatan tersebut, termasuk kegiatan elektroforesis, visualisasi dan dokumentasi
dilaksanakan di laboratorium PKHT.
Isolasi DNA
Prosedur isolasi DNA durian mengikuti metode CTAB (Lian et al. 2006)
yang meliputi 4 tahapan utama yakni pengambilan sampel daun dan ekstraksi,
pemurnian, presipitasi pelet DNA, dan uji kualitas DNA.
a. Pengambilan sampel daun dan ekstraksi
Daun durian diketahui banyak mengandung fenolik, sehingga waktu
pengambilan dan pemilihan daun untuk analisis DNA harus diperhatikan. Untuk
menghindari DNA berwarna kekuningan, daun yang diambil dan waktu
pengambilan daun menjadi sangat penting. Daun yang diambil sebaiknya bukan
daun yang muda karena akan menghasilkan banyak lendir saat dilakukan isolasi
DNA, oleh karena itu daun tua lebih baik. Namun kendala yang sering muncul
pada daun tua banyak terjadi fenolik untuk itu waktu pengambilan daun dilakukan
diwaktu pagi hari sebelum matahari bersinar terik dan saat pengangkutan, daun
diusahakan tidak terpapar panas sehingga daun tidak mengalami pencoklatan.
Sampel daun yang belum digunakan kemudian disimpan di dalam deep freezer
agar tidak rusak.
Sampel daun dari masing-masing bahan tanaman digerus menggunakan
mortar dengan penambahan buffer ekstraksi (CTAB 10%; EDTA 0.5 M (pH
8.0); Tris-HCl 1 M (pH 8.0); NaCl 5 M; β-mercaptoetanol 1%), PVPP dan pasir
kuarsa. Hasil gerusan dimasukkan dalam tabung steril ukuran 1.5 ml, Kemudian
ditutup rapat, diinkubasi dalam waterbath pada suhu 65oC selama 30 menit.
Setelah diangkat sample didinginkan beberapa menit sebelum dituangkan
18
larutan chloroform : isoamyl-alcohol. Larutan
chloroform : isoamyl-alcohol
digunakan untuk presipitasi protein yang telah didenaturasi. Tujuannya agar
protein terpisah dari larutan buffer yang mengandung DNA.
b. Pemurnian
Buffer pemurnian 1x volume berupa campuran chloroform : isoamylalcohol
(CIAA) dengan perbandingan 24:1 v/v ditambahkan ke dalam sampel setelah tube
diangkat dari waterbath dan suhunya telah turun, lalu divortex perlahan-lahan
(sekitar 6-8 rpm) selama 1 menit. Sampel kemudian disentrifugasi dengan
kecepatan 10 000 rpm selama 10 menit dengan tujuan memisahkan bagian DNA
dan bahan-bahan lainnya. Pemisahan fraksi di dalam campuran dilakukan dengan
mengambil supernatant dan memindahkannya ke dalam tube steril baru. Proses
pemurnian kemudian kembali dilakukan dengan penambahan CIAA 1x volume,
di vortex selama 1 menit dan disentrifugasi pada 10 000 rpm selama 10 menit.
c. Presipitasi
Supernatant dari hasil pemurnian dipindahkan ke tube steril baru ukuran 1.5
ml, ditambahkan isopropanol (dingin) 1x volume, kemudian dikocok perlahan dan
diinkubasi dalam 4oC selama 30 menit sehingga terbentuk gumpalan yang
berbentuk seperti lendir. Larutan DNA tersebut disentrifugasi kembali dan larutan
dibuang hingga pelet DNA tertinggal diujung tube. Pelet kemudian dicuci dengan
100 µl ethanol 70% dan disentrifugasi kembali, kemudian dikering anginkan selama
6 jam sampai pelet kering. Selanjutnya pelet dilarutkan dalam 100 µl TE (1 M
Tris-HCl (pH 8,0); 0,5 M EDTA (pH 8,0); air bebas ion).
d. Uji kualitas DNA
Kualitas DNA total diuji dengan menggunakan gel agarose 0.8% dan
dielektroforesis dalam larutan buffer TAE 1x yang dialirkan arus listrik dari muatan
negatif menuju muatan positif selama 47 menit pada tegangan 50 volt. Konsentrasi
5 µl DNA total kemudian dibandingkan dengan 1 µl lamda DNA (Promega) yang
dielektroforesis bersama dengan konsentrasi 254 µg/ml, sehingga untuk setiap 1 µl
DNA total setara dengan 91.4 ng/ µl. Pewarnaan dilakukan dengan cara
19
perendaman gel agarose dalam larutan EtBr 1% selama 15 menit, kemudian
didokumentasikan menggunakan kamera digital canon power shoot A480 di bawah
penyinaran UV transulliminator.
Polymerase Chain Reaction (PCR)
Amplifikasi dilakukan dengan alat PCR merk Applied Biosystem 2720
thermal cycler. Primer yang digunakan adalah primer Inter Simple Sequence
Repeat (ISSR) koleksi Laboratorium Pusat Kajian Hortikultura Tropika IPB
sebanyak 10 primer (Tabel 4) yang telah dioptimalisasi.
Komposisi PCR yang digunakan dalam proses PCR meliputi DNA template,
primer ISSR, PCR mix go tag green master Promega dan nuclease free water. Komposisi PCR meliputi : DNA 10 ng/µl, primer 10 pmol/µl, PCR mix 12.5 μl, kemudian
ditambahkan air bebas ion hingga mencapai volume 25 μl. Tahapan PCR meliputi pre
heat, denaturation, annealing, extension, dan pendinginan (Tabel 5).
Tabel 4. Nama dan susunan basa primer ISSR koleksi PKHT-IPB.
No.
1
2
3
ANALISIS KERAGAMAN BEBERAPA GENOTIPE DURIAN
(Durio zibethinus Murr.) MENGGUNAKAN PENANDA
MORFOLOGI DAN MOLEKULER (ISSR)
KARLINA SYAHRUDDIN
SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2012
PERNYATAAN MENGENAI TESIS DAN
SUMBER INFORMASINYA
Dengan ini saya menyatakan bahwa tesis yang berjudul Analisis
Keragaman Beberapa Genotipe Durian (Durio zibethinus Murr.) menggunakan
Penanda Morfologi dan Molekuler (ISSR) adalah karya saya dengan arahan dari
komisi pembimbing dan belum diajukan dalam bentuk apa pun kepada perguruan
tinggi mana pun. Sumber informasi yang berasal atau kutipan dari karya yang
diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks
dan dicantumkan dalam daftar pustaka di bagian akhir tesis ini.
Bogor, Juli 2012
Karlina syahruddin
NIM A.253090151
ABSTRACT
KARLINA SYAHRUDDIN. Variability Analysis of Several Genotipes of Durian
(Durio zibethinus Murr.) using Morphological and Molecular (ISSR) Markers. Under
guidance by SOBIR and NURUL KHUMAIDA.
Indonesia is one of the durian diversity center. Evaluation and
characterization activities should be conducted to identify the genotipes in order
to differentiate the individual plant in the spesies. Genetic variation of 21
collected genotipes of Indonesia Agency for Agricultural Research and
Development (IAARD) Cipaku orchard, Bogor was evaluated using
morphological and Inter Simple Sequence Repeat (ISSR) markers. Variability
analysis based on 22 morphological characters gained 64 (100%) polymorphism.
Molecular analysis using ten primers of ISSR amplified 48 locus. The 39 locus
(81.25%) were polymorphic and the 9 locus (18.75%) were monomorphic,
respectively. Both of the markers have different clustering, therefore they should
be analysed using Joint Analysis. The result of the study showed genetic
variability among 21 genotipes was grouped into 2 clusters on 0.51 similarity
coefficient. The first group (A) consisted of the genotipe from Indonesia and the
second group (B) consisted of Kanjau genotipe from Thailand with matrix
correlation value was 0.83. Kanjau genotipe was suggested as a candidate in
durian breeding programme, in order to increase Indonesian durian value in the
future.
Keywords : Durio zibethinus, Joint Analysis, genetic variation, Kanjau
RINGKASAN
KARLINA SYAHRUDDIN. Analisis Keragaman Beberapa Genotipe Durian
(Durio zibethinus Murr.) menggunakan Penanda Morfologi dan Molekuler
(ISSR). Dibimbing oleh SOBIR dan NURUL KHUMAIDA.
Indonesia merupakan pusat keragaman tanaman durian dengan sejumlah
besar sumber daya genetik yang belum banyak dimanfaatkan. Salah satu
pemanfaatan tanaman durian adalah dengan program pemuliaan dalam rangka
perbaikan genetik tanaman durian yang sangat bergantung pada sumber
keragaman genetik durian itu sendiri. Oleh karena itu koleksi plasma nutfah
durian Balai Pengkajian Teknologi Pertanian (BPTP), Kebun Percobaan Cipaku,
perlu dievaluasi keragaman genetiknya untuk kegiatan manipulasi genetik ke
arah perakitan kultivar unggul yang diinginkan. Kendala yang diperoleh dengan
hanya mengandalkan keragaman morfologi adalah terbatasnya karakter yang
diamati dan sangat bergantung pada lingkungan, oleh karena itu diperlukan alat
bantu yang lain yaitu dengan metode molekuler. Metode analisis molekuler
yang banyak digunakan saat ini adalah yang berbasis PCR. Salah satu penanda
yang dapat digunakan dengan metode tersebut yaitu penanda ISSR. Diharapkan
dengan kombinasi kedua penanda tersebut akan menghasilkan data yang lebih
akurat dalam mencari besar nilai keragaman dan pola hubungan genetik diantara
21 genotipe durian.
Karakter morfologi yang dapat diamati pada 21 genotipe yang diuji
adalah sebanyak 22 karakter. Berdasarkan karakter tersebut diperoleh 64 sub
karakter polimorfik (100%). Hasil analisis pengelompokan diperoleh koefisien
kemiripan genetik sebesar 0.34 hingga 0.83 dengan besar nilai keragaman
berkisar 7 hingga 66%. Hasil penelitian ini mengelompokkan 21 genotipe
durian dalam 2 kelompok pada koefisien kemiripan 0.34 yaitu kelompok A
meliputi Lokal cipaku, Layung, Tambleg, Kendil, Hepe, Sikoclak, Manalagi,
Pangkalan, Pingku, Pasirjati, Perwira, Mentega, Bulan, Tanjung mabah, Kuning
garing, Hejo, Aseupan, Semeng, Sunan dan kelompok B meliputi Kim dan
Kanjau. Pengelompokan terpisah berdasarkan perbedaan karakter bentuk ujung
daun, keadaan pinggir daun, keadaan permukaan daun dan warna daun.
Hasil amplifikasi DNA 21 genotipe durian dengan menggunakan 10
primer menghasilkan 659 pita DNA, dengan 48 lokus yang terdiri dari pola pita
polimorfik sebanyak 39 lokus dengan 470 pita atau sebesar 81.25 % dan pita
monomorfik sebanyak 9 lokus dengan 189 pita atau sebesar 18.75 %. Koefisien
kemiripan genetik 21 genotipe dari sepuluh primer ISSR berkisar antara 0.680.92, yang berarti keragaman genetik berkisar 8 sampai 32 %. Berdasarkan hasil
analisis pengelompokan diperoleh 2 kelompok pada koefisien kemiripan 0.68,
yaitu kelompok genotipe Indonesia dan genotipe Kanjau (Thailand).
Penggabungan data penanda morfologi dan molekuler, dapat
memberikan informasi baik secara fenotipik maupun genetik. Koefisien
kemiripan genetik 21 genotipe durian berdasarkan gabungan data morfologi molekuler (ISSR) berkisar antara 0.51 - 0.84 yang menunjukkan keragaman
genetik berkisar 16 - 49%. Hasil Analisis pengelompokan memisahkan 21
genotipe durian pada koefisien kemiripan 0.51 menjadi dua kelompok yaitu
v
kelompok A meliputi genotipe durian dari Indonesia meliputi Lokal cipaku,
Layung, Tambleg, Kendil, Hepe, Sikoclak, Manalagi, Pangkalan, Pingku, Pasirjati,
Perwira, Mentega, Bulan, Tanjung mabah, Kuning garing, Hejo, Aseupan, Semeng,
Sunan, Kim dan kelompok B meliputi dan Kanjau dari Thailand. Durian genotipe
Kanjau merupakan genotipe potensial untuk dijadikan tetua persilangan untuk
menghasilkan durian dengan karakter yang sesuai dengan kebutuhan pasar.
Kata kunci : Durio zibethinus, analisis gabungan, variasi genetik, Kanjau.
© Hak Cipta milik IPB, tahun 2012
Hak Cipta dilindungi Undang-undang
Dilarang mengutip sebagian atau seluruh karya tulis ini tanpa
mencantumkan atau menyebutkan sumbernya. Pengutipan hanya untuk
kepentingan pendidikan, penelitian, penulisan karya ilmiah, penyusunan
laporan, penulisan kritik, atau tinjauan suatu masalah dan pengutipan
tersebut tidak merugikan kepentingan yang wajar IPB
Dilarang mengumumkan dan memperbanyak sebagian atau seluruh karya
tulis dalam bentuk apa pun tanpa izin IPB
ANALISIS KERAGAMAN BEBERAPA GENOTIPE DURIAN
(Durio zibethinus Murr.) MENGGUNAKAN PENANDA
MORFOLOGI DAN MOLEKULER (ISSR)
KARLINA SYAHRUDDIN
Tesis
sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
Magister Sains pada
Mayor Pemuliaan dan Bioteknologi Tanaman
SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2012
Judul Tesis : Analisis Keragaman Beberapa Genotipe Durian (Durio zibethinus
Murr.) Menggunakan Penanda Morfologi dan Molekuler (ISSR).
Nama
: Karlina Syahruddin
NIM
: A.253090151
Disetujui
Komisi Pembimbing
Dr. Ir. Sobir, MSi
Ketua
Dr. Ir. Nurul Khumaida, MSi
Anggota
Diketahui
Ketua Mayor
Pemuliaan dan Bioteknologi Tanaman
Dekan Sekolah Pascasarjana
Dr. Ir .Trikoesoemaningtyas, MSc
Dr. Ir. Dahrul Syah, MSc. Agr
Tanggal Sidang :
Tanggal Lulus :
ix
Penguji Luar Komisi pada Ujian Tesis : Dr. Desta Wirnas, SP. MS
PRAKATA
Puji dan syukur penulis panjatkan kepada Allah SWT atas segala
karunia-Nya sehingga karya ilmiah ini berhasil diselesaikan. Judul penelitian
adalah Analisis Keragaman Beberapa Genotipe Durian (Durio zibethinus
Murr.) menggunakan Penanda Morfologi dan Molekuler (ISSR). Penelitian
dilaksanakan sejak bulan Agustus 2011 sampai dengan Januari 2011.
Ucapan terimakasih dan penghargaan yang setinggi-tingginya
penulis sampaikan kepada :
1. Dr. Ir. Sobir, MSi dan Dr. Ir. Nurul Khumaida, MSi selaku komisi
pembimbing yang telah memberikan arahan dan bimbingan sejak
perencanaan, pelaksanaan sampai penyelesaian penyusunan tesis.
2. Dr. Ir. Trikoesoemaningtyas, MSc selaku ketua Mayor Pemuliaan dan
Bioteknologi Tanaman SPs IPB dan Dr. Ir. Darda Efendi, MSi selaku
Sekretaris Mayor Pemuliaan dan Bioteknologi Tanaman SPs IPB.
3. Pusat Kajian Hortikultura Tropika IPB, yang telah memberikan izin
kepada penulis untuk melakukan penelitian di Laboratorium Molekuler.
4. Balai Pengkajian dan Pengembangan Teknologi Pertanian Bogor, Kebun
Percobaan Cipaku, yang telah memberikan izin kepada penulis untuk
melakukan penelitian morfologi.
5. Dr. Desta Wirnas, SP MSi selaku penguji luar komisi pembimbing.
6. Prof. Dr. Ir. Sudarsono, MSc yang meluangkan waktu untuk berdiskusi.
7. Bapak dan Ibu, kakak (Rika Fitriani, Silvana, Soraya, Fatah,
Jamaluddin), Adik (Sadly, Dian, Rian, Sofyan, Bella dan Devi) serta
seluruh keluarga besar atas restu dan doanya.
8. Erni seminar SP MSi, Dr. Wierny, Dr. Sumadi yang telah mendukung
penulis untuk melanjutkan studi.
9. Sulassih SP MSi, Rahmah Badaruddin, Dede safitri setiawan, Siti
Halimah, Amin Nur, Yusra, Nur Arifin, Vina, Vitri, Erwin, Ernila, Ina
Rahmawati, Sofie, Kristiana, Sulaiman, Cory, Sri Imriani Pulungan, Ira
Bahari, Ipit, Devina, Dina, Putri, Reni, Deden, Selvy, Ade Andry atas
kebersamaannya selama ini.
xi
10. Dosen-dosen mayor Pemuliaan dan Bioteknologi Tanaman atas ilmu dan
dukungannya.
11. Teman-teman di Faperta IPB atas doa dan dukungannya.
12. Teman-teman Mayor AGH, PBT 2008, 2009 dan 2010 atas
kebersamaannya.
13. Teman-teman Pondok Rizky atas doa dan kebersamaannya.
14. Adeel Abdulkarim Fadhl Altuhish atas dorongan dan motivasinya
selama penulis menyelesaikan penulisan tesis.
15. Teman-teman yang tidak bisa penulis sebutkan namanya satu-satu.
Terimakasih atas dukungan dan cintanya.
Semoga karya ilmiah ini dapat bermanfaat bagi pengembangan ilmu
pengetahuan dan ilmu pertanian masa depan.
Bogor, Juli 2012
Karlina Syahruddin
RIWAYAT HIDUP
Penulis dilahirkan di Makassar, 7 November 1983 dari pasangan
Alm. Bapak Syahruddin dan Ibu Nurmiaty Norma. Penulis adalah anak ke
empat dari sepuluh bersaudara. Tahun 2002 penulis lulus dari SMA Negeri
1 Makassar dan pada tahun yang sama penulis melanjutkan studi pada
program sarjana Agronomi, Teknologi Benih Fakultas Pertanian UNPAD.
Penulis berkesempatan melanjutkan pendidikan Program Magister Sains
pada Mayor Pemuliaan dan Bioteknologi Tanaman, Sekolah Pascasarjana
IPB pada tahun 2009.
DAFTAR ISI
Halaman
DAFTAR TABEL ........................................................................................
xiv
DAFTAR GAMBAR ...................................................................................
xv
DAFTAR LAMPIRAN ................................................................................
xvi
PENDAHULUAN
Latar Belakang ....................................................................................
1
Tujuan .................................................................................................
3
Kerangka Pemikiran ............................................................................
4
TINJAUAN PUSTAKA
Sejarah penyebaran, taksonomi dan botani tanaman durian ...............
7
Analisis keragaman genetik tanaman durian ......................................
9
Penanda Morfologi ..............................................................................
10
Penanda Molekuler Inter Simple Sequence Repeats (ISSR) ...............
11
METODOLOGI
Waktu dan Tempat ..............................................................................
13
Bahan dan Alat ....................................................................................
13
Metode ................................................................................................
14
Analisis Data .......................................................................................
20
HASIL DAN PEMBAHASAN
Keragaman Karakter Morfologi ..........................................................
23
Analisis Penanda Morfologi ...............................................................
23
Analisis Penanda Molekuler ...............................................................
37
Analisis Gabungan Penanda Morfologi dan Molekuler (ISSR)..........
47
SIMPULAN DAN SARAN
Simpulan .............................................................................................
51
Saran ...................................................................................................
51
DAFTAR PUSTAKA ..................................................................................
53
LAMPIRAN .................................................................................................
57
DAFTAR TABEL
Halaman
1. Nama genotipe tanaman durian koleksi Balai Pengkajian Teknologi
Pertanian (BPTP), kebun percobaan Cipaku dan daerah asalnya ........
13
2. Karakter pengamatan morfologi vegetatif sifat kualitatif pada 21
genotipe tanaman durian di BPTP kebun percobaan Cipaku...............
15
3. Karakter pengamatan morfologi vegetatif sifat kuantitatif pada 21
genotipe tanaman durian di BPTP kebun percobaan Cipaku...............
16
4. Nama dan susunan basa primer ISSR koleksi PKHT-IPB........................
19
5. Suhu dan waktu yang digunakan pada proses Polymerase Chain
Reaction ..............................................................................................
19
6. Keragaan primer dan lokus pada penanda molekuler ..........................
20
7. Karakter morfologi vegetatif sifat kualitatif dan proporsi subkarakternya
yang ditunjukkan pada 21 genotipe tanaman durian koleksi BPTP kebun
percobaan Cipaku ......................................................................................... 24
8. Proporsi karakter daun yang muncul pada 21 genotipe tanaman durian
yang diamati di BPTP kebun percobaan Cipaku ................................. 27
9. Karakter morfologi vegetatif sifat kuantitatif dan proporsi subkarakter
yang ditunjukkan pada 21 genotipe tanaman durian koleksi BPTP
kebun percobaan Cipaku ..................................................................... 31
10. Rekapitulasi karakter polimorfik penanda morfologi pada 21 genotipe
tanaman durian .....................................................................................
34
11. Hasil amplifikasi sepuluh primer ISSR pada 21 genotipe tanaman
durian....................................................................................................
38
DAFTAR GAMBAR
Halaman
1. Bagan alur penelitian analisis keragaman durian koleksi Balai
Pengkajian Teknologi Pertanian, kebun Percobaan Cipaku
berdasarkan penanda morfologi dan molekuler (ISSR). .....................
5
2. Wilayah amplifikasi Inter Simple Sequence Repeats (ISSR) ...........
12
3. Skematik pengukuran karakter kuantitatif daun durian ......................
16
4. Keragaan pinggir daun pada tanaman durian ......................................
26
5. Keragaan bentuk daun durian genotipe Kanjau ...................................
29
6. Dendogram koefisien kemiripan 21 genotipe tanaman durian
berdasarkan karakter morfologi vegetatif sifat kualitatif. ...................
32
7. Dendogram koefisien kemiripan 21 genotipe tanaman durian
berdasarkan karakter morfologi vegetative sifat kuantitatif ...............
33
8. Dendogram koefisien kemiripan 21 genotipe tanaman durian
berdasarkan karakter morfologi vegetatif ...........................................
35
9. Karakter daun pada genotipe durian Kim (A) dan Kanjau (B). ..........
36
10. Profil pita DNA yang dibentuk pada primer PKBT 4. ........................
41
11. Profil pita DNA yang dibentuk pada primer PKBT 10 .......................
40
12. Profil pita DNA yang dibentuk pada primer PKBT 9 .........................
40
13. Profil pita DNA yang dibentuk pada primer PKBT 12.......................
41
14. Perbedaan pola pita DNA genotipe kanjau dan genotipe Indonesia ...
43
15. Dendogram 21 genotipe tanaman durian berdasarkan profil pita
DNA ....................................................................................................
46
16. Dendogram 21 genotipe tanaman durian berdasarkan data gabungan
morfologi- molekuler (ISSR) ..............................................................
48
DAFTAR LAMPIRAN
Halaman
1. Koefisien kemiripan pada 21 genotipe tanaman durian berdasarkan
penanda morfologi vegetatif sifat kualitatif ........................................
57
2. Koefisien kemiripan pada 21 genotipe tanaman durian berdasarkan
penanda morfologi vegetatif sifat kuantitatif ......................................
58
3. Koefisien kemiripan pada 21 genotipe tanaman durian berdasarkan
penanda morfologi vegetatif ...............................................................
59
4. Koefisien kemiripan pada 21 genotipe tanaman durian berdasarkan
penanda molekuler (ISSR) ..................................................................
60
5. Koefisien kemiripan pada 21 genotipe tanaman durian berdasarkan
penanda gabungan ...............................................................................
61
6. Deskripsi morfologi vegetatif durian Lokal cipaku ............................
62
7. Deskripsi morfologi vegetatif durian Kendil ......................................
63
8. Deskripsi morfologi vegetatif durian Layung .....................................
64
9. Deskripsi morfologi vegetatif durian Pangkalan ................................
65
10. Deskripsi morfologi vegetatif durian Bulan........................................
66
11. Deskripsi morfologi vegetatif durian Pingku ......................................
67
12. Deskripsi morfologi vegetatif durian Hepe .........................................
68
13. Deskripsi morfologi vegetatif durian Tanjung mabah ........................
69
14. Deskripsi morfologi vegetatif durian Kuning garing ..........................
70
15. Deskripsi morfologi vegetatif durian Semeng ....................................
71
16. Deskripsi morfologi vegetatif durian Mentega ...................................
72
17. Deskripsi morfologi vegetatif durian Pasirjati ....................................
73
18. Deskripsi morfologi vegetatif durian Aseupan ...................................
74
19. Deskripsi morfologi vegetatif durian Kim ..........................................
75
20. Deskripsi morfologi vegetatif durian Tambleg ...................................
76
xvii
21. Deskripsi morfologi vegetatif durian Sunan .............................................. 77
22. Deskripsi morfologi vegetatif durian Sikoclak .......................................... 78
23. Deskripsi morfologi vegetatif durian Hejo ................................................ 79
24. Deskripsi morfologi vegetatif durian Perwira ............................................ 80
25. Deskripsi morfologi vegetatif durian Kanjau............................................. 81
26. Deskripsi morfologi vegetatif durian Manalagi ......................................... 82
PENDAHULUAN
Latar Belakang
Indonesia merupakan salah satu negara dengan kekayaan hayati yang
tinggi di dunia. Salah satu kekayaan hayati tersebut adalah tanaman durian.
Indonesia merupakan pusat keragaman tanaman durian, dimana 19 spesies
ditemukan di Kalimantan, 14 spesies diantaranya adalah endemik Kalimantan dan
7 spesies ditemukan di Sumatra (Subhadrabandhu S & Ketsa 2001). Enam spesies
dari 26 spesies Durio tersebut, merupakan spesies yang dapat dikonsumsi, namun
hanya Durio zibethinus Murr. yang banyak dikembangkan karena memiliki aroma
dan rasa yang khas. D. zibethinus ini kemudian tersebar ke seluruh wilayah
Indonesia dan berkembang menjadi genotipe-genotipe spesifik wilayah.
Program pemuliaan tanaman dalam rangka menghasilkan varietas unggul
untuk memenuhi kebutuhan pasar bergantung pada besarnya keragaman genetik yang
tersedia. Program multivarietas yang dicanangkan oleh pemerintah merupakan suatu
kegiatan eksplorasi dengan mencari plasma nutfah dari wilayah dimana terdapat
keragaman genetik yang tinggi yaitu tempat asal berkembangnya spesies tanaman
tertentu (center of origin) atau dari wilayah di mana tanaman tersebut dibudidayakan
secara intensif (center of diversity). Upaya pengkayaan plasma nutfah kemudian
dengan melakukan kegiatan koleksi, domestikasi dan introduksi (Baihaki et al. 1999).
Kegiatan koleksi bertujuan
untuk mengumpulkan plasma nutfah dengan
memanfaatkan variasi yang ada di alam. Koleksi plasma nutfah juga bertujuan untuk
mempelajari tingkat keragaman yang ada dengan kegiatan karakterisasi serta untuk
tujuan konservasi atau penyelamatan keragaman genetik (Syukur et al. 2009).
Menurut Seetharam & Prasad (1989), fungsi plasma nutfah tergantung pada
dua faktor : (1) evaluasi dan karakterisasi dan (2) identifikasi sumber gen yang
berguna. Oleh karena itu, koleksi plasma nutfah yang ada perlu dievaluasi keragaman
genetiknya untuk kegiatan pemuliaan yaitu mengidentifkasi karakter-karakter unggul
yang dimiliki tanaman.
Identifikasi keragaman dari tanaman durian yang dikoleksi penting untuk
dilaksanakan mengingat tanaman-tanaman tersebut membutuhkan identifikasi
yang tepat agar dapat membedakan individu dalam spesies. Data hasil identifikasi
dapat digunakan sebagai dasar dalam seleksi genotipe unggul. Ketersediaan
2
informasi mengenai keragaman jenis atau sumber plasma nutfah akan
menjadikan program pemuliaan lebih terarah sehingga dapat menghasilkan
genotipe unggul yang diinginkan.
Pendekatan untuk mempelajari keragaman genetik pada tanaman dapat
dilakukan melalui penggunaan penanda (marker) tertentu seperti penanda
morfologi, kimiawi dan molekuler (DNA). Menurut Asiedu et al. (1989) penanda
adalah karakter yang dapat diturunkan dan berasosiasi dengan genotipe tertentu.
Penanda morfologi dikembangkan dari karakteristik tanaman yang dapat
dibedakan satu sama lain dan terlihat secara langsung seperti bentuk pohon,
batang, daun, bunga dan buah. Pengembangan metode karakterisasi tanaman
durian ini telah diatur oleh International Plant Genetic Resources Institute
(IPGRI) (Bioversity International 2007).
Penggunaan penanda morfologi terkadang sulit dilakukan untuk
beberapa tanaman yang memiliki kekerabatan dekat sehingga sangat sedikit
penanda yang bisa didapatkan dari sifat morfologi. Penanda morfologi juga
bersifat kompleks karena merupakan hasil interaksi antara genotipe dan
lingkungan. Hal ini menyebabkan kesulitan dalam membedakan antara
karakter yang dibawa secara genetik atau hasil adaptasi terhadap lingkungan.
Di samping itu, pengamatan karakter bunga dan buah sering terkendala oleh
musim dan lingkungan. Kendala tersebut dapat diatasi dengan penggunaan
penanda molekuler yang berbasis DNA.
Penanda molekuler telah digunakan untuk menunjukkan bahwa gen-gen
dapat berkontribusi pada proses spesiasi organisme (Karp et al. 1997). Teknik
penanda molekuler telah banyak tersedia saat ini. Pendekatan berbasis Polymerase
Chain Reaction (PCR) banyak digunakan karena sederhana dan hanya
membutuhkan sedikit sampel DNA. Inter Simple Sequence Repeat (ISSR) adalah
salah satu penanda yang banyak digunakan saat ini. Penanda ISSR merupakan
penanda multilokus acak yang dihasilkan oleh amplifikasi PCR dengan primer
mikrosatelit (Zietkiewicz et al. 1994). Penanda ISSR dapat bersifat dominan dan
untuk beberapa kasus dapat bersifat kodominan (Reddy et all. 2001). ISSR
menguntungkan karena tidak memerlukan informasi genomik tanaman yang akan
dianalisis dan lebih sensitif dalam mendeteksi diversitas genetik pada tingkat yang
3
rendah. Selain itu, ISSR relatif lebih mudah dan sama ekonomisnya dengan RAPD
(Bradford 2008). Penanda ISSR juga berguna dalam mempelajari hubungan
interspesifik dan intraspesifik pada tanaman berkerabat.
Karekterisasi merupakan tahap awal dan sangat penting dalam menunjang
keberhasilan program pemuliaan selanjutnya. Karakterisasi berdasarkan morfologi
dan DNA bertujuan menemukan karakter-karakter spesifik dan unggul dari
tanaman serta dapat berfungsi sebagai DNA fingerprinting. Penelitian ini penting
dilaksanakan karena masih terbatasnya informasi mengenai keragaman genetik
tanaman durian, terutama tanaman durian yang telah dikoleksi oleh BPTP di
kebun percobaan Cipaku.
Tujuan
Secara umum penelitian ini bertujuan untuk mendapatkan informasi tentang
keragaman genetik tanaman durian koleksi Balai Pengkajian Teknologi Pertanian
(BPTP) di kebun percobaan Cipaku Jawa Barat, Departemen Pertanian.
Secara khusus penelitian ini bertujuan untuk :
1.
Mengidentifikasi
keragaman 21 genotipe tanaman durian berdasarkan
penanda morfologi stadia vegetatif.
2.
Mengidentifikasi keragaman 21 genotipe tanaman durian berdasarkan
penanda ISSR.
3.
Mengidentifikasi keragaman 21 genotipe tanaman durian berdasarkan data
gabungan penanda morfologi dan penanda ISSR
4
Kerangka Pemikiran
Indonesia memiliki sejumlah besar sumber daya genetik tanaman
durian, namun belum banyak dimanfaatkan. Salah satu pemanfaatan sumber
daya genetik tanaman durian adalah dengan program pemuliaan dalam rangka
perbaikan genetik tanaman durian yang sangat bergantung pada besarnya
sumber keragaman genetik durian itu sendiri. Oleh karena itu koleksi plasma
nutfah durian yang ada di Cipaku, perlu dievaluasi keragaman genetiknya
untuk kegiatan manipulasi genetik ke arah perakitan kultivar unggul yang
diinginkan. Kendala yang diperoleh dengan hanya mengandalkan keragaman
morfologi adalah terbatasnya karakter yang diamati dan sangat bergantung
pada lingkungan, oleh karena itu diperlukan alat bantu yang lain yaitu dengan
molekuler. Metode analisis molekuler yang banyak digunakan saat ini adalah
yang berbasis PCR. Salah satu penanda yang dapat digunakan dengan metode
tersebut yaitu penanda ISSR, yang merupakan penanda multilokus acak.
Kombinasi kedua penanda morfologi dan molekuler akan menghasilkan data
yang lebih akurat dalam mencari besar nilai keragaman dan pola hubungan
genetik di antara 21 genotipe durian. Berdasarkan latar belakang di atas,
maka disusun serangkaian percobaan identifikasi morfologi dan analisis
molekuler durian koleksi kebun Cipaku, Bogor. Hasil penelitian ditujukan
untuk mendapatkan karakter spesifik atau pembeda morfologi dan molekuler
pada durian lokal dan introduksi. Informasi mengenai tingkat keragaman
plasma nutfah durian di Cipaku dapat digunakan dalam pelestarian plasma
nutfah yang akan membantu program pemuliaan tanaman dan pengembangan
durian di wilayah Cipaku pada khususnya dan Indonesia pada umumnya.
Adapun alur pemikiran penelitian adalah sebagai berikut :
5
Durian lokal dan introduksi
Koleksi Kebun Percobaan Cipaku
Karakterisasi
Morfologi vegetatif
DNA
22 karakter
10 Primer ISSR
Skoring DATA Biner
Program NTSYS
Diperoleh
Besar nilai keragaman
Pola hubungan genetik
Besar nilai kemiripan antar genotipe
Kesesuaian Goodness of fit
Informasi Kebenaran genotipe
Seleksi genotipe unggul untuk kegiatan
pemuliaan yang terarah
Gambar 1.
Bagan alur penelitian analisis keragaman durian koleksi Balai Pengkajian
Teknologi Pertanian, kebun Percobaan Cipaku berdasarkan penanda
morfologi dan molekuler (ISSR).
6
TINJAUAN PUSTAKA
Sejarah Penyebaran, Taksonomi dan Botani Tanaman Durian
a. Asal-usul dan taxonomi durian
Nama durian (Durio Spp) diadopsi dari asal katanya “duri” (bahasa
Melayu). Genus durian diperkirakan berasal dari Asia Tenggara. Tanaman durian
tumbuh liar dan terpencar-pencar di hutan “Malesia” yang sekarang meliputi
daerah Malaysia, Sumatra, dan Kalimantan. Saat ini penanaman durian telah
menyebar ke daerah yang meliputi wilayah Sri Lanka dan India Selatan hingga
New Guinea (Prosea 1992).
Durian termasuk ke dalam ordo Malvaceae, famili Bombacaceae dan
genus Durio. Genus ini terdiri atas sekitar 28 spesies. Di Indonesia 19 spesies
ditemukan di Kalimantan dengan 14 spesies merupakan indigenous Kalimantan
dan 7 spesies ditemukan di Sumatra, namun tidak satupun merupakan indigenous
Sumatra. Kalimantan dikenal sebagai pusat asal-usul dari spesies Durio dengan
ditemukannya tetua (ancestor) dari Durio spesies yaitu D. Wyath smithii.
Sunaryono (1990) menyatakan bahwa pusat keragaman genetik durian berada di
Kalimantan Timur dan Kalimantan Tengah. Spesies durian yang dapat dikonsumsi
hanya D. zibethinus (Durian), D. dulcis (Lahong), D. graveolens (Tabelak), D.
grandiflorus (durian Monyet/Munjit), D. kutejensis (Lai) dan D. testudinarium
(durian Kura).
Spesies D. zibethinus merupakan spesies yang memiliki nilai ekonomi
penting dan banyak ditanam secara komersial. Spesies ini juga dikenal dengan
nama D. accunatissima. Beberapa klon-klon durian spesies D. zibethinus telah
banyak dikebunkan dan memiliki variasi bentuk morfologi pohon, daun, bunga
dan buah (Subhadrabandhu S & Ketsa 2001). Tanaman D. zibethinus bersifat
heterogenous, sehingga menunjukkan karakteristik sifat yang luas dalam bentuk
pohon, bentuk buah, kualitas aril, warna buah menyebar dari warna hijau hingga
kuning-krem, warna aril yang menyebar dari warna putih atau krem hingga
kuning emas, biji yang kecil hingga besar, biji yang kisut hingga bulat, perbedaan
waktu pembungaan dan pembentukan buah serta perbedaan dalam kemampuan
membentuk buah.
8
b. Morfologi tanaman durian
Durian tumbuh secara soliter sebagai tanaman tahunan. Durian sebagai
tanaman hutan hujan tropis, dapat tumbuh baik pada dataran rendah hingga
ketinggian 800 meter dpl dengan tinggi tanaman sekitar 30-40 meter dan
diameter batang 2-2.5 meter, tetapi untuk durian hasil grafting tumbuh tidak
lebih dari 12 meter (Brown 1997). Tanaman durian tumbuh optimal pada
daerah dengan curah hujan 1500 mm/tahun.
Tanaman durian memiliki arsitektur pohon Roux dengan bentuk batang
orthotropic monopodial dan cabang lateral plagiotropik. Kulit batang durian
berwarna coklat merah tua, dan mengelupas secara tidak teratur.
Daun durian tumbuh berselang-seling dan pertumbuhannya secara tunggal,
berbentuk jorong sampai lanset, berpangkal daun runcing atau tumpul, sementara
ujung daun melancip. Struktur daun agak tebal dengan permukaan daun atas
berwarna hijau mengkilap sedangkan bagian bawah berwarna coklat tembaga,
kuning keemasan hingga keperakan. Daun durian ditutupi bulu (trichoma) pada
bagian permukaan bawah daun (Widodo 1997).
Pohon durian mulai berbunga pada umur 6-7 tahun untuk tanaman asal
biji. Bakal bunga tumbuh pada titik-titik mata tertentu yang dari tahun ke tahun
akan
keluar pada tempat titik yang sama. Bentuk bunga durian indah, beraroma
wangi yang muncul pada bagian batang dan cabang yang kokoh (cauliflorus).
Keluarnya bunga lebih banyak dibagian dekat pangkal dahan atau tengah-tengah
dahan dibandingkan dibagian ujungnya (Brown 1997). Lama pembentukan bunga
dari mulai muncul bakal bunga hingga mekar adalah berkisar antara 40-60 hari
bergantung pada intensitas hujan yang terjadi.
Bunga durian tersusun dalam tangkai dan bergerombol. Setiap kuntum
bunga bermahkota lima helai yang terlepas satu sama lain dan memiliki benang
sari yang menyatu. Bunga durian adalah bunga sempurna, namun untuk membentuk buah, tanaman durian melakukan penyerbukan silang yang dibantu oleh angin
dan serangga dan hanya pada beberapa kultivar saja yang bisa menyerbuk sendiri
seperti Monthong dan Chanee. Bunga akan mekar mulai pada pukul 1600 sore dan
menyerbuk pada malam hari. Dengan tipe penyerbukan seperti ini menyebabkan
tingginya keragaman pada tanaman durian (Bumrungsri et al. 2009).
9
Bentuk buah durian bervariasi dari bulat hinga lonjong. Warna kulit buah
bermacam-macam dari hijau hingga kecoklatan. Tangkai buah berbentuk bulat
panjang dan terletak dipangkal buah dengan panjang berkisar 15 cm (Wiryanta
2002). Duri durian pun beragam dari mulai panjang meruncing berbentuk piramid
hingga tidak berduri. Setiap buah umumnya terdiri dari lima juring yang bersekat
kuat hingga tidak bersekat.
Warna daging buah bervariasi dari warna putih, kuning muda hingga
jingga (Verheij & Coronel 1991). Ketebalan, rasa dan tekstur daging buah sangat
bergantung pada jenis dan varietas durian. Jumlah biji durian dalam satu juring
bergantung juga pada jenis dan verietas durian. Bentuk dan ukuran biji bervariasi
dengan permukaan halus hingga mengkerut dan warna kulit biji coklat.
Analisis Keragaman Genetik Tanaman Durian
Durian memiliki jumlah kromosom sebanyak 2n=2x=56. Durian merupakan
tanaman dengan sistem penyerbukan silang (cross pollination). Oleh karena itu
progeny durian sangat heterozygous sehingga menghasilkan banyak rekombinasi baru
dan menghasilkan sifat yang beranekaragam (Brown 1997). Kebanyakan
perbanyakan tanaman durian di Indonesia dengan biji dari buah tanaman yang
tumbuh liar di hutan-hutan atau juga yang dilakukan oleh petani dengan cara
generatif atau dengan biji yang disemaikan (Sastrapradja 1979), sehingga banyak
tanaman durian Indonesia yang tidak teridentifikasi dan hanya beberapa diantaranya
yang baru dikarakterisasi secara sederhana dan dilepas menjadi varietas dan masih
terus dalam pengkajian lanjut.
Studi variasi genetik pada tumbuhan telah dilakukan selama beberapa
dekade berdasarkan karakter morfologi dan fisiologi. Karakter ini biasanya
produk dari ekspresi gen dan dipengaruhi oleh faktor lingkungan. Kondisi ini
sering membuat sulit untuk melakukan analisa dan menghasilkan kesimpulan
yang kurang jelas. Analisis berbasis DNA memberikan solusi untuk masalah ini,
karena tidak mengandalkan pada produk yang diekspresikan dari genom dan
independen dari pengaruh lingkungan atau tahap perkembangan. Oleh sebab itu
informasi tambahan secara genetik sangat diperlukan guna mendapatkan hasil
pengelompokan yang lebih akurat (Semagn et al. 2006)
10
Marka molekuler adalah upaya yang dilakukan dalam membedakan
karakteristik tanaman pada tingkat DNA. Penggunaan penanda molekuler
utamanya dilakukan untuk meminitor variasi pada susunan DNA didalam satu
spesies dan pada sejumlah spesies. Teknologi pada tingkat genetik ini menjadi
penting terkait dengan potensi utamanaya bagi pengembangan program
pemuliaan,
yaitu efektivitas
pengorganisasian plasma nutfah, pengujian
kemurnian genotipe atau klon dan perlindungan hak kekayaaan intelektual. Para
pemulia bisa melindungi genotipe temuannya tidak hanya teridentifikasi secara
morfologi namun juga secara genetika (Karp et al. 1997).
Analisis penanda molekuler menjadi penting karena karakter tanaman
pada dasarnya hasil interaksi antara faktor genetik dengan lingkungannya,
sehingga tanaman yang pada dasarnya masih satu jenis menjadi berbeda secara
fisik
karena
perbedaan
perlakuan
atau
lingkungan.
Salah
satu
cara
mengidentifikasi persamaan atau perbedaan jenis dibalik keragaman karakteristik
fisik adalah melihat variasi pada tingkat gen (Henry 1997).
Penanda Morfologi
Karakter morfologi tanaman adalah salah satu penanda yang sering
digunakan dalam mengidentifikasi keragaman tanaman. Penampilan morfologi
merupakan hasil dari interaksi antara genotipe dan lingkungan. Pemunculan
suatu fenotipe merupakan hasil ekspresi banyak gen melalui rangkaian proses
pengaturan yang kompleks, itu sebabnya keragaman dapat terjadi karena adanya
perbedaan lingkungan adaptasi (Allard 1960). Deskripsi durian unggul
menggambarkan karakter-karakter buah durian yang beragam. Tiap genotipe
memiliki deskripsi morfologi buah yang berbeda-beda (Dirjen Hort. 2008).
Penggunaan marka morfologi (berdasarkan pengamatan visual) dalam
tataran aplikasi lapangan mempermudah dalam mengidentifikasi suatu
genotipe tanaman, namun kadang sulit dilakukan untuk beberapa tanaman
yang memiliki kekerabatan dekat karena perbedaan karakter pada spesies yang
berkerabat dekat sangat sedikit, dan sangat dipengaruhi oleh lingkungan
sehingga mungkin akan menghasilkan informasi yang bias. Menurut
Poespodarsono (1988) karakter morfologi terdiri dari dua sifat yaitu kualitatif
11
dan kuantitatif. Sifat kualitatif dapat dibedakan secara tegas karena
dikendalikan oleh gen sederhana. Sedangkan sifat kuantitatif tidak dapat
dibedakan secara sederhana karena dikendalikan oleh banyak gen dan memiliki
distribusi kontinu. Kedua sifat tersebut saling mendukung dalam proses adaptasi
dan spesiasi suatu tanaman pada lingkungan tertentu.
Penanda Molekuler Inter Simple Sequence Repeats (ISSR)
Perkembangan teknik-teknik molekuler berdasarkan DNA merupakan salah
satu alat untuk menganalisis genom tanaman. Teknik ini berkembang karena dapat
mengurangi
keterbatasan sifat
dari
penanda
morfologi
yaitu rendahnya
polimorfisme, adanya pengaruh deleterious, pleiotropi dan epistasis (Weising et al.
2005). Sejak pertengahan 1980-an, identifikasi genom dan seleksi telah
berkembang pesat dengan bantuan teknologi PCR. Sejumlah besar protokol
penanda yang cepat dan membutuhkan hanya sedikit sampel DNA telah
dikembangkan. Tiga penanda berbasis PCR yang luas penggunaannya adalah
RAPD , SSR atau mikrosatelit, dan AFLP.
Setiap teknik penanda molekuler memiliki kekurangan dan kelebihan.
Penanda RAPD sangat cepat dan mudah dikembangkan karena sekuens primernya
bersifat acak, tetapi kurang reprodusibel (Virk et al. 1995). AFLP memiliki
reprodusibilitas yang sedang tetapi membutuhkan biaya operasional yang tinggi
(Karp et al. 1997). Mikrosatelit bersifat spesifik dan sangat polimorfik, namun
membutuhkan pengetahuan awal tentang sekuens genomik tanaman untuk
mendisain primer spesifiknya, sedangkan informasi sekuens genomik tanaman
terbatas hanya pada spesies yang bernilai ekonomi saja.
Pemilihan teknik penanda molekular bergantung pada reprodusibilitas dan
kesederhanaannya. Penanda terbaik untuk pemetaan genom, Marker Assisted
Selection (MAS), studi filogenik, dan konservasi tanaman harus menggunakan
biaya yang rendah dan tenaga kerja yang sedikit serta reliabilitasnya tinggi. Salah
satu penanda molekuler yang banyak digunakan sejak tahun 1994 (Zietkiewicz et
al. 1994) adalah ISSR, yang merupakan bagian mikrosatelite yang tidak mengkode
protein (non coding region).
12
Daerah mikrosatelit merupakan segmen DNA yang berulang yang dimiliki
oleh semua organism baik eukariot maupun prokariot. DNA repetitif paling
banyak ditemukan pada genom organisme eukariotik. Sekuens DNA berulang ini
merupakan sumber variasi di DNA kloroplas, mitokondria dan inti. Daerah ini
terdiri dari pengulangan daerah secara berpasangan dari beberapa nukleotida,
umumnya 2-6 nukleotida dengan perulangan mencapai ukuran sampai dengan 106
bp yang terdistribusi disepanjang genom dan terdapat pada genom eukariot
(Wolfe & Liston 1998). ISSR merupakan daerah di dalam DNA yang panjangnya
sangat bervariasi dalam suatu spesies yang sama (Salimath et al. 1995).
Karakteristik mikrosatelit sama di dalam genom seluruh organism, memiliki level
variasi alelik yang tinggi, bersifat kodominan, dan potensial untuk analisis yang
dapat diautomasi menjadikan daerah ini sebagai penanda molekuler yang unggul
(Trojanwska & Balibok 2004).
ISSR merupakan penanda semi acak yang diamplifikasi oleh PCR dengan
adanya satu primer yang komplementer terhadap suatu target mikrosatelit (Gambar
2). Penanda ini dikembangkan dari daerah di antara lokus mikrosatelit atau yang
disebut juga Single Sequence Repeat (SSR). Amplikasi daerah tersebut tidak
membutuhkan informasi sekuens genom dan menghasilkan pola multilokus dan
sangat polimorfik (Nagaoka & Ogihara 1997). Setiap pita mewakili sekuens DNA
yang dibatasi oleh dua mikrosatelit yang berbeda. Seperti halnya RAPD, penanda
ISSR cepat dan mudah dilakukan, namun memiliki reprodusibilitas seperti penanda
SSR karena primernya yang lebih panjang.
Gambar 2. Wilayah amplifikasi Inter Simple Sequence Repeats (ISSR).
(Zietkiewicz et al. 1994).
METODOLOGI
Waktu dan Tempat
Penelitian ini dilakukan mulai bulan September 2011 sampai Januari 2012
bertempat di Balai Pengkajian Teknologi Pertanian (BPTP), kebun koleksi
Cipaku Bogor dan Laboratorium Molekuler Pusat Kajian Hortikultura Tropika
(PKHT), Institut Pertanian Bogor (IPB).
Bahan dan Alat
Dalam penelitian ini digunakan 21 genotipe tanaman durian dari berbagai
daerah yang menjadi koleksi Balai Pengkajian Teknologi Pertanian (BPTP) Jawa
Barat di kebun Cipaku, Bogor (Tabel 1). Genotipe yang digunakan terdiri dari
varietas nasional (yang sudah dilepas) dan genotipe unggul daerah yang belum
dilepas.
Tabel 1. Nama genotipe tanaman durian koleksi Balai Pengkajian Teknologi
Pertanian (BPTP), kebun percobaan Cipaku dan daerah asalnya.
No
Nama genotipe Daerah asal
No
Nama genotipe
Daerah asal
1
Lokal cipaku
Bogor, Jabar
12
Pasir jati
Pasir jati, Jabar
2
Kendil
Brongkol, Jateng
13
Aseupan
Rancamaya, Jabar
3
Layung
Pandeglang, Jabar
14
Kim
Pandeglang, Jabar
4
Pangkalan
Kalbar
15
Tambleg
Ciapus, Jabar
5
Bulan
Ciawi, Jabar
16
Sunan
Boyolali, Jateng
6
Pingku
Bogor, Jabar
17
Sikoclak
Bogor, Jabar
7
Hepe
Jonggol, Jabar
18
Hejo
Bogor, Jabar
8
Tanjung mabah
Mabah, Kalbar
19
Perwira
Majalengka, Jabar
9
Kuning garing
Pandeglang, Jabar
20
Kanjau
Thailand
10
Semeng
Semeng, Kalbar
21
Manalagi
Malang, Jatim
11
Mentega
Kalbar
14
Bahan yang digunakan dalam pengamatan molekuler antara lain: pasir kuarsa,
merkaptoetanol, PVPP (polyvinylpolypyrrolidone), CTAB, aquades steril, CIAA
(Chloroform isoamylalcohol) (CIAA 24:1), alkohol absolute 70%, isopropanol,
agarose, air bebas ion, buffer TAE 1x, loading dye, PCR mix, Primer ISSR (10 primer),
ethidium bromide, tube 1.5 ml, tube 0.2µl, tip putih, tip kuning, tip biru dan kb ladder.
Alat-alat yang digunakan adalah mortal, micropipette, vortex, shaker,
freezer, centrifuge, waterbath, mesin PCR (Applied Biosystem 2720 thermal
cycler), bak elektroforesis, UV transluminator dan kamera digital.
Metode
a. Pengamatan Morfologi
Percobaan ini terdiri atas dua tahapan, Tahap pertama pemilihan tanaman
untuk analisis morfologi tanaman. Tanaman durian yang dipilih adalah tanaman
durian yang ditanam pada tahun 1996 - 2001. Dari beberapa tanaman durian yang
mewakili kultivar durian tertentu tersebut kemudian dipilih yang memiliki vigor
tinggi. Tahap kedua, tanaman durian terpilih kemudian diamati berdasarkan
karakter morfologi yang digambarkan dalam deskriptor. Pengamatan dilakukan
pada bulan September sampai dengan Desember 2011.
Contoh daun untuk analisis keragaman morfologi diambil secara acak
dalam 1 pohon induk durian pada cabang 1, 2 dan 3. Cabang terpilih adalah
cabang yang tidak ternaungi dan tidak terdapat serangan hama dan penyakit. Daun
contoh kemudian dipilih dalam satu ranting terpilih dimulai dari daun ke-tiga dan
diskor berdasarkan panduan descriptors for durian (Bioversity Internasional 2007).
Karakter yang diamati sebanyak 22 karaker meliputi karakter kualitatif sebanyak
14 karakter (karakter pohon, batang, dan daun) (Tabel 2) dan karakter kuantitatif
meliputi 8 karakter pengukuran (Tabel 3). Karakter pengamatan karakter daun
dari setiap genotipe kemudian ditabulasi. Hasil tabulasi yang memiliki nilai
dominan akan dijadikan sebagai karakter penciri untuk genotipe yang dievaluasi.
15
Tabel 2. Karakter pengamatan morfologi vegetatif sifat kualitatif pada 21 genotipe
tanaman durian di BPTP kebun percobaan Cipaku.
No
Penanda Morfologi Kualitatif
1.
Bentuk tajuk
2.
Habitus pertumbuhan batang
3.
Pola percabangan
4.
Tekstur kulit batang
5.
Warna daun
6.
Bentuk daun (BD)
7.
Bentuk ujung daun (BUD)
8.
Bentuk pangkal daun (BPD)
9.
Tekstur daun
10.
Peruratan daun atas
11.
Peruratan daun bawah
12.
Kerebahan daun
13.
Keadaan pinggir daun
14.
Keadaan permukaan daun
Kategori
Deskripsi
1.
2.
1.
2.
1.
2.
3.
4.
1.
2.
3.
1.
2.
3.
1.
2.
3.
1.
2.
3.
4.
5.
1.
2.
3.
1.
2.
1.
2.
1.
2.
1.
2.
1.
2.
3.
4.
1.
2.
Piramidal
Oblong
Lurus
Melilit
Erect
Semi-erect
Wide
Horizontal
Halus
Kasar
Mengelupas
Hijau muda
Hijau
Hijau tua
Obovate-lanceolate
Oval-oblong
Elliptic
Acuminate
Acuminate-acute
Cuspidate-acuminate
Acuminate-curve
Long acuminate
Obtuse
Acute
Cuneate-acute
Papery
Leathery
Jelas
Tidak Jelas
Menonjol
Tidak menonjol
Rebah 45o
Down vertically
Lengkung keluar
Keatas (V)
Datar
Lengkung kedalam (U)
Rata
Bergelombang
Sumber : Descriptors for durian (Bioversity International 2007).
16
Tabel 3. Karakter pengamatan morfologi vegetatif sifat kuantitatif pada 21 genotipe
tanaman durian di BPTP kebun percobaan Cipaku.
No
Penanda Morfologi Kuantitatif
1.
Panjang daun (cm)
2.
Lebar daun (cm)
3.
Panjang tangkai daun (cm)
4.
Panjang ujung daun (cm)
5.
Diameter tangkai besar daun (cm)
6.
Diameter tangkai kecil daun (cm)
7.
Kerapatan daun ( panjang
rangkaian daun (cm) / jumlah
daun (buah))
Jumlah vena primer (buah)
8.
Kategori
Deskripsi
1.
2.
3.
1.
2.
3.
1.
2.
3.
1.
2.
3.
1.
2.
3.
1.
2.
3.
1.
2.
3.
1.
2.
3.
14.06 ≤ PD < 14.85
14.85 ≤ PD < 15.82
15.82 ≤ PD
4.7 ≤ LD < 5.33
5.33 ≤ LD < 6.01
6.01 ≤ LD
1.75 ≤ PTD < 1.77
1.77 ≤ PTD < 1.83
1.83 ≤ PTD
1.25 ≤ PUD < 1.33
1.33 ≤ PUD < 1.52
1.52 ≤ PUD
0.284 ≤ DTB < 0.314
0.314 ≤ DTB < 0.35
0.35 ≤ DTB
0.191 ≤ DTK < 0.204
0.204 ≤ DTK < 0.212
0.212 ≤ DTK
1.78 ≤ KD < 1.97
1.97 ≤ KD < 2.25
2.25 ≤ KD
TD > 14
12 ≤ TD < 14
11 ≥ TD < 12
Panjang ujung daun
Lebar daun atas
Lebar daun tengah
Panjang daun
Panjang petiole
Lebar daun bawah
Sudut pusat daun
Lebar petiole tebal dan kecil
Gambar 3. Skematik pengukuran karakter kuantitatif daun durian (RIRDC 2009).
17
b. Pengamatan Molekuler
Tahapan pengerjaan molekuler meliputi dua kegiatan utama yaitu isolasi
DNA dan analisis ISSR. Persiapan template DNA dilakukan dengan
mengekstraksi DNA dari daun tanaman durian dilakukan pada bulan September November 2011. Analisis ISSR dilakukan selama bulan November 2011 - Januari
2012 dengan mengamplifikasi template DNA melalui mesin PCR. Seluruh
kegiatan tersebut, termasuk kegiatan elektroforesis, visualisasi dan dokumentasi
dilaksanakan di laboratorium PKHT.
Isolasi DNA
Prosedur isolasi DNA durian mengikuti metode CTAB (Lian et al. 2006)
yang meliputi 4 tahapan utama yakni pengambilan sampel daun dan ekstraksi,
pemurnian, presipitasi pelet DNA, dan uji kualitas DNA.
a. Pengambilan sampel daun dan ekstraksi
Daun durian diketahui banyak mengandung fenolik, sehingga waktu
pengambilan dan pemilihan daun untuk analisis DNA harus diperhatikan. Untuk
menghindari DNA berwarna kekuningan, daun yang diambil dan waktu
pengambilan daun menjadi sangat penting. Daun yang diambil sebaiknya bukan
daun yang muda karena akan menghasilkan banyak lendir saat dilakukan isolasi
DNA, oleh karena itu daun tua lebih baik. Namun kendala yang sering muncul
pada daun tua banyak terjadi fenolik untuk itu waktu pengambilan daun dilakukan
diwaktu pagi hari sebelum matahari bersinar terik dan saat pengangkutan, daun
diusahakan tidak terpapar panas sehingga daun tidak mengalami pencoklatan.
Sampel daun yang belum digunakan kemudian disimpan di dalam deep freezer
agar tidak rusak.
Sampel daun dari masing-masing bahan tanaman digerus menggunakan
mortar dengan penambahan buffer ekstraksi (CTAB 10%; EDTA 0.5 M (pH
8.0); Tris-HCl 1 M (pH 8.0); NaCl 5 M; β-mercaptoetanol 1%), PVPP dan pasir
kuarsa. Hasil gerusan dimasukkan dalam tabung steril ukuran 1.5 ml, Kemudian
ditutup rapat, diinkubasi dalam waterbath pada suhu 65oC selama 30 menit.
Setelah diangkat sample didinginkan beberapa menit sebelum dituangkan
18
larutan chloroform : isoamyl-alcohol. Larutan
chloroform : isoamyl-alcohol
digunakan untuk presipitasi protein yang telah didenaturasi. Tujuannya agar
protein terpisah dari larutan buffer yang mengandung DNA.
b. Pemurnian
Buffer pemurnian 1x volume berupa campuran chloroform : isoamylalcohol
(CIAA) dengan perbandingan 24:1 v/v ditambahkan ke dalam sampel setelah tube
diangkat dari waterbath dan suhunya telah turun, lalu divortex perlahan-lahan
(sekitar 6-8 rpm) selama 1 menit. Sampel kemudian disentrifugasi dengan
kecepatan 10 000 rpm selama 10 menit dengan tujuan memisahkan bagian DNA
dan bahan-bahan lainnya. Pemisahan fraksi di dalam campuran dilakukan dengan
mengambil supernatant dan memindahkannya ke dalam tube steril baru. Proses
pemurnian kemudian kembali dilakukan dengan penambahan CIAA 1x volume,
di vortex selama 1 menit dan disentrifugasi pada 10 000 rpm selama 10 menit.
c. Presipitasi
Supernatant dari hasil pemurnian dipindahkan ke tube steril baru ukuran 1.5
ml, ditambahkan isopropanol (dingin) 1x volume, kemudian dikocok perlahan dan
diinkubasi dalam 4oC selama 30 menit sehingga terbentuk gumpalan yang
berbentuk seperti lendir. Larutan DNA tersebut disentrifugasi kembali dan larutan
dibuang hingga pelet DNA tertinggal diujung tube. Pelet kemudian dicuci dengan
100 µl ethanol 70% dan disentrifugasi kembali, kemudian dikering anginkan selama
6 jam sampai pelet kering. Selanjutnya pelet dilarutkan dalam 100 µl TE (1 M
Tris-HCl (pH 8,0); 0,5 M EDTA (pH 8,0); air bebas ion).
d. Uji kualitas DNA
Kualitas DNA total diuji dengan menggunakan gel agarose 0.8% dan
dielektroforesis dalam larutan buffer TAE 1x yang dialirkan arus listrik dari muatan
negatif menuju muatan positif selama 47 menit pada tegangan 50 volt. Konsentrasi
5 µl DNA total kemudian dibandingkan dengan 1 µl lamda DNA (Promega) yang
dielektroforesis bersama dengan konsentrasi 254 µg/ml, sehingga untuk setiap 1 µl
DNA total setara dengan 91.4 ng/ µl. Pewarnaan dilakukan dengan cara
19
perendaman gel agarose dalam larutan EtBr 1% selama 15 menit, kemudian
didokumentasikan menggunakan kamera digital canon power shoot A480 di bawah
penyinaran UV transulliminator.
Polymerase Chain Reaction (PCR)
Amplifikasi dilakukan dengan alat PCR merk Applied Biosystem 2720
thermal cycler. Primer yang digunakan adalah primer Inter Simple Sequence
Repeat (ISSR) koleksi Laboratorium Pusat Kajian Hortikultura Tropika IPB
sebanyak 10 primer (Tabel 4) yang telah dioptimalisasi.
Komposisi PCR yang digunakan dalam proses PCR meliputi DNA template,
primer ISSR, PCR mix go tag green master Promega dan nuclease free water. Komposisi PCR meliputi : DNA 10 ng/µl, primer 10 pmol/µl, PCR mix 12.5 μl, kemudian
ditambahkan air bebas ion hingga mencapai volume 25 μl. Tahapan PCR meliputi pre
heat, denaturation, annealing, extension, dan pendinginan (Tabel 5).
Tabel 4. Nama dan susunan basa primer ISSR koleksi PKHT-IPB.
No.
1
2
3