Aktivitas Antimikroba Ekstrak Kulit Buah Manggis(Garcinia mangostana) Terhadap Bakteri Aeromonas hydrophila, Streptococcus Agalactiae dan Jamur Saprolegnia sp.

  Lampiran 1. Persiapan Media Bakteri dan Jamur Media Trypticase Soy Agar (TSA)

  Sebanyak 40 g bubuk TSA dilarutkan dalam 1000 ml akuades yang ditempatkan dalam Erlenmeyer 1 liter dan dipanaskan pada penangas air sambil diaduk hingga larut dan homogen dengan menggunakan batang pengaduk,

  o

  kemudian disterilkan dengan autoclave pada suhu 121 C dengan tekanan uap 1atm selama 15 menit. Setelah itu dimasukkan ke dalam tabung reaksi atau cawan yang telah steril, setelah memadat disimpan dalam lemari es dengan plastik steril.

  Media Potato Dextrose Agar (PDA)

  Sebanyak 10g bubuk PDA dilarutkan dalam 500 ml akuades yang ditempatkan dalam Erlenmeyer 1liter dan dipanaskan pada penangas air sambil diaduk hingga larut dan homogen dengan menggunakan batang pengaduk,

  o

  kemudian disterilkan dengan autoclave pada suhu 121 C dengan tekanan uap 1atm selama 15 menit. Setelah itu dimasukkan ke dalam tabung reaksi atau cawan yang telah steril, lalu disimpan pada lemari es dengan plastik steril

  Lampiran 2. Sterilisasi Alat dan Bahan

  Sterilisasi alat dilakukan sebelum semua peralatan digunakan, yaitu dengan cara membungkus semua peralatan dengan menggunakan kertas stensil

  o

  kemudian di masukkan ke dalam oven dengan suhu 150 C selama 4 jam. Bahan

  o

  atau media dimasukkan kedalam autoklaf pada suhu 121 C dengan tekanan 15psi (per square inci) selama 15 menit. Untuk alat yang tidak tahan panas tinggi disterilisasi dengan zat kimia berupa alkohol 70%.

  Lampiran 3. Pembuatan Larutan Baku McFarland

  Larutan baku McFarland terdiri atas dua komponen, yaitu larutan BaCl

  2

  1% dan H

  2 SO 4 1%. Sebanyak 0,05 mL larutan BaCl 2 1% dicampurkan dengan

  9.95ml larutan H SO 1% dan dikocok hingga homogen. Kekeruhan larutan

  2

  4

  diukur pada panjang gelombang 620nm dengan menggunakan akuades sebagai blangkonya. Nilai absorban larutan baku harus berada di kisaran 0,08 sampai dengan 0.13. Larutan baku McFarland 0,5 ekuivalen dengan suspensi sel bakteri

  8 dengan konsentrasi 0.5 × 10 CFU/ml.

  Lampiran 4. Proses Pembuatan Ekstrak Kulit Buah Manggis

  Kulit buah manggis yang telah kering dan simplisia Penimbangan dan penuangan pelarut Proses penyaringan setelah maserasi dan Pemisahan ekstrak dengan pelarut menggunakan rotary evaporator Proses pemekatan ekstrak dengan water bath

  Lampiran 5. Proses Pengujian Toksisitas A. salina

  Kista A. salina dan wadah penetasan Proses pemipetan larutan uji dengan mikropipet, Proses pengukuran air 5ml dan

  Proses pemasukan A. salina Setelah pengamatan 24 jam

  Lampiran 6. Pembuatan Konsentrasi Larutan Uji

  Larutan induk adalah konsentrasi 80%, yaitu dengan perbandingan 0,8 gram dalam 1 ml DMSO (b/v). Untuk membuat konsentrasi 60%, 40% dan 20% dilakukan dengan pengenceran sebagai berikut:

  V

  1 N

1 =V

  2 N

  2

  a. Konsentrasi 60%

  V

  1 x 80% = 0,5 x 80%

  V = 0,375 ml

  1

  = 3 75μl

  b. Konsentrasi 40%

  V

  1 x 80% = 0,5 x 40%

  V

  1 = 0,25 ml

  = 250 μl

  c. Konsentrasi 20%

  V

  1 x 80% = 0,5 x 20%

  V

  1 = 0,125 ml

  = 12 5μl

  Lampiran 7. Analisis Kriteria Bakteri Aeromonas hydrophila

  Uji motilitas motil dan uji O/F positif fermentative Pewarnaan gram negatif berwarna merah dan berbentuk batang pendek

  Lampiran 8. Analisis Kriteria Bakteri Edwardsiella tarda

  Uji MR positif VP negative dan Citrat negatif Pewarnaan gram negatif berwarna merah dan berbentuk batang pendek

  Lampiran 9. Analisis Kriteria Jamur Saprolegnia sp.

  Pengujian Jamur secara morfologi Hasil pengamatan mikroskopis

  Lampiran 10. Proses Pengujian Antimikroba

  Penimbangan ekstrak, Penghomogenan ekstrak dengan vortex dan penyiapan suspensi bakteri Pembandingan dengan Larutan McFarland dan Pengolesan suspense bakteri pada media

  Perendaman cakram, peletakan cakram pada media uji dan pengukuran zona hambat

  

a b e d c f

a b c d e f a b c d e f Lampiran 11. Hasil Skrining Fitokimia Kulit Buah Manggis

  Hasil skrining fitokimia pelarut metanol dengan pereaksi: a. FeCl

  3 , b. Wagner,

c. Dragendroff, d. Mayer, e. Bouchardat dan f. Aqua

  Hasil skrining fitokimia pelarut etil asetat dengan pereaksi: a.Aqua, b. Wagner,

c. Bouchardat, d. Mayer, e. Dragendroff dan f. FeCl

  3 Hasil skrining fitokimia pelarut n-heksana dengan pereaksi: a.Aqua, b. Wagner,

c. Bouchardat, d. Mayer, e. Dragendroff dan f. FeCl

  Lampiran 12. Hasil Pengujian Antimikroba

  (a) (b) (c) Hasil pengujian antibakteri terhadap bakteri A. hydrophila dengan pelarut (a) metanol (b) etil asetat (c) n-heksana

  (a) (b) (c) Hasil pengujian antibakteri terhadap bakteri Edwardsiella tarda dengan pelarut

  (a) metanol (b) etil asetat (c) n-heksana (a) (b) (c)

  Hasil pengujian antijamur terhadap jamur Saprolegnia sp. dengan pelarut (a) metanol (b) etil asetat (c) n-heksana (d) kontrol negatif (DMSO) (e) kontrol positif (nistatin)

  Lampiran 13. Data Awal Kematian A. salina Pada Berbagai Konsentrasi

  Perlakuan Ulangan U

1 U

  3 U

  4

  1 2 1,8 100 ppm

  5

  5

  3

  4 5 4,4 1000 ppm

  6

  6

  4

  5 6 5,4 n-heksana 10 ppm

  3

  2

  2

  3 2 2,8 100 ppm

  6

  6

  5

  4

  4

  5 1000 ppm

  8

  7

  6

  7 6 6,8

  3

  1

  4 U

  2

  5 Rata-rata

  Kontrol air laut Kontrol DMSO

  2

  1

  2 2 1,4

  1

  2

  2

  1 2 1,6 Metanol 10 ppm

  2

  3

  1

  5 5 5,8 Etil asetat 10 ppm

  2

  2 100 ppm

  4

  5

  3

  4

  4

  4 1000 ppm

  6

  7

  2 U

  6

  Lampiran 14. Contoh Perhitungan Penentuan LC

  50

a. Ekstrak Kulit Buah Manggis dengan Pelarut Metanol

  (ppm) Total

  3

  2

  = 0,837 Penentuan LC

  50

  (Konsentrasi yang dapat menyebabkan kematian sebesar 50%) maka 50% nilai probit (y) = 5 (dilihat dari tabel probit), x = log konsentrasi.

  y = 1,78x + 2,296 R² = 0,837

  1

  2

  4

  50 x 100% = 40%

  5

  6

  7

  8

  9 0,5 1 1,5 2 2,5 3 3,5

  N ila i P ro b it

Log Konsentrasi

  Ekstrak Metanol

  Kurva hubungan log konsentrasi versus nilai probit ekstrak metanol: Dari grafik hubungan antara log konsentrasi (sumbu x) dengan nilai probit sumbu y didapatkan persamaan y = 1,78x + 2,296 dan R

  20

  Populasi Jumlah

  50

  Kematian Persen

  Mortalitas Log

  Konsentrasi Probit

  LC

  50

  (ppm) metanol

  10

  10

  Pelarut Konsentrasi

  20 1 4,16 372,524 100

  50

  20

  40 2 4,75 1000

  50

  29

  58 3 5,2 Pada ekstrak dengan konsentrasi 100 ppm Persen mortalitas =

  Jumlah Artemia Mati Jumlah Populasi x 100% =

  2 Perhitungan LC 50 dari persamaan regresi y = 1,78x + 2,296 dan R = 0,837

  Adalah sebagai berikut: 5 = 1,78x + 2,296 x = (5 – 2,296) / 1,78 x =2,571153846 anti log dari x = 372,5236471 LC = 372,524 ppm

  50

b. Ekstrak Kulit Buah Manggis dengan Pelarut Etil asetat

  Konsentrasi Total Jumlah Persen Log LC

  50 Pelarut

  Probit (ppm) Populasi Kematian Mortalitas Konsentrasi (ppm)

  10

  50

  9

  18 1 4,08 Etil asetat 100

  50

  22

  44 2 4,85 431,811 1000

  50

  27

  54 3 5,1 Pada ekstrak dengan konsentrasi 100 ppm

  Jumlah Artemia Mati

  Persen mortalitas =

  x 100% Jumlah Populasi

  22 = x 100%

  50 = 44%

  Kurva hubungan log konsentrasi versus nilai probit ekstrak etil asetat:

  Ekstrak Etil asetat

  6 y = 0,51x + 3,656

5 R² = 0,920

  it

  4 b ro

  3

i P ila

2 N

  1 0,5 1 1,5 2 2,5 3 3,5

  Log Konsentrasi

  Dari grafik hubungan antara log konsentrasi (sumbu x) dengan nilai probit sumbu

  2

  y didapatkan persamaan y = 0,51x + 3,656 dan R = 0,920 Penentuan LC

  50 (Konsentrasi yang dapat menyebabkan kematian sebesar

  50%) maka 50% nilai probit (y) = 5 (dilihat dari tabel probit), x = log konsentrasi.

  2 Perhitungan LC dari persamaan regresi y = 0,51x + 3,656 dan R = 0,920

  50

  adalah sebagai berikut: 5 = 0,51x + 3,656 x = (5 – 3,656) / 0,51 x = 2,635294118 anti log dari x = 431,8114139 LC

  50 = 431,811 ppm

c. Ekstrak Kulit Buah Manggis dengan Pelarut n-heksana

  y = 0,514x + 3,942 R² = 0,997

  = Jumlah Artemia Mati Jumlah Populasi

x 100%

=

  25

  50 x 100% = 50%

  Kurva hubungan log konsentrasi versus nilai probit ekstrak n-heksana: Dari grafik hubungan antara log konsentrasi (sumbu x) dengan nilai probit sumbu y didapatkan persamaan y = 0,514x + 3,942 dan R

  2

  = 0,997

  1

  34

  2

  3

  4

  5

  6 0,5 1 1,5 2 2,5 3 3,5

  N ila i P ro b it

Log Konsentrasi

  Ekstrak n-Heksana

  68 3 5,47 Pada ekstrak dengan konsentrasi 100 ppm Persen mortalitas

  Pelarut Konsentrasi

  (ppm) Total

  (ppm) n-heksana

  Populasi Jumlah

  Kematian Persen

  Mortalitas Log

  Konsentrasi Probit

  LC

  50

  10

  5 1000

  50

  14

  28 1 4,442 114,384 100

  50

  25

  50

  2

  50 Penentuan LC

  50 (Konsentrasi yang dapat menyebabkan kematian sebesar 50%) maka 50% nilai probit (y) = 5 (dilihat dari tabel probit), x = log konsentrasi.

  2 Perhitungan LC 50 dari persamaan regresi y = 0,514x + 3,942 dan R =

  0,997 adalah sebagai berikut: 5 = 0,514x + 3,942 x = (5 – 3,942) / 0,514 x = 2,058365759 anti log dari x = 114,3841262 LC = 114,384 ppm

  50

  Lampiran 15. Data Awal Zona Hambat Ekstrak Kulit Buah Manggis

a. Aeromonas hydrophila Pelarut Konsentrasi Ulangan ∑ Rata- rata (mm) U

1 U

  20

  20

  6 32,66

  9

  8

  6

  80 Kloramfenikol

  60

  40

  33,82 n-heksana DMSO

  7 8,5

  6,08 10,4

  4,6 4,8

  52 169,1

  24 30,4

  23

  16 33,82

  4 4,2

  6

  8 32,66

  10 33,82

  4

  32,66

  7,7 7,8

  4,2 5,64

  39 163,3

  21 28,2 38,5

  11 32,66

  5

  2

  4 4,2

  32.66

  8

  6

  5

  3

  6 32,66

  10

  5

  5 5,5

  40

  4

  5

  8 33,82

  3 3,5

  1

  9 33,82

  3

  6

  8 33,82

  

₂

U ₃ U ₄ U ₅ Metanol DMSO

  3

  3

  4

  3 33,82

  5

  2 2,5

  80 Kloramfenikol

  60

  5

  6

  14 33,82

  5 33,82

  11 33,82

  4

  4

  3

  10 33,82

  5 8,2

  7

  6 8,5

  16 19,5 20,5

  4

  80 Kloramfenikol

  60

  40

  20

  33,82 Etil asetat DMSO

  3,2 3,9 4,1 8,4

  42 169,1

  4

b. Edwardsiella tarda Pelarut Konsentrasi Ulangan ∑ Rata- rata (mm) U

1 U

  80 Kloramfenikol

  40

  2

  1

  6 33,61

  4

  2

  1

  80 Kloramfenikol

  60

  20

  8 33,61

  12 34,76 n-heksana DMSO

  4,8 6,8 8,2

  60 173,8

  41

  34

  24

  11 34,76

  6

  5

  5

  1

  8 34,76

  6

  ^{2 U 3 U 4 U 5} Metanol DMSO

  20

  40

  33,61

  1,2 2,4 4,4 6,4

  34 168,05

  22

  12

  7 33,61

  2

  5

  3

  2

  6 33,61

  5

  3

  1

  7 33,61

  3

  3

  5

  3

  9 34,76

  7 34,76

  5

  4

  2

  7 34,76

  6

  5

  3

  7

  28

  6

  4

  8 34,76

  6

  5

  4

  13 34,76

  8

  60

  16

  32

  4

  4

  3

  18 34,76

  14

  13

  10

  10 34,76

  8

  6

  13 34,76

  44 173,8

  8

  6

  4

  80 Kloramfenikol

  60

  40

  20

  34,76 Etil asetat DMSO

  3,2 5,4 6,4 8,8

  7

b. Saprolegnia sp. Pelarut Konsentrasi Ulangan ∑ Rata- rata (mm) U

1 U

  1,6 3,2 5,8 7,8

  3

  2

  1

  80 Nistatin

  60

  40

  20

  11,45 n-heksana DMSO

  29

  39 68,25

  1

  16

  8

  6 11,45

  5

  4

  2

  9 11,45

  7

  4 10,32

  2

  1

  2

  10,32

  1,2 2,2 3,6 5,4

  27 51,6

  18

  11

  6

  6 10,32

  3

  1

  3

  7 10,32

  5

  3

  2

  6 10,32

  4

  2

  1

  4 10,32

  2

  ^{2 U 3 U 4 U 5} Metanol DMSO

  20

  7 11,45

  1

  6 611,45

  5

  3

  2

  5 11,45

  4

  2

  1

  4

  4

  3

  1

  6 11,45

  5

  4

  2

  80 Nistatin

  60

  40

  4

  7 11,45

  5

  3

  3

  1

  7 11,45

  6

  4

  2

  11.45

  9

  6

  2

  7

  80 Nistatin

  60

  40

  20

  11,45 Etil asetat DMSO

  1,4 2,8 4,4 6,2

  31 68,25

  22

  16

  8 11,45

  Lampiran 16. Tabel Probit Menurut Vilchez dkk (2001)

  Persentase Probit

  1

  2

  3

  4

  5

  6

  7

  8

  9

• 2,67 2,95 3,12 3,25 3,36 3,45 3,52 3,59 3,66 10 3,72 3,77 3,82 3,87 3,92 3,96 4,01 4,05 4,08 4,12 20 4,16 4,19 4,23 4,26 4,29 4,33 4,36 4,39 4,442 4,45 30 4,48 4,50 4,53 4,56 4,59 4,61 4,64 4,67 4,69 4,72 40 4,75 4,77 4,80 4,82 4,85 4,87 4,90 4,92 4,95 4,97 50 5,00 5,03 5,05 5,08 5,10 5,13 5,15 5,18 5,20 5,23 60 5,25 5,28 5,31 5,33 5,36 5,39 5,41 5,44 5,47 5,50 70 5,52 5,55 5,58 5,61 5,64 5,67 5,71 5,74 5,77 5,81 80 5,84 5,88 5,92 5,95 5,99 6,04 6,08 6,13 6,18 6,23 90 6,28 6,34 6,41 6,48 6,55 6,64 6,75 6,88 7,05 7,33

  99 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9

  7,33 7,37 7,41 7,46 7,51 7,58 7,67 7,75 7,88 8,09