Karakterisisasi Komponen Bioaktif Gorgonian Akar Bahar Sebagai Antioksidan, Inhibitor Xantin Oksidase Dan Inhibitor Lipoksigenase

KARAKTERISASI KOMPONEN BIOAKTIF GORGONIAN
AKAR BAHAR SEBAGAI ANTIOKSIDAN, INHIBITOR
XANTIN OKSIDASE DAN INHIBITOR LIPOKSIGENASE

YUNIALDI HAPYNES TEFFU

SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2016

PERNYATAAN MENGENAI TESIS DAN SUMBER
INFORMASI SERTA PELIMPAHAN HAK CIPTA
Dengan ini saya menyatakan bahwa tesis berjudul Karakterisasi
Komponen Bioaktif Gorgonian Akar Bahar sebagai Antioksidan, Inhibitor Xantin
Oksidase dan Inhibitor Lipoksigenase adalah benar karya saya dengan arahan dari
komisi pembimbing dan belum diajukan dalam bentuk apapun kepada perguruan
tinggi mana pun. Sumber informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang
diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks
dan dicantumkan dalam Daftar Pustaka di bagian akhir tesis ini.
Dengan ini saya melimpahkan hak cipta dari karya tulis saya kepada

Institut Pertanian Bogor.

Bogor, April 2016
Yunialdi Hapynes Teffu
C3511120221

RINGKASAN

YUNIALDI HAPYNES TEFFU. Karakterisisasi Komponen Bioaktif Gorgonian
Akar Bahar Sebagai Antioksidan, Inhibitor Xantin Oksidase dan Inhibitor
Lipoksigenase. Dibimbing oleh RUDDY SUWANDI dan NURJANAH.
Akar bahar telah lama dikenal oleh masyarakat karena bentuknya yang
menyerupai tumbuhan laut. Akar bahar termasuk dalam kelompok hewan.
Keunikan bentuknya banyak dimanfaatkan oleh masyarakat sebagai perhiasan
berupa gelang. Selain keunikan bentuknya, akar bahar juga secara empiris oleh
masyarakat digunakan sebagai obat reumatik. Kegunaannya sebagai obat
reumatik perlu dikaji secara ilmiah terutama kandungan metabolit sekunder yang
bermanfaat sebagai bahan obat dalam bidang farmasi.
Penelitian ini bertujuan untuk mengidentifikasi akar bahar, logam berat,
metabolit primer, dan metabolit sekunder yang bermanfaat sebagai antioksidan,

bahan obat anti-reumatik dan anti-inflamasi dalam bidang farmasi. Penelitian ini
terdiri dari identifikasi jenis akar bahar, analisis proksimat, logam berat,
kandungan radium, ekstraksi, fitokimia, uji toksisitas (brine shrimp lethality test),
uji aktivitas antioksidan, inhibitor xantin oksidase dan inhibitor lipoksigenase.
Hasil identifikasi berdasarkan bentuk sklerit, akar bahar teridentifikasi
sebagai Rumphella sp. dan Hicksonella sp. mengandung komponen protein yang
tinggi pada bagian aksial sebesar 22.23%; dan kadar air terendah pada kulit akar
bahar 2.28%. Kandungan logam berat Hg, As, Cu, dan Cd berada dalam kisaran
batas aman sedangkan logam berat Pb melebihi standar yang ditetapkan BSN dan
BPOM. Akar bahar mengandung radium 0.65 Bq/kg sampai 0.79 Bq/kg;
ekstraksi bertingkat dengan pelarut berbeda diperoleh rendemen terbanyak
menggunakan pelarut metanol kulit sebesar 56%; mengandung metabolit sekunder
alkaloid, flavonoid, fenol hidrokuinon, steroid/triterpenoid, dan saponin.
Penetapan kadar ekstrak akar bahar secara semi kuantitatif berdasarkan nilai Rf
menunjukkan nilai Rf ekstrak akar bahar mendekati bahkan sama dengan nilai Rf
baku standar.
Hasil analisis menunjukkan aktivitas ekstrak akar bahar termasuk dalam
kategori toksik dengan nilai LC50 190.81 µg/mL – 873.19 µg/mL. Hasil uji
menggunakan metode DPPH ekstrak akar bahar tidak potensial sebagai
antioksidan karena nilai IC50 diatas 1 000 µg/mL; dan standar vitamin C nilai IC50

4.82 µg/mL; ekstrak n-Heksana kulit akar bahar menghambat aktivitas enzim
xantin oksidase dengan nilai IC50 24.90 µg/mL (konsentrasi 30.25 µg/mL), dan
standar alopurinol nilai IC50 1.03 µg/mL (25 µg/mL). Ekstrak n-Heksana kulit
akar bahar tidak berpotensi sebagai anti-inflamasi dalam menghambat aktivitas
enzim lipoksigenase dengan nilai IC50 2.14 µg/mL (konsentrasi 3.33 µg/mL) dan
standar baikelain 0.01 µg/mL (konsentrasi 0.05 µg/mL).
Kata kunci: akar bahar, inhibitor xantin oksidase, inhibitor lipoksigenase, radium,
sklerit

SUMMARY

YUNIALDI HAPYNES TEFFU. Characterization of Bioactive Compounds of
Gorgonian Akar Bahar as Antioxidants, Inhibitor Xanthine Oxidase and
Lipoxygenase. Supervised by RUDDY SUWANDI and NURJANAH.
Akar bahar has been widely known by local people as a sea plumes, but it
is actually belongs to Animalia kingdom. Empirically, akar bahar has been used
by local people as anti-rheumatic agent. The uniqueness of its form, widely used
by people as bracelet. However, there is no information of akar bahar as antirheumatic agent. Its usefulness as anti-rheumatic agent needs to be observated
scientifically, especially content of secondary metabolites useful as drugs in the
pharmaceutical field.

The aims of this research were to identify genus of akar bahar and
characterize akar bahar including its heavy metal contents and bioactive
compounds. The analyzes of this research consisted of identification, proximate
analysis, heavy metal and radium contents, phytochemical, toxicity assay,
antioxidant activity assay, xanthine oxidase inhibitor and lipoxygenase inhibitor.
Akar bahar was identified as Rumphella sp. and Hicksonella sp based on
its schlerite shape. The highest protein was found in its axial part at 22.23% and
the lowest moisture content was identified in its bark at 2.28%. Hg, As, Cu, and
Cd contents of akar bahar were in the save levels, but its Pb content was exceeded
the BSN and BPOM standards. Radium content in akar bahar was 0.65 Bq/kg0.79 Bq/kg. The highest yield was obtained from bark methanol extract.
The methanol extract contained alkaloids, flavonoids, phenol hydroquinone,
steroids/triterpenoids, and saponins. Assay of akar bahar extract semi
quantitatively based on the value of Rf showed that Rf value of akar bahar extract
approached even equal to the value of standard Rf.
Toxicity assay showed that akar bahar extract was a toxic. LC50 of akar
bahar was 190.8 µg/mL-873.19 µg/mL. Antioxidant activity of akar bahar was not
potential as antioxidant because the value of IC50 was above 1 000 µg/mL by
using DPPH method; while IC50 of vitamin C as a standard was 4.82 µg/mL. nHexana extract of akar bahar bark potential as anti-rheumatic agents. n-Hexana
extract of akar bahar bark could inhibit xanthine oxidase and lipoxygenase
activities (as anti-rheumatic and anti-inflammatory agents). IC50 of n-Hexana

extract as anti-rheumatic agent was 24.90 µg/mL (concentration of 30.25 µg/mL),
while IC50 of allopurinol standard was 1.03 µg/mL (concentration of 25 µg/mL).
IC50 of n-Hexana extract was not potential as anti-inflammatory agent 2.14 µg/mL
(concentration of 3.33 µg/mL) and baicelain standard was 0.01 µg/mL
(concentration of 0.05 µg/mL).
Keywords: akar bahar, lipoxygenase inhibitor, radium, schlerites, xanthine
oxidase inhibitor

© Hak Cipta Milik IPB, Tahun 2016
Hak Cipta Dilindungi Undang-Undang

Dilarang mengutip sebagian atau seluruh karya tulis ini tanpa mencantumkan
atau menyebutkan sumbernya. Pengutipan hanya untuk kepentingan pendidikan,
penelitian, penulisan karya ilmiah, penyusunan laporan, penulisan kritik, atau
tinjauan suatu masalah; dan pengutipan tersebut tidak merugikan kepentingan
IPB.
Dilarang mengumumkan dan memperbanyak sebagian atau seluruh karya tulis ini
dalam bentuk apapun tanpa izin IPB.

KARAKTERISASI KOMPONEN BIOAKTIF GORGONIAN

AKAR BAHAR SEBAGAI ANTIOKSIDAN, INHIBITOR
XANTIN OKSIDASE DAN INHIBITOR LIPOKSIGENASE

YUNIALDI HAPYNES TEFFU

Tesis
sebagai salah satu syarat untuk mendapatkan gelar
Magister Sains
pada
Program Studi Teknologi Hasil Perairan

SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2016

Penguji Luar Komisi Pada Ujian Tesis : Dr Desniar, SPi, MSi

Judul Tesis

Nama
NIM

: Karakterisasi Komponen Bioaktif Gorgonian Akar
Bahar Sebagai Antioksidan, Inhibitor Xantin Oksidase
dan Inhibitor Lipoksigenase
: Yunialdi Hapynes Teffu
: C351120221

Disetujui oleh
Komisi Pembimbing

Dr Ir Ruddy Suwandi, MS M.Phil
Ketua

Prof Dr Ir Nurjanah, MS
Anggota

Diketahui oleh

Ketua Program Studi
Teknologi Hasil Perairan

Dekan Sekolah Pascasarjana

Dr Ir Wini Trilaksani, MSc

Dr Ir Dahrul Syah, MSc Agr

Tanggal Ujian: 25 Januari 2016

Tanggal Lulus :

PRAKATA
Puji dan syukur penulis panjatkan kepada Tuhan Yesus atas berkat karunia
dan rahmatNya sehingga penulis dapat menyelesaikan penelitian dan penulisan
tesis ini dengan judul “Karakterisasi Komponen Bioaktif Gorgonian Akar
Bahar Sebagai Antioksidan, Inhibitor Xantin Oksidase dan Inhibitor
Lipoksigenase”. Tesis ini merupakan salah satu syarat untuk mendapatkan gelar
Magister Sains di Program Studi Teknologi Hasil Perairan, Sekolah Pascasarjana,

Insitut Pertanian Bogor. Penulisan tesis ini tak lepas dari bantuan berbagai pihak.
Penulis mengucapkan terima kasih kepada:
1. Dr. Ir. Ruddy Suwandi, MS, M.Phil sebagai ketua komisi pembimbing dan
Prof. Dr. Ir. Nurjanah, MS sebagai anggota komisi yang telah banyak
mencurahkan waktu dan penuh kesabaran dalam membimbing penulis selama
penelitian dan penulisan tesis.
2. Dr. Ir. Wini Trilaksani, MSc sebagai Ketua Program Studi Pascasarjana
Teknologi Hasil perairan dan Prof. Dr. Ir. Joko Santoso, MSi sebagai Ketua
Departemen Teknologi Hasil Perairan.
3. Prof. Ir. Linawati Hardjito, MS, PhD sebagai Gugus Kendali Mutu Program
Studi Teknologi Hasil Perairan dan Dr. Desniar, SPi, MSi sebagai penguji luar
komisi atas saran dan masukannya yang begitu berharga dalam
penyempurnaan penulisan tesis.
4. Orang tua tercinta Julius Teffu dan Juliana Teffu-Leosae, saudara-saudari
Junariaty Teffu, Marlince Teffu, Noviani Teffu, Erni Teffu, Jefri Teffu,
Marvel Teffu, keponakan Eka dan Devina, keluarga Yakob Sanak dan
Efrodina Sanak-Teffu atas ketulusan doa, cinta, motivasi dan kasih sayang.
5. Dosen dan staf pegawai Program Studi Pascasarjana Teknologi Hasil Perairan
FPIK IPB yang telah memberikan banyak ilmu dan pengalaman kepada
penulis selama studi.

6. Keluarga besar Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan Universitas Kristen
Artha Wacana Kupang-NTT atas doa, semangat dan motivasinya.
7. Keluarga besar Bapak Simon Leo Riwu, Martinus Leo Riwu, Bapak Ruben Pa
Mau, Bapak Petrus Alo Ruha, dan Bapak Wempi Alo Ruha, atas bantuan
pengambilan sampel di perairan Raijua. Ir. M.I. Yosephine Tuti H sebagai staf
peneliti LIPI Ancol Jakarta atas bantuan dalam mengidentifikasi sampel.
Ibu Berna Elya, Ibu Marista, Ibu Sari, Mbak Ulfah, atas bantuan penggunaan
fasilitas laboratorium Fakultas Farmasi Universitas Indonesia.
8. Kementrian Pendidikan Tinggi dan Kebudayaan yang telah memberikan
beasiswa BPPS dan Kampus Universitas Kristen Artha Wacana Kupang-NTT
atas bantuan biaya studi dan penelitian selama penulis menempuh pendidikan.
9. Teman-teman seperjuangan S2 THP angkatan 2012, angkatan 2010, 2011,
2013, teman-teman GAMANUSTRATIM, Wisma Baristar, Keluarga PA
Oekumene atas kebersamaan, persahabatan dan persaudaraannya.
Semoga karya ilmiah ini bermanfaat.
Bogor, April 2016
Yunialdi Hapynes Teffu

DAFTAR ISI

DAFTAR TABEL

xi

DAFTAR GAMBAR

xi

DAFTAR LAMPIRAN

xii

1 PENDAHULUAN
Latar Belakang
Tujuan Penelitian
Manfaat Penelitian
Ruang Lingkup

1
1
2
2
2

2 METODE
Waktu dan Lokasi Penelitian
Bahan dan Alat
Prosedur Penelitian

3
3
3
3

3 HASIL DAN PEMBAHASAN
Pengambilan Sampel dan Identifikasi
Komposisi Kimia Akar Bahar
Logam Berat
Radium
Ekstrak Akar Bahar
Komponen Aktif Ekstrak Kasar Akar Bahar (Genus Rumphella
dan Hicksonella)
Penetapan Kadar Komponen Aktif Ekstrak Kasar Akar Bahar dengan
Kromatografi Lapis Tipis Densitometri
Toksisitas Ekstrak Akar Bahar
Aktivitas Antioksidan Ekstrak Akar Bahar
Aktivitas Inhibitor Xantin Oksidase Ekstrak Akar Bahar
Aktivitas Inhibitor Lipoksigenase Ekstrak Akar Bahar

16
16
18
21
26
28

4 SIMPULAN DAN SARAN
Simpulan
Saran

52
52
52

DAFTAR PUSTAKA

53

LAMPIRAN

63

RIWAYAT HIDUP

30
35
39
40
44
48

100

DAFTAR TABEL
Komposisi kimia gabungan sampel akar bahar (genus Rumphella
dan Hicksonella)
2 Kandungan logam berat gabungan sampel akar bahar (genus
Rumphella dan Hicksonella)
3 Komponen aktif simplisia dan ekstrak kasar gabungan sampel akar
bahar (genus Rumphella dan Hicksonella).
4 Nilai Rf ekstrak dan Nilai Rf baku standar dengan metode KLTdensitometri pada panjang gelombang 366 nm
5 Nilai LC50 ekstrak akar bahar
6 Hasil pengujian aktivitas antioksidan (IC50) berbagai ekstrak akar
bahar dengan vitamin C sebagai pembanding
7 Persentase penghambatan xantin oksidase ekstrak kasar akar bahar
dan standar alopurinol
8 Nilai IC50 ekstrak kasar akar bahar dan alopurinol
9 Aktivitas penghambatan lipoksigenase ekstrak kasar akar bahar dan
standar baikailein
10 Nilai IC50 terhadap penghambatan lipoksigenase
1

18
22
30
38
39
42
45
46
48
50

DAFTAR GAMBAR
1
2
3
4
5
6

Tahapan penelitian
Metode ekstraksi bertingkat (Wikanta et al. 2005)
Bentuk sklerit akar bahar (a) sklerit Rumphella sp.; (b) Rumphella
sp.; (c) sklerit Hicksonella sp.; (d) Hicksonella sp
Rendemen ekstrak kulit dan aksial gabungan sampel akar bahar
(genus Rumphella dan Hicksonella.
Profil kromatografi ekstrak kulit akar bahar
Persentase penghambatan terbaik bermacam ekstrak kasar akar
bahar
terhadap
larutan
DPPH
pada
konsentrasi
500 ppm dan vitamin C konsentrasi 20 ppm.
MK (ekstrak
metanol kulit);
EAK (ekstrak etil kulit);
HK (ekstrak heksan
kulit); MA(ekstrak metanol aksial) ;
EAA (ekstrak etil asetat
aksial);
HA (ekstrak heksan aksial);
vitamin C

4
9
17
29
37

41

DAFTAR LAMPIRAN

1
2
3
4
5
6
7
8
9
10

Determinasi/klasifikasi akar bahar
Hasil uji proksimat akar bahar
Hasil uji radium akar bahar
Hasil uji logam berat akar bahar
Hasil uji fitokimia kualitatif ekstrak akar bahar
Hasil spektrum luas area bercak standar dan ekstrak akar bahar
Hasil analisis probit penentuan LC50 ekstrak akar bahar
Hasil uji aktivitas antioksidan ekstrak akar bahar
Hasil uji antioksidan vitamin C
Hasil uji aktivitas penghambatan xantin oksidase ekstrak akar
bahar
11 Hasil uji aktivitas penghambatan xantin oksidase standar
allopurinol
12 Hasil uji aktivitas penghambatan lipoksigenase ekstrak akar
bahar
13 Hasil uji aktivitas penghambatan lipoksigenase standar baikelain

65
66
66
67
72
74
80
86
91
92
95
96
99

1

1 PENDAHULUAN
Latar Belakang
Usaha pemanfaatan organisme laut sebagai sumber senyawa obat mulai
berkembang seiring dengan penemuan senyawa-senyawa bioaktif dari laut. Usaha
pencarian obat baru tersebut bertujuan untuk mengatasi penyakit-penyakit yang
hingga kini belum ditemukan obatnya, seperti penyakit AIDS. Kegiatan ini
dilakukan oleh berbagai institusi dan industri obat terkemuka di dunia. Salah
satunya adalah NCI (National Cancer Institute) yang setiap tahunnya giat meneliti
bioaktivitas senyawa kimia dari beribu-ribu jenis organisme laut terutama
invertebrata dari seluruh dunia. Melalui skrining terhadap aktivitas sitotoksisitas
diharapkan bisa ditemukan senyawa-senyawa baru sebagai antioksidan,
antiinflamasi, antibakteri, antitumor dan antivirus (Suffnes et al. 1989).
Lingkungan laut adalah salah satu ekosistem terkaya dan paling kompleks.
Lingkungan kimia yang keras dan kondisi fisik di lingkungan tersebut telah
mendorong produksi berbagai macam molekul penting dengan ciri struktural yang
unik. Molekul yang berasal dari laut tersebut menunjukkan berbagai jenis
kegiatan biologis (Jain et al. 2008).
Perairan laut di Nusa Tenggara Timur kaya akan berbagai jenis gorgonian.
Gorgonian termasuk dalam kelompok karang Octocorallia yang memiliki tekstur
tubuh yang lunak, disokong oleh duri-duri atau spikula yang terdapat didalam
jaringan tubuhnya serta memiliki delapan tentakel (Manuputty 1996). Salah satu
organisme laut gorgonian yang penting dan perlu mendapat perhatian yaitu akar
bahar, karena keberadaannya melimpah hampir di seluruh perairan Nusa Tenggara
Timur. Penelitian oleh Tuti (2014) pada perairan Maumere Kabubapen Sikka
Nusa Tenggara Timur melaporkan keberadaan gorgonian akar bahar yang
ditemukan sebanyak 16 marga (genus) gorgonian dari 8 suku (family) yang
diamati pada 14 stasiun pengamatan. Gorgonian dari marga Isis atau dikenal
sebagai “patah tulang” atau “bambu laut” merupakan marga yang paling banyak
dijumpai dan mendominasi perairan Maumere.
Keberadaan gorgonian akar bahar yang melimpah di perairan Nusa
Tenggara Timur merupakan salah satu potensi yang perlu dikaji dan diteliti.
Penelitian ini difokuskan pada gorgonian akar bahar yang banyak digunakan oleh
masyarakat pulau Sabu-Raijua sebagai gelang dan obat tradisional. Masyarakat di
Pulau Sabu-Raijua Nusa Tenggara Timur, menggunakan akar bahar sebagai obat,
dengan cara akar bahar yang telah dikeringkan digerus untuk diambil serbuknya
lalu diseduh dengan air panas dan diminum sebagai obat nyeri pada sendi.
Pengetahuan empiris yang berkembang di masyarakat bahwa akar bahar
mengandung radium alami yang dipercaya sebagai zat yang berfungsi untuk
mengobati reumatik.
Reumatik didefinisikan sebagai kondisi yang disertai rasa nyeri dan kaku
pada sistem tulang otot (muskoskeletal) dan penyakit yang terjadi pada jaringan
ikat. Dapat juga diartikan sebagai penyakit yang menyerang sendi, otot dan
jaringan tubuh (Utami 2003). Salah satu jenis reumatik yang sering dijumpai
dalam masyarakat adalah gout. Reumatik gout ini disebabkan oleh tingginya
kadar asam urat di dalam darah. Serangan akut gout biasanya disertai dengan

2

tanda-tanda radang/inflamasi pada sendi seperti bengkak, panas, sakit bila
digerakkan, dan kulit di atas sendi tampak kemerahan. Serangan pertama kali
memberikan gejala yang khas, berupa nyeri hebat pada persendian yang timbul
secara mendadak (Dalimartha 2002).
Penelitian terhadap famili gorgonian akar bahar beberapa tahun terakhir
yang dilaporkan menunjukan potensi aktivitas biologis yang menjanjikan.
Penelitian pada gorgonian Rumphella antiphaties, Carijoa sp., oktokoral Carijoa
multiflora menunjukan sifat potensial biologis sebagai antibakteri (Sung et al.
2007a; Sung et al. 2007b; Zhao et al 2013; Díaz-Marrero et al. 2011), sebagai
antiprotozoa (Reimão et al. 2008). Oktokoral Dendronephthya griffin dan Soft
Coral Scleronephthya gracillimum berfungsi sebagai anti-inflamasi (Chao et al.
2008; Fang et al. 2011); gorgonian Rumphella antipathies menunjukan
penghambatan turunan anion superoksida dan pelepasan elastase oleh neutrofil
manusia (Chung et al. 2013; Chung et al. 2014).
Pengetahuan masyarakat tentang khasiat akar bahar sebagai obat didasarkan
pada pengetahuan empiris. Pembuktian akan khasiat akar bahar perlu adanya
penelitian ilmiah di laboratorium akan komponen metabolit primer dan komponen
metabolit sekunder yang terkandung didalamnya serta manfaat dari senyawa lain
yang bermanfaat bagi manusia dalam pengembangannya sebagai bahan obat di
bidang farmasi.
Tujuan Penelitian
Tujuan dari penelitian ini adalah :
1. Mengidentifikasi jenis akar bahar
2. Mengkarakterisasi komposisi kimia dan komponen bioaktif akar bahar
3. Menentukan aktivitas antioksidan, inhibitor xantin oksidase dan inhibitor
lipoksigenase.
Manfaat Penelitian
Manfaat dari penelitian ini antara lain:
1. Memperoleh informasi mengenai klasifikasi akar bahar, kandungan proksimat,
kandungan radium, kandungan logam berat dan komponen aktif akar bahar.
2. Memperoleh informasi konsentrasi ekstrak akar bahar sebagai antioksidan,
persentase penghambatan xantin oksidase dan persentase penghambatan
lipoksigenase.
Ruang Lingkup
1. Mengidentifikasi jenis akar bahar
2. Mengkarakterisasi akar bahar meliputi klasifikasi, analisis proksimat, analisis
logam berat, kandungan radium, menghitung rendemen, ekstraksi dan uji
komponen aktif akar bahar.
3. Menguji ekstrak akar bahar sebagai antioksidan, inhibitor xantin oksidase dan
inhibitor lipoksigenase secara in vitro.

3

2 METODE
Waktu dan Lokasi Penelitian
Penelitian ini dilaksanakan pada bulan Januari 2014 sampai bulan Juni
2015 di perairan Pulau Sabu-Nusa Tenggara Timur, Laboratorium Karakteristik
Bahan Baku Teknologi Hasil Perairan IPB, Laboratorium Ilmu dan Teknologi
Pangan Fakultas Teknologi Pertanian IPB, Laboratorium Nutrisi Ternak Perah
Fakultas Peternakan IPB, Laboratorium Pusat Teknologi Keselamatan dan
Metrologi Radiasi-BATAN Jakarta Selatan, Laboratorium Biofarmaka IPB,
Laboratorium Kimia Organik Departemen Kimia IPB dan Laboratorium Pusat
Studi Bahan Alam Fakultas Farmasi Universitas Indonesia.
Bahan dan Alat
Bahan utama dalam penelitian adalah akar bahar. Bahan kimia yang
digunakan etanol 70% (Brataco), pelarut n-Heksana p.a (Merck, KGaA), etil
asetat p.a (Merck KGaA), metanol p.a. (Merck KGaA), kloroform ((Merck
KGaA), Artemia salina Leach, 1,1- difenil-2-pikrilhidrazil (DPPH) (Sigma
Aldrich), dimetil sulfoksid (DMSO) (Merck KGaA), xantin (Sigma Aldrich), HCl
(Merck KGaA), allopurinol (Sigma-Aldrich), rutin hidrat (Sigma-Aldrich), boldin
(Sigma-Aldrich), digoksin (Sigma-Aldrich), diosgenin (Sigma-Aldrich), kuersetin
(Sigma-Aldrich) -sitosterol (Sigma-Aldrich), TLC silika gel 60 F254 (Merck
KGaA), enzim lipoksigenase (Sigma-Aldrich), asam borat p.a (Merck KGaA) KCl
(Merck KGaA)
Alat yang digunakan pH meter, salinometer, flow/current meter, sechi
disk, global positioning system (GPS Garmin etrex), coolbox, mikroskop
binokuler Olympus (U-RFLT 50), Atomic Absorption Spectrofotometer (AA700Shimadzu), MVU-1A (Mercury Vaporizer Unit-Shimadzu), HVG-1(Shimadzu),
Spektrometer Gamma (DETEKTR HPGe ORTEG GMX-25P4), orbital shaker
(wiseshake SHO-1D), rotary evaporator (Heidolph VV 2000), timbangan
analitik (AND HR-200), pH meter (EU TECH INSTRUMENTS PH 700), single
channel pippetor (Corning Lambda Plus), pipet 10 µL (Thermo Scientific
Finnpipette® F2), spektrometer UV/VIS Double Beam T80+ (PG Instruments
Ltd), TLC Scanner 3 (Camaq).
Prosedur Penelitian
Penelitian ini meliputi kegiatan pengambilan sampel dan preparasi;
identifikasi sampel; analisis proksimat; pengujian logam berat; pengujian
kandungan radium; ekstraksi; uji fitokimia kuantitatif; penetapan kadar fitokimia;
uji toksisitas; uji aktivitas antioksidan; uji aktivitas penghambatan xantin oksidase
dan uji aktivitas penghambatan lipoksigenase. Diagram alir tahapan penelitian
dapat dilihat pada Gambar 1.

4

Pengambilan sampel

Akar bahar

 Penentuan titik koordinat
 Pengukuran parameter
kualitas perairan

Identifikasi

Preparasi
sampel

Kulit

Aksial

Analisis komponen kimia, analisis
logam berat, analisis radium

Ekstraksi

Ekstrak

Uji fitokimia kualitatif, semi kuantitatif kadar
fitokimia, uji toksisitas, uji aktivitas
antioksidan, uji aktivitas inhibitor xantin
oksidase, uji aktivitas inhibitor lipoksigenase

Gambar 1 Tahapan penelitian
Pengambilan sampel
Akar bahar diambil dalam keadaan hidup di perairan sekitar Pulau Raijua,
Nusa Tenggara Timur dengan metode penyelaman berkisar 2 sampai 5 meter di
bawah permukaan laut oleh nelayan setempat. Pengambilan data kondisi perairan
meliputi suhu, salinitas, pH, kedalaman, kecepatan arus, dan kecerahan.
Penentuan titik koordinat pengambilan sampel menggunakan alat GPS.
Sampel dicuci dengan air laut bersih, kemudian dikeringkan selama enam
hari menggunakan sinar matahari. Sampel kering dimasukan dalam kemasan
plastik polietilen, lalu dibawa ke laboratorium di Bogor, dalam wadah yang
tertutup. Selanjutnya dilakukan tahapan karakterisasi, ekstraksi dan pengujian

5

ekstrak. Sampel basah untuk keperluan identifikasi dilakukan dengan merendam
sampel dalam larutan alkohol 70%.
Identifikasi sampel gorgonian akar bahar
Identifikasi gorgonian dilakukan dengan mengamati bentuk koloni, bentuk
morfologi jarum sklerit yang terletak di badan maupun di tentakelnya. Langkahlangkah yang dilakukan untuk mengidentifikasi sampel gorgonian menurut Tuti
(2014) dengan cara sampel diambil kira-kira 15 cm. Bagian ujung, tengah dan
pangkal sampel dipotong 1 cm. Selanjutnya jaringan sampel dipisahkan dengan
pemutih sebanyak 5-7 tetes. Sampel dibiarkan selama 5-10 menit. Aksis tengah
koloni akan terpisah dengan sklerit berupa tepung, lalu sklerit dicuci dengan air
bersih. Sklerit yang sudah bersih dapat dilihat bentuk morfologinya dengan
mikroskop pembesaran 40x. Hasil foto bentuk sklerit dibandingankan dengan
referensi untuk menentukan bentuk polip, surface dan subsurface menggunakan
buku identifikasi Fabricius dan Alderslade (2001).
Analisis proksimat (AOAC 2005)
Pengujian proksimat terhadap akar bahar meliputi uji kadar air, protein,
lemak, abu, karbohidrat, abu tak larut asam (AOAC 2005), dan abu larut asam
dihitung secara by difference.
-

Analisis kadar air

Cawan porselin dikeringkan dalam oven pada suhu 105 oC selama
60 menit. Cawan porselin tersebut diletakkan ke dalam desikator (kurang lebih
15 menit) atau dibiarkan hingga beratnya konstan kemudian ditimbang. Sebanyak
5 g sampel dimasukkan ke dalam cawan tersebut, kemudian dikeringkan dengan
oven pada suhu 105 °C selama 300 menit, kemudian dimasukkan ke dalam
desikator dan dibiarkan sampai dingin selama 30 menit, selanjutnya ditimbang
sampai beratnya konstan. Kadar air dihitung dengan rumus :
B-C
Kadar air (%) =
x 100%
B-A
Keterangan:

-

A = berat cawan kosong (gram)
B = berat cawan dengan sampel (gram)
C = berat cawan dan sampel setelah dikeringkan (gram)

Analisis kadar lemak

Sampel seberat 5 g (W1) dimasukkan ke dalam kertas saring. Pada kedua
ujung kertas saring ditutup dengan kapas bebas lemak dan selanjutnya
dimasukkan ke dalam selongsong lemak, kemudian sampel yang telah dibungkus
dimasukkan dalam labu lemak yang sudah ditimbang beratnya (W2) dan
disambungkan dengan tabung sokhlet. Selongsong lemak dimasukkan ke dalam
ruang ekstraktor tabung sokhlet dan disiram dengan pelarut lemak (n-Heksana).
Kemudian dilakukan refluks selama 360 menit. Pelarut lemak yang ada dalam
labu lemak didestilasi hingga semua pelarut lemak menguap. Pada saat destilasi
pelarut akan tertampung di ruang ekstraktor, pelarut dikeluarkan sehingga tidak

6

kembali ke dalam labu lemak, selanjutnya labu lemak dikeringkan dalam oven
pada suhu 105 °C, setelah itu labu didinginkan dalam desikator sampai beratnya
konstan (W3). Kadar lemak dihitung dengan rumus:
W3- W2

Kadar Lemak (%) =

x 100%

W1
Keterangan :
W1 = berat sampel (g)
W2 = berat labu lemak kosong (g)
W3 = berat labu lemak dengan lemak (g)
-

Analisis kadar protein

Prinsip dari analisis protein yaitu untuk mengetahui kandungan protein
kasar (crude protein) pada suatu bahan. Pengukuran kadar protein dilakukan
dengan metode Kjeldahl. Tahap-tahap yang dilakukan dalam analisis protein
terdiri dari tiga tahap yaitu:
(a) Tahap destruksi
Sampel ditimbang sebanyak 1 gram kemudian dimasukkan ke dalam labu
Kjeldahl. Setengah butir kjeltab dimasukkan ke dalam tabung tersebut dan
ditambahkan 10 mL H2SO4 p.a 98%. Tabung yang berisi larutan tersebut
dimasukkan ke dalam alat pemanas dengan suhu 400 °C. Proses destruksi
dilakukan sampai larutan menjadi bening.
(b) Tahap destilasi
Hasil destruksi diencerkan dengan akuades hingga 100 mL dengan labu
takar. Air dipanaskan sampai mendidih di heater rangkaian alat destilator. Asam
borat sebanyak 25 mL dimasukkan ke dalam erlenmeyer. Erlenmeyer tersebut
kemudian dipasang pada tempatnya (di tempat pengeluaran sampel dan NaOH).
Hasil destruksi (larutan sampel) dipipet sebanyak 10 mL dan dimasukkan ke
dalam destilator. Setelah itu, larutan NaOH 50% sebanyak 10 mL juga
dimasukkan ke dalam destilator. Setelah larutan di dalam erlenmeyer yang berisi
asam borat berubah warna menjadi biru kehitaman atau hijau toska, erlenmeyer
diangkat dan dilakukan proses titrasi.
(c) Tahap titrasi
Titrasi dilakukan dengan menggunakan HCl 0.0947 N sampai terjadi
perubahan warna menjadi merah (warna asam borat semula). Perhitungan kadar
protein dihitung dengan rumus:
N (%) =

mL HCl − mL blanko x N HCl x 14.007
x 100%
mg contoh x faktor koreksi alat

Faktor konversi
-

= 6.25

Analisis kadar abu

Cawan abu porselen dibersihkan dan dikeringkan di dalam oven suhu
105 ºC selama 30 menit. Cawan tersebut kemudian dimasukkan ke dalam

7

desikator (30 menit) dan ditimbang. Sampel sebesar 5 g ditimbang dan
dimasukkan ke dalam cawan abu porselen. Selanjutnya dibakar di atas
kompor listrik sampai tidak berasap dan dimasukkan ke dalam tanur pengabuan
(600 ºC) selama 420 menit. Cawan dimasukkan ke dalam desikator dibiarkan
sampai dingin kemudian ditimbang.
Kadar abu dihitung dengan rumus:
C-A
Kadar abu (%) =

x 100%
B-A

Keterangan:

-

A = berat cawan kosong (gram)
B = berat cawan abu porselen dengan sampel (gram)
C = berat cawan abu porselen dengan sampel setelah dikeringkan
(gram)

Analisis kadar karbohidrat

Sampel sebanyak 5 g dimasukkan ke dalam erlenmeyer ukuran 500 mL.
Sampel ditambahkan 200 mL HCl 3% dan selanjutnya dididihkan selama 180
menit dengan pendingin tegak. Larutan hidrolisat didinginkan dan dinetralkan
menggunakan NaOH 30%. Larutan hidrolisat ditambahkan indikator fenolpthalein
3 tetes dan diencerkan dengan akuades sampai batas tera 500 mL dalam labu ukur
kemudian disaring menggunakan kertas saring. Larutan hidrolisat diambil 10 mL
menggunakan pipet dan dimasukkan ke dalam erlenmeyer 500 mL, lalu larutan
ditambahkan 25 mL larutan Luff Schrool dan 15 mL akuades serta batu didih.
Larutan dipanaskan selama 3 jam dan waktu mulai hitung saat mendidih. Larutan
hidrolisat yang telah didinginkan kemudian ditambahkan 15 mL larutan KI 20%
dan 25 ml H2SO4 25%. Larutan hidrolisat kemudian dititrasi dengan larutan
natrium tiosulfat 0.1 N yang telah distandarisasi. Kadar karbohidrat dihitung
dengan rumus:
Kadar Karhohidrat (%) =

B − V x N thio x Bst Glukosa x FP
x 100%
mg contoh

Keterangan : B = bobot setara/ekuivalen ½ dari Mr.
V = volume thiosulfat
FP = faktor pengenceran
-

Analisis kadar abu tak larut asam

Abu hasil penetapan kadar abu total dilarutkan dalam 25 mL HCl 10% dan
dididihkan selama 5 menit. Larutan tersebut kemudian disaring dengan kertas
saring bebas abu dan dicuci dengan air suling sampai bebas klorida. Kertas saring
kemudian dikeringkan dalam oven. Abu yang telah kering kemudian diabukan
kembali dalam tanur dengan menggunakan wadah cawan porselen. Cawan
porselen tersebut kemudian didinginkan dalam desikator dan ditimbang hingga
beratnya konstan. Kadar abu tidak larut asam ditentukan dengan rumus:
Berat abu (g)
Kadar abu tidak larut asam (%) =

x 100%
Berat sampel awal (g)

8

-

Analisis kadar abu larut asam

Penetapan kadar abu larut asam ditentukan berdasarkan selisih antara kadar
abu total dikurangi dengan kadar abu tak larut asam.
Kadar abu larut asam = kadar abu total – kadar abu tak larut asam.
Analisis logam berat Hg ,Cd, Pb, As dan Cu (AOAC 2002)
Sampel ditimbang 0.5 gram, dan ditambahkan asam nitrat pekat 5 mL.
panaskan dengan suhu 180 C sampai 200 C sampai 1 mL. Larutan ditambahkan
asam nitrat 10 mL dan asam perkolat 10 mL, panaskan lagi dengan suhu 180 C
sampai 200 C hingga larutan menjadi ± 5 mL. Larutan diencerkan dengan
aquades ke dalam 100 mL. Larutan disaring menggunakan kertas milipore. Filtrat
dianalisis menggunakan Atomic Absorption Spectrophotometer (AAS).
Analisis kandungan radium (Badan Tenaga Nuklir Nasional 1998)
Analisis kandungan radium dilakukan untuk mengetahui kandungan radium
yang terkandung dalam akar bahar mengacu pada Badan Tenaga Nuklir Nasional
(1998). Prosedur pengujian yaitu sampel dibersihkan, kemudian ditimbang berat
sampel (200 g - 500 g). Sampel dikeringkan pada suhu 105 C hingga kering.
Sampel yang telah kering dimasukkan dalam tanur dengan suhu 500 C sampai
menjadi abu. Sampel abu tersebut kemudian dimasukan ke dalam vial 250 mL.
Sampel ditutup rapat dan didiamkan selama 40 hari pada suhu ruang. Setelah 40
hari disimpan, sampel siap diukur kandungan radium menggunakan spektrometer
gamma.
Ekstraksi (Wikanta et al. 2005)
Ekstraksi dilakukan secara bertingkat berdasarkan Wikanta et al. (2005)
menggunakan metode maserasi. Akar bahar kering dipisahkan antara kulit dan
aksial lalu dihaluskan. Sampel ditimbang sebanyak 50 g kulit dan aksial akar
bahar dan ditambahkan masing-masing pelarut n-Heksana p.a sebanyak 300 mL
dengan perbandingan 1:6. Campuran dikocok dengan menggunakan shaker
selama 24 jam kemudian disaring menggunakan kertas whatman no 42. Filtrat
pertama disimpan dalam lemari pendingin. Ekstraksi dilakukan sampai larutan
menjadi jernih. Hasil penyaringan (filtrat) masing-masing bagian akar bahar
(kulit dan aksial) ditampung dan digabung kemudian dievaporasi menggunakan
rotary evaporator dengan suhu 40 C sampai pekat. Ekstrak pekat kemudian
dipindahkan ke dalam botol vial. Proses ekstraksi terhadap residu hasil ekstraksi
n-Heksana diulang menggunakan pelarut etil asetat p.a dan metanol p.a. Hasil
ekstrak kasar ditimbang untuk mengetahui rendemen berdasarkan jenis pelarut
menggunakan rumus:
Berat ekstrak kering (g)
Rendemen (b/b) =

x 100%
Berat sampel awal (g)

9

Akar bahar kering

Pemisahan kulit dan
aksial akar bahar

Penimbangan
Penimbangan
masing-masing
masing-masing
bagian akar
50 gram
bahar 50 g
gram
Maserasi
Maserasi
(@@2424jam)
jamxdengan
3 dengan
n-Heksana
n-Heksana

Penyaringan
(kertas
(kertasWhatman
whatmanno42)
42)

Filtrat

Evaporasi

Residu

Maserasi
Maserasi
(@@2424jam)
jamxdengan
3 dengan
etiletil
asetat
asetat

Penyaringan
(kertas
(kertasWhatman
whatmanno42)
42)

Ekstrak
n-Heksana
Filtrat

Residu

Evaporasi

Maserasi
Maserasi
(@@2424jam)
jamxdengan
3 dengan
metanol
metanol

Ekstrak
etil asetat

Penyaringan
(kertas
(kertasWhatman
whatmanno42)
42)

Filtrat

Evaporasi

Penimbangan

Ekstrak
metanol

Gambar
Gambar22metode
Metode ekstraksi bertingkat(Wikanta
bertingkat (Wikantaetetal.
al.2005).
2005).

Residu

10

Uji Kualitatif Fitokimia (Harborne 1984)
Pengujian fitokimia secara kualitatif dilakukan untuk mengetahui ada
tidaknya komponen-komponen bioaktiktif dalam ekstrak akar bahar. Pengujian
fitokimia secara kualitatif dilakukan menurut Harborne (1984) terdiri dari uji
alkaloid, steroid/tripenoid, flavanoid, saponin, fenol hidrokinon dan tanin.
Alkaloid
Sebanyak 1 mg ekstrak dari masing-masing pelarut dilarutkan dalam
beberapa tetes asam sulfat 2 N, setelah itu akan di uji dengan beberapa
pereaksi alkaloid diantaranya Dragendorff, Meyer dan Wagner. Hasil uji
positif jika terbentuk endapan coklat untuk pelarut Wagner, endapan putih
kekuningan untuk pelarut Meyer, dan endapan merah sampai jingga untuk pelarut
Dragendorff.
Pereaksi Meyer dibuat dengan cara menambahkan 1 mL HgCl2 dengan
0.5 g KI lalu dilarutkan dan diencerkan dengan akuades menjadi 100 mL dengan
labu takar. Pereaksi ini tidak berwarna.
Pereaksi Wagner dibuat dengan cara 10 mL akuades dipipet kemudian
ditambahkan 2.5 g iodin dan 2 g kalium iodida lalu dilarutkan dan diencerkan
dengan akuades menjadi 200 mL dalam labu takar. Pereaksi ini berwarna coklat.
Pereaksi Dragendorff dibuat dengan cara melarutkan 0.8 g bismut subnitrat
dalam 10 mL asam asetat dan 40 mL air. Larutan ini dicampur dengan larutan
yang dibuat dari 8 g kalium iodida dalam 20 mL air. Sebelum digunakan, 1
volume campuran ini diencerkan dengan 2.3 volume campuran 20 mL asam asetat
glasial dan 100 mL air. Pereaksi ini berwarna jingga.
Steroid/Triterpenoid
Sebanyak 1 mg sampel dilarutkan dalam 2 mL kloroform pada tabung
reaksi. Kemudian ke dalamnya ditambahkan 10 tetes anhidra asetat dan 3 tetes
asam sulfat pekat kedalam campuran larutan tersebut. Hasil uji positif apabila
terbentuk larutan berwarna merah dan berubah menjadi biru dan hijau.
Flavonoid
Sebanyak 1 mg ekstrak dari masing-masing pelarut ditambahkan
0.1 mg magnesium dan 0.4 mL amil alkohol (campuran asam klorida 37% dan
etanol 95% dengan volume yang sama) dan 4 mL alkohol, selanjutnya dikocok.
Hasil uji positif jika terbentuk warna merah, kuning atau jingga pada lapisan amil
alkohol.
Saponin (uji busa)
Sebanyak 1 mg sampel dilarutkan dalam air panas dan dikocok maka akan
menghasilkan busa. Hasil positif jika pada sampel menghasilkan busa yang stabil
selama 30 menit dan tidak hilang jika ditambahkan 1 tetes HCl 2 N.
Fenol hidrokuinon (pereaksi FeCl3)
Sampel sebanyak 1 mg kemudian diekstrak dengan etanol 70% sebanyak
20 mL. Ambil sebanyak 1 mL dari larutan yang dihasilkan kemudian ditambahkan

11

2 tetes larutan FeCl 5%. Hasil positif bila ditunjukkan dengan terbentuknya
larutan berwarna hijau atau hijau biru.
Tanin
Sampel sebanyak 1 mg ditambahkan FeCl3 kemudian campuran
dihomogenkan. Adanya warna hijau kehitaman menandakan sampel mengandung
komponen tanin.
Penetapan Kadar Semi Kuantitatif Komponen Aktif (Kromatografi Lapis
Tipis-Densitometri) (Desmiaty et al. 2014; Katrin et al. 2014)
Penetapan kadar ekstrak akar bahar dilakukan dengan metode KLTdensitometer mengacu pada Desmiaty et al. (2014) dan Katrin et al. (2014) yang
dimodifikasi dan dibandingkan dengan standar yang digunakan. Flavanoid
(standar rutin hidrat); alkaloid (standar boldin); saponin (standar digoksin) dan
steroid/triterpenoid (standar -sitosterol).
Larutan baku standar
Standar yang digunakan ditimbang sebanyak 5 mg dilarutkan dalam metanol
p.a sebanyak 10 mL sehingga di peroleh larutan standar 500 ppm. Sebanyak
10 µL larutan standar pembanding ditotolkan pada lempeng KLT silika gel GF254.
Larutan uji
Sampel ditimbang sebanyak 25 mg dilarutkan dalam 5 mL pada masingmasing pelarut (metanol, etil asetat dan n-Heksana) sehingga di peroleh larutan uji
500 ppm. Sampel selanjutnya ditotolkan sebanyak 5 sampai 10 µL pada lempeng
KLT silika gel GF254, bersama standar yang digunakan pada lempeng KLT yang
sama. Selanjutnya lempeng dikembangkan atau dielusidasi sesuai eluen masingmasing standar. Elusidasi alkaloid menggunakan eluen diklorometana : metanol
(9:1); flavonoid menggunakan eluen metanol : aquades (80:20);
steroid/triterpenoid menggunakan eluen n-Heksana : etil asetat (8:2); saponin
menggunakan eluen kloroform : metanol (4:1).
Hasil elusidasi berupa bercak noda diamati di bawah lampu UV dengan
panjang gelombang 254 dan 366 nm. Bila bercak yang diharapkan tidak terdeteksi dengan UV, maka bercak ditandai pada tepi plat sesuai dengan KLT
sampel yang telah dilakukan sebelumnya dan dideteksi dengan pereaksi
berdasarkan standar yang digunakan. Pereaksi dragendrof untuk mendeteksi
alkaloid; flavonoid disemprot dengan AlCl3; steroid/triterpenoid disemprot
dengan vanillin-asam sulfat; dan saponin disemprot dengan larutan Leiberman
Buchard; dan dipanaskan di atas hot plate 5 sampai 10 menit hingga timbul
bercak noda yang jelas. Sampel pada plat KLT yang telah dielusi kemudian
dianalisis dengan densitometer pada panjang gelombang 254 dan 366 nm. Kadar
ekstrak dihitung dengan metode perbandingan luas area uji terhadap luas area
pembanding dalam % b/b.

12

Uji Toksisitas dengan Brine Shrimp Lethality Test (BSLT) (Meyer et al. 1982;
Juniarti et al. 2009)
Uji Toksisitas dengan Metode brine shrimp lethality test (BSLT)
berdasarkan metode Meyer et al 1982; Juniarti et al 2009. Metode BSLT
digunakan untuk menguji toksisitas sampel secara umum dengan menggunakan
telur udang (Artemia salina Leach).
Penetasan larva udang
Bejana disiapkan untuk penetasan telur udang. Selanjutnya dalam bejana
tersebut diletakkan lampu untuk menghangatkan suhu dalam penetasan,
sedangkan di ruang sebelahnya diberi air laut. Ke dalam air laut dimasukkan ± 50
sampai 100 mg telur udang untuk ditetaskan. Pada bagian telur ditutup dengan
aluminium foil, dan lampu dinyalakan selama 48 jam untuk menetaskan telur.
Larva udang yang akan diuji diambil menggunakan pipet.
Persiapan larutan sampel yang akan diuji
Ekstrak yang akan diuji dibuat dalam konsentrasi 10 ppm, 100 ppm, 500
ppm dan 1000 ppm dalam air laut. Bila sampel tidak larut tambahkan 2 tetes
dimetil sulfoksid (DMSO).
Prosedur uji toksisitas
Sebanyak 100 µL air laut yang mengandung larva udang sebanyak 10-12
ekor dengan cara dipipet, kemudian dimasukkan ke dalam wadah uji. Di
tambahkan larutan sampel yang akan diuji masing-masing sebanyak 100 µL,
dengan konsentrasi 10 ppm; 100 ppm; 500 ppm; dan 1000 ppm. Setiap
konsentrasi dilakukan 3 kali ulangan. Larutan diaduk sampai homogen. Kontrol
dilakukan tanpa penambahan sampel (ekstrak). Semua vial diinkubasi pada suhu
kamar selama 24 jam di bawah penerangan lampu TL 20 Watt. Pengamatan
dilakukan setelah 24 jam dengan melihat jumlah Artemia salina yang mati pada
tiap konsentrasi. Selanjutnya dihitung mortalitas dengan cara: akumulasi mati
dibagi jumlah akumulasi hidup dan mati (total) dikali 100%. Penentuan nilai
LC50 dalam μg/mL atau ppm dilakukan menggunakan analisis probit. Meyer et
al. (1982) menyatakan suatu zat dikatakan aktif atau toksik bila nilai LC50