Purifikasi Parsial dan Karakterisasi Enzim Protease dari Isolat B19 KUB BPPT CC

PURIFIKASI PARSIAL DAN KARAKTERISASI ENZIM
PROTEASE DARI ISOLAT B19 KUB BPPT CC

SARAH FITRIANI

DEPARTEMEN BIOKIMIA
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2013

PERNYATAAN MENGENAI SKRIPSI DAN
SUMBER INFORMASI SERTA PELIMPAHAN HAK CIPTA*
Dengan ini saya menyatakan bahwa skripsi berjudul Purifikasi Parsial dan
Karakterisasi Enzim Protease dari Isolat B19 KUB BPPT CC adalah benar karya
saya denganarahan dari komisi pembimbing dan belum diajukan dalam bentuk
apa pun kepada perguruan tinggi mana pun. Sumber informasi yang berasal atau
dikutip dari karya yang diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari penulis lain telah
disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam Daftar Pustaka di bagian akhir
skripsi ini.
Dengan ini saya melimpahkan hak cipta dari karya tulis saya kepada Institut

Pertanian Bogor.
Bogor, Juni 2013
Sarah Fitriani
NIM G84090013

ABSTRAK
SARAH FITRIANI. Purifikasi Parsial dan Karakterisasi Enzim Protease dari
Isolat B19 KUB BPPT CC. Dibimbing oleh SURYANI dan SISWA
SETYAHADI.
Ketidakmampuan dari protease yang berasal dari tumbuhan dan hewan
untuk memenuhi kebutuhan enzim dunia saat ini telah menginisiasi peningkatan
penggunaan protease mikrobial. Tujuan penelitian ini untuk memurnikan dan
mengkarakterisasi protease mikrobial dari isolat B19 KUB BPPT CC. Isolat
ditumbuhkan pada media yang mengandung kalsium kaseinat agar 0.5%, urea
0.5%, dan ekstrak khamir 0.05%. Protease ekstraseluler dari isolat B19 KUB
BPPT CC dipurifikasi dengan menggunakan presipitasi amonium sulfat dan
dialisis. Fraksinasi amonium sulfat pada kejenuhan 60%berhasil meningkatkan
kemurnian enzim hingga 8.37 kali. Protease termofilik alkalin ini memiliki pH
optimum 9.0 dan suhu optimum pada 60 °C. Fenilmetansulfonil-fluor (PMSF)
menginhibisi aktivitas enzim ini secara sempurna, sehingga enzim tergolong

dalam kelas protease serin. Pengujian pengaruh terhadap ion logam menunjukkan
ion Na+ dapat meningkatkan aktivitas enzim ini hingga 119.93%. Nilai Km dan
Vmaks enzim dengan kasein sebagai substrat adalah 0.021 mM dan 90.91 U/mg.
Estimasi berat molekul enzim berdasarkan hasil zimografi kasein adalah 33.8 kDa
dan 19.7 kDa. Protease ini memiliki kemampuan untuk menghidrolisis berbagai
susbtrat seperti serum albumin (BSA), gelatin, hemoglobin, kasien, dan kolagen.
Kata kunci: isolat B19 KUB BPPT CC, karakterisasi, protease serin-alkalin
purifikasi parsial

ABSTRACT
SARAH FITRIANI. Partial Purification and Characterization of Protease Enzyme
from B19 KUB BPPT CC isolate. Supervised by SURYANI and SISWA
SETYAHADI.
The inability of the plant and animal proteases to meet current world
demands has led to an increased interest in microbial proteases. The purpose of
this research was to purify and characterize microbial protease from B19 KUB
BPPT CC isolate. The isolate were grown in media containing calcium caseinate
agar 0.5%, urea 0.5%, and yeast extract 0.05%. Extracelluler protease from B19
KUB BPPT CC isolate was purified using amonium sulfate precipitation and
dialysis. The protease was purified 8.37 fold with a recovery by 60% amonium

sulfate precipitation. This thermophilic alkaline protease showed a pH optimum of
9.0 and optimum temperature was 60 °C. Phenylmethanesulfonyl-fluoride
(PMSF) completely inhibited the enzyme activity suggesting that it was serine
protease. Among metal ions, the Na+ ions enhanced activity up to 119.93%. The
Km and Vmax values exhibited by purified protease were 0.021 mM and 90.91
U/mgusing casein as substrate. The molecular weight was estimated to be 33.8
kDa and 19.7 kDa on casein zymography. In addition, this enzyme was capable of
hydrolyzing bovine serum albumin (BSA), gelatin, hemoglobin, casein, and
collagen.
Keywords: B19 KUB BPPT CC isolate, characterization, partial purification,
serine-alkaline protease

PURIFIKASI PARSIAL DAN KARAKTERISASI ENZIM
PROTEASE DARI ISOLAT B19 KUB BPPT CC

SARAH FITRIANI

Skripsi
sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
Sarjana Sains

pada
Departemen Biokimia

DEPARTEMEN BIOKIMIA
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2013

Judul Skripsi: Purifikasi Parsial dan Karakterisasi Enzim Protease dari Isolat B19
KUB BPPT CC
Nama
: Sarah Fitriani
NIM
: G84090013

Disetujui oleh

Dr Suryani, S.P, M.Sc
Pembimbing I

Dr Ir Siswa Setyahadi, M.Sc
Pembimbing II

Diketahui oleh

Dr Ir I Made Artika, M.App.Sc
Ketua Departemen

Tanggal Lulus:

PRAKATA
Puji dan syukur penulis panjatkan kepada Allah subhanahu wa ta’ala atas
segala karunia-Nya sehingga karya ilmiah ini berhasil diselesaikan. Judul
penelitian yang dilaksanakan sejak bulan Januari 2013 ini adalah Purifikasi Parsial
dan Karakterisasi Enzim Protease dari Isolat B19 KUB BPPT CC.
Terima kasih penulis ucapkan kepada Ibu Dr Suryani, S.P M.Sc dan Bapak
Dr Ir Siswa Setyahadi, M.Sc selaku pembimbing, serta Kak Ruby Setiawan yang
telah banyak memberi saran. Di samping itu, penghargaan penulis sampaikan
kepada Djamil S.Si, M.Si selaku Kepala Laboratorium Teknologi Bioindustri,

Laboratorium Pengembangan Teknologi Agroindustri dan Biomedika
(LAPTIAB), Badan Pengkajian dan Penerapan Teknologi, beserta staf Divisi
Biokatalis, yang telah membantu selama pengumpulan data penelitian. Ungkapan
terima kasih juga disampaikan kepada ayah, ibu, serta seluruh keluarga, atas
segala doa dan kasih sayangnya.
Semoga karya ilmiah ini bermanfaat, terutama untuk pengembangan ilmu
biokimia.

Bogor, Juni 2013
Sarah Fitriani

DAFTAR ISI
DAFTAR GAMBAR
DAFTAR LAMPIRAN
PENDAHULUAN
METODE
Bahan

vi
vi

1
2
2

Alat

2

Prosedur Analisis Data

2

HASIL DAN PEMBAHASAN
Hasil
Pembahasan
SIMPULAN DAN SARAN
Simpulan
Saran
DAFTAR PUSTAKA
LAMPIRAN

RIWAYAT HIDUP

5
5
9
12
12
12
13
16
23

DAFTAR GAMBAR
1 Pengaruh suhu (A) dan pH (B) pada aktivitas protease
5
2 Hubungan ln [aktivitas] protease isolat B19 KUB BPPT CC dialisat terhadap
waktu pemanasan pada suhu 50 °C (■) dan 70 °C (▲)
6
3 Pengaruh penambahan ion logam terhadap aktivitas protease isolat B19KUB
BPPT CC pada suhu dan pH optimum

6
4 Pengaruh inhibitor terhadap aktivitas protease isolat B19KUB BPPT CC pada
7
suhu dan pH optimum
5 Hasil analisis bobot molekul SDS-PAGE dan zimografi denganperangkat
lunak PhotoCap (a)marker LMW, (b)ekstrak kasar protease, (c) dialisat 60%,
7
dan (d) zimogram kasein 0.1%
6 SDS-PAGE produk hasil hidrolisis enzim protease dialisat isolat B19 KUB
BPPT CC (a) BSA , (a') BSA terhidrolisis, (b) gelatin, (b’)gelatinterhidrolisis,
(c)hemoglobin, (c’) hemoglobin terhidrolisis, (d)kasein,(d’) kasien
8
terhidrolisis, (e) kolagen, dan (e’) kolagen terhidrolisis
7 Pengaruh konsentrasi substrat terhadap aktivitas spesifik enzim (A) dan kurva
Lineweaver – Burk (B)
8

DAFTAR LAMPIRAN
1
2

3
4
5
6

Aktivitas protease fraksi pemurnian
Pengaruh suhu
Pengaruh pH
Stabilitas terhadap panas
Pengaruh ion logam dan inhibitor
Kinetika kimia

16
17
18
19
20
21

PENDAHULUAN

Enzim merupakan biokatalisator yang diproduksi oleh makhluk hidup
untuk mengkatalisis dan mengendalikan reaksi kimia yang penting dalam tubuh
makhluk hidup tersebut. Berbeda dengan katalisator biasa, enzim mempunyai
spesifitas katalitik yang tinggi yang ditentukan oleh gugus fungsi pada situs
aktifnya (Nelson dan Cox 2007). Kemajuan dalam teknologi fermentasi, rekayasa
genetika, dan teknologi aplikasi enzim menyebabkan penggunaan enzim dalam
dunia industri semakin meluas. Kunci kemajuan ini terletak pada kemampuan
enzim untuk bekerja secara spesifik dengan akurasi yang tinggi sebagai biokatalis.
Keunggulan-keunggulan ini menyebabkan enzim menjadi katalis hayati yang jauh
lebih unggul daripada katalis kimiawi (Sutandi 2003).
Protease merupakan enzim proteolitik yang sangat penting dan banyak
digunakan secara luas dalam aplikasi industri melalui reaksi sintesis dan hidrolisis.
Protease digunakan dalam aplikasi industri seperti detergen, farmasi, produk kulit,
pengempukkan daging, produk-produk makanan, hidrolisat protein, dan proses
pengolahan limbah industri (Martin dan Nascimento 2006). Enzim ini menguasai
lebih dari 65% total penjualan enzim dunia (Chu 2007). Protease komersial
diproduksi oleh mikroba, hewan, dan tumbuhan. Protease mikrobial saat ini
banyak diproduksi sejalan dengan permintaan dunia industri yang terus meningkat
(Rao et al. 1998). Protease ini (EC: 3.4.111-19) mewakili satu dari tiga grup besar
penjualan enzim dunia (Dias et al 2008) dan menguasai 40% total dari penjualan
enzim dunia dengan produsen utama perusahaan Novozymes di Denmark (Rao et
al. 1998). Mikroba dipilih sebagai sumber enzim yang menjanjikan karena
memiliki keragaman biokimia yang luas dan kemungkinan untuk dimanipulasi
secara genetik (Rao et al. 1998).
Sebagian besar enzim mikroba yang dihasilkan secara komersial adalah
enzim ekstraseluler yang diproduksi di dalam sel dan dikeluarkan ke cairan
lingkungan sekitar tempat sel itu tumbuh. Hal ini menjadi salah satu kelebihan
mikroba dibandingkan dengan hewan dan tumbuhan yang membutuhkan proses
penghancuran sel untuk mendapatkan enzim yang diinginkan (Sutandi 2003).
Pada penelitian ini protease ekstrasel diisolasi dari isolat B19 KUB BPPT CC
yang dihasilkan dari penapisan pada kulit udang yang difermentasi. Protease
komersial dari bakteri terutama genus dari Bacillus yang paling banyak diproduksi
adalah protease netral dan protease alkalin. Protease alkalin saat ini paling banyak
digunakan dalam industri enzim karena memiliki beberapa keunggulan.
Karakteristik protease alkalin dari bakteri adalah aktivitasnya yang tinggi pada
kisaran pH 10 dan suhu optimalnya mencapai 60 °C, karakter inilah yang
menyebabkan protease ini cocok untuk diaplikasikan pada industri detergen (Rao
et al. 1998).
Aktivitas protease sebagai enzim tentunya dipengaruhi oleh berbagai faktor
meliputi konsentrasi enzim, suhu, kondisi keasaman (pH), konsentrasi kation atau
anion, dan berbagai senyawa yang dapat mempengaruhi kerja enzim lainnya
(Copeland 2000). Penelitian ini bertujuan menentukan aktivitas spesifik ekstrak
kasar enzim dan fraksi enzim protease hasil purifikasi parsial, karakter dari enzim,
dan kinetika kimia enzim protease dari isolat lokal B19 KUB BPPT CC. Hipotesis
pada penelitian ini adalah enzim protease yang dihasilkan oleh isolat lokal B19

2
KUB BPPT CC memiliki aktivitas spesifik yang tinggi setelah mengalami
purifikasi parsial, selain itu didapatkan berbagai karakter yang menopang kondisi
optimum bekerjanya enzim, dan diperoleh nilai Km dan Vmaksnya. Penelitian ini
diharapkan dapat menghasilkan enzim protease yang telah dipurifikasi dan
dikarakterisasi dari isolat lokal yang potensial, sehingga dapat dimanfaatkan
dalam skala aplikasi lebih lanjut.

METODE
Bahan
Bahan yang digunakan adalah isolat lokal Bacillus sp. B19 KUB BPPT
CC yang diisolasi dari kulit udang. Bahan untuk media inokulum adalah Luria
Bertani dengan komposisi ekstrak khamir 0.5%, pepton 1%, NaCl 0.5%, agar
2.0% dan air RO (reverse osmosis). Bahan untuk media produksi (fermentasi)
0.5% kalsium kaseinat agar, 0.05% ekstrak khamir, dan 0.5% urea. Bahan untuk
uji aktivitas enzim adalah larutan TCA Amano, larutan kasein 0.6%, standar
tirosin, bufer fosfat 0.5 M, larutan Na2CO3 0.55 M, air Milli-Q, dan reagen Folin
Ciocalteu. Kolagen, serum albumin (BSA), hemoglobin, dan gelatin untuk uji
spesifitas
substrat.
EDTA
(Ethylenediaminetetraaceticacid),
PMSF
(Phenylmethanesulfonyl fluoride), reagen Lowry, ion logam, untuk karakterisasi
enzim, standar protein SDS-PAGE, dan membran tubing selulosa D9777 (SigmaAldrich).
Alat
Alat-alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah autoklaf, magnetic
stirer, inkubator bergoyang, lemari pendingin, oven, laminar air flow,
sentrifugator, thermo mixer, UV-Vis spektrofotometer, hotplate, tabung vial
(Eppendorf), pipet mikro,tip plastik, labu ukur, gelas piala, labu Erlenmeyer, alat
vortex, BECKMAN φ 34 pH meter, dan perangkat elektroforesis SDS-PAGE.
Prosedur Analisis Data
Produksi Enzim Protease
Kultur isolat B19 KUB BPPT CC agar miring diambil 1-2 ose dan
diinokulasikan dalam dua tahap masing-masing ke dalam 10 mL kemudian 90 mL
media Luria Bertani cair sebagai media starter, pada tiap tahap dilakukan inkubasi
dalam inkubator bergoyang pada suhu 37 ºC dengan kecepatan 150 rpm selama 6
jam. Kultur pada media inokulum 100 mL dimasukkan ke dalam media produksi
900 mL, lalu diinkubasi pada suhu 37 ºC dengan kecepatan 150 rpm selama 24
jam. Enzim diisolasi dengan sentrifugasi pada kecepatan 13000 rpm selama 5
menit pada suhu 4 ºC, kemudian supernatan diambil sebagai filtrat enzim
(Wahyuntari dan Hendrawati et al. 2012 ; Guangrong et al. 2006 ; Sezonov G et
al. 2007).
Uji Aktivitas Enzim Protease dengan Metode Amano Termodifikasi
Sebanyak 625 µL larutan kasein 0.6% diinkubasi selama 10 menit pada
suhu 37º C dengan thermo mixer. Kemudian ditambahkan 125 µL filtrat enzim
protease dan diinkubasi selama 10 menit pada suhu 37º C. Selanjutnya

3
ditambahkan 625 µL larutan TCA Amano dan diinkubasi selama 10 menit pada
suhu 37º C. Setelah itu disentrifugasi pada kecepatan 10000 rpm selama 5 menit.
Filtrat hasil sentrifugasi kemudian diambil sebanyak 300 µL dan ditambahkan 750
µL larutan Na2CO3 0.55 M serta pereaksi Folin 1:2 sebanyak 150 µL. Kemudian
diinkubasi selama 10 menit pada suhu 37º C dengan thermo mixer. Absorbansi
diukur pada panjang gelombang 660 nm (Amano Inc 2013).
Pengukuran Konsentrasi Enzim
Larutan standar divariasikan konsentrasinya dengan larutan RO. Sebanyak
20 µL larutan dari masing-masing konsentrasi direaksikan 180 µL larutan PBS
dan 2 mL reagen Lowry lalu divorteks dan diinkubasi selama 10 menit pada 37 ºC.
Kemudian ditambahkan pereaksin Folin-Ciocalteu 200 µL dan diinkubasi 30
menit hingga terjadi perubahan warna dari bening menjadi biru. Setelah itu,
campuran larutan divorteks dan diukur absorbansinya pada panjang gelombang
750 nm. Penentuan protein dilakukan dengan metode Lowry dan diukur dengan
spektrofotometer pada 750 nm. Sebanyak 20 µL enzim kasar direaksikan dengan
180 µL larutan PBS dan 2 mL reagen Lowry lalu divorteks dan diinkubasi selama
10 menit pada 37 ºC. Kemudian ditambahkan pereaksi Folin Ciocalteu 200 µL
dan diinkubasi 30 menit hingga terjadi perubahan warna dari bening menjadi biru.
Setelah itu campuran larutan divorteks dan diukur absorbansinya pada panjang
gelombang 750 nm (Lowry et al. 1951).
Presipitasi Amonium Sulfat dan Dialisis
Purifikasi parsial dilakukan dengan menggunakan amonium sulfat pada
kejenuhan 25%-80%. Pengendapan dilakukan dengan menambahkan garam
amonium sulfat ke dalam supernatan (ekstrak kasar) sedikit demi sedikit,
dicampurkan selama 1 jam pada kondisi dingin, dan disentrifugasi pada 3.000 rpm
selama 10 menit. Presipitat dilarutkan dalam 0.05 M bufer fosfat pada pH 7.5
dengan perbandingan 1:2 (b/v). Dialisis dilakukan dengan membran tubing
selulosa D9777 dengan ukuran molecular weight cut off (MWCO) 12.4 kDa.
Sebelum digunakan, membran diproses untuk menghilangkan kontaminan seperti
gliserol, ion logam berat, atau komponen mikro mengandung sulfur. Persiapan
membran dimulai dengan membran dicuci dengan air RO. Enzim yang telah
diendapkan, dilarutkan dengan larutan bufer fosfat 0.05 M pH7.5 dengan kondisi
sama seperti pada awal enzim diekstrak. Larutan kemudian dimasukkan ke dalam
kantong dialisis dan disuspensikan dalam bufer fosfat 0.05 M pH 7.5, didialisis
selama 12-18 jam pada kondisi dingin dengan penggantian bufer setiap 6 jam
(Baehaki 2012).
Penentuan Suhu Optimum
Penentuan suhu optimum dilakukan dengan melakukan uji aktivitas enzim
protease metode Amano termodifikasi pada suhu 40-65 °C dengan rentang
interval 5 °C (Baehaki 2012).
Penentuan pH Optimum
Penentuan pH optimum dilakukan dengan mereaksikan enzim dan substrat
pada pH 6-10 (rentang 1 nilai pH) pada suhu optimum dan diuji kuantitatif dengan
metode Amano termodifikasi. Pada pH 6-8 bufer digunakan bufer Na-fostat,
untuk pH 9 menggunakan bufer Tris-HCl, dan pH 10 menggunakan bufer
karbonat-bikarbonat (Baehaki 2012).
Stabilitas terhadap Waktu Pemanasan
Pengujian stabilitas enzim protease pada suhu tinggi dilakukan dengan

4
memanaskan enzim hasil dialisis pada suhu 50 dan 70 ºC masing-masing selama
20, 40, dan 60 menit. Selanjutnya aktivitas enzim dianalisis dengan metode
Amano termodifikasi (Baehaki 2012).
Pengaruh Ion Logam dan Inhibitor pada Aktivitas Protease
Ion logam yang digunakan adalah CaCl2, MnCl2, MgCl2, ZnSO4, NaCl,
dan KCl dengan konsentrasi 1 mM dan 5 mM, sedangkan inhibitor yang diuji
adalah PMSF dan EDTA dengan konsentrasi 2 mM dan 5 mM. Enzim diinkubasi
dengan ion logam dan inhibitor selama 1 jam pada suhu ruang, kemudian
dilakukan uji aktivitas enzim dengan metode Amano termodifikasi (Baehaki
2012 ; Wahyuntari dan Hendrawati 2012).
Penentuan Berat Molekul dengan SDS-PAGE
Standar protein berat molekul rendah (LMW) yang digunakan adalah
fosforilase b (97 kDa), BSA (bovine serum albumin) (66 kDa), ovalbumin (45
kDa), carbonic anhydrous (29 kDa), inhibitor tripsin (21.5 kDa), dan αlaktalbumin (14.4 kDa). Gel terdiri atas dua jenis, yaitu 12% gel pemisah dan 4%
gel penahan. Gel dielektroforesis dengan tegangan 150 V dan 100 A selama 1.5
jam. Setelah proses running dilakukan gel diwarnai dengan PageBlue selama 30
menit, kemudian dicuci dengan air RO selama 1 jam (Laemmli 1970).
Zimografi Kasein0.1%
Zimografi kasein dilakukan dengan komposisi gel penahan 4% dan gel
pemisah 12%. Gel akrilamid 12% dikopolimerisasi dengan substrat kasein 0.1%.
Sebanyak 4 μL enzim dialisat dicampurkan dengan 16 μL sampel bufer, kemudian
dielektroforesis dengan tegangan 150 V dan 100 A selama 1.5 jam. Kemudian gel
direndam dengan Triton X-100 2.5% selama 1 jam dan dilakukan inkubasi dalam
bufer Tris-HCl 10 mM, pH 9 selama 4 jam pada suhu 60 °C. Deteksi zimogram
dilakukan dengan pewarnaan PageBlue selama 30 menit. Kelebihan warna
dikurangi dengan merendam gel dalam larutan peluntur (5.0% metanol + 7.5%
asam asetat) sampai diperoleh pita-pita protein yang berwarna bening
berlatarbelakang biru (Baehaki 2012 ; Jamilah 2011).
SDS-PAGE Spesifitas Substrat
Substrat yang digunakan adalah serum albumin, kasein, gelatin, kolagen,
dan hemoglobin. Kasien, albumin, dan gelatin dilarutkan dalam bufer Tris-HCl
pH 9.0. Kolagen dan hemoglobin dilarutkan pada 1% b/v urea di dalam 0.1 N
NaOH dan pH disesuaikan pada pH 9 menggunakan 0.1 N HCl. Sebanyak 800 µL
1% suspensi protein ditambah 200 μL dan direaksikan di dalam tabung vial,
kemudian enzim diinkubasi pada 60 °C selama 1 jam. Reaksi dihentikan dengan
pemanasan pada 100 °C selama 1 menit di penangas air. Aktivitas hidrolitik diuji
melalui SDS-PAGE dengan membandingkan pita protein yang terhidrolisis
dengan kontrol substrat yang tidak direaksikan dengan enzim (Wahyuntari dan
Hendrawati 2012).
Kinetika Kimia Enzim Protease
Konsentrasi substrat kasein yang digunakan sebesar 0.2%-1.0%. Aktivitas
enzim diuji dengan metode Amano termodifikasi pada suhu dan pH optimumnya,
lalu dibuat kurva hubungan antara konsentrasi kasein dan aktivitas spesifik enzim.
Setelah itu dibuat persamaan linear Lineweaver-Burk dan ditentukan nilai Km dan
Vmaks nya menggunakan persamaan tersebut (Wahyuntari dan Hendrawati 2012).

5

HASIL DAN PEMBAHASAN
Hasil
Protease Hasil Fraksinasi Amonium Sulfat dan Dialisis
Ekstrak kasar enzim protease dari isolat B19 KUB BPPT CC diendapkan
dengan fraksinasi amonium sulfat dari kejenuhan 25% sampai 80% (rentang
interval 20%). Purifikasi dilanjutkan dengan dialisis menggunakan membran
tubing selulosa. Tabel 1 menunjukkan bahwa protein total dan aktivitas total
tertinggi terdapat pada fraksi dengan kejenuhan 60%, masing-masing sebesar 0.42
mg dan 69.26 U. Aktivitas spesifik tertinggi juga terdapat pada fraksi dengan
kejenuhan 60% sebesar 164.92 U/mg dengan yield 0.31% dan kemurnian naik
hingga 8.37 kali. Aktivitas total, aktivitas spesifik, dan tingkat kemurnian
terendah terdapat pada fraksi dengan kejenuhan 25%.
Tabel 1 Aktivitas protease pada tiap fraksi pemurnian
Yield
(%)

Kemurnian
(kali)

100.00

1.00

Kasar

26.60

1.35

850.00

22 610.00

A.s 25% (D)

4.20

0.20

2.00

8.40

0.40

21.18

0.04

1.07

A.s 40% (D)

12.21

0.18

2.00

24.42

0.36

67.85

0.11

3.44

A.s 60% (D)

34.63

0.21

2.00

69.26

0.42

164.92

0.31

8.37

A.s 80% (D)

18.18

0.15

2.00

36.37

0.30

121.24

0.16

6.15

Aktivitas [Protein] Volume
(U/mL) (mg/mL) (mL)

Aktivitas
total (U)

Aktivitas
spesifik
(U/mg)
19.71

Protein
total
(mg)
1 147.00

Fraksi

Suhu dan pH Optimum
Kondisi optimum enzim protease dari isolat B19 KUB BPPT CC untuk
melangsungkan reaksi enzimatis adalah pada pH 9 dan suhu 60 °C (Gambar 1).
A

B
80

Aktivitas relatif
(%)

80

Aktivitas relatif
(%)

100

100

60
40
20
0

60
40
20
0

40

45

50

55

Suhu ( C)

60

65

6

7

8

9

pH

Gambar 1 Pengaruh suhu (A) dan pH (B) pada aktivitas protease

10

6
Stabilitas terhadap Waktu Pemanasan
Nilai konstanta (k) laju deaktivasi protease isolat B19 KUB BPPT CC
untuk suhu 50 °C dan 70 °C masing-masing sebesar 0.004/menit dan 0.147/menit
(Gambar 2). Waktu paruh enzim pada suhu 50 °C dan 70 °C diperoleh dengan
menurunkan rumus kinetika deaktivasi enzim, masing-masing sebesar 173 menit
dan 4.7 menit.
5
Ln aktivitas (U/mL)

4

y = -0.004x + 4.513
R² = 0.997

3
2
1

y = -0.147x + 4.066
R² = 0.934

0
-1 0

20

40

60

-2
-3

Waktu (menit)

Gambar 2 Hubungan aktivitas protease isolat B19 KUB BPPT CC dialisat
terhadap waktu pemanasan pada suhu 50 °C (■) dan 70 °C (▲)
Pengaruh Ion Logam dan Senyawa Inhibitor
Aktivitas fraksi dialisat 60% protease meningkat terhadap penambahan ion
logam Ca2+, Mg2+, Na+, dan K+. Ion logam Na+dengan konsentrasi sebesar 5 mM
memberikan peningkatan aktivitas residual tertinggi sebesar 119.93%. Ion logam
MgCl2 sebesar 1 mM juga meningkatkan aktivitas residual enzim ini sebesar
110.52%. Akan tetapi, ion logam Zn2+ dan Mn2+ dengan konsentrasi 5 mM
menurunkan aktivitas residual enzim masing-masing sebesar 83.44% dan 74.25%
(Gambar 3).

Gambar 3 Pengaruh penambahan ion logam terhadap aktivitas protease isolat
B19KUB BPPT CC pada suhu dan pH optimum

7

Aktivitas residual (%)

PMSF sebagai inhibitor untuk protease serin menurunkan aktivitas residual
protease secara drastis. PMSF sebesar 5 mM menurunkan aktivitas
ivitas residual eenzim
menjadi 4.06%. EDTA sebagai inhibitor untuk metaloprotease menurunkan
aktivitas residual protease menjadi sepertiganya. EDTA sebesar 2 mM dan 5 mM
menurunkan aktivitas
vitass residual enzim menjadi 40.11% dan 34.85% (Gambar 4).
100
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0

2 mM
5 mM

Kontrol

PMSF

EDTA

Jenis Inhibitor
Gambar 4 Pengaruh inhibitor terhadap aktivitas protease isolat B19 KUB BPPT
CC pada suhu dan pH optimum
Hasil Analisis Berat Molekul dengan SDS-PAGE
SDS
dan Zimografi Kasein
Ekstrak kasar enzim memi
memiliki empat pita dengan berat molekul sebe
sebesar 89.0,
41.5, 33.0, dan 29.5 kDa, sedangkan dialisat 60% memiliki tiga pita sebesar 33.2,
30.8, dan 28.1 kDa (Gambar 5). Berat molekul protease dikonfirmasi dengan
zimografi kasein 0.1% yang menghasilkan dua pita, yakni 33.88 kDa dan 19.7 kDa.

Gambar 5

Hasil analisis bobot molekul SDS-PAGE dan zimografi
denganperangkat
perangkat llunak PhotoCap (a) marker LMW, (b)ekstrak kasar
protease, (c) dialisat 60%, dan (d) zimogram kasein 0.1%

8
SDS-PAGE Spesifitas Substrat
Sebanyak lima jenis substrat direaksikan dengan protease isolat B19 KUB
BPPT CC, kemudian hasilnya dianalisis dengan menggunakan SDS-PAGE.
PAGE. Pola
pita peptida hasil hidrolisis enzim proetase isolat B19 KUB BPPT CC terlihat
pada Gambar 6. Dialisat 60% enzim ini mampu menghidrolisis substrat, seperti
BSA, gelatin, hemoglobin, kasein, dan
d kolagen dalam
m kondisi alkalin pada 60 °C.

Gambar 6 SDS-PAGE produk hasil hidrolisis enzim protease dialisat isolat B19
KUB BPPT CC (a) BSA , (a') BSA terhidrolisis, (b) gelatin, (b’)
gelatin terhidrolisis, (c) hemoglobin, (c’) hemoglobin terhidrolisis,
(d)kasein,(d’)
(d’) kasien terhidrolisis, (e) kolagen, dan (e’) kolagen
terhidrolisis
Kinetika Kimia Enzim Protease
Pengaruh konsentrasi substrat kasein terhadap aktivitas spesifik enzim dan
diilustrasikan dengan menggunakan kurva Lineweaver-Burk dapat dilihat pada
Gambar 7. Nilai Km dan vmaks dari protease isolat B19 KUB BPPT CC fraksi
dialisat dengan menggunakan kasein masing-masing sebesar 0.021 mM dan 90.91
U/mg.
0.05

A
1/Akt. spesifik (mg/U)

Akt spesifik (U/mg)

60
50
40
30
20
10

0
-1E-04

0.0001 0.0003
[Kasein] (M)

0.0005

0.04

B
y = 0.011 + 2.34 x 10-66 x
R² = 0.981

0.03
0.02
0.01

0
-3000

2000
1/[Kasein]

7000

12000

(M-1)

Gambar 7 Pengaruh konsentrasi substrat terhadap aktivitas spesifik enzim (A)
dan kurva Lineweaver – Burk (B)

9
Pembahasan
Protease Hasil Fraksinasi Amonium Sulfat dan Dialisis
Fraksinasi dengan amonium sulfat merupakan salah satu cara pemurnian
protein melalui proses pengendapan (Rosenberg 2005). Pengendapan terjadi oleh
adanya peningkatan kekuatan ion dengan penambahan garam amonium sulfat
(Solihati 2006). Fraksinasi amonium sulfat bertingkat yang digunakan dalam
penelitian ini dilakukan untuk memisahkan protein enzim dari protein yang lain,
sehingga diperoleh tingkat kemurnian protein pada setiap fraksi, sedangkan
dialisis protein adalah suatu proses penghilangan garam organik dan pertukaran
dengan bufer. Metode penggunaan kantung dialisis akan menghilangkan molekul
berbobot molekul rendah yang tidak diinginkan dan menggantikanya dengan bufer.
(Rosenberg 2005). Membran dialisis yang digunakan dalam penelitian ini memilki
nilai cut off sebesar 12.4 kDa yang mampu menahan protease agar tidak keluar
selama dialisis karena protease memiliki berat molekul antara 15 hingga 126 kDa
(Shankar 2010 ; Rao et al. 1998). Berdasarkan hasil yang diperoleh diketahui
bahwa konsentrasi amonium sulfat yang paling sesuai untuk mengendapkan
protease dari isolat B19 KUB BPPT CC adalah amonium sulfat dengan
konsentrasi 60%. Pada larutan, sejumlah besar molekul air terikat dengan ion
sulfat (SO42-) dan akan mengurangi jumlah air yang berikatan dengan molekul
protein. Pada konsentrasi amonium sulfat 60%, molekul air yang tidak berikatan
akan terpisah dari protein enzim ini, sehingga menyebabkan presipitasi bagi enzim
(Rosenberg 2005). Aktivitas yang dihasilkan setelah pengendapan oleh 60%
amonium sulfat dan dialisis adalah 34.63 U/ml dengan aktivitas spesifik 164.92
U/mg dengan peningkatan kemurnian 8.37 kali dari aktivitas ekstrak kasar 26.60
U/ml dengan aktivitas spesifik 19.71 U/mg. Beberapa protease juga mengendap
dengan baik pada konsentrasi amonium sulfat antara 60-70%, misalnya pada
protease dari Bacillus alcalophilus TCCC11004 dan Bacillus licheniformis UV-9
(Cheng et al. 2010 ; Nadeem et al. 2013).
Suhu dan pH Optimum
Dialisat protease isolat B19 KUB BPPT CC aktif bekerja pada suhu 40
sampai 65 °C dengan suhu optimum pada 60 °C. Berdasarkan suhu optimumnya
protease ini tergolong protease termofilik artinya bekerja aktif pada suhu yang
tinggi. Protein yang bersifat termofilik memiliki karakteristik yang berbeda pada
strukturnya dibandingkan protein mesofilik. Protein termofilik memiliki lebih
banyak struktur jembatan garam ditambah dengan keberadaan rantai utama ikatan
hidrogen yang berlimpah jika dibandingkan dengan protein mesofilik. Selain itu,
protein ini memiliki residu asam amino yang bersifat hidrofobik lebih banyak
dibandingkan protein mesofilik. Hal ini akan menaikkan titik didih dari protein
tersebut (Sadeghi et al. 2006). Pada suhu 50 °C aktivitas residual enzim ini
sebesar 79.66% dan 93.36% pada 55 °C, serta menunjukkan penurunan aktivitas
residual sampai 69.46% pada suhu 65 °C (Gambar 1). Hal ini dikarenakan adanya
denaturasi protein pada suhu yang lebih tinggi (Shankar 2010). Suhu optimum
protease dari Bacillus licheniformis UV-9 pada pH 11 adalah 60 °C (Nadeem et al.
2013). Beberapa protease yang berasal dari genus Bacillus dan P. aeruginosa

10
MN1 juga memiliki suhu optimum pada 60 °C (Banerjee et al. 1999 ; Beg et al.
2003 ; Martins dan Nascimento 2006 ; Khosravi-Darani et al. 2008; Olajuyigbe
dan Ajele 2008). Dialisat protease isolat B19 KUB BPPT CC memiliki pH
optimum 9.0 pada suhu 60 °C dengan substrat kasein, sehingga protease ini
termasuk dalam golongan protease alkalin (Gambar 1). Protease alkalin akan
bekerja dengan baik pada kondisi basa (Rao et al. 1998). Enzim ini memiliki
aktivitas residual sebesar 84.70% pada pH 7.0 dan 95.72% pada pH 8.0. Protease
B .licheniformis LHSB-05 juga memiliki pH optimum 9.0. Beberapa protease dari
genus Bacillus lainnya memiliki pH optimum berkisar antara 9.0-10.0 (Johnvesly
dan Naik 2001; Yu et al. 2006; Olajuyigbe dan Ajele 2008).
Stabilitas terhadap Waktu Pemanasan
Kestabilan terhadap waktu pemanasan protease dialisat diuji pada suhu
50 °C dan 70 °C pada pH dan suhu optimum. Protease isolat B19 KUB BPPT CC
relatif stabil terhadap pemanasan pada suhu 50 °C dengan nilai konstanta laju
deaktivasi sebesar 0.004/menit, sedangkan untuk suhu 70 °C aktivitas menurun
jauh dengan konstanta laju deaktivasi sebesar 0.147/menit (Gambar 2). Hal ini
dikarenakan semakin tinggi suhu maka konstanta deaktivasi enzim akan semakin
tinggi (Baehaki 2012). Waktu paruh (t1/2) enzim ini pada suhu 50 °C dan 70 °C
masing-masing sebesar 173 menit dan 4.7 menit, artinya pemanasan dengan suhu
tersebut selama 173 menit atau 4.7 menit aktivitas protease dialisat akan menjadi
setengahnya. Hal ini memperlihatkan enzim ini cukup stabil terhadap pemanasan
pada 50 °C. Protease serin alkalin dari Bacillus subtilis PE-11 memiliki waktu
paruh 250 menit dan 50 menit pada suhu 70 dan 80 °C (Adinarayana et al. 2003).
Protease termostabil dari Bacillus sp. Strain GX6638 memiliki waktu paruh 200
menit pada suhu 50 °C dan 22 menit pada 60 °C. Protease komersial subtilisin
Carlsberg serta subtilisin BPN memiliki waktu paruh 3.4 dan 2.4 menit pada suhu
50 °C (Durham et al. 1987).
Pengaruh Ion Logam dan Senyawa Inhibitor
Beberapa ion logam diuji pengaruhnya terhadap aktivitas protease dialisat
pada konsentrasi 2 mM dan 5 mM (Gambar 3). Hasil pengujian menunjukkan 5
mM NaCl dapat meningkatkan aktivitas protease isolat B19 KUB BPPT CC
menjadi 119.93% dari aktivitas semula (100%). Pengaruh 5 mM NaCl
memperlihatkan enzim ini termasuk enzim yang peka terhadap penambahan
garam yakni, enzim yang peka terhadap perubahan polaritas larutan dan sisi
aktifnya kaya akan ikatan hidrogen (Paada 2004). Ion logam 5 mM MnCl2
menurunkan aktivitasnya menjadi 74.25% dan 5 mM ZnSO4 menurunkan
aktivitas residual enzim ini menjadi 83.44%. Pada uji pengaruh ion logam
Bacillus subtilis rekombinan R1 dari enzim hasil kromatografi Sephadex G100
menunjukkan kation NaCl dan BaCl sebesar 0.1 mM meyebabkan peningkatan
aktivitas relatif enzim protease menjadi 160% dan 171% dari aktivitas enzim
tanpa kation. Selain itu, terdapat juga kation yang dapat menurunkan aktivitas
enzim yakni MnCl2, FeCl2, dan ZnCl2 (Paada 2004). Penambahan garam yang
polar dapat meningkatkan kekuatan ion dan mempertinggi konstanta dielektrik
pelarut dan mempengaruhi kestabilan molekul protein, serta mempengaruhi

11
kecepatan reaksi enzim. Ion logam umumnya berikatan dengan residu asam amino
yang bersifat negatif seperti aspartat dan glutamat (Paada 2004). Pengaruh
inhibitor terhadap aktivitas protease terlihat pada Gambar 3. Inhibitor PMSF
sebagai inhibitor bagi protease serin sebesar 5 mM menurunkan aktivitasnya
menjadi hanya 4.06%, sedangkan EDTA sebagai pengkelat logam (inhibitor
metaloprotease) 5 mM menurunkan aktivitasnya menjadi sepertiganya, yakni
34.85% (Gambar 4). Hal ini menunjukkan bahwa protease ini tergolong protease
serin (Wahyuntari dan Hendrawati 2012). PMSF merupakan inhibitor ireversibel
bagi protease serin. PMSF akan terikat secara kovalen dan menyerang sisi aktif
enzim protease yang memiliki residu serin di dalamnya, sehingga enzim akan
kehilangan kemampuan katalitiknya (James 1978). Pengaruh 2 mM Na2.EDTA
dan 2 mM PMSF pada protease Thermophilic bacillus strain HS08 menurunkan
aktivitas relatifnya menjadi masing-masing 6% dan 4% (Guangrong et al. 2006).
Hasil Analisis Berat Molekul dengan SDS-PAGE dan Zimografi Kasein
Elektroforesis adalah teknik untuk memisahkan molekul berdasarkan
muatan dan berat molekul (Bintang 2010). Jenis elektroforesis yang akan
digunakan adalah jenis elektroforesis gel yang tersusun atas poliakrilamid. SDSPAGE (Poly Acrilamide Gel Electrophoresis) merupakan metode yang banyak
digunakan untuk analisis sampel biologis, karena kemampuannya dalam
memisahkan campuran protein yang kompleks (Mikkelsen dan Corton 2004).
Zimografi bertujuan menganalisis aktivitas proteolitik dengan menambahkan
substrat protein pada gel pemisah. Substrat yang umum digunakan dalam
zimografi antara lain kasein, gelatin, dan fibrin (Paada 2004). Hasil visualisasi
SDS-PAGE menunjukkan terdapat empat pita protein pada ekstrak kasar dengan
estimasi berat molekul masing-masing sebesar 89.0, 41.5, 33.0, dan 29.5 kDa.
Pada fraksi dialisat 60% terdapat tiga pita protein dengan estimasi berat molekul
33.2, 30.8, dan 28.1 kDa. Zimogram kasein 0.1% menunjukkan pita protease yang
memiliki aktivitas proteolitik dengan estimasi berat molekul sebesar 33.8 kDa dan
19.7 kDa (Gambar 5). Pengujian pengaruh inhibitor dan penentuan pH optimum
menyatakan bahwa enzim ini tergolong pada protease serin alkalin, protease jenis
ini biasanya memiliki berat molekul rendah antara 15 sampai 35 kDa (Rao et al.
1998 ; Gupta et al. 2002). Serin alkalin protease lainya dari Bacillus sp. SSR1
berdasarkan analisis SDS-PAGE memiliki bobot molekul 29 dan 35 kDa (Singh et
al. 2001). Selain itu, serin alkalin protease dari Bacillus subtilis PE-11 memiliki
bobot molekul sebesar 15 kDa (Adinarayana et al. 2003).
SDS-PAGE Spesifitas Substrat
Protease serin memiliki spesifitas substrat yang luas, serta memiliki
aktivitas esterolitik dan amidase (Rao et al. 1998). Sebanyak lima jenis substrat
direaksikan dengan protease isolat B19 KUB BPPT CC, kemudian hasilnya
dianalisis dengan menggunakan SDS-PAGE. Protease dialisat isolat B19 KUB
BPPT CC dapat menghidrolisis kasein, gelatin, dan BSA yang terlarut dalam
bufer Tris-HCl pH 9.0 dengan baik. Hemoglobin dan kolagen dalam larutan 1%
(b/v) urea juga dapat dihidrolisis oleh protease ini (Gambar 6). Kemampuan
menghidrolisis berbagai substrat membuat protease serin banyak digunakan dalam

12
industri detergen dan produk kulit (Gupta et al. 2002). Hal ini membuka
kemungkinan aplikasi lebih lanjut dari enzim ini pada industri detergen dan
penyamakan kulit. Protease lain dari bakteri Bacilllus megaterium DSM-319 juga
dapat menghidrolisis kelima substrat tersebut dan telah diuji aplikasinya pada
penyamakan kulit sapi (Wahyuntari dan Hendrawati 2012).
Kinetika Kimia Enzim Protease
Hubungan antara kecepatan reaksi enzimatis dengan konsentrasi substrat
bergantung pada afinitas enzim terhadap substrat tersebut (Ahmed et al. 2011).
Protease alkalin biasanya memiliki afinitas yang tinggi terhadap substrat kasein
(Adinarayana et al. 2003). Nilai Km dan Vmaks dari protease serin alkalin isolat
B19 KUB BPPT CC fraksi dialisat dengan menggunakan kasein masing-masing
sebesar 0.021 mM dan 90.91 U/mg (Gambar 7). Konsentrasi kasein sebesar 0.021
mM merupakan jumlah kasein yang dibutuhkan untuk mencapai setengah
kecepatan reaksi maksimumnya. Nilai Vmaks yang tinggi menunjukkan laju reaksi
juga semakin cepat (Yuningsih 2006). Nilai Km yang dimiliki enzim ini relatif
kecil, hal ini menunjukkan afinitas enzim yang tinggi terhadap substrat kasein.
Protease dari Bacillus subtilis memiliki nilai Km dan Vmaks sebesar 58 μM dan 148
U/mL pada substrat kasein (Ahmed et al. 2011).Bilangan putaran dapat ditentukan
dengan terlebih dahulu mengetahui berat molekul suatu enzim. Bilangan putaran
merupakan jumlah molekul substrat yang diubah menjadi produk per satuan
waktu pada satu molekul enzim saat enzim tersebut jenuh oleh substrat (Triana
2012). Berat molekul enzim ini diasumsikan sebesar 33.8 kDa, maka nilai kcat
enzim fraksi dialisat adalah sekitar 50 s-1 . Nilai bilangan putaran ini akan
menentukan kecepatan reaksi katalisis suatu enzim (Ibrahim et al. 2012).

SIMPULAN DAN SARAN
Simpulan
Aktivitas spesifik tertinggi bagi protease ini terdapat pada fraksi amonium
sulfat 60% sebesar 164.92 U/mg. Protease ini tergolong protease alkalin
termofilik karena memiliki pH optimum 9.0 dan suhu optimum 60 °C, serta
tergolong dalam protease serin. Protease ini juga relatif stabil terhadap pemanasan
pada suhu 50 °C. Ion logam Na+ 5 mM merupakan aktivator kuat bagi protease ini.
Berat molekul protease ini melalui analisis zimografi kasien masing-masing
sebesar 33.8 kDa dan 19.7 kDa. Nilai Km dan Vmaks enzim dengan kasein sebagai
substrat adalah 0.021 mM dan 90.91 U/mg. Protease ini juga memiliki spesifitas
substrat yang luas yang menambah keunggulanya.
Saran
Pemurnian enzim lebih lanjut perlu dilakukan dengan kromatografi penukar
ion atau filtrasi gel agar didapatkan protease yang murni. Zimografi gelatin perlu
dilakukan sebagai pembanding bagi zimografi kasein untuk memastikan berat
molekul dari protease ini. Studi mengenai aplikasi enzim ini juga perlu dilakukan
untuk melihat potensinya di dunia industri.

13

DAFTAR PUSTAKA
Adinarayana K, Ellaiah P, Prasad DS .2003. Purification and partial
characterization of thermostable serine alkaline protease from a newly isolated
Bacillus subtilis PE-11 AAPS. Pharm Sci Tech 4(4):440-448. doi:
10.1208/pt040456.
Ahmed I, Zia MA, Iqbal HMN. 2011. Purification and kinetic parameters
characterization of an alkaline protease produced from Bacillus subtilis through
submerged fermentation technique. World Applied Sciences Journal 12(6):751757.
[Amano Inc] Amano Enzyme Inc. 2013. Protease[internet]. [diacu 2013 Maret 6].
Tersedia dari: http://www.amano-enzyme.co.jp/
Baehaki A. 2012. Kolagenase Bacillus licheniformis F11 asal Palembang dan
aplikasinya pada pembuatan peptida kolagen bioaktif.[tesis]. Bogor
(ID) :Institut Pertanian Bogor.
Banerjee UC, Sani RK, Azmi W, Soni, R. 1999. Thermostablealkaline protease
from Bacillus brevis andits characterization as a detergent additive. Process
Biochemistry. 35(1-2):213-219.doi:10.1016/S0032-9592(99)00053-9
Beg QK, Saxena RK, Gupta R. 2002. De-repression and subsequent induction of
protease synthesis by Bacillus mojavensis under fed-batch operations. Process
Biochem. 37: 1103–1109.doi:10.1016/S0032-9592(01)00320-X
Bintang M. 2010. Biokimia – Teknik Penelitian. Jakarta (ID) : Erlangga.
Cheng K, Lu FP, Li M, Liu LL, Liang XM. 2010. Purification and biochemical
characterization of a serine alkaline protease TC4 from a new isolated Bacillus
alcalophilus TCCC11004 in detergent formulations. African Journal of
Biotechnology 9(31): 4942-4953. doi: 10.5897/AJB09.1651
Chu WH. 2007. Optimization of extracellular alkaline protease production from
species of Bacillus. Journal of Industrial Microbiology Biotechnology 34: 241245. doi: 10.1007/s10295-006-0192-2
Copeland RA.2000. Enzymes : A Practical Inroduction to Structure, Mechanism,
and Data Analysis. New York (US) : J Wiley.
Dias DR, Vilela DM, Silvestre MPC, Schwan RF. 2008. Alkaline protease from
Bacillus sp. isolated from coffee bean grown on cheese whey. World Journal of
Microbiology and Biotechnology 24: 2027-2034. doi: 10.1007/s11274-0089706-6
Durham DR, Stewardt DB, Stellwagt J.1987. Novel alkaline- and heat-stable
serine proteases from alkalophilic Bacillus sp. Strain GX6638 JB-99 in a
chemically defined medium.J Bacteriol 169 (6): 2762-2768. doi: PMC212182
Guangrong H, Tiejing Y, Po H, Jiaxing J. 2006 .Purification and characterization
of a protease from Thermophilic bacillus strain HS08. African Journal of
Biotechnology 5(24):2433-2438.
Gupta R, Beg QK, Lorenz P. 2002. Bacterial alkaline proteases: molecular
approachesand industrial applications. Appl Microbiol Biotechnol 59:15-32.
doi :10.1007/s00253-002-0975-y
Ibrahim MA, Olatominwa JO, Alyu AB, Bashir M, Sallau AB. 2012. Partial
characterization of protease from the leaves of Jatrophacurcas. International
Journal of Biology 4(4):79-85. doi : 10.5539/ijb.v4n4p79

14
James G. 1978. Inactivation of the protease inhibitor phenylmethylsulfonyl
fluoride in bufers. Analytical Biochemistry 86(2):574-576. doi :10.1016/00032697(78)90784-4.
Jamilah I. 2011. Penapisan Bacillus dan karakterisasi protease dan amilase
ekstraseluler yang dihasilkan untuk degradasi sisa pakan pada budi daya
udang.[tesis]. Bogor (ID) :Institut Pertanian Bogor.
Johnvesly B dan Naik GR.2001. Studies on production of thermostablealkaline
protease from thermophilic and alkalophilic Bacillus sp JB-99 in a chemically
defined
medium.
Process
Biochem
37:139-144.
doi:
http://dx.doi.org/10.1016/S0032-9592(01)00191-1
Khosravi-Darani K, Falahatpishe HR, Jalai M. 2008.Alkaline protease production
on date waste by analkalophillic Bacillus sp. 2-5 isolated from soil. African
Journal of Biotechnology 7(10):1536-1542. doi: 10.5897/AJB07.885
Laemmli UK. 1970. Cleavege of structural protein during the assembly of the
head of bacteriophage T4. Nature 227: 680-685. doi: 10.1038/227680a0
Lowry OH, Roserbrough NJ, Farr AL, Randall R. 1951. Protein measurement
with Folin Phenol Reagent. Journal of Biological Chemistry. 193: 265-275.
doi :10.1074/jbc.270.46.27489
Martin MLL dan Nascimento WCA. 2006. Studies on stability of protease from
Bacillus sp and its compatibility with commercial detergent. Brazilia Microbiol
37: 307-311. doi: http://dx.doi.org/10.1590/S1517-83822006000300020
Mikkelsen dan Corton. 2004. Bioanalytical Chemistry. New Jersey (US) : J Wiley
Nadeem M, Qazi JI, Syed Q, Gulsher M. 2013. Purification and characterization
of an alkaline protease from Bacillus licheniformis UV-9 for detergent
formulations [internet]. [diacu 20013 Maret 30]; 35(2): 187-195. Tersedia dari:
http://www.sjst.psu.ac.th.
Nelson DL dan Cox MM. 2007. Principles of Biochemistry Fifth Edition. New
York(US) : WH Freeman
Olajuyigbe FM dan Ajele JO. 2008. Some properties ofextracellular protease
from Bacillus licheniformis Lbb1-11 isolated from “iru” a tradionally
fermented African locus bean condiment. Global Journal of Biotechnologyand
Biochemistry 3:42-46.
Paada MY. 2004. Pemurnian dan karakterisasi enzim protease serin dari Bacillus
subtilis rekombinan R1.[tesis]. Bogor (ID) :Institut Pertanian Bogor.
Rao MB, Tanksale AM, Ghatge MS, Desphande VV. 1998. Molecular and
biotechnological aspects of microbial proteases. Mol Biol Rev 62(3):597-635.
doi : PMC98927
Rosenberg IM. 2005. Ptotein Analysis and Purification : Benchtop techniques.
New York (US). Springer Publishing.
Sadeghi M, Manesh HN, Zarrabi M, Ranjbar B. 2006. Effective factors in
thermostability of thermophilic proteins. Biophysical Chemistry 119(3):256270. doi :http://dx.doi.org/10.1016/j.bpc.2005.09.018
Sezonov G, Joseleau-Petit D, D’Ari R. 2007. Escherichia coli physiology in
Luria-Bertani broth. J Bacteriol 189: 8746-9. doi:10.1128/JB.01368-07.
Shankar S. 2010. Biochemical characterzation of protease. [tesis].Pune
(IN) :University of Pune.

15
Singh J, Batra N, Sobti RC.2001. Serine alkaline protease from a newly isolated
Bacillus sp. SSR1. Process Biochem 36(8) : 781-785. doi : 10.1016/S00329592(00)00275-2
Solihati . 2006. Pemurnian dan pencirian protease dari ekstrak jamur merang
[skripsi]. Bogor (ID) : Institut Pertanian Bogor.
Sutandi C. 2003. Potensi Enzim Protease Lokal [skripsi]. Bogor (ID) : Institut
Pertanian Bogor.
Triana R. 2012. Pemurnian dan karakterisasi enzim glukosa oksidase dari isolat
lokal Aspergillus niger (IPBCC.08.610).[skripsi]. Bogor (ID) :Institut
Pertanian Bogor.
Wahyuntari B dan Hendrawati H.2012.Properties of an Extracellular Protease of
Bacillus megaterium DSM 319 as Depilating Aid of Hides. Microbiology
Indonesia 6(2). doi : 10.5454/mi.6.2.4.
Yu J, Jin H, Choi W, Yoon M .2006. Production and characterization of an
alkaline protease from Bacillus licheniformis MH31.Agric Chem Biotechnol
49(4): 135-139.
Yuningsih S. 2006. Isolasi dan pencirian protease dari bakteri isolat nato.[skripsi].
Bogor (ID) :Institut Pertanian Bogor.

16

Lampiran 1 Aktivitas protease fraksi pemurnian
Fraksi

Enzim
Kasar
Am Sulfat
25% (D)
Am. Sulfat
40% (D)
Am. Sulfat
60% (D)
Am. Sulfat
80% (D)

Aktivitas
(U/mL)
26.55
26.21
27.05
5.04
3.29
4.27
11.84
11.91
12.89
33.21
35.59
35.10
18.49
17.16
18.91

[Protein]
(mg/mL)

Volume
(mL)

1.35

850.00

0.20

2.00

0.18

2.00

0.21

2.00

0.15

2.00

Aktivitas
total (U)
23364.00
22278.00
22992.00
10.08
6.58
8.54
23.68
23.82
25.78
66.42
71.18
70.20
36.98
34.32
37.82

Protein total
(mg)

1147.00

0.40

0.36

0.42

0.30

Aktivitas
spesifik
(U/mg)
20.37
19.42
20.04
25.20
17.00
21.35
65.77
66.16
71.61
158.14
169.47
167.14
123.26
114.40
126.07

Aktivitas
spesifik
rata-rata (U/mg)
19.94

21.18

67.85

164.92

121.24

17

Lampiran 2 Pengaruh suhu
Suhu

Aktivitas
(U/mL)

[Protein]
(mg/mL)

Volume
(mL)

35.73
40º C

0.21

0.125

0.125

57.31
67.26
67.26
80.56
55º C

0.21

86.46
57.59

0.03

0.125

267.90

66.63

320.28

79.66

376.24

93.36

402.05

100

279.26

69.46

411.71
274.24
0.03

7.46

41.86

368.86
392.38

10.81
7.19
0.21

59.70

0.03

0.125

168.28

320.28
383.62

9.68
10.30
0.21

65º C

0.03

0.125

Aktivitas
Relatif (%)

272.90
320.28

8.41
10.07

77.46
82.40
60º C

0.03

0.125

Aktivitas
Spesifik
rata-rata (U/mg)

168.14
262.90

7.16
8.41
0.21

Aktivitas
Spesifik
(U/mg)
168.42

0.03
4.41
6.90

0.21

50º C

Protein
Total (mg)

4.46

35.31
55.21
45º C

Aktivitas
Total (U)

284.28

18

Lampiran 3 Pengaruh pH
pH

Aktivitas
(U/mL)

[Protein]
(mg/mL)

Volume
(mL)

58.16
6

0.21

0.125

0.125

75.39
87.73
87.73
91.65
9

0.21

0.03

0.125

64.23

369.66

84.70

417.76

95.72

436.43

100

356.33

81.65

436.43
353.00
0.03

9.44

280.28

417.76
436.43

11.46
9.27
0.21

75.53

0.03

0.125

Aktivitas
relatif (%)

359.00
417.76

10.97
11.46

91.65
74.13
10

0.03

0.125

Aktivitas
spesifik
rata-rata (U/mg)

283.62
380.33

9.42
10.97
0.21

Aktivitas
spesifik
(U/mg)
276.95

0.03
7.44
9.98

0.21

8

Protein
total (mg)

7.27

59.56
79.87
7

Aktivitas
total (U)

359.67

19

Lampiran 4 Stabilitas terhadap panas
Perlakuan

Aktivitas Enzim
(U/mL)

Aktivitas Enzim
Rata-rata
(U/mL)

Aktivitas Enzim
Kontrol Negatif
(U/mL)

Aktivitas Residual
(%)

82.82

91.65

90.37

76.58

91.65

83.56

70.07

91.65

76.46

0.81

91.65

0.89

0.25

91.65

0.28

82.68
50°C, 20 menit
82.96
76.23
50°C, 40 menit
76.93
68.95
50°C, 60 menit
71.19
0.91
70°C, 20 menit
0.70
0.21
70°C, 40 menit
0.28

20
Lampiran 5 Pengaruh ion logam dan inhibitor
Perlakuan

1 mM CaCl2

Aktivitas
enzim (U/mL)

Aktivitas enzim
kontrol negatif
(U/mL)

102.44

Aktivitas
residual
(%)
108.33

94.56
5 mM CaCl2
1 mM MnCl2

102.02
87.45

5 mM MnCl2
1 mM MgCl2

70.21
55.63

5 mM MgCl2
1 mM ZnSO4

51.71
48.06

5 mM ZnSO4
1 mM NaCl

78.90
57.32

5 mM NaCl
1 mM KCl

59.70
102.16

5 mM KCl

90.94

107.89
92.48
94.56
74.25
110.52
49.78
103.73
96.55

49.78
94.56

83.44
113.15

49.78
119.93
108.04
94.56

Perlakuan

Aktivitas
enzim
(U/mL)

96.17

Aktivitas
enzim
rata-rata
(U/mL)

Aktivitas
enzim
kontrol
negatif
(U/mL)

Aktivitas
residual
(%)

3.61

78.62

4.59

3.19

78.62

4.06

31.53

78.62

40.11

27.40

78.62

34.85

3.57
2 mM PMSF
3.64
2.94
5 mM PMSF
3.43
31.60
2 mM EDTA
31.46
26.77
5 mM EDTA
28.03

21

Lampiran 6 Kinetika kimia
[Kasein]
(M)

8.47 x 10
(0.2%)

AS

AK

FP

Aktivitas
(U/mL)

0.730

0.071

1

46.17

0.720
0.552

0.069
0.047

1
2

45.61
70.77

-5

1.69 x 10-4
(0.4%)
2.54 x 10-4
(0.6%)
3.39 x 10-4
(0.8%)
4.24 x 10-4
(1.0%)

[Protein]
(mg/mL)

2
2

0.045
0.083

2
2

86.88
84.36

0.610
0.671

0.070
0.052

2
2

84.22
86.74

2

87.16

27.32

0.03

0.125

41.93
41.71
51.71

0.03

0.125

51.71
51.71
50.23

0.03
10.53
10.84

0.21
0.053

0.125

0.125

50.19
50.14
51.61

0.03
10.90

Aktivitas
Spesifik
rata-rata (U/mg)

27.15
42.14

10.86
10.55
0.21

Aktivitas
Spesifik
(U/mg)
27.48

0.03

8.76
10.86
0.21

0.675

0.125

70.07
86.88

0.665
0.684

Protein
Total
(mg)

5.70
8.85
021

0.050
0.044

Aktivitas
Total (U)
5.77

0.21

0.550
0.664

Volume
(mL)

51.76
51.90

22
Lampiran 6 Lanjutan
1/[Kasein] (M-1)
11,800.80
5,900.05
3,933.33
2,950.02
2,360.05

[Kasein] (M)
8.47 x 10-5
1.69 x 10-4
2.54 x 10-4
3.39 x 10-4
4.24 x 10-4

V(U mg-1)
27.32
41.93
53.14
52.31
55.55

1/V (U-1 mg)
0.040
0.023
0.019
0.020
0.018

y = 0.011 + 2.34x 10-6 x
1
1
Km
1
=
+
Vo Vmaks [kasein] Vmaks
1
0.011
Vmaks
Vmaks = 90.91 U/mg
Km
2.34x 10-6
Vmaks
Km= 2.127 x 10-4M = 0.021 mM
[Et]=

μg enzim/mL

μg

bobot molekul enzim ( mol )

Asumsi bobot molekul = 33.8 kDa = 33.8 x 10-3 μg/mL

0.21 x 10-3 μg/mL
[Et]
0.00636 μmol mL-1
-3
33.8 x 10 μg/μmol
Vmaks 90.91 μmol menit-1 mg-1 x 0.21 mg ml-1
Bilangan putaran =
[Et]
0.00636 μmol ml-1
= 3001 menit-1 = 50 s-1

23

RIWAYAT HIDUP
Penulis dilahirkan di Bengkulu pada tanggal 18 April 1991 dari ayah
Drs.Muzwar Nawawi dan ibu Nahdian Sinatra. Penulis merupakan putri bungsu
dari empat bersaudara. Tahun 2009 penulis lulus dari SMU Negeri 5 Bengkulu
dan pada tahun yang sama penulis lulus seleksi masuk IPB melalui jalur
Undangan Seleksi Masuk IPB. Penulis diterima di Program Biokimia,
Departemen Biokimia, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam. Selama
mengikuti program S1 di IPB penulis pernah bergabung dengan organisasi
SERUM-G (Serambi Rukhiyah Mahasiswa Fmipa) dan CREBs (Community
Research and Education in Biochemistry Student) di Departemen Biokimia
IPB.Penulis juga pernah menjadi asisten praktikum untuk mata kuliah
Mikrobiologi Dasar di Departemen Biologi FMIPA IPB. Penulis merupakan
penerima beasiswa dari LSM Turki PASIAD pada tahun 2012-2013. Pada tahun
2012 penulis melaksanakan praktik lapangan di Laboratorium Teknologi
Bioindustri, LABTIAP, BPPT, Puspiptek, Serpong dengan judul Aktivitas Enzim
Protease dari Isolat B19 KUB BPPT CC dengan Variasi Komposisi Media
Fermentasi Berbasis Molases dan Kasein.