Uji sitotoksisitas ekstrak etanolik daun sirih merah [Piper crocatum Ruiz & Pav] terhadap kultur sel raji - USD Repository

  UJI SITOTOKSISITAS EKSTRAK ETANOLIK DAUN SIRIH MERAH (Piper crocatum Ruiz & Pav) TERHADAP KULTUR SEL RAJI SKRIPSI Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S. Farm) Program Studi Ilmu Farmasi Oleh : Eva Dwi Kusumaningtyas NIM : 048114147 FAKULTAS FARMASI UNIVERSITAS SANATA DHARMA YOGYAKARTA 2008

  UJI SITOTOKSISITAS EKSTRAK ETANOLIK DAUN SIRIH MERAH (Piper crocatum Ruiz & Pav) TERHADAP KULTUR SEL RAJI SKRIPSI Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S. Farm) Program Studi Ilmu Farmasi Oleh : Eva Dwi Kusumaningtyas NIM : 048114147 FAKULTAS FARMASI UNIVERSITAS SANATA DHARMA YOGYAKARTA 2008

  PERSETUJUAN PEMBIMBING UJI SITOTOKSISITAS EKSTRAK ETANOLIK DAUN SIRIH MERAH (Piper crocatum Ruiz & Pav) TERHADAP KULTUR SEL RAJI

  Yang diajukan oleh : Eva Dwi Kusumaningtyas

  NIM : 048114147 telah disetujui oleh Pengesahan Skripsi Berjudul

  UJI SITOTOKSISITAS EKSTRAK ETANOLIK DAUN SIRIH MERAH (Piper crocatum Ruiz & Pav) TERHADAP KULTUR SEL RAJI

  Oleh : Eva Dwi Kusumaningtyas

  NIM : 048114147 Dipertahankan di hadapan Panitia Penguji Skripsi

  Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma pada tanggal : 28 Juni 2008

HALAMAN PERSEMBAHAN

  

Aku menanti datangnya pagi

Dan aku temui

Aku menanti bergantinya hari

Dan aku temui

  

Aku menanti musim berganti

Dan aku temui

Aku mencari hati

Dan aku dapati

  

Tiada kata yang bisa terucap selain terimakasih

KASIH

  Dan tiada hal yang dapat kuingat selain Skripsi Ini kupersembahkan Untuk : Papa dan Mamaku tercinta.... Kakakku terkasih.... – Saudara dan teman temanku.... Almamaterku...

  

LEMBAR PERNYATAAN PERSETUJUAN

PUBLIKASI KARYA ILMIAH UNTUK KEPENTINGAN AKADEMIS

  Yang bertanda tangan di bawah ini, saya mahasiswa Universitas Sanata Dharma : Nama : Eva Dwi Kusumaningtyas Nomor Mahasiswa : 048114147

  Demi pengembangan ilmu pengetahuan, saya memberikan kepada Perpustakaan Universitas Sanata Dharma karya ilmiah saya yang berjudul :

  

“Uji Sitotoksisitas Ekstrak Etanolik Daun Sirih Merah (Piper Crocatum Ruiz

& Pav) terhadap Kultur Sel Raji”

  beserta perangkat yang diperlukan (bila ada). Dengan demikian saya memberikan kepada Perpustakaan Universitas Sanata Dharma hak untuk menyimpan, me- ngalihkan dalam bentuk media lain, mengelolanya dalam bentuk pangkalan data, mendistribusikan secara terbatas, dan mempublikasikannya di Internet atau media lain untuk kepentingan akademis tanpa perlu meminta ijin dari saya maupun memberikan royalti kepada saya selama tetap mencantumkan nama saya sebagai penulis.

  Demikian pernyataan ini yang saya buat dengan sebenarnya. Dibuat di Yogyakarta Pada tanggal : 18 Juli 2008 Yang menyatakan ( Eva Dwi Kusumaningtyas )

  

PRAKATA

  Puji syukur penulis panjatkan kepada Tuhan Yesus Kristus atas semua rahmat dan karuniaNya sehingga penulis dapat menyelesaikan penelitian dan penulisan skripsi yang berjudul “Uji Sitotoksisitas Ekstrak Etanolik Daun Sirih

  

Merah (Piper Crocatum Ruiz & Pav) terhadap Kultur Sel Raji.” Skripsi ini

  disusun dalam rangka memenuhi salah satu syarat untuk memperoleh gelar Sarjana Farmasi (S.Farm).

  Selama penelitian dan penyusunan skripsi ini, penulis tidak terlepas dari bantuan dan dukungan berbagai pihak. Oleh karena itu, penulis mengucapkan terimakasih kepada :

  1. Rita Suhadi, M.Si., Apt selaku Dekan Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma.

  2. Drs. A. Yuswanto S.U., Ph.D., Apt. selaku dosen pembimbing atas kesediaannya dalam memberikan arahan, dukungan dan masukan dalam penelitian dan penulisan skripsi ini.

  3. Drs. Mulyono., Apt. selaku dosen penguji yang telah banyak memberikan masukan kepada penulis.

  4. Yohanes Dwiatmaka, M.Si. selaku dosen penguji yang telah banyak memberikan masukan kepada penulis.

5. Ibu Tri Yuliani dan segenap karyawan LPPT Universitas Gadjah Mada yang telah banyak membantu dalam pelaksanaan penelitian.

  6. Ign. Y. Kristio Budiasmoro, M.Si., dan Romo Sunu yang telah membantu penyelesaian skripsi ini.

  7. Papa dan Mamaku tercinta, Kakakku Petra, Mbak Dwi, dek Pasha, Andreas Bob Dwi Putra dan segenap keluarga besar atas semua dukungan, kasih sayang dan semangat yang diberikan.

  8. Anggota team sirih merah : Ririt, Meri, Siska dan Nur, terimakasih untuk kerjasama dan bantuannya, serta suka dan duka dalam masa ‘penantian’.

  9. Rike, Bu Novi dan temen – temen GTY, Mbak Darti sekeluarga, Bapak Narkoyo sekeluarga yang selalu memberikan dukungan.

  10. Teman - teman kosku Yanti, Dewi, Ayu, Wulan, teman – teman kelas C dan praktikum golongan F, Vina, Syamsi, Mas Adi, Robert, Finza, Budiaji, Maria, Siska, Evi, Dhita, Mas Ary, Yusak, Hendrat, Kornel untuk pengertian dan dukungan yang diberikan serta persahabatan kita.

  11. Semua pihak yang turut membantu dalam penyusunan skripsi ini.

  Penulis menyadari masih banyak kekurangan yang terdapat dalam penelitian dan penyusunan skripsi ini. Oleh karena itu penulis mengharapkan kritik dan saran yang menyempurnakan. Semoga penulisan skripsi ini dapat memberikan manfaat bagi semua pihak serta mendukung perkembangan ilmu pengetahuan.

  Yogyakarta, Mei 2008 Penulis

  Eva Dwi Kusumaningtyas

PERNYATAAN KEASLIAN KARYA

  Saya menyatakan dengan sesungguhnya bahwa skripsi yang saya tulis ini tidak memuat karya atau bagian karya orang lain, kecuali yang telah disebutkan dalam kutipan dan daftar pustaka, sebagaimana layaknya karya ilmiah.

  Yogyakarta, 10 Mei 2008 Penulis

  Eva Dwi Kusumaningtyas

  

INTISARI

  Di Indonesia, kanker merupakan salah satu penyakit yang masih berpotensi tinggi dalam menyebabkan kematian. Secara empiris, tanaman sirih merah (Piper crocatum) telah digunakan oleh masyarakat sebagai obat antikanker. Tujuan dari penelitian ini adalah untuk mengetahui potensi efek sitotoksik dan nilai LC

  50 ekstrak etanolik daun sirih merah terhadap kultur sel Raji.

  Penelitian ini merupakan penelitian eksperimental murni dengan rancangan lengkap pola satu arah. Ekstrak etanolik daun sirih merah dibuat dalam delapan konsentrasi yaitu 250; 500; 750; 1000; 1250; 1500; 1750; 2000 µg/ml. Uji sitotoksisitas ekstrak etanolik daun sirih merah dilakukan dengan metode direct

  

counting. Perolehan hasil perhitungan merupakan persen kematian sel yang

  kemudian dilakukan analisis statistik menggunakan Anova satu arah dan analisis probit untuk menentukan nilai LC

  50 .

  Melalui uji sitotoksisitas yang dilakukan dapat diketahui bahwa ekstrak etanolik daun sirih merah mempunyai efek sitotoksik terhadap kultur sel Raji, dengan nilai LC 50 395,5 µg/ml.

  Kata kunci : sitotoksisitas, ekstrak etanolik, daun sirih merah, LC , sel Raji ₅₀

  

ABSTRACT

In Indonesia, cancer is a kind of the disease that might cause death.

  Empiricaly, Piper crocatum Ruiz & Pav has been used for cancer treatment. The objective of this research is to identify the cytotoxicity potential and the LC

  50 of ethanolic extract of Piper crocatum Ruiz & Pav against Raji Cell Culture.

  This research was pure experimental with one way completely randomized design. Ethanolic extract of Piper crocatum Ruiz & Pav was made on eight concentration, that were 250; 500; 750; 1000; 1250; 1500; 1750 and 2000 µg/ml. The cytotoxicity test have been done with the direct counting method. Cytotoxicity of ethanolic extract of Piper crocatum Ruiz & Pav were analyzed with one way Anova and the LC

  50 value were analyzed with probit statistic.

  The result showed that the extract of Piper crocatum Ruiz & Pav have cytotoxicity effect on Raji cell culture with LC value of 395.5 µg/ml.

  50 Keyword : cytotoxicity, ethanolic extract, Piper crocatum Ruiz & Pav, LC Raji cell culture _50,

  DAFTAR ISI

  Halaman HALAMAN SAMPUL ............................................................................................ i HALAMAN JUDUL............................................................................................... ii HALAMAN PERSETUJUAN PEMBIMBING .................................................... iii PENGESAHAN SKRIPSI ..................................................................................... iv HALAMAN PERSEMBAHAN................................................................... ...........v PRAKATA............................................................................................................. vi PERNYATAAN KEASLIAN KARYA .............................................................. viii

  INTISARI............................................................................................................... ix

  ABSTRACT ...............................................................................................................x

  DAFTAR ISI.......................................................................................................... xi DAFTAR TABEL..................................................................................................xv DAFTAR GAMBAR ........................................................................................... xvi DAFTAR LAMPIRAN...................................................................................... xviii

  BAB I PENGANTAR ..............................................................................................1 A. Latar Belakang ................................................................................................1

  1. Perumusan Masalah................................................................................2

  2. Keaslian karya ........................................................................................3

  3. Manfaat penelitian ..................................................................................3

  B. Tujuan Penelitian ............................................................................................3

  1. Tujuan umum..........................................................................................3

  BAB II PENELAAHAN PUSTAKA.......................................................................4 A. Sirih Merah...................................................................... .............................. 4

  1. Keterangan Botani ......................................................................................4

  2. Deskripsi Tanaman .....................................................................................4

  3. Kandungan Kimia.......................................................................................4

  4. Khasiat dan Kegunaan ................................................................................5

  B. Teknik Penyarian…………............................................................................ 5

  C. Kanker .............................................................................................................7

  1. Tinjauan Umum ..........................................................................................7

  2. Limfoma ...................................................................................................10

  D. Kultur Sel ......................................................................................................10

  E. Sitotoksisitas .................................................................................................11

  F. Landasan Teori..............................................................................................12

  G. Hipotesis........................................................................................................13

  BAB III METODOLOGI PENELITIAN...............................................................14 A. Jenis dan Rancangan Penelitian ....................................................................14 B. Variabel dan Definisi Operasional ................................................................14

  a. Variabel ....................................................................................................14

  1. Variabel bebas......................................................................................14

  2. Variabel tergantung..............................................................................14

  3. Variabel pengacau terkendali...............................................................14

  b. Definisi operasional .................................................................................14

  C. Alat dan Bahan..............................................................................................15

  1. Alat .......................................................................................................15

  2. Bahan ....................................................................................................15

  D. Tata Cara Penelitian ......................................................................................16

  1. Determinasi tanaman ............................................................................16

  2. Pengumpulan daun sirih merah ............................................................16

  3. Pembuatan serbuk daun sirih merah .....................................................16

  4. Sterilisasi alat........................................................................................17

  5. Pembuatan ekstrak etanolik daun sirih merah ......................................17

  6. Pembuatan larutan uji ...........................................................................17

  7. Pembuatan medium pencuci dan medium penumbuh ..........................18

  a. Pembuatan medium pencuci .............................................................18

  b. Pembuatan medium penumbuh ........................................................18

  8. Preparasi kultur sel Raji........................................................................18

  a. Propagasi sel raji...............................................................................18

  b. Panen sel raji.....................................................................................19

  9. Uji sitotoksisitas ekstrak etanolik daun sirih merah dengan menggunakan metode direct counting .................................................19 E. Analisis Hasil ................................................................................................20

  BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN ...............................................................21 A. Determinasi Tanaman ...................................................................................21 B. Pengumpulan daun sirih merah.....................................................................21

  C. Pembuatan serbuk daun sirih merah .............................................................22

  D. Pembuatan Ekstrak Etanolik Daun Sirih Merah ...........................................22

  E. Sterilisasi Alat ...............................................................................................24

  F. Pembuatan Medium Pencuci dan Penumbuh................................................24

  G. Preparasi Kultur Sel Raji...............................................................................25

  H. Uji Sitotoksisitas Ekstrak Etanolik Daun Sirih Merah..................................26

  BAB V. KESIMPULAN DAN SARAN................................................................33 A. Kesimpulan ...................................................................................................33 B. Saran..............................................................................................................33 DAFTAR PUSTAKA ............................................................................................34 LAMPIRAN...........................................................................................................37 BIOGRAFI PENULIS ...........................................................................................52

  

DAFTAR TABEL

  Halaman Tabel I. Pelarut dan tingkat kepolaran.................................................................7 Tabel II. Hasil perhitungan sel raji secara direct counting pada perlakuan masing-masing konsentrasi ekstrak etanolik daun sirih merah setelah inkubasi 24 jam ....................................................................................27

  Tabel III. Persentase kematian sel raji dan harga probit setelah pemberian ekstrak etanolik daun sirih merah setelah inkubasi 24 jam ..............................29 Tabel IV. Harga probit sesuai dengan prosentasenya ..........................................42 Tabel V. Nilai koefisien korelasi pada level signifikansi 5% dan 1% ................50

  

DAFTAR GAMBAR

  Halaman Gambar 1. Sel Raji pada kontrol dan sel Raji dengan pemberian ekstrak etanolik daun sirih merah 2000 µg/ml, pada bilik haemocytometer di bawah mikroskop dengan perbesaran 100x...................................................26

  Gambar 2. Sel raji yang mati seluruhnya pada pemberian ekstrak dengan konsentrasi 2000 µg/ml; sel raji pada pemberian ekstrak dengan konsentrasi 250 µg/ml, pada perbesaran 100x ...................................27

  Gambar 3. Kontrol pada perbesaran 100x, tidak terdapat kematian sel raji ........28 Gambar 4. Grafik pengaruh konsentrasi ekstrak etanolik daun sirih merah terhadap persentase kematian sel Raji ..........................................28 Gambar 5. Grafik hubungan log konsentrasi ekstrak terhadap harga probit pada penetapan I .........................................................................................30 Gambar 6. Grafik hubungan log konsentrasi ekstrak terhadap harga probit pada penetapan II........................................................................................31 Gambar 7. Grafik hubungan log konsentrasi ekstrak terhadap harga probit pada penetapan III ......................................................................................31 Gambar 8. Tanaman Sirih merah (Piper crocatum Ruiz & Pav.).........................38 Gambar 9. 96 well Plate dan conical steril..........................................................38 Gambar 10. Kultur sel raji dalam flask ..................................................................38 Gambar 11. Laminar air flow.................................................................................39 Gambar 12. Haemocytometer dan cell counter......................................................39

  Gambar 14. Sel raji dengan pemberian ekstrak 1750 µg/ml..................................40 Gambar 15. Sel raji dengan pemberian ekstrak 1500 µg/ml..................................40 Gambar 16. Sel raji dengan pemberian ekstrak 1250 µg/ml..................................40 Gambar 17. Sel raji dengan pemberian ekstrak 1000 µg/ml..................................41 Gambar 18. Sel raji dengan pemberian ekstrak 750 µg/ml....................................41 Gambar 19. Sel raji dengan pemberian ekstrak 500 µg/ml....................................41

  DAFTAR LAMPIRAN Halaman

  Lampiran 1. Hasil determinasi .................................................................................7 Lampiran 2. Peralatan dan bahan yang digunakan dalam penelitian .....................38 Lampiran 3. Sel raji dengan pemberian ekstrak setelah inkubasi 24 jam ..............40 Lampiran 4. Tabel probit........................................................................................42 Lampiran 5. Perhitungan LC

  50 ekstrak etanolik daun sirih merah terhadap kultur

  sel raji ...............................................................................................43 Lampiran 6. Perhitungan nilai korelasi LC

  50 ekstrak etanolik daun sirih merah

  terhadap sel Raji pada taraf kepercayaan 95%.................................50 Lampiran 7. Tes distribusi normal Kolmogorov-Smirnov.....................................51 Lampiran 8. Analisis statistik Anova satu arah......................................................51

BAB I PENGANTAR A. Latar Belakang Kanker merupakan salah satu penyakit yang berpotensi tinggi dalam

  menyebabkan kematian dan bertanggung jawab atas satu dari setiap lima kematian. Di Indonesia, kanker menempati peringkat keenam setelah penyakit jantung dan jumlah pasien kanker mengalami peningkatan setiap tahun (Adamo, 2006). Pengobatan terhadap kanker dapat dilakukan dengan cara pembedahan, kemoterapi dan radioterapi. Alternatif lain yang digunakan oleh sebagian penderita kanker adalah melalui ramuan tradisional dari tanaman. Pengembangan dan pemanfaatan bahan alam terutama tanaman telah berlangsung lama di Indonesia yang kaya akan tumbuh – tumbuhan (Dalimartha, 2006). Masyarakat dengan latar belakang budaya dan etniknya, lazim menggunakan obat tradisional dengan memanfaatkan bahan alam tersebut yang disebut dengan jamu. Namun penggunaan tanaman sebagai obat biasanya masih terbatas secara tradisional dan turun temurun berdasarkan pengalaman.

  Tanaman sirih merah (Piper crocatum Ruiz & Pav) mempunyai bentuk yang menarik dan dapat berfungsi sebagai antikejang, antiseptik, analgetik, antiketombe, antidiabetes, pelindung hati, antidiare, mempertahankan kekebalan tubuh dan penghilang bengkak serta berbagai macam radang, dan yang paling menarik adalah pemakaian empiris ekstrak yang diklaim dapat menyembuhkan penyakit kanker payudara dan kanker rahim (Sudewo, 2005). Pemanfaatan daun sirih merah sebagai obat kanker telah diakui secara empiris, baik digunakan secara tunggal maupun dikombinasikan dengan tanaman lain dalam berbagai bentuk seperti rebusan dan kapsul. Akan tetapi, secara ilmiah belum terdapat bukti yang mendukung mengenai kebenaran aktivitas tanaman sirih merah sebagai obat antikanker.

  Mengacu pada klaim khasiat bahwa ekstrak daun sirih merah tersebut dapat mengobati penyakit kanker payudara dan kanker rahim, maka perlu dilakukan penelitian mengenai potensi ekstrak daun sirih merah terhadap penyakit kanker yang lain. Dari hasil penelitian ini diharapkan dapat memberikan gambaran mengenai potensi efek sitotoksik ekstrak etanolik daun sirih merah terhadap kultur sel kanker limfoma.

   Perumusan Masalah 1.

  Uji sitotoksisitas dapat dilakukan secara in vitro dengan menggunakan suatu kultur sel. Kultur sel Raji merupakan kultur sel kanker yang diturunkan dari penyakit Limfoma Burkitt. Berdasarkan latar belakang dari penelitian maka timbul beberapa permasalahan, yaitu : a. Apakah ekstrak etanolik daun sirih merah memiliki efek sitotoksik terhadap kultur sel Raji ? b. Berapakah nilai LC

  50 ekstrak etanolik daun sirih merah terhadap kultur sel

  Raji?

  2. Keaslian Karya

  Sejauh ini, penulis belum menemukan adanya penelitian mengenai uji sitotoksisitas ekstrak etanolik daun sirih merah (Piper crocatum Ruiz & Pav) terhadap kultur sel Raji di Universitas Sanata Dharma dan Universitas Gadjah Mada Yogyakarta.

  3. Manfaat Penelitian

  a. Manfaat Teoritis Penelitian ini diharapkan dapat memberikan dan memperkaya informasi mengenai daya sitotoksisitas ekstrak etanolik daun sirih merah terhadap kultur sel Raji.

  b.

  Manfaat Praktis Penelitian ini diharapkan dapat memberikan suatu alternatif untuk pengobatan kanker dengan memanfaatkan bahan alam.

  

B. Tujuan Penelitian

Tujuan Umum

  1. Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui potensi sitotoksik dari ekstrak etanolik daun sirih merah.

  2. Tujuan Khusus

  a. Untuk mengetahui potensi sitotoksisitas ekstrak etanolik daun sirih merah terhadap kultur sel Raji.

  b. Untuk mengetahui nilai LC

  50 ekstrak etanolik daun sirih merah terhadap kultur

BAB II PENELAAHAN PUSTAKA A. Sirih Merah

  1. Keterangan Botani

  Tanaman sirih merah termasuk ke dalam famili Piperaceae dan genus Piper, memiliki nama spesies Piper crocatum Ruiz & Pav, serta sinonim dengan ornatum N.E.Br (Anonim, 2007a).

  2. Deskripsi Tanaman Tanaman sirih merah tumbuh menjalar seperti halnya sirih hijau.

  Batangnya bulat berwarna hijau keunguan dan tidak berbunga. Daunnya bertangkai membentuk jantung dengan bagian atas meruncing, bertepi rata dan permukaannya mengkilap atau tidak berbulu. Panjang daunnya bisa mencapai 15 sampai dengan 20 cm. Warna daun bagian atas hijau bercorak warna putih keabu

• – abuan. Bagian bawah daun berwarna merah hati cerah. Daunnya berlendir, berasa sangat pahit dan beraroma wangi khas sirih. Batangnya beruas dengan jarak buku 5 – 10 cm, di setiap buku tumbuh bakal akar (Sudewo, 2005).

   Kandungan Kimia 3.

  Dari hasil penelitian berupa uji tabung dan uji kromatografi lapis tipis diketahui daun sirih merah mengandung senyawa flavonoid, alkaloid, senyawa polifenolat, tanin dan minyak atsiri (Sudewo, 2005).

4. Khasiat dan Kegunaan

  Dalam penggunaan secara empiris ekstrak daun sirih merah pada pemakaian tunggal atau dikombinasikan dengan tanaman obat lainnya mampu mengobati penyakit seperti diabetes mellitus, peradangan akut pada organ tubuh tertentu, luka yang sulit sembuh, kanker payudara dan kanker rahim, leukemia, TBC, radang pada lever, lemah sahwat, ambeien, jantung koroner, darah tinggi dan asam urat (Sudewo, 2005).

B. Teknik Penyarian

  Ekstraksi atau penyarian adalah kegiatan penarikan kandungan kimia yang dapat larut sehingga terpisah dari bahan yang tidak dapat larut dengan pelarut air. Hal – hal yang perlu diperhatikan dalam pembuatan ekstrak meliputi pembuatan serbuk simplisia dan klasifikasinya, cairan penyari, pemekatan, pengeringan ekstrak dan rendemen (Anonim, 2000).

  Ekstrak merupakan sediaan pekat yang diperoleh dengan mengekstraksi zat aktif dari simplisia nabati atau simplisia hewani menggunakan pelarut yang sesuai, kemudian semua atau hampir semua pelarut diuapkan dan massa atau serbuk yang tersisa diperlakukan sedemikian hingga memenuhi baku yang telah ditetapkan (Anonim,1995). Pada ekstrak tumbuhan (umumnya konsentrasi etanolnya berbeda – beda) jika bahan pengekstrasinya sebagian atau seluruhnya diuapkan, maka diperoleh ekstrak, yang dikelompokkan menurut sifat – sifatnya menjadi : a. Ekstrak encer (extractum tenue). Merupakan ekstrak dengan konsistensi yang b.

  Ekstrak kental (extractum spissum). Ekstrak ini liat dalam keadaan dingin dan tidak dapat dituang. Kandungan airnya berjumlah sampai 30%. Jika kandungan air terlalu tinggi maka dapat menyebabkan suatu instabilitas bahan (tumbuhnya bakteri).

  c. Ekstrak kering (extractum siccum). Memiliki konsistensi kering dan mudah digosokkan. Melalui penguapan cairan pengekstraksi dan pengeringan terbentuk suatu produk, biasanya menunjukkan kandungan lembab tidak lebih dari 5%.

  d. Ekstrak cair (extractum fluidum). Diartikan sebagai suatu sediaan cair simplisia yang mengandung etanol sebagai pelarut atau sebagai pengawet atau sebagai pelarut dan pengawet (Voigt, 1994; Anonim, 1995)

  Pengetahuan mengenai kandungan senyawa aktif yang terkandung dalam simplisia akan mempermudah pemilihan cairan penyari dan cara ekstraksi yang tepat (Anonim, 2000). Pemilihan cairan penyari harus meliputi beberapa kriteria, antara lain adalah murah dan mudah diperoleh, stabil secara kimia fisika, selektif yaitu hanya menarik zat berkhasiat yang dikehendaki, tidak mempengaruhi zat berkhasiat dan diperbolehkan oleh peraturan. Cairan penyari yang digunakan dapat berupa air, etanol, etanol – air atau pelarut lain. Oleh karena banyak bahan tumbuhan larut air atau larut alkohol, maka air atau etanol lebih disukai penggunaannya sebagai cairan pengekstraksi (Voigt, 1994). Bila cairan penyari digunakan air, maka untuk mencegah timbulnya kapang ditambahkan bahan pengawet yang diberikan pada awal penyarian (Anonim, 1986).

  

Tabel I. Pelarut dan Tingkat Kepolaran

  Pelarut Tingkat Kepolaran

  Air 10,2 DMSO 7,2

  Etanol 4,3 Etil Asetat 4,4

  Maserasi merupakan cara penyarian yang sederhana. Maserasi dilakukan dengan cara merendam serbuk simplisia ke dalam cairan penyari. Metode ini digunakan untuk penyarian simplisia yang mengandung zat aktif yang mudah larut dalam cairan penyari. Kerusakan senyawa yang tidak tahan panas dapat dihindari dengan metode ini (Anonim, 1986).

  

C. Kanker

Tinjauan Umum

1. Proliferasi sel terjadi melalui suatu rangkaian proses. Siklus dari sel

  sendiri terdiri dari fase mitosis dan interfase. Pada proses interfase tersebut sel akan mengalami fase G-1 yang merupakan permulaan dari replikasi asam deoksiribonukleat (DNA). Kemudian melalui fase S yaitu pembentukan DNA baru, jumlah kromosom akan berlipat dua dan terjadi persiapan ke tahapan selanjutnya. Fase G-2 merupakan fase pertumbuhan, kromosom yang terbentuk dari proses ini sudah ada dalam bentuk kromatida (Mutschler, 1999).

  Kanker adalah suatu penyakit dimana terjadi pertumbuhan sel – sel jaringan tubuh yang tidak normal, cepat dan tidak terkendali. Dalam keadaan normal, sel hanya akan membelah jika tubuh membutuhkannya seperti mengganti sel rusak dan mati. Sebaliknya, sel kanker akan terus membelah diri meskipun tidak dibutuhkan, terlepas dari pengendalian pertumbuhan dan tidak lagi menuruti hukum – hukum pembiakan (Dalimarta, 2006). Sifat dari sel kanker adalah mempunyai kemampuan untuk bermigrasi dari tempatnya tumbuh ke jaringan di dekatnya (invasif) dan membentuk massa pada daerah baru di dalam tubuh (metastasis). Kanker terdiri dari sel ganas, menjadi lebih agresif dari waktu ke waktu dan menjadi letal apabila jaringan atau organ yang diperlukannya untuk bertahan hidup mengalami gangguan (Sofyan, 2000).

  Penyebab dari kanker dapat berupa inveksi virus maupun faktor – faktor yang menginduksi penyakit oleh perubahan gen –gen secara mutasi. Mutasi merupakan perubahan yang terjadi pada gen atau pada kromosom. Beberapa buah mutasi mungkin dibutuhkan untuk mengubah sel normal menjadi sel kanker.

  Mutasi-mutasi tersebut sering diakibatkan agen kimia maupun fisik yang disebut . Mutasi dapat terjadi secara spontan (diperoleh) ataupun diwariskan (mutasi germline). Bila sel kehilangan kemampuan untuk melakukan apoptosis (m), atau bila inisiatif untuk melakukan apoptosis dihambat (oleh isalnya ketika sel mengalami kerusakan yang sudah tidak dapat diperbaiki lagi. Keputusan untuk melakukan apoptosis berasal dari sel itu sendiri, dari (Anonim, 2007b).

  Terjadinya kanker disebut pula dengan karsinogenesis. Dalam prosesnya dibagi menjadi beberapa tahapan berupa : a. Tahap inisiasi, sebagai tahap awal yang mengakibatkan terjadinya perubahan genetik sehingga menyebabkan abnormalitas proliferasi sel tunggal. Pada perubahan ini seringkali disebabkan karena mutasi atau pengaruh zat – zat yang bersifat karsinogen.

  b. Tahap promosi, sel tumbuh sangat pesat yang pada akhirnya menjadi tumor benigna .

  c.

  Tahap progresi, neoplasma akan berkembang menjadi bersifat ganas, biasanya diikuti invasi sel tumor ke dalam jaringan setempat dan dapat terjadi proses metastasis.

  d. Tahap metastasis akan mengakibatkan penyebaran sel neoplastik dari tempat tumor utama menuju tempat yang lebih jauh (Schneider, 1997).

  Sel kanker dikenal oleh tubuh sebagai bahan asing, sehingga mekanisme imunologi tubuh akan bereaksi secara humoral maupun seluler. Tubuh mempunyai kemampuan immunosurveillance terhadap semua sel kanker maupun sel yang bermutasi untuk mencegah perkembangan sel kanker tersebut, namun terkadang terjadi immunological escape yaitu sel kanker luput dari pengawasan sistem imun, sehingga terjadilah kanker. Penderita kanker sendiri juga mengalami supresi imun, tetapi kanker juga mempengaruhi sistem imun itu sendiri (Nafrialdi, 1995).

2. Limfoma

  Limfoma adalah kanker yang berasal dari jaringan limfoid mencakup sistem limfatik dan imunitas tubuh. Kelainan umum yang sering menyertai adalah pembesaran kelenjar limfe dan terdapat kelainan sumsum tulang. Dalam praktek yang dimaksud dengan limfoma adalah LH (Limfoma Hodgkin) dan LNH (Limfoma Non Hodgkin). Pada LNH disebabkan oleh rangsangan imunologik yang menimbulkan proliferasi jaringan limfoid yang tidak terkendali (Tambunan, 2003).

D. Kultur Sel

  Kultur sel merupakan keadaan dimana sel prokariotik maupun eukariotik berada dalam kondisi yang terkontrol. Sedangkan kultur primer adalah sel yang diisolasi dari suatu jaringan maupun organ aslinya kemudian ditumbuhkan dalam kultur media secara invitro dan dikondisikan sama seperti pada saat sel masih berada dalam jaringan aslinya (Freshney, 2000). Pemeriksaan kultur ini dapat dilakukan dengan pengamatan morfologi sel, warna medium dan kepadatan sel (Wolf, 2006). Pemindahan sel ke dalam flask baru dengan medium yang baru disebut dengan subkultur (Freshney, 2000).

  Sel Raji merupakan continous cell line yang berasal dari sel β – limfoma manusia. Dikenalkan pada tahun 1964 yang diturunkan dari penyakit Limfoma

  Burkitt yang diderita oleh seorang anak laki – laki berusia 11 tahun. Penyakit ini dihubungkan dengan infeksi oleh virus Epstein Barr yaitu virus DNA yang menimbulkan ploriferasi pada sel – sel

  β normal. Protein virus ini menginaktivasi mengalami pembelahan secara berkelanjutan (King, 2000). Bentuk morfologi dari sel Raji berupa sel tunggal berbentuk lingkaran yang terkadang dalam bentuk berkelompok. Sifat yang dimiliki sel raji adalah tidak melekat pada dinding atau dasar sumuran namun melayang di dalam cairan media (Anonim, 2007c).

  

Sitotoksisitas

E.

  Sitotoksisitas dapat didefinisikan sebagai sifat beracun suatu senyawa terhadap sel hidup. Uji sitotoksisitas dapat dilakukan secara invitro menggunakan kultur sel di dalam mengevaluasi keamanan obat, makanan, kosmetik maupun bahan – bahan kimia yang lain (Freshney, 1986).

  Penggunaan haemocytometer sangat umum dan sering dipakai dalam penghitungan sel karena efisien dan akurat. Suatu chamber hitung yang kaku berbentuk kotak dan memiliki kedalaman 0,1 mm digunakan sebagai media bantu dalam penghitungan sel. Pada saat chamber telah terisi dengan suspensi sel, dapat dilakukan pengamatan di bawah mikroskop dan sel dihitung pada sejumlah bilik yang dipilih pada haemocytometer. Dari perhitungan yang dilakukan, dapat ditentukan jumlah sel per ml dari suspensi sel tersebut. Untuk mengetahui sel yang hidup maupun yang mati dapat digunakan zat penanda seperti trypan blue.

  Pada metode ini perlu diperhatikan pada saat pengisian suspensi sel ke dalam

  

chamber pada haemocytometer agar tidak terjadi gelembung yang dapat

  menyebabkan terjadinya kesalahan dalam perhitungan sel. Kondisi lain yang menentukan keakuratan dalam perhitungan sel adalah kebersihan bilik hitung yang digunakan dan ketepatan dalam pengisian suspensi sel ke dalam chamber

F. Landasan Teori

  Efek flavonoid terhadap macam – macam organisme sangat banyak macamnya, hal ini mengakibatkan tumbuhan yang mengandung flavonoid banyak dipakai dalam pengobatan tradisional. Flavonoid telah menunjukkan perannya sebagai antioksidan, antimutagenik, antineoplastik, dan aktivitas vasodilatator.

  Potensi antioksidan flavonoid dapat digunakan untuk mencegah kerusakan oksidatif pada pengendalian sejumlah penyakit (Miller, 1999). Selain itu juga diketahui bahwa terdapat senyawa flavonoid mampu menghambat DNA polimerase Tiga senyawa flavonoid alam telah diisolasi menggunakan etil asetat, yang berasal dari fraksinasi S. feruginosa, yaitu kuersetin, kuersetrin, dan flavonol glikosida 4-O-asetil kuersetrin memiliki daya sitotoksik pada kultur jaringan kanker glioblastoma manusia (Miller, 1999).

  Pada umumnya alkaloid merupakan senyawa yang tidak berwarna, kelarutannya sangat bervariasi tergantung struktur dan bentuknya dalam tumbuhan (Roberts, 1998). Beberapa alkaloid telah diketahui memiliki aktivitas antikanker melalui interaksi dengan target seperti RNA polimerase dan DNA topoisomerase (Sukardiman, 2003). Senyawa alkaloid yang terkandung di dalam tanaman seperti senyawa vinkristin dan vinblastin dapat menghambat RNA polimerase, vinblastin berperan dalam penghambatan pembelahan sel yaitu pada tahap metafase. Ekstraksi dari senyawa alkaloid dalam tanaman dapat dilakukan dengan menggunakan pelarut etanol atau etil asetat melalui metode ekstraksi yang sesuai (Roberts, 1998).

G. Hipotesis

  Ekstrak etanolik daun sirih merah mempunyai efek sitotoksik terhadap kultur sel Raji.

BAB III METODE PENELITIAN A. Jenis dan Rancangan penelitian Penelitian mengenai uji sitotoksisitas ekstrak etanolik daun sirih merah

  (Piper crocatum Ruiz & Pav) terhadap kultur sel Raji ini termasuk penelitian eksperimental murni dengan rancangan acak lengkap pola satu arah.

  B.

  

Variabel dan Definisi Operasional

  1. Variabel

  a. Variabel Bebas Konsentrasi ekstrak etanolik daun sirih merah yaitu 250; 500; 750; 1000; 1250; 1500; 1750; 2000 µg/ml.

  b. Variabel Tergantung Persentase kematian sel Raji.

  c. Variabel Pengacau Terkendali i.

  Tempat tumbuh dan waktu pemanenan daun sirih merah dikendalikan dengan memanen daun sirih merah pada tempat dan waktu yang sama. ii. Medium tumbuh sel Raji dikendalikan dengan menggunakan medium RPMI 1640-serum.

  2. Definisi Operasional a.

  Sitotoksisitas ialah sifat toksik atau beracun dari ekstrak etanolik daun sirih b.

  50 ialah konsentrasi ekstrak etanolik daun sirih merah yang mampu

  LC membunuh atau dapat menyebabkan kematian sejumlah 50% sel uji (sel Raji) dan dinyatakan dalam µg/ml.

  c. Ekstrak etanolik daun sirih merah adalah ekstrak yang diperoleh dengan cara mengekstraksi daun sirih merah secara maserasi dengan penyari etanol 70%.

  

C. Alat dan Bahan

Alat

  1. Peralatan yang digunakan dalam penelitian ini antara lain: alat - alat gelas,

  timbangan analitik (Mettler Toledo), alumunium foil, tabung conical (Nunc), autoklaf, tissue culture flask (Nunc), swing rotor centrifuge, inkubator (inco 2 memmert), mikropipet, lemari pendingin (Sharp), cell counter (togoshiseiki), 96-well plate (Nunc), laminar air flow (Labconco), inverted

  

microscope (Olympus IMT-2), mikroskop (Olympus), haemocytometer (Neubauer

  Improved), tissue, glove, masker, waterbath, yellow tip, blue tip, effendorf, blender, oven, ayakan.

  2. Bahan

  Bahan-bahan yang digunakan dalam penelitian ini ialah : a. Daun sirih merah

  b. Kultur sel Raji yang diambil dari stok Laboratorium Penelitian dan Pengujian Terpadu (LPPT) Universitas Gadjah Mada, Yogyakarta.

  c. Etanol 70% (bahan penyari daun sirih merah) e.

  Trypan blue

  f. Aquabidest g.

  Media pencuci: RPMI 1640 (Gibco), natrium bikarbonat, Hepes

  h. Media penumbuh: RPMI 1640 (Gibco), FBS (Foetal Bovine Serum) 10%(Gibco), Penisilin Streptomisin 2% (Gibco), dan Fungison 0,5% (Gibco).

  

D. Tata Cara Penelitian

Determinasi Tanaman

  1. Bahan utama yang digunakan dalam penelitian ini adalah daun sirih

  merah yang telah dideterminasi di Laboratorium Biologi Farmasi, Fakultas Farmasi, Universitas Gadjah Mada, Yogyakarta menggunakan acuan baku Backer dan Brink (1965).

   Pengumpulan Daun Sirih Merah 2.

  Daun sirih merah yang digunakan dalam penelitian diambil dari daerah Desa Mantenan, Kecamatan Mertoyudan, Kabupaten Magelang, Propinsi Jawa Tengah.

  3. Pembuatan Serbuk Daun Sirih Merah

  Daun sirih merah segar dicuci menggunakan air mengalir dan ditiriskan sehingga sisa air menghilang. Untuk proses pengeringan digunakan oven pada suhu 60 – 70 °C. Hasil pengeringan diserbuk menggunakan blender dan diayak dengan pengayak 0,75 mm. Serbuk yang diperoleh disimpan dalam botol

  4. Sterilisasi Alat

  Alat – alat yang akan digunakan dicuci bersih menggunakan deterjen, dibilas menggunakan air mengalir dan dikeringkan. Masing – masing dibungkus menggunakan alumunium foil dan disterilkan dalam autoklaf selama 20 menit pada suhu 121°C dengan tekanan 2,05 abs bar (Hagman, 2005).

  5. Pembuatan Ekstrak Etanolik Daun Sirih Merah

  Serbuk kering daun sirih merah ditimbang sebanyak 100 gram kemudian dimaserasi menggunakan 700 ml larutan penyari etanol 70%. Kemudian ditutup dan dibiarkan selama 24 jam terlindung dari cahaya matahari. Setelah 24 jam sari diserkai, disaring, ampas diperas. Ampas yang diperoleh kemudian ditambah cairan penyari secukupnya, diaduk dan diserkai sehingga diperoleh seluruh sari sebanyak 100 bagian. Bejana ditutup, dibiarkan di tempat sejuk dan terlindung dari cahaya, rendaman harus dikocok berulang-ulang (kira-kira 3x sehari). Setelah 2 hari maserat disaring dengan kertas saring kemudian ditampung. Maserat yang

  o

  terkumpul kemudian dipekatkan di atas waterbath dengan suhu 60-65 C dibantu dengan kipas angin hingga diperoleh ekstrak kental.

   Pembuatan larutan uji 6.

  Ekstrak etanolik daun sirih merah ditimbang sebanyak 0,1 g, dilarutkan dengan DMSO dan diaduk sampai homogen untuk mendapatkan sediaan ekstrak induk dengan konsentrasi 100 mg/ml. Dari sediaan ekstrak induk tersebut, dibuat sediaan uji, dengan konsentrasi sebesar 250 µg/ml, 500 µg/ml, 750 µg/ml, 1000 µg/ml, 1250 µg/ml, 1500 µg/ml, 1750 µg/ml, dan 2000 µg/ml.

7. Pembuatan Medium Pencuci dan Medium Penumbuh Pembuatan medium pencuci a.

  RPMI 1640 dilarutkan dalam aquabidest kurang lebih 80 ml, ditambahkan 2,3 gram natrium bikarbonat dan 2 gram Hepes, diencerkan sampai diperoleh volume 100 ml, pH dibuat 7,2 dan larutan disterilkan dengan menggunakan filter berdiameter 0,22 µm. Medium disimpan dalam almari es pada suhu 4 °C (Freshney, 1986; Jacoby and Pastan, 1979; Sambrook et al, 1989).

b. Pembuatan medium penumbuh (RPMI 1640-serum)

  Dibuat suatu campuran antara 10 ml FBS (Foetal Bovine Serum), 2 ml penisilin – streptomisin dan 0,5 ml fungison, ditambahkan RPMI 1640 sehingga diperoleh volume 100 ml. Larutan disterilkan dengan menggunakan filter berdiameter 0,22 µm. Medium disimpan dalam almari es pada suhu 4 °C (Freshney, 1986; Jacoby and Pastan, 1979; Sambrook et al, 1989).

8. Preparasi Kultur Sel Raji Propagasi Sel Raji a.

  Sel diambil dari tangki nitrogen cair, kemudian segera dicairkan dalam penangas air 37°C, kemudian ampul disemprot dengan etanol 70%. Ampul dibuka dan sel Raji dipindahkan dalam tabung conical steril yang berisi medium RPMI 1640. Suspensi sel disentrifugasi selama 5 menit, supernatan dibuang, diganti dengan medium RPMI yang baru, kemudian disuspensikan perlahan.

  Suspensi sel lalu disentrifugasi kembali selama 5 menit kemudian dicuci ulang sekali lagi. Supernatan dibuang, pelet ditambahkan 1 ml medium sampai homogen, kemudian sel ditumbuhkan dalam tissue culture flask kecil dan diinkubasikan dalam inkubator dengan suhu 37°C dengan aliran 5% CO

  2 dari

  udara. Setelah 24 jam, medium penumbuh diganti dan sel ditumbuhkan hingga konfluen dan jumlahnya cukup untuk penelitian.

   Panen Sel Raji b.

  Setelah jumlah sel cukup, media diganti dengan RPMI 1640 baru sebanyak 5 ml kemudian sel diresuspensikan menggunakan pipet Pasteur. Sel dipindahkan dalam tabung conical steril dan ditambahkan medium RPMI sampai volume 10 ml dan disentrifugasi 3000 rpm selama 10 menit. Supernatan dibuang dan pelet sel diresuspensikan perlahan dengan 1 ml medium. Sel kemudian dihitung menggunakan haemocytometer. Suspensi sel ditambah

  4 sejumlah medium sehingga memperoleh konsentrasi sel sebesar 3,0x10 /100 µl.

  

9. Uji Sitotoksisitas Ekstrak Etanolik Daun Sirih Merah dengan

Menggunakan Metode Direct Counting

  Untuk uji sitotoksisitas, sebanyak 100 µl suspensi sel Raji dengan kepadatan 3,0x104/100 µl dimasukkan dalam sumuran-sumuran 96-well