Optimasi produksi enzim mananase dari bakteri laut bacillus subtilis dengan substrat biomassa manan

OPTIMASI PRODUKSI ENZIM MANANASE DARI
BAKTERI LAUT Bacillus subtilis DENGAN
SUBSTRAT BIOMASSA MANAN

IRFAN PEBI NUGRAHA

DEPARTEMEN BIOKIMIA
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2014

ii

PERNYATAAN MENGENAI SKRIPSI DAN
SUMBER INFORMASI SERTA PELIMPAHAN HAK CIPTA*
Dengan ini saya menyatakan bahwa skripsi berjudul Optimasi Produksi
Enzim Mananase dari Bakteri Laut Bacillus subtilis dengan Substrat Biomassa
Manan adalah benar karya saya dengan arahan dari komisi pembimbing dan
belum diajukan dalam bentuk apa pun kepada perguruan tinggi mana pun.
Penelitian ini didanai oleh DIPA Biorefinary, Puslit Bioteknologi LIPI, tahun

anggaran 2014. Sumber informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang
diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks
dan dicantumkan dalam Daftar Pustaka di bagian akhir skripsi ini.
Dengan ini saya melimpahkan hak cipta dari karya tulis saya kepada Institut
Pertanian Bogor.
Bogor, Juni 2014

Irfan Pebi Nugraha
NIM G84100064

* Pelimpahan hak cipta atas karya tulis dari penelitian kerja sama dengan pihak
luar IPB harus didasarkan pada perjanjian kerja sama yang terkait.

ABSTRAK
IRFAN PEBI NUGRAHA. Optimasi Produksi Enzim Mananase dari Bakteri Laut
Bacillus subtilis dengan Substrat Biomassa Manan. Dibimbing oleh EDY
DJAUHARI PURWAKUSUMAH dan NANIK RAHMANI.
Enzim mananase dapat diaplikasikan secara luas di dunia industri
khususnya industri kertas, pakan, pangan, tekstil, detergen, ataupun farmasi.
Proses produksi mananase dari Bacillus subtilis dipengaruhi oleh jenis substrat,

konsentrasi substrat, pH media produksi, serta suhu fermentasi. Substrat manan
murni tidak direkomendasikan untuk produksi karena harganya yang terlalu
mahal. Tujuan penelitian ini adalah menentukan jenis substrat alternatif terbaik
dari berbagai biomassa manan untuk optimasi produksi mananase dari Bacillus
subtilis yang diisolasi dari Laut Bali. Berdasarkan penelitian ini, porang
merupakan substrat alternatif terbaik untuk produksi mananase dari Bacillus
subtilis dengan nilai aktivitas enzim sebesar 11.29 U/mL. Aktivitas mananase
optimum 37,70 U/mL diperoleh dalam 24 jam fermentasi dengan konsentrasi
substrat, pH dan suhu masing-masing 1%, pH 8 dan 50oC.
Kata kunci: Bacillus subtilis, manan, mananase

ABSTRACT
IRFAN PEBI NUGRAHA. Optimization Production of Mannanase from Marine
Bacterium Bacillus subtilis with Mannan Biomass Subrate. Supervised by EDY
DJAUHARI PURWAKUSUMAH and NANIK RAHMANI.
Mananase can be applied widely in the industrial world, such as paper,
feed, food, textiles, detergent, or pharmaceutical industries. Mannanase
production process is influenced by the type of substrate, substrate concentration,
pH of the media production and fermentation temperature. Mannan pure substrate
is not recommended because it is too expensive. The aim of this research was to

determine alternative substrates of various mannan biomass and the optimum
conditions for production of mananase by Bacillus subtilis isolated from Bali sea.
Based on this research, porang was the best alternative substrate for production of
mananase by Bacillus subtilis with enzyme acitivities of 11.29 U/mL. The
maksimum mannanase activity of 37.70 U/mL was achieved following 24 hours
of fermentation when substrat concentration, pH and temperature were controlled
at 1%, pH 8 and 50◦C respectively.
Keyword: Bacillus subtilis, mannan, mannanase

iv

OPTIMASI PRODUKSI ENZIM MANANASE DARI
BAKTERI LAUT Bacillus subtilis DENGAN
SUBSTRAT BIOMASSA MANAN

IRFAN PEBI NUGRAHA

Skripsi
sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
Sarjana Sains

pada
Departemen Biokimia

DEPARTEMEN BIOKIMIA
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2014

vi

PRAKATA
Alhamdulillah. Terima kasih, terima kasih, terima kasih. Penulis
menghaturkan segala puji bersanding syukur kepada Allah yang telah memberikan
karunia-Nya untuk membantu menyelesaikan penulisan skripsi yang berjudul
Optimasi Produksi Enzim Mananase dari Bakteri Laut Bacillus subtilis pada
Biomassa Manan. Penelitian ini dilaksanakan mulai dari bulan November 2013
sampai dengan Juni 2014 di Laboratorium Biokatalis dan Fermentasi, Bidang
Bioproses, Pusat Penelitian Bioteknologi-LIPI Cibinong.
Selesainya proses penelitian dan penulisan skripsi ini penulis hanya bisa

mengucapkan banyak terima kasih kepada ibu Nanik rahmani M.Si. dan bapak
Drs. Edy Djauhari Purwakusumah M.Si. atas segala arahan dan bimbingan selama
penelitian ataupun penulisan skripsi ini. Penulis juga mengucapkan banyak
terimakasih terutama bagi kedua orang tua penulis (Ibu dan Bapak) yang telah
memberikan dukungan dan motivasi spiritual, kepada Lisnawati yang selalu
membantu saya dan memotivasi dalam proses kegiatan penelitian dan penulisan.
Terimakasih juga penulis ucapkan kepada bapak Dr. Yopi selaku kepala
Laboratorium Biokatalis dan Fermentasi (LBF) Puslit Bioteknologi LIPI. Tidak
terkecuali kepada teman-teman di laboratorium (Yuli, Rony, Nadia, Fatia, Mona,
Muti, Ajeng, Azizah, Gading, Wida, Kholis, Ari, dkk.), selain itu khususnya
kepada Ibu Lia, Pak Diki dan untuk semua civitas LBF yang tidak bisa saya
sebutkan namanya satu-persatu penulis mengucapkan terima kasih untuk semua
bantuan yang pernah diberikan. Sekali lagi, terima kasih.
Atas segala kekurangan dan ketidaksempurnaan baik dari segi isi ataupun
cara penyampaian materi pada skripsi ini penulis memohon maaf, karena penulis
menyadari bahwa tulisan ini dibuat sebatas pengetahuan dan pemikiran penulis
yang masih dalam tahap pembelajaran. Terakhir, penulis berharap bahwa barisan
kata-kata yang terangkai dalam skripsi ini bisa bermanfaat bagi siapapun yang
membacanya.
Bogor, Juni 2014

Irfan Pebi Nugraha

viii

DAFTAR ISI

DAFTAR GAMBAR
DAFTAR LAMPIRAN
PENDAHULUAN
METODE
Bahan dan Alat
Metode Penelitian
HASIL
PEMBAHASAN
SIMPULAN DAN SARAN
Simpulan
Saran
DAFTAR PUSTAKA
LAMPIRAN

RIWAYAT HIDUP

viii
viii
1
2
2
3
6
9
13
13
13
13
16
32

DAFTAR GAMBAR
1
2

3
4
5
6
7
8
9

Hasil peremajaan Bacillus subtilis pada media LBG 0.5%
Hasil analisis pertumbuhan sel pada berbagai biomassa manan
Hasil analisis aktivitas mananase pada berbagai biomassa manan
Hasil analisis pertumbuhan sel pada konsentrasi substrat porang
Hasil analisis aktivitas mananase pada konsentrasi substrat porang
Hasil analisis pertumbuhan sel pada berbagai kondisi pH
Hasil analisis aktivitas mananase pada berbagai kondisi pH
Hasil analisis pertumbuhan sel berbagai variasi suhu
Hasil analisis aktivitas mananase berbagai variasi suhu

6
6

7
7
7
8
8
9
9

DAFTAR LAMPIRAN
1 Alur penelitian
2 Kurva standar D-(+)-Manosa
3 Hasil perhitungan aktivitas mananase dari Bacillus subtilis pada
berbagai jenis biomassa
4 Hasil perhitungan aktivitas mananase dari Bacillus subtilis pada
berbagai konsentrasi porang
5 Hasil perhitungan aktivitas mananase dari Bacillus subtilis pada
ragam pH media produksi
6 Hasil perhitungan aktivitas mananase dari Bacillus subtilis pada
ragam suhu produksi
7 Contoh perhitungan aktivitas enzim mananase dari Bacillus subtilis

laut menggunakan substrat porang 0.5% pada jam ke-0 ulangan 1
8 Hasil pembacaan spektrofotometer λ = 660 nm kultur bakteri laut
Bacillus subtilis pada berbagai substrat biomassa
9 Hasil pembacaan spektrofotometer λ = 660 nm kultur bakteri laut
Bacillus subtilis pada berbagai konsentrasi substrat porang
10 Hasil pembacaan spektrofotometer λ = 660 nm kultur bakteri laut
Bacillus subtilis pada beragam pH media produksi
11 Hasil pembacaan spektrofotometer λ = 660 nm kultur bakteri laut
Bacillus subtilis pada beragam suhu produksi

18
19
20
22
24
26
28
29
30
31

32

x

PENDAHULUAN
Mananase merupakan enzim penghidrolisis kompleks polisakarida (manan)
menjadi bentuk yang lebih sederhana seperti oligosakarida (mano-oligosakarida)
dan monosakarida (manosa). Aplikasi mananase untuk saat ini sudah sangat luas
terutama untuk bidang bioteknologi dan dunia industri. Hasil hidrolisis manan
berupa mano-oligosakarida dapat dimanfaatkan sebagai bahan pangan fungsional
pada industri pangan. Industri kertas memanfaatkan mananase dalam tahapan
proses bleaching bahan baku kertas, yaitu untuk menggantikan fungsi hidrogen
peroksida yang bermanfaat dalam proses ekstraksi lignin pada pulp. Industri kopi
instan memerlukan mananase dalam proses pengeringan produk, yaitu untuk
menurunkan tingkat viskositas ekstrak kopi dengan memecah kandungan manan
pada biji kopi. Mananase juga dibutuhkan pada industri detergen sebagai
penghilang kotoran pada pakaian yang terkena noda makanan yang mengandung
manan, galaktomanan, guar gum yang biasanya digunakan untuk zat penstabil es
krim, saus, gel rambut, dan pasta gigi. Aplikasi lain dari mananase yaitu pada
dunia industri pakan ternak, untuk meningkatkan nilai kandungan nutrisi pakan
(Dhawan dan Kaur 2007).
Aplikasi enzim mananase yang cukup luas pada berbagai industri tersebut
khususnya, memberikan peluang besar untuk memproduksi enzim pendegradasi
manan ini dalam skala industri. Dalam proses produksi mananase dibutuhkan
suatu sumber yang baik. Salah satu sumber penghasil mananase yang telah banyak
diketahui selain hewan dan tumbuhan adalah bakteri (Dhawan dan Kaur 2007).
Bakteri dengan kemampuan memproduksi enzim mananase dinamakan sebagai
bakteri manolitik, yang dapat ditemukan pada ekosistem daratan ataupun daerah
perairan. Penelitian ini difokuskan pada jenis mananase yang dihasilkan oleh
bakteri manolitik laut. Pemilihan bakteri laut dikarenakan jenis bakteri dari
perairan laut Indonesia belum banyak diteliti dan dikembangkan, selain itu
pemilihan jenis bakteri laut juga didasarkan pada sifat dan karakteristik yang unik
pada bakteri ataupun enzim yang dihasilkannya. Enzim yang diproduksi oleh
mikroba laut memiliki karakter yang lebih stabil dan lebih aktif dibanding enzim
sejenis yang bersumber dari hewan atau tumbuhan (Bull et al. 2000). Selain itu
diketahui bahwa enzim yang berasal dari mikroba laut memiliki sifat unik yaitu
toleran terhadap kadar garam tinggi serta tahan terhadap suhu dan tekanan tinggi
serta bersifat adaptif terhadap suhu dingin (Tricone 2011). Bacillus subtilis yang
berasal dari perairan pantai Sanur Bali dipilih sebagai sumber penghasil mananase
pada penelitian ini.
Kualitas produk (enzim) dari suatu fermentasi selain bergantung pada jenis
mikrobanya juga dipengaruhi substrat pada media fermentasinya. Menurut
Sumardi (2005) enzim mananase biasanya diproduksi dengan tambahan substrat
manan murni seperti Locust bean gum (LBG) pada media produksinya. Harga
substrat murni yang relatif mahal memunculkan peluang untuk memanfaatkan
biomassa pertanian sebagai sumber karbon utama (substrat) dalam produksi enzim
mananase. Di Indonesia berbagai jenis sumber manan banyak terdapat pada
limbah perkebunan dan merupakan sumber biomasa yang masih belum banyak
dimanfaatkan. Selama ini pemanfaatan biomasa mannan, terutama dari limbah
bungkil kelapa sawit dan kopra, lebih ditujukan untuk pakan ternak dengan

2

tingkat efisiensi penyerapan yang rendah (Yopi et al. 2006). Biomassa pertanian
diketahui memiliki kandungan hemiselulosa yang tinggi dan manan merupakan
salah satu koponen penyusun hemiselulosa. Beberapa jenis biomassa yang
digunakan sebagai substrat pada penelitian ini yaitu tepung umbi porang, bungkil
kelapa sawit, tandan kosong kelapa sawit dan juga bagasse. Biomassa porang
dijadikan sebagai kandidat substrat untuk produksi mananase karena umbi porang
diketahui mengandung 30.56% glukomanan (Akbar et al. 2013). Sekitar 20-40%
komposisi serat dari bungkil kelapa sawit adalah manan (Yopi et al. 2006). Hasil
penelitian Samsuri et al. (2007) menyatakan bahwa kandungan lignoselulosa pada
bagasse sekitar 52.7% selulosa, 20% hemiselulosa, dan 24.2% lignin. Sebagai
hasil samping produksi minyak kelapa sawit, tandan kosong kelapa sawit
mengadung 46.77% selulosa, 17.92% hemiselulosa, dan 4.15% lignin (Piarpuzan
et al. 2011).
Selain jenis substrat yang tepat, kondisi fermentasi juga perlu diperhatikan
agar enzim yang didapat lebih optimum. Kondisi produksi mananase dari bakteri
dapat dioptimalkan dengan memperhatikan beberapa faktor diantaranya
konsentrasi substrat, pH media serta suhu ketika fermentasi (Sumardi 2005).
Proses produksi enzim juga dipengaruhi oleh kondisi aerasi, volume media
tumbuh mikroba, serta kecepatan agitasi pada proses fermentasinya (Dan et al.
2012).
Tujuan penelitian ini adalah menentukan substrat biomassa mannan terbaik
sebagai substrat alternatif untuk produksi enzim mananase dari bakteri laut
Bacillus subtilis. Penelitian ini juga bertujuan menentukan kondisi optimum
fermentasinya (konsentrasi substrat media, pH media kultur, suhu fermentasi).
Penelitian ini dilaksanakan mulai bulan November 2014 hingga bulan Juni 2014
di Laboratorium Biokatalis dan Fermentasi, Puslit Bioteknologi, Lembaga Ilmu
Pengetahuan Indonesia, Cibinong, Bogor.

METODE
Bahan dan Alat
Penelitian ini menggunakan bahan LBG (Locust bean gum), tepung porang,
serbuk bagasse, serbuk tandan kosong kelapa sawit (TKKS), serbuk bungkil
kelapa sawit (BKS), bakteri laut Bacillus subtilis dari Pantai Sanur, Bali, Artificial
Sea Water (ASW), ekstrak khamir, bacto peptone, larutan bufer fosfat pH 6 0.05
M, larutan NaOH 2%, larutan HCl 10%, larutan DNS, larutan bufer standar pH 4,
larutan bufer standar pH 7, larutan bufer standar pH 10, akuades, es, alkohol 96%,
D-manosa, dan agar.
Peralatan yang digunakan adalah spektrofotometer UV-VIS double beam
Hitachi U-3900H, water bath Julabo TW20, shaker BioShaker BR-43FL, oven
Memmert, autoklaf Tomy High Pressure Steam Sterillizer ES-315, inkubator,
sentrifus Hitachi Micro Ultracentrifuge CS 150NX, laminar air flow Sanyo Bio
Clean Bench MCV-B13, pH meter, ice maker, neraca analitik percisa 303A, cool
box, pengaduk magnetik, vortex IKA MS 3 Basic, tabung reaksi, mikropipet 10–
1000 µL, eppendorf 1,5 mL, tips 10-1000 µL, Erlenmeyer 100 mL, 250 mL, dan

2

3

300 mL, gelas piala, botol scott, pipet tetes, sudip, cawan petri, ose, botol
semprot, termometer, bunsen, gelas ukur, labu takar 10 mL, rak tabung, dan kuvet.
Metode Penelitian
Penelitian ini terbagi atas empat tahap utama yaitu seleksi substrat manan
dari berbagai jenis biomassa, optimasi konsentrasi substrat terpilih, optimasi pH
media produksi dan optimasi suhu fermentasi.
Peremajaan Bakteri Laut Bacillus Subtilis (Yopi et al. 2006)
Pembuatan Media Peremajaan. Komposisi media yang terdiri dari 3.8%
(b/v) Artificial Sea Water (ASW), 0.5% (b/v) substrat Locust Bean Gum (LBG),
0.5% (b/v) agar, 0.1% (b/v) yeast extract dan 0.5% (b/v) bacto peptone dilarutkan
dengan akuades, dihomogenkan dengan pengaduk magnetik kemudian disterilisasi
dengan autoklaf pada tekanan 1 atm dengan suhu 121oC selama 15 menit. Media
kemudian dituang ke dalam cawan petri secara aseptik dalam laminar air flow,
dibiarkan dingin dan memadat.
Peremajaan bakteri laut Bacillus subtilis. Bakteri dari stok secara aseptik
digoreskan pada media padat dengan ose steril di dalam laminar air flow. Media
yang telah ditanami bakteri diinkubasi selama 24-48 jam pada suhu ruang.
Sebelum melakukan penanaman, laminar tempat kerja disinari sinar UV terlebih
dahulu selama 15 menit untuk membunuh mikroorganisme yang tidak diinginkan
sehingga dapat menurunkan risiko kontaminasi sebelum penanaman.
Seleksi Substrat Manan Alternatif dari Berbagai Jenis Biomassa
Media cair untuk proses produksi dibuat dua bagian yaitu untuk proses
prekultur sebanyak 10 mL (Erlenmeyer 100 mL) dan kultur sebanyak 30 mL
(Erlenmeyer 300 mL). Komposisi media yang terdiri dari 3.8% (b/v) Artificial Sea
Water (ASW), 0.1% (b/v) yeast extract dan 0.5% (b/v) bacto peptone dilarutkan
dengan akuades, dengan terlebih dahulu ditambahkan substrat porang, LBG, BKS,
TKKS dan bagasse sebanyak 0.5% (b/v) pada masing-masing Erlenmeyer,
kemudian dihomogenkan dengan pengaduk magnetik kemudian disterilisasi
dengan autoklaf pada tekanan 1 atm dengan suhu 121oC selama 15 menit. Bakteri
yang telah berhasil diremajakan secara aseptik diinokulasikan pada media
prekultur sebanyak satu ose, kemudian diinkubasi dalam inkubator bergoyang
pada kecepatan 150 rpm dan suhu 30oC selama satu malam. Prekultur dimasukkan
ke dalam media kultur secara aseptik dan diinkubasi selama 120 jam. Pemanenan
sel dilakukan setiap 24 jam sebanyak 2 mL. Masing-masing sebanyak 1 mL untuk
pengukuran pertumbuhan sel dan preparasi enzim ekstrak kasar.
Optimasi Konsentrasi Substrat Terpilih
Optimasi konsentrasi terdiri dari lima variasi konsentrasi yaitu 0.5%, 1%,
1.5%, 2% dan 2.5% (b/v). Media cair untuk proses produksi dibuat dua bagian
yaitu untuk proses prekultur sebanyak 10 mL (Erlenmeyer 100 mL) dan kultur
sebanyak 30 mL (Erlenmeyer 300 mL) masing-masing 2 ulangan untuk setiap
parameter. Komposisi media yang terdiri dari 3.8% (b/v) Artificial Sea Water
(ASW), 0.1% (b/v) yeast extract dan 0.5% (b/v) bacto peptone dilarutkan dengan
akuades, dengan terlebih dahulu ditambahkan substrat terpilih sebanyak 0.5%

19

4

(b/v), 1% (b/v), 1.5% (b/v) 2% (b/v) dan 2.5% (b/v) pada masing-masing
Erlenmeyer, kemudian dihomogenkan dengan pengaduk magnetik kemudian
disterilisasi dengan autoklaf pada tekanan 1 atm dengan suhu 121oC selama 15
menit. Bakteri yang telah berhasil diremajakan secara aseptik diinokulasikan pada
media prekultur sebanyak satu ose, kemudian diinkubasi dalam shaker pada
kecepatan 150 rpm dan suhu 30oC selama satu malam. Prekultur dimasukkan ke
dalam media kultur secara aseptik dan diinkubasi selama 120 jam dengan suhu
dan kecepatan yang sama dengan prekultur. Pemanenan dilakukan setiap 24 jam
sebanyak 2 mL. Masing-masing sebanyak 1 mL untuk pengukuran pertumbuhan
sel dan 1 mL lainnya untuk preparasi enzim ekstrak kasar.
Optimasi pH Media Produksi
Optimasi pH media terdiri dari lima variasi pH yaitu 5, 6, 7, 8 dan 9. Media
cair untuk proses produksi dibuat dua bagian yaitu untuk proses prekultur
sebanyak 10 mL (Erlenmeyer 100 mL) dan kultur sebanyak 30 mL (Erlenmeyer
300 mL) masing-masing 2 ulangan untuk setiap parameter. Komposisi media
yang terdiri dari 3.8% (b/v) Artificial Sea Water (ASW), 0.1% (b/v) yeast extract
dan 0.5% (b/v) bacto peptone dilarutkan dengan akuades, pH media untuk
masing-masing Erlenmeyer diukur dengan menggunakan pH meter, tingkat
keasaman media ditepatkan dengan penambahan sedikit asam (larutan HCl 10%)
atau sedikit basa (larutan NaOH 2%) dengan pipet tetes. Setelah diukur pH
kemudian media ditambahkan substrat terpilih pada masing-masing Erlenmeyer
dengan konsentrasi yang telah diperoleh pada optimasi konsentrasi substrat.
Media dihomogenkan dengan pengaduk magnetik kemudian disterilisasi dengan
autoklaf pada tekanan 1 atm dengan suhu 121oC selama 15 menit. Bakteri yang
telah berhasil diremajakan secara aseptik diinokulasikan pada media prekultur
sebanyak satu ose, kemudian diinkubasi dalam shaker pada kecepatan 150 rpm
dan suhu 30oC selama satu malam. Prekultur dimasukkan ke dalam media kultur
secara aseptik dan diinkubasi selama 120 jam dengan suhu dan kecepatan yang
sama dengan prekultur. Pemanenan dilakukan setiap 24 jam sebanyak 2 mL.
Masing-masing sebanyak 1 mL untuk pengukuran pertumbuhan sel dan 1 mL
lainnya untuk preparasi enzim ekstrak kasar.
Optimasi Suhu Produksi
Optimasi suhu produksi terdiri dari empat variasi yaitu suhu 20oC, 30oC,
o
40 C dan 50oC. Media cair untuk proses produksi dibuat dua bagian yaitu untuk
proses prekultur sebanyak 10 mL (Erlenmeyer 100 mL) dan kultur sebanyak 30
mL (Erlenmeyer 300 mL) masing-masing 2 ulangan untuk setiap parameter.
Komposisi media yang terdiri dari 3.8% (b/v) Artificial Sea Water (ASW), 0.1%
(b/v) yeast extract dan 0.5% (b/v) bacto peptone dilarutkan dengan akuades,
kemudian pH media diukur dengan menggunakan pH meter, tingkat keasaman
media ditepatkan dengan penambahan sedikit asam (larutan HCl 10%) atau sedikit
basa (larutan NaOH 2%) dengan pipet tetes. Setelah diukur pH kemudian media
ditambahkan substrat terpilih pada masing-masing Erlenmeyer dengan konsentrasi
yang telah diperoleh pada optimasi konsentrasi substrat. Media dihomogenkan
dengan pengaduk magnetik kemudian disterilisasi dengan autoklaf pada tekanan 1
atm dengan suhu 121oC selama 15 menit. Bakteri yang telah berhasil diremajakan
secara aseptik diinokulasikan pada media prekultur sebanyak satu ose, kemudian

4

5

diinkubasi dalam inkubator bergoyang pada kecepatan 150 rpm dan suhu sesuai
variasi yang ada yaitu masing-masing 20oC, 30oC, 40oC dan 50oC selama satu
malam. Prekultur dimasukkan ke dalam media kultur secara aseptik dan
diinkubasi selama 120 jam pada suhu dan kecepatan yang sama dengan prekultur.
Pemanenan sel dilakukan setiap 24 jam sebanyak 2 mL. Masing-masing sebanyak
1 mL untuk pengukuran pertumbuhan sel dan 1 mL lainnya untuk preparasi
ekstrak kasar enzim mananase.
Pembuatan Kurva Pertumbuhan Sel Bakteri laut Bacillus subtilis (Yopi et al.
2006)
Kurva pertumbuhan sel dibuat dengan cara melakukan pengukuran optical
density (OD) 1 mL hasil pemanenan sel setiap 24 jam, mulai dari jam ke-0 sampai
jam ke 120. Pengukuran OD dilkukan dengan spektrofotometer UV-Vis pada
panjang gelombang 660 nm.
Preparasi Ekstrak Kasar Mananase (Yopi et al. 2006)
Enzim mananase ekstrak kasar didapatkan dari ekstraksi kultur sel dengan
cara sentrifugasi pada kecepatan 12000 rpm selama 15 menit pada suhu 4oC,
kemudian supernatan dipindahkan pada microtube ependorf baru dan
disentrifugasi pada kecepatan, suhu dan waktu yang sama. Ekstrak enzim
mananase dipertahankan pada suhu dingin yaitu minimal 4°C untuk menjaga
aktifitas enzimnya (Liu et al. 2011). Hasil ekstraksi enzim (supernatan) yang
diperoleh merupakan enzim ekstrak kasar mananase yang siap digunakan untuk
proses pengujian.
Analisis Aktivitas Ekstrak Kasar Mananase (Miller 1959)
Aktivitas enzim mananase ditentukan dengan menggunakan metode DNS
yang telah dimodifikasi, yaitu mereaksikan 0.25 mL enzim yang telah diencerkan
dengan 0.25 mLsubstrat LBG 0.5% (b/v) dalam bufer fosfat pH 6 (0.05 M) dan
ditambahkan reagen DNS sebanyak 0.75 mL dalam tabung reaksi, kemudian
diinkubasi pada suhu 50°C selama 15 menit. Reaksi dihentikan dengan merendam
tabung reaksi berisi sampel dalam air mendidih 100°C selama 15 menit. Gula
pereduksi yang dibebaskan ditentukan dengan menggunakan metode DNS (Miller
1959). Warna yang terbentuk diukur dengan spektrofotometer dengan panjang
gelombang 540 nm. Nilai absorbansi yang diperoleh dikonversi menjadi
konsentrasi gula pereduksi (ppm) menggunakan persamaan yang didapat dari
kurva standar manosa. Kurva standar manosa dibuat dengan cara melarutkan 0.01
g D-manosa ke dalam 10 mL bufer fosfat 0.05 M (1000 ppm), kemudian
diencerkan secara bertingkat pada konsentrasi 100 ppm sampai 900 ppm. Setiap
hasil pengenceran direaksikan sebanyak 0.5 mL dengan 0.75 mL reagen DNS,
dipanaskan 15 menit dalam water bath 100oC, didinginkan dalam es selama 10
menit, kemudian diukur nilai absorbansinya dengan spektrofotometer UV-Vis
pada panjang gelombang 540 nm. Satu unit aktivitas enzim (U) yaitu jumlah
mikromol gula pereduksi yang terbentuk per mL enzim per menit (Kanti 2005).
DNS adalah senyawa aromatis yang mampu bereaksi dengan gula reduksi
dalam suasana lingkungan yang bersifat basa. Hasil uji DNS berwarna jingga
kemerahan sehingga dapat diukur dengan spektrofotometer pada panjang
gelombang 540 nm. Nilai absorbansi sebanding dengan jumlah gula reduksi.

19

6

Penambahan NaOH ke dalam komposisi larutan reagen DNS bertujuan untuk
memberikan suasana basa ketika reaksi. Reaksi DNS ini merupakan reaksi redoks,
gugus aldehid gula pereduksi akan teroksidasi menjadi gugus karboksil,
sedangkan DNS (kuning) sebagai oksidator akan tereduksi membentuk 3-amino5-nitrosalicylic acid (jingga-merah kecolatan) (Sastrohamidjojo 2005).

HASIL
Peremajaan Bakteri Laut Bacillus Subtilis pada Media Padat
Bakteri laut Bacillus subtilis berhasil diremajakan pada media padat
mengandung substrat LBG 0.5% (b/v). Pertumbuhan Bacillus subtilis ditandai
dengan adanya koloni berwarna putih kecoklatan, sedikit berlendir dan tumbuh
pada permukaan media padat (Gambar 1) Bakteri yang diremajakan digunakan
untuk perlakuan selanjutnya.

Gambar 1 Peremajaan bakteri laut Bacillus subtilis pada media LBG 0.5%
Seleksi Substrat Manan Alternatif dari Berbagai Jenis Biomassa
Kurva pertumbuhan sel Bacillus subtilis dengan substrat biomassa manan
menunjukkan bahwa porang memiliki nilai pertumbuhan lebih tinggi
dibandingkan biomassa lain. Pertumbuhan Bacillus subtilis pada media TKKS dan
bagasse memliliki laju yang lambat (Gambar 2). Hasil ananisis aktivitas mananase
menunjukkan bahwa tepung porang memiliki nilai aktivitas enzim paling tinggi
yaitu 11.3 U/mL pada jam ke-96, nilai ini lebih tinggi dibanding aktivitas enzim
pada biomassa BKS, TKKS dan bagasse dengan LBG sebagai pembanding
(Gambar 3).

Gambar 2 Pertumbuhan sel Bacillus subtilis pada berbagai biomassa manan.
●Porang ●BKS ●Bagasse ●TKKS ●LBG

6

7

Gambar 3 Aktivitas mananase dari Bacillus subtilis pada berbagai biomassa
manan. ●Porang ●BKS ●Bagasse ●TKKS ●LBG
Optimasi Konsentrasi Substrat Porang
Berdasarkan hasil seleksi substrat, porang dipilih sebagai substrat
alternatif untuk proses optimasi. Tahap pertama diawali dengan optimasi
konsentrasi porang pada 0.5%, 1%, 1.5%, 2% dan 2.5% (b/v). Kurva pertumbuhan
Bacillus subtilis pada panjang gelombang 660 nm menunjukkan perbedaan laju
pertumbuhan yang tidak berbeda nyata antar konsentrasi substrat. Kurva yang
terbentuk saling berimpit dengan pertumbuhan optimum pada jam ke-24 (Gambar
4). Hasil analisis aktivitas mananase menunjukkan konsentrasi 1% memiliki nilai
aktivitas enzim lebih tinggi dari konsentrasi lain yaitu sebesar 15,64 U/mL pada
jam ke-96 (Gambar 5).

Gambar 4 Pertumbuhan sel Bacillus subtilis pada berbagai konsentrasi substrat
porang. ●0.5% ●1% ●1.5% ●2% ●2.5%

Gambar 5 Aktivitas mananase dari Bacillus subtilis pada berbagai variasi
konsentrasi substrat porang. ●0.5% ●1% ●1.5% ●2% ●2.5%

19

8

Optimasi pH Media Produksi
Proses optimasi produksi mananase dari Bacillus subtilis laut dilanjutkan
dengan proses optimasi pH media produksi. Optimasi dilakukan dengan
mengggunakan substrat porang 1% pada ragam pH 5, 6, 7, 8, dan 9. Pertumbuhan
optimum dari Bacillus subtilis terjadi pada jam ke-96 (gambar 6). Berdasarkan
analilisi aktivitas enzim, aktivitas mananase dari Bacillus subtilis laut optimum
pada pH 8 dengan waktu inkubasi selama 72 jam, dengan nilai aktivitas enzim
mencapai 19,31 U/mL (Gambar 7).

Gambar 6 Pertumbuhan sel Bacillus subtilis dengan substrat porang 1% pada
berbagai kondisi pH media produksi. ●5 ●6 ●7 ●8 ●9

Gambar 7 Aktivitas mananase dari Bacillus subtilis dengan substrat porang 1%
pada berbagai kondisi pH media produksi. ●5 ●6 ●7 ●8 ●9
Optimasi Suhu Produksi
Setelah diketahui jenis substrat alternatif terbaik, konsentrasi substrat
optimum, serta pH media optimum, selanjutnya dilakukan tahap optimasi suhu
dengan kondisi konsentrasi substrat porang 1%, pH media 8 pada ragam variasi
suhu 20oC, 30oC, 40oC dan 50oC. Laju pertumbuhan Bacillus subtilis pada kondisi
fermentasi suhu 40oC lebih tinggi dibanding suhu lain (Gambar 8). Berdasarkan
hasil analisis aktivitas enzim, pada suhu fermentasi 50oC nilai aktivitas mananase
lebih tinggi dibanding suhu lain yaitu 40oC, 30oC, dan 20oC (Gambar 9), nilai
aktivitas enzimnya mencapai 37,70 U/mL pda jam ke-24.

8

9

Gambar 8 Pertumbuhan sel Bacillus subtilis dengan substrat porang 1% pada pH
media 8 dengan berbagai variasi suhu. ●20oC ●30oC ●40oC ●50oC

Gambar 9 Aktivitas mananase dari Bacillus subtilis dengan substrat porang 1%
pada pH media 8 dengan berbagai variasi suhu. ●20oC ●30oC ●40oC
●50oC

PEMBAHASAN
Seleksi Substrat Manan Alternatif dari Berbagai Jenis Biomassa
Bakteri membutuhkan nutrien agar dapat bertahan hidup dan berkembang
biak. Salah satu nutrien penting bagi pertumbuhan sel bakteri adalah karbon yang
penting sebagai sumber energi. Karbon dibutuhkan bakteri sebagai sumber energi
utama untuk proses pertumbuhan dan replikasi. Karbon biasanya diperoleh bakteri
dari hasil pemecahan enzimatis molekul-molekul organik kompleks seperti
karbohidrat (Greg and Richard 2009).
Agar bakteri dapat bertahan hidup, berkembang dengan baik dan
menghasilkan enzim yang diinginkan, dalam komposisi media kulturnya harus
ditambahkan sumber karbon utama sebagai substrat. Suatu substrat dimanfaatkan
oleh mikroorganisme untuk pertumbuhan biomassa, pemeliharaan sel dan
menghasilkan produk (Yuliana 2008). Jenis substrat biasanya disesuaikan dengan
jenis enzim yang akan diproduksi. Manan merupakan substrat spesifik untuk
produksi enzim mananase. Substrat manan yang ditambahkan ke dalam media
produksi enzim mananase merupakan gula kompleks (polisakarida), sel tidak
dapat mencerna secara langsung karena molekul gula kompleks terlalu besar.

19

10

Manan yang merupakan polisakarida adalah satu-satunya sumber karbon
yang ada dalam media, sehingga akan didegradasi menjadi gula yang lebih
sederhana seperti monosakarida atau oligosakarida oleh sel bakteri. Polisakarida
manan hanya akan terdegradasi menjadi gula sederhana jika sel mensekresikan
enzim pendegradasi manan berupa enzim mananase. Mananase akan
mendegradasi manan, glukomanan, galaktomanan, galaktoglukomanan menjadi
manosa dan gula-gula sederhana lain sehingga karbohidrat yang ada dapat dicerna
oleh sel bakteri. Oleh karena itu pemilihan jenis substrat harus tepat agar enzim
mananase yang dihasilkan oleh bakteri lebih optimum.
Biomassa yang dihasilkan dari berbagai macam limbah pertanian diketahui
memiliki kandungan hemiselulosa yang tinggi. Hemiselulosa diketahui sebagai
polisakarida kedua terbanyak di alam yang sangat melimpah setelah selulosa.
Hemiselulosa memiliki komponen penyusun utama yang terdiri atas hetero-1,4-βD-xilan dan hetero-1,4-β-D-manan (galaktoglukomanan, galaktomanan, dan
glukomanan). (Sumadi 2005). Fakta ini memungkinkan bahwa biomassa dari
limbah pertanian dapat dijadikan substrat manan alternatif.
Kurva pertumbuhan Bacillus subtilis pada berbagai macam substrat
menunjukkan laju yang berbeda. Bacillus subtilis yang dikulturkan pada media
yang ditambahkan substrat porang memiliki laju pertumbuhan paling tinggi jika
dibandingkan pertumbuhan Bacillus subtilis pada media yang ditambahkan
substrat dari biomassa lain seperti TKKS, bagasse ataupun BKS. Berdasarkan
kurva dapat diketahui bahwa Bacillus subtilis pada media kultur telah tumbuh
dengan baik (gambar 2).
Diketahui terdapat 4 fase pertumbuhan bakteri ketika ditumbuhkan pada
kultur curah (batch culture), yaitu fase adaptasi (lag phase), fase perbanyakkan
(exponential phase), fase statis (stationer phase), dan fase kematian (death phase)
(Purwoko, 2007). Berdasarkan analisa pertumbuhan Bacillus subtilis pada media
substrat porang, fase lag atau fase penyesuaian bakteri terhadap lingkungannya
yang baru terjadi pada jam ke-0 hingga jam ke-24, ditunjukkan dengan garis yang
cenderung mendatar dan hanya sedikit naik di awal kurva. Fase log dimulai pada
jam ke-24 sampai jam ke-72 di mana bakteri mulai tumbuh dan berkembang
secara cepat seiring berjalannya waktu fermentasi, garis kurva cenderung
meningkat tajam. Fase stasioner terjadi ketika sel bakteri yang mati dan yang
berkembang biak kurang lebih seimbang sehingga membuat garis kurva sedikit
mendatar seperti yang terlihat pada kurva sekitar jam ke-72 dan jam ke-96, pada
jam ini terjadi aktivitas mananase optimum pada media dengan substrat porang.
Biasanya kurva pertumbuhan diakhiri dengan fase kematian dengan garis
kurva yang semakin menurun, hal ini disebabkan habisnya kandungan zat
makanan pada media sehingga bakteri tidak mampu berkembang biak dan
melakukan metabolisme, keadaan ini menyebabkan jumlah sel yang hidup
semakin berkurang (Yuwono 2005). Bentuk kurva yang cenderung mendatar pada
jam ke-96 sampai jam ke-120 diperkirakan karena adanya fase adaptasi kembali
Bacillus subtilis terhadap suber karbon lain selain manan yang terkandung dalam
biomassa, hal ini bersifat wajar karena biomassa tersusun atas berbagai macam
karbohidrat (Chuan et al. 2006).
Hasil seleksi berbagai jenis biomassa yang diuji sebagai substrat alternatif
untuk produksi mananase dari bakteri laut Bacillus subtilis pada percobaan ini
menunjukkan nilai yang beragam, hal ini didapat diamati dari kurva aktivitas

10

11

ekstrak kasar enzim mananase (Gambar 3). Nilai aktivitas enzim mananase
menunjukkan banyaknya unit enzim yang diproduksi oleh Bacillus sbutilis laut
pada saat fermentasi. Nilai aktivitas mananase pada media yang ditambahkan
porang 0.5% sebagai substrat menunjukkan nilai aktivitas enzim sebesar 11.3
U/mL, nilai ini lebih tinggi dibanding nilai aktivitas mananase dengan substrat
biomassa lain seperti TKKS, bagasse, dan BKS pada konsentrasi yang sama.
Aktivitas enzim tertinggi terjadi pada jam ke-96, ini dapat diartikan bahwa
produksi enzim mananase oleh Bacillus subtilis laut paling banyak terjadi pada
jam ke-96. Secara analitik, aktivitas enzim mananase pada media substrat porang
lebih tinggi dibanding yang lain, antara lain disebabkan karena komposisi tepung
porang mengandung persentase manan yang tinggi yaitu sekitar 30.56%
glukomanan (Akbar et al. 2013). Konsentrasi manan tersebut lebih tinggi
dibanding bungkil kelapa sawit (BKS) yang mengandung sekitar 20-40% manan
(Yopi et al. 2010). Biomassa lain seperti bagasse diketahui hanya mengadung
20% hemiselulosa (mengandung manan) dan substansi TKKS terdiri atas 17.92%
hemiselulosa (mengandung manan) (Samsuri et al. 2007, Piarpuzan et al. 2011).
Penelitian sebelumnya oleh Chuan et al. (2006) pada Bacillus subtilis ATCC3366
menunjukkan aktivitas mananase optimum sebesar 8 U/mL setelah diinkubasi
selama 36 jam pada substrat biomassa PKC (palm kernel cake).
Berdasarkan hasil seleksi substrat manan, tepung porang dipilih sebagai
substrat terbaik dan digunakan sebagai sumber karbon utama dalam tahap
optimasi produksi mananase dari bakteri laut Bacillus subtilis. Media dengan
substrat tepung porang memiliki nilai aktivitas mananase lebih tinggi dibanding
biomassa lain yang digunakan pada pengujian ini.

Optimasi Konsentrasi Substrat Porang
Pertumbuhan Bacillus subtilis pada proses optimasi konsentrasi substrat
porang diamati dari kurva pertumbuhannya (Gambar 4). Berdasarkan kurva, laju
pertumbuhan bakteri optimum pada jam ke-24, pertumbuhan meningkat drastis
pada rentang jam ke-0 sampai jam ke-24 kemudian menurun di jam selanjutnya
hingga hari terakhir pemanenan. Kurva pertumbuhan bakteri laut Bacillus subtilis
pada beberapa konsentrasi tidak menunjukkan perbedaan yang signifikan,
sehingga garis kurva cenderung saling berimpit. Tidak adanya pengenceran
menyebabkan konsentrasi sel yang diukur terlalu tinggi sehingga menyebabkan
ketidaktepatan dalam pengukuran nilai absorbansi sampel oleh spektrofotometer.
Konsentrasi sampel yang terlalu pekat sangat mempengaruhi nilai OD (optical
density) sampel yang terbaca oleh spektrofotometer (Assidqi et al. 2012).
Hasil analisis aktivitas enzim mananase pada tahap optimasi konsentrasi
substrat menunjukkan bahwa konsentrasi substrat porang paling optimum adalah
1%, nilainya lebih tinggi dibanding aktivitas enzim mananase pada konsentrasi
lain seperti 0.5%, 1.5%, 2.% dan 2.5% (Gambar 5). Nilai aktivitas mananase
untuk konsentrasi 1 % optimum pada jam ke-96 dengan nilai sebesar 15.64 U/mL,
lebih tinggi dibanding aktivitas mananase pada konsentrasi 0.5%, 1.5%, 2.% dan
2.5% berturut-turut adalah 8.13 U/mL, 10.47 U/mL, 11.87 U/mL dan 12.67
U/mL. Keadaan ini menyatakan bahwa mananase paling banyak diproduksi pada
jam ke-96 oleh bakteri Bacillus subtilis laut pada konsentrasi substat 1%. Dapat
dilihat bahwa konsentrasi substrat yang terlalu rendah (0.5%) tidak dapat

19

12

memproduksi enzim secara maksimal, namun konsentrasi substrat yang terlalu
tinggi (>1%) juga bersifat tidak efektif untuk proses produksi. Konsentrasi
substrat yang tinggi membuat molekul mananase berinteraksi dengan substratnya
membentuk kompleks enzim dengan dobel substrat yang sifatnya tidak produktif,
sehingga aktivitas enzim menjadi rendah (Sumardi 2005). Konsentrasi substrat
yang terlalu tinggi pada proses kultur dapat menyebabkan penurunan laju transfer
oksigen yang penting bagi proses metabolisme mikroba, karena konsentrasi
substrat yang tinggi dapat membatasi gerak pencampuran media oleh shaker
(Purwadaria et al. 2003).

Optimasi pH media Produksi
Berdasarkan kurva pertumbuhan Bacillus subtilis memiliki pH optimum 6
untuk pertumbuhannya (Gambar 6), namun berbeda dengan pH optimum untuk
produksi enzimnya yang optimum pada pH 8 (Gambar 7). Produksi mananase
pada pH 5 dan pH 9 sangat rendah jika dilihat dari nilai aktivitas enzimnya, hal ini
dikarenakan kondisi media yang terlalu asam atau terlalu basa yang menyebabkan
penghambatan proses produksi enzim. Nilai pH diketahui dapat mempengaruhi
konformasi enzim mananase (Sumardi 2005). Konformasi enzim akan berubah
jika berada pada kondisi pH terlalu asam atau terlalu basa (Agustini 2009).
Sejalan dengan penelitian sebelumnya oleh Dan et al. (2012) yang
menyatakan bahwa bakteri jenis Bacillus sp. HDYM-05 optimum memproduksi
mananase pada pH 8. Namun Jiang et al. (2006) menyatakan bahwa pH optimum
untuk Bacillus subtilis adalah pH 6. Selain itu Bacillus sp. memiliki pH optimum
untuk proses produksi mananase pada pH 6.5 (Meenakshi et al. 2010). Berbeda
dengan Bacillus subtilis IE dan Bacillus pumilus S5 pada penelitian Adebayo et
al. (2013) yang yang menyatakan bahwa enzim mananase diproduksi secara
optimum pada kondisi media pH 5.
Berdasarkan kurva, nilai aktivitas enzim optimum untuk pH 8 terjadi sekitar
jam ke-72. Hasil ini menunjukkan bahwa perubahan pH media mempengaruhi
waktu optimum produksi mananase oleh Bacillus subtilis. Waktu optimum
produksi enzim mananase berubah dari jam ke-96 menjadi jam ke-72 setelah
dilakukan proses optimasi pada pH medianya. Sejalan dengan Gupta et al. (2003)
yang menyatakan bahwa induksi perubahan morfologi bakteri dan sekresi enzim
dipengaruhi oleh kondisi pH media tumbuh bakteri.

Optimasi Suhu Produksi
Metabolisme suatu organisme tidak terlepas dari kondisi lingkungannya,
termasuk pengaruh suhu. Suhu diketahui mampu mengendalikan pertumbuhan
bakteri dan mempengaruhi laju pertumbuhannya, selain itu suhu juga
mempengaruhi jumlah total pertumbuhan dari suatu organisme (Pelczar dan Chan
2008). Suhu merupakan faktor penting yang dapat mempercepat atau bahkan
memperlambat laju metabolisme suatu organisme termasuk bakteri yang
dikulturkan pada media fermentasi. Oleh sebab itu perlu dilakukan optimasi suhu
pada proses produksi mananase dari Bacillus subtilis laut.
Bacillus subtilis laut yang dikulturkan memiliki suhu optimum pertumbuhan
pada temperatur 40oC (Gambar 8) namun sangat baik memproduksi mananase

12

13

pada temperatur 50oC, dengan nilai aktivitas mananase sebesar 37.70 U/mL pada
jam ke-24 (Gambar 9). Pertumbuhan Bacillus subtilis meningkat sejalan dengan
bertambahnya suhu. Dapat dilihat dari kurva pertumbuhannya ketika suhu
dinaikan hingga 40oC pertumbuhannya meningkat drastis namun kembali
menurun pada suhu 50oC. Terlihat bahwa pertumbuhan Bacillus subtilis sangat
dipengaruhi oleh perubahan suhu dengan perubahan temperatur pada rentang 10oC
(Prescott et al. 2008). Berdasarkan pertumbuhannya bakteri ini digolongkan ke
dalam kelompok mesofilik, yang tumbuh optimum pada temperatur 30oC-45oC
(Tang et al. 2009), namun optimum memproduksi mananase pada suhu 50oC.
Penelitian sebelumnya oleh Younis et al. (2010) menyatakan bahwa
Bacillus subtilis KO strain tubuh dengan baik pada temperatur 45oC dengan waktu
optimum pertumbuhan 24 jam pada substrat mollase. Sedangkan Jiang et al.
(2006) menyatakan kondisi optimum untuk produksi mananase dari Bacillus
subtilis WY34 adalah 50oC, dengan substrat porang 2% dan pH optimum 6.

SIMPULAN DAN SARAN
Simpulan
Porang merupakan substrat alternatif terbaik untuk proses produksi enzim
mananase dari bakteri laut Bacillus subtilis karena memiliki nilai aktivitas enzim
mananase yang lebih tinggi dibanding biomassa lain seperti TKKS, BKS dan
bagasse yaitu sebesar 11.29 U/mL. Proses optimasi produksi enzim mananase
telah berhasil dilakukan dengan menggunakan substrat porang pada konsentrasi
1% dan pH media 8 dengan suhu 50oC. Produksi enzim mananase mengalami
peningkatan setelah tahap optimasi berdasarkan nilai aktivitas enzimnya, dari
11.29 U/mL pada jam ke-96 menjadi 37.70 U/mL pada jam ke-24.
Saran
Proses optimasi dilengkapi dengan parameter-parameter lain seperti aerasi,
kecepatan agitasi, dan penambahan garam-garam mineral yang dibutuhkan untuk
pertumbuhan Bacillus subtilis agar proses produksi dapat lebih dioptimalkan.
Enzim dapat dipurifikasi agar lebih murni dan dapat diaplikasikan secara luas.

DAFTAR PUSTAKA
Adebayo-tayo B, Elelu T, Akinola G, Oyinloye I. 2013. Screening and production
of mannanase by Bacillus strains isolated from fermented food
condiments. IRFB 13: 53-62.
Agustini N dan Kusmiati. 2009. Identifikasi dan uji aktivitas antibakteri senyawa
aktif secara maserasi dan digesti dalam berbagai pelarut dari mikroalga
Dunaliella salina. Seminar Nasional IX Pendidikan Tinggi FKIP UNS
544-551.

19

14

Assidqi K, Tjahjaningsih W, Sigit S. 2012. The potentials of leaves extracts of
patikan kebo (Euphorbia hirta) as antibacterial against Aeromonas
hydrophila in vitro. Journal of Marine and Coastal Science.1(2), 113-124.
Akbar H, Supriyanto A, Haryani K. 2013. Karakterisasi tepung konjak dari
tanaman iles-iles (Amorphallus oncophyllus) di Daerah Guning Kreo
Semarang Jawa Tengah. J Chem Tech Ind 2 (4): 4-47.
Arisman. 2009. Buku Ajar Ilmu Gizi. Jakarta: Penerbit buku kedokteran EGC.
Bull AT, Ward AC, Goodfellow M. 2000. Search and discovery strategies for
biotechnology: The Paradim Shift. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 64 (3): 573.
Chuan CH, Krishnaiah K, Wong CM, Janaun J. 2006. Palm Kernel Cake as
Substrate for β-Mannanase production by Bacillus subtilis ATCC336
under Submerged and Solid State Fermentation. Proceedings of the 1st
International Conference on Natural Resource Engineering & Technology
182-185.
Dan Z, Wenxiang P, Gang S, hongzhi L, Xue L, Jingping G. 2012. Optimization
of mannanase production by Bacillus sp. hdym-05 through factorial
method and response surface methodology. Afr. J. Microbiol. Res. 6 (1):
176-182.
Dhawan S, Kaur J. 2007. Microbial mannanases: An overview of production and
applications. Critical Reviews in Biotechnology 27: 197–216.
Greg A. Somerville dan Richard A. Proctor. 2009. At the crossroads of bacterial
metabolism and virulence factor synthesis in Staphylococci. Microbiol.
Mol. Biol. Rev. 73(2): 233.
Gupta R, Gigras P, Mohapatra H, Goswami VK, Chauhan B. 2003. Microbialamylases: a biotechnological perspective. Journal of Process. Biochem.
38: 1599-1616.
Jiang Z, Wei Y, Li D, Li L, Chai P, dan Kusakabe I. 2006. High-level production,
purification, and characterization of a thermostable β-mannanase from the
newly isolated Bacillus subtilis WY34. J. Carbo Polys. 66:89-96.
Kanti Atit. 2005. Cellulolytic actinomycetes isolated from soil in Bukit Duabelas
National Park, Jambi. J. Biol Diversity. 6(2): 85-89.
Liu J, Zhang Z, Zhu H, Dang H, Lu J, Cui Z. 2011. Isolation and characterization
of α-amilase from marine Pseudomonas sp. K6-28-040. J Biotech 10 (14):
2733 -2740.
Meenakshi M, Singh G, Bhalla A, Hoondal GS. 2010. Solid State fermentation
and characterization of partially purified thermostable mannanase krom
Bacillus sp. MG-33. Bioresource. 5(3):1689-1701.
Miller GL. 1959. Use of dinitrosalisylic acid reagent for determination of reducing
sugar. Anal Chem 31(3):426–428.
Pelczar MJ, Chan ECS. 2008. Dasar-Dasar Mikrobiologi. Hadioetomo RS, Imas
T, Tjitrosomo SS, Angka SL, penerjemah. Jakarta: UI-Press. Terjemahan
dari: Elements of Microbiology.

14

15

Piarpuzan D, Quintero JA, Cardona CA. 2011. Empty fruit bunches from palm as
a potential raw material for fuel ethanol production. Biomass and
Bioenergy 35: 1130-1137.
Purwadaria T, Haryati T, Frederick E, Tangendjaja B. 2003. Optimation of βmannanase production on submerged culture of Eupenicillium javanicum
as well as pH and temperature enzyme characterization. JITV 8 (1).
Samsuri M, Gozan M, Mardias R, Baiquni M, Hermansyah H, Wijanarko A,
Prasetya B, Nasikin M. 2007. Pemanfaatan selulosa bagas untuk produksi
etanol melalui sakarifikasi dan fermentasi serentak dengan enzim xilanase.
Makara Teknologi 11 (1): 17-24.
Sastrohamidjojo. 2005. Kimia Organik, Sterokimia, Lemak, dan Protein.
Yogyakarta: Gadjah Mada University Press.
Sumardi. 2005. Optimasi produksi enzim β-mananase ekstraseluler dari bakteri
Geobacillus Stearothermophilus L-07. J. Sains Tek. 11: 2.
Tricone A. 2011. Marine biocatalyst: enzymatic features and apllication. Mar.
Drugs. 9: 478-499.
Yopi, Purnawan A, Thontowi A, Hermansyah H, Wijanarko A. 2006. Preparasi
manan dan mananase kasar dari bungkil kelapa sawit. Jurnal Teknologi 4:
312-319.
Yopi, Susilaningsih D, Purnawan A, Hermansyah H, Thontowi A, Djohan AC,
Praharyawan S, Lisdiyanti. 2010. Palm kernel cake biomass fermentation
using stirrer fermentor for mananase and saccharides production.
Prosiding Asean-Korea Symposium and Workshop on Biorefinery
Technology 455-459.
Younis Magdi AM, Hezayen Francis F, Nour-Eiden MA, Shabeb MSA. 2010.
Optimization of cultivation medium and growth condition for Bacillus
subtilis KO strain isolated from sugar cane molasses. American-Eurasian
J. Agric. And Envviron. Sci. 7(1): 31-37.
Yuliana Neti. 2008. Kinetika pertumbuhan bakteri asam laktat isolat T5 yang
berasal dari tempoyak. Industrial Tech J and Agric. 13(2).
Yuwono T. 2005. Biologi Molekular. Yogyakarta : Erlangga.

19

16

LAMPIRAN

16

17

Lampiran 1 Alur Penelitian
PEREMAJAAN
Bacillus subtilis

SELEKSI SUBSTRAT ALTERNATIF
(BKS, TKKS, Bagasse, Porang)

OPTIMASI PRODUKSI ENZIM
MANANASE
Optimasi konsentrasi substrat
Optimasi pH media produksi

Optimasi suhu produksi

Proses yang dilakukan pada tahap seleksi substrat dan optimasi:
1. Prekultur
2. Kultur
3. Pengukuran pertumbuhan sel
4. Preparasi enzim ekstrak kasar
5. Analisis aktivitas enzim

18

Lampiran 2 Kurva standar D-(+)-Manosa

20

21

Lampiran 3 Hasil perhitungan aktivitas mananase dari Bacillus subtilis pada berbagai jenis biomassa
Jenis
Inkubasi
biomassa

Porang

BKS

Bagasse

0
24
48
72
96
120
0
24
48
72
96
120
0
24
48
72
96
120

Sample

Kontrol

S-K

ppm (mg/L)

mg/mL

S1

S2

K1

K2

S1

S2

S1

S2

S1

S2

0.063
0.340
0.816
0.736
0.870
0.827
0.030
0.082
0.092
0.123
0.112
0.113
0.020
0.086
0.065
0.072
0.058
0.058

0.066
0.397
0.663
0.631
0.842
0.690
0.040
0.161
0.077
0.225
0.189
0.182
0.071
0.148
0.149
0.175
0.140
0.133

0.023
0.022
0.020
0.020
0.023
0.018
0.020
0.029
0.017
0.016
0.015
0.024
0.033
0.019
0.028
0.023
0.015
0.020

0.023
0.022
0.020
0.020
0.023
0.018
0.023
0.021
0.029
0.038
0.032
0.035
0.061
0.030
0.034
0.039
0.045
0.034

0.040
0.318
0.796
0.716
0.847
0.809
0.012
0.024
0.020
0.033
0.030
0.022
-0.013
0.067
0.037
0.049
0.043
0.038

0.043
0.375
0.643
0.611
0.819
0.672
0.017
0.140
0.048
0.187
0.157
0.147
0.010
0.118
0.115
0.136
0.095
0.099

31.345
127.207
292.034
264.448
309.621
296.517
21.690
25.828
24.448
28.931
27.897
25.138
13.069
40.655
30.310
34.448
32.379
30.655

32.379
146.862
239.276
228.241
299.966
249.276
23.414
65.828
34.103
82.034
71.690
68.241
21.000
58.241
57.207
64.448
50.310
51.690

0.031
0.127
0.292
0.264
0.310
0.297
0.022
0.026
0.024
0.029
0.028
0.025
0.013
0.041
0.030
0.034
0.032
0.031

0.032
0.147
0.239
0.228
0.300
0.249
0.023
0.066
0.034
0.082
0.072
0.068
0.021
0.058
0.057
0.064
0.050
0.052

Aktivitas
mananase
S1
S2
(U/mL)
1.161 1.199
1.180
4.711 5.439
5.075
10.816 8.862
9.839
9.794 8.453
9.123
11.467 11.110 11.288
10.982 9.232
10.107
0.803 0.867
0.835
0.957 2.438
1.697
0.905 1.263
1.084
1.072 3.038
2.055
1.033 2.655
1.844
0.931 2.527
1.729
0.484 0.778
0.636
1.506 2.157
1.831
1.123 2.119
1.621
1.276 2.387
1.831
1.199 1.863
1.531
1.135 1.914
1.524
U/mL

19
19

20
20
Lanjutan
Jenis
biomassa

TKKS

LBG

Sample
Inkubasi
0
24
48
72
96
120
0
24
48
72
96
120

Kontrol

S-K

ppm (mg/L)

mg/mL

U/mL

S1

S2

K1

K2

S1

S2

S1

S2

S1

S2

S1

S2

0.041
0.049
0.060
0.077
0.083
0.097
0.037
0.312
0.440
0.389
0.357
0.435

0.069
0.084
0.085
0.088
0.091
0.071
0.036
0.359
0.464
0.368
0.430
0.397

0.016
0.017
0.021
0.027
0.018
0.015
0.027
0.022
0.023
0.020
0.031
0.027

0.014
0.013
0.009
0.026
0.012
0.022
0.025
0.021
0.016
0.018
0.020
0.023

0.025
0.032
0.039
0.050
0.065
0.082
0.010
0.290
0.417
0.369
0.326
0.408

0.055
0.071
0.076
0.062
0.079
0.049
0.011
0.338
0.448
0.350
0.410
0.374

26.172
28.586
31.000
34.793
39.966
45.828
21.000
117.552
161.345
144.793
129.966
158.241

36.517
42.034
43.759
38.931
44.793
34.448
21.345
134.103
172.034
138.241
158.931
146.517

0.026
0.029
0.031
0.035
0.040
0.046
0.021
0.118
0.161
0.145
0.130
0.158

0.037
0.042
0.044
0.039
0.045
0.034
0.021
0.134
0.172
0.138
0.159
0.147

0.969
1.059
1.148
1.289
1.480
1.697
0.778
4.354
5.976
5.363
4.814
5.861

1.352
1.557
1.621
1.442
1.659
1.276
0.791
4.967
6.372
5.120
5.886
5.427

Aktivitas
mananase
(U/mL)
1.147
1.308
1.384
1.365
1.569
1.486
0.784
4.660
6.174
5.241
5.350
5.644

22

23

Lampiran 4 Hasil perhitungan aktivitas mananase dari Bacillus subtilis pada berbagai konsentrasi substrat
Konsentrasi
Inkubasi
porang

0.5%

1%

1.5%

0
24
48
72
96
120
0
24
48
72
96
120
0
24
48
72
96
120

Sample

Kontrol

S-K

ppm (mg/L)

mg/mL

U/mL

S1

S2

K1

K2

S1

S2

S1

S2

S1

S2

S1

S2

0.102
0.106
0.113
0.062
0.087
0.123
0.140
0.099
0.168
0.167
0.234
0.186
0.147
0.087
0.124
0.117
0.123
0.076

0.099
0.111
0.141
0.173
0.126
0.149
0.128
0.078
0.106
0.125
0.212
0.148
0.111
0.108
0.112
0.101
0.163
0.128

0.056
0.047
0.035
0.031
0.034
0.026
0.049
0.047
0.047
0.021
0.023
0.026
0.056
0.039
0.030
0.029
0.032
0.026

0.038
0.036
0.066
0.032
0.026
0.028
0.061
0.050
0.044
0.028
0.035
0.024
0.050
0.026
0.040
0.034
0.028
0.037

0.046
0.059
0.078
0.031
0.053
0.097
0.091
0.052
0.121
0.146
0.211
0.160
0.091
0.048
0.094
0.088
0.091
0.050

0.061
0.075
0.075
0.14