Metode penelitian BAHAN DAN METODE

3.3 Metode penelitian

Secara keseluruhan, alur penelitian yang akan dilakukan digambarkan dalam skema pada Gambar 4. Penelitian Pendahuluan: ----------------------------------------------------------------------------------------------------------- Penelitian Utama Isolasi BAL golongan Lactobacillus, Lactococcus, dan Streptococcus dari daging sapi bangsa peranakan Ongol yang dijual di berbagai pasar tradisional di daerah Bogor Pengujian kemampuan bakterisidal dari 10 isolat BAL terhadap bakteri enteropathogenic E. coli EPEC secara in vitro Didapatkan 10 jenis BAL isolat indigenus yang mempunyai kemampuan bertahan pada pH asam lambung yaitu pH 2 dan pH usus 7.2 serta pada kondisi garam empedu 0.5 sesuai dengan kondisi saluran pencernaan Arief et al. 2008 Didapatkan 2 spesies BAL yang mempunyai kemampuan terbaik dalam melawan EPEC, yaitu Lactobacillus plantarum dan Lactobacillus fermentum Astawan et al. 2009 Penelitian Utama: Gambar 4 Diagram alir alur penelitian yang akan dilakukan. Pengujian BAL Lactobacillus plantarum dan Lactobacillus farmentum pada kelompok tikus dengan perlakuan: A: kontrol negatif : cekok ransum standar dan akuades H1-H21 B: cekok Lactobacillus plantarum H1-H21 C: cekok Lactobacillus fermentum H1-H21 D: cekok Lactobacillus plantarum H1-H21 dan EPEC H8-H14 E: cekok Lactobacillus fermentum H1-H21 dan EPEC H8-H14 F: kontrol positif: cekok EPEC H8-H14 Terminasi Hari perlakuan H0 H22 Cekok EPEC: D,E,F T1 T2 T3 Analisa kandungan antioksidan intraselular Cu,Zn-SOD di jaringan ginjal tikus percobaan H8 H15 Cekok BAL: B, C, D,E Persiapan hewan percobaan Hewan percobaan Hewan percobaan yang digunakan dalam penelitian ini adalah tikus putih jantan Albino Norway Rats Rattus norvegicus galur Sprague Dawley umur 5-6 minggu hasil pengembangbiakan dari Badan POM RI sebanyak 90 ekor dengan berat badan 140-240 gram. Kandang dan perlengkapan Kandang yang digunakan adalah kandang yang berukuran 17.5 x 23.75 x 17.5 cm, dengan jumlah sesuai dengan jumlah tikus yang digunakan. Kandang terbuat dari stainless steel. Kandang tikus berlokasi pada tempat yang bebas dari suara ribut dan terjaga dari asap industri serta polutan lainnya. Lantai kandang mudah dibersihkan dan disanitasi. Suhu optimum ruangan untuk tikus adalah 22- 24 o C dan kelembaban udara 50-60 dengan ventilasi yang cukup namun tidak ada jendela terbuka. Ransum Komposisi ransum basal disusun berdasarkan standar AOAC 2005 yaitu mengandung karbohidrat, protein, lemak, mineral, vitamin, dan air. Komposisi ransum untuk tikus percobaan adalah sebagai berikut : Tabel 1 Komposisi campuran ransum basal tikus Bahan-bahan Jumlah Protein kasein X=1.60 x 100N sampel 10 port Minyak jagung [8-X x ekstrak eter] 100 Campuran mineral [5-X x kadar abu] 100 Campuran vitamin 1 CMC [1-X x kadar serat kasar] 100 Air [5-X x kadar air] 100 Maizena Untuk membuat 100 Perlakuan terhadap hewan percobaan Awalnya dilakukan adaptasi tikus terhadap lingkungan selama lima hari dengan pemberian makanan berupa ransum basal pada semua tikus. Tikus dibagi dalam 6 kelompok perlakuan. Setiap kelompok perlakuan terdiri dari 5 ekor tikus. Kelompok tersebut terbagi atas kelompok perlakuan kontrol negatif ransum normal, kontrol positif cekok EPEC, perlakuan cekok BAL, dan perlakuan cekok BAL ditambah EPEC Tabel 2. Jumlah BAL yang diberikan disesuaikan dengan petunjuk Zoumoupopoulou et al. 2008. Dua kultur BAL terpilih yaitu Lactobacillus plantarum dan Lactobacillus fermentum berumur satu hari pada media MRS broth sebanyak 1 ml dengan populasi 10 8 cfu diberikan sesuai dengan perlakuan pada tikus percobaan. Sedangkan populasi Enteropathogenic E.coli penyebab diare yang diberikan adalah 10 5 cfuml menurut Oyetayo 2004. BAL dan EPEC diberikan secara oral menggunakan sonde. Semua kelompok tikus perlakuan diberi pakan ransum dan akuades ad libitum. Tabel 2 Kelompok tikus perlakuan Kelompok Tikus Perlakuan A Tikus kontrol negatif yaitu tikus tanpa perlakuan, hanya diberi ransum standar dan akuades mulai hari ke-1 sampai hari ke-21 B Tikus yang diberi Lactobacillus plantarum mulai hari ke-1 sampai hari ke-21 C Tikus yang diberi Lactobacillus fermentum mulai hari ke-1 sampai hari ke-21 D Tikus yang diberi Lactobacillus plantarum mulai hari ke-1 sampai hari ke-21 dan pemberian EPEC pada hari ke-8 sampai hari ke-14 E Tikus yang diberi Lactobacillus fermentum mulai hari ke-1 sampai hari ke-21 dan pemberian EPEC pada hari ke-8 sampai hari ke-14 F Tikus yang diberi EPEC selama 7 hari hari ke-8 sampai hari ke-14 Setelah perlakuan, dilakukan proses terminasi, ada tiga kali terminasi dengan selang waktu 7 hari. Hari ke-8 dilakukan terminasi terhadap keenam kelompok perlakuan dengan kode T1, hari ke-15 dilakukan terminasi terhadap keenam kelompok perlakuan dengan kode T2, hari ke-22 dilakukan terminasi terhadap keenam kelompok perlakuan dengan kode T3 Gambar 5. Gambar 5 Skema terminasi pada kelompok tikus perlakuan. Pemrosesan Jaringan Pengambilan Sampel Sampling, Fiksasi, dan Pemotongan Organ Pengambilan sampel ginjal dilakukan setelah tikus diberi perlakuan. Tikus dimatikan dengan cara cervicalis dislocatio lalu abdomen tikus dibedah dan organ ginjal diambil dengan sangat hati-hati untuk menghindari kerusakan jaringan. Sampel ginjal dicuci dengan menggunakan NaCl fisiologis 0.9 untuk menghilangkan darah kemudian direndam dengan larutan Bouin yang telah diberi label dan catatan waktu masuknya sampel ke dalam larutan. Larutan Bouin yang terdiri dari larutan asam pikrat jenuh, formalin 37 - 40, dan asam asetat glasial disiapkan terlebih dahulu dengan perbandingan 15:5:1. Organ ginjal difiksasi dengan larutan Bouin selama 24 jam kemudian larutan Bouin diganti dengan alkohol 70 stopping point. Organ ginjal yang telah difiksasi kemudian dipotong kecil berbentuk dadu dan dimasukkan ke dalam tissue basket serta diberi label. Dehidrasi Dehidrasi bertujuan untuk mengeluarkan air dari dalam jaringan dengan menggunakan seri alkohol bertingkat yaitu alkohol 70, alkohol 80, alkohol 90, alkohol 95 masing-masing 24 jam, alkohol absolut I, alkohol absolut II, dan alkohol absolut III masing-masing 1 jam. H0 H8 T1 T2 T3 H22 H15 Cekok EPEC: D,E,F Cekok BAL: B, C, D, E Penjernihan Clearing Penjernihan bertujuan menggantikan tempat etanol dalam jaringan. Reagen yang dipergunakan adalah xylol. Jaringan dipindahkan dari alkohol absolut III ke larutan penjernih xylol. Penjernihan dilakukan dalam xylol I 1 jam, xylol II 1 jam, dan xylol III 30 menit pada suhu kamar dan 30 menit pada inkubator. Infiltrasi Parafin Infiltrasi parafin bertujuan untuk menggantikan kedudukan dehidran dalam jaringan dan bahan penjernih dengan parafin cair. Jaringan dimasukkan dalam parafin cair I, parafin cair II, dan parafin cair III masing-masing 1 jam di dalam oven. Penanaman Jaringan Embedding Bahan dan alat yang digunakan dalam proses ini adalah inkubator, embedding tissue console, pinset, parafin cair, gliserin, blok kayu, pinset, pemanas bunsen, tutup pagoda, spatula, dan kertas film untuk label. Tahap pertama tutup pagoda diolesi gliserin dan tetap dalam kondisi hangat pengerjaan dilakukan diatas hot plate bersuhu 67 C, kemudian parafin cair pada embedding tissue console dituangkan ke dalam tutup pagoda perlahan- lahan sampai permukaannya cembung. Jaringan secara hati-hati diletakkan ke dalam parafin dengan menggunakan pinset. Kemudian letaknya diatur sesuai dengan posisinya terhadap jaringan yang lain untuk mempermudah proses pemotongan. Pada setiap sampel diberikan label dengan nama sampelnya ditulis menggunakan pensil di atas kertas film. Setelah jaringan ditanam, tutup pagoda dipindahkan dari keadaan hangat ke bagian dingin cold plate untuk beberapa saat agar membeku lalu dipindahkan ke dalam air sampai parafin membeku sempurna. Jika parafin telah membeku sempurna, parafin dikeluarkan dari pagoda dengan cara mengungkit salah satu sisi pagoda dengan pisau. Potongan parafin yang membungkus jaringan ditrimming sampai membentuk kotak lalu ditempelkan pada balok kayu yang telah disediakan. Pembuatan Blok Parafin Pisau dipanaskan diatas pemanas bunsen dan parafin di sekitar sampel dirapikan dengan cara dipotong. Kayu tempat penempelan sampel diletakkan pada alas agar statis. Potongan- potongan parafin diletakkan diatas pisau kemudian pisau dipanaskan sampai parafin cair. Parafin cair pada pisau diteteskan ke balok kayu. Sampel yang ada diletakkan diatas pisau panas dan secara perlahan diletakkan di balok kayu yang telah dialasi parafin cair. Blok parafin disimpan dalam lemari es sebelum dipotong menggunakan mikrotom. Penyayatan Sectioning dan Penempelan ke Gelas Objek Blok parafin dipasang pada mikrotom dan diatur agar posisinya sejajar dengan posisi pisau. Blok parafin dipotong dengan ketebalan 4 µ m. Pada awal pemotongan dilakukan trimming karena jaringan yang terpotong masih belum sempurna. Setelah didapatkan hasil sayatan yang terbaik, hasilnya diambil dengan kertas yang basah pada bagian ujung lalu diapungkan diatas air dingin. Jika hasil potongan membentuk pita maka jaringan dipisahkan dengan jarum satu persatu. Potongan jaringan yang telah terpisah ditempatkan pada air hangat dengan suhu 37 C untuk menghilangkan kerutan lalu ditempatkan pada gelas objek. Sediaan pada gelas objek lalu dilihat di bawah mikroskop untuk melihat ada tidaknya luka pisau dan ketebalan potongan, jika belum maka dicari potongan lain. Gelas objek dengan sediaan jaringan terpilih diberi label sesuai dengan perlakuan dan dikeringkan. Sediaan disimpan pada inkubator dengan suhu 37 C selama semalam lalu siap diwarnai dengan pewarnaan HE. Untuk pewarnaan immunohistokimia, gelas objek dilem dahulu dengan neofren. Sebelum pengeleman, gelas objek dibersihkan terlebih dahulu dengan ultrasonic cleaner menggunakan larutan pembersih 20 menit kemudian secara berurutan larutan pada ultrasonic cleaner diganti dengan akuades sebanyak 3 kali masing-masing selama 20 menit. Gelas objek yang telah bersih disimpan dalam inkubator dengan suhu 37 o C selama semalam lalu dilem dengan neofren. Pewarnaan Pewarnaan Immunohistokimia Superoxide Dismutase Cu,Zn-SOD Pewarnaan khusus imunohistokimia terhadap Cu,Zn-SOD dilakukan untuk mengamati perubahan kandungan enzim antioksidan Cu,Zn-SOD pada jaringan ginjal. Langkah awal dilakukan deparafinisasi dengan xylol III-I, waktu untuk xylol III dan II selama 3 menit sedangkan untuk xylol I selama 5 menit. Kemudian dilakukan rehidrasi dengan alkohol absolut III-alkohol 80 masing-masing selama 3 menit dan terakhir dengan alkohol 70 selama 5 menit. Selanjutnya dimasukkan dalam akuades selama 15 menit. Setelah itu diinkubasi dalam substrat methanol yang ditambahkan H 2 O 2 selama 15 menit untuk menghilangkan aktivitas peroksidase endogen, selanjutnya dicuci berturut-turut dengan akuades dan Phosphate Buffer Saline PBS masing-masing 2x10 menit. Setelah itu jaringan diinkubasi dalam serum normal-Bovine Serum Albumin BSA sebanyak 60 µL selama 30-60 menit pada suhu 37 o C untuk menutupi antigen non spesifik dan berikutnya jaringan dicuci dengan PBS selama 3x10 menit. Kemudian jaringan diinkubasi dalam antibodi monoklonal Cu,Zn-SOD 1:200 pada suhu 4 o C selama 2 malam. Selanjutnya dicuci dengan PBS selama 3x5 menit dan diinkubasi dalam antibodi sekunder Dako Envision Peroxidase Dako K 1491 selama 60 menit dalam ruang gelap. Hasil reaksi antigen dengan antibodi divisualisasikan dengan menggunakan DAB Diamino Benzidine dalam tris buffer yang ditambahkan H 2 O 2 selama 25 menit ditutup gelap, selanjutnya dicounterstain dengan hemaktosilin. Setelah itu dilakukan dehidrasi dan clearing, jaringan kemudian dimounting dengan entelan dan siap untuk diamati. Preparat yang telah siap untuk diamati menunjukkan reaksi positif apabila berwarna coklat. Warna coklat menunjukkan kandungan antioksidan Cu,Zn-SOD.

3.4 Parameter dan Analisis Data