METODE PENETAPAN KADAR MELOXICAM DALAM DARAH MANUSIA IN VITRO SECARA KROMATOGRAFI CAIR KINERJA TINGGI
ISSN : 1693-9883 Majalah Ilmu Kefarmasian, Vol. I, No.2, A gustus 2004, 79 - 92
M ETODE PEN ETAPAN KADAR M ELOXICAM
DALAM DARAH M AN USIAIN VITRO SECARA KROM ATOGRAFI CAIR KIN ERJA TIN GGI
Har mita, Umar M ansur , Fir nando
Depar temen Far masi, FMIPA Univer sitas Indonesia
ABSTRACT
Until nowadays study of drug profile inside body (pharmacokinetic) and its
development is still an interesting topic under pharmaceutical service. Develop-
ment of an accurate analysis method for small quantity of drug in blood is an impor-
tant step, HPLC method usually recommended for this purpose. Observation in
studying the optimal method to analyze drug in human blood by using internal
standard has been done for meloxicam, a new generation of NSAID. Two things has
been focused to this observation, finding an ideal internal standard for meloxicam
and testing the recovery of meloxicam in blood sample by in vitro. Coefficient of
distribution of many samples (piroxicam, trimetropim, caffeine, salisilamid) gives
caffeine as recommended internal standard for meloxicam. The recovery test gives
83,58% 3,802% , 74,37% 0,711% , 82,14% 1,937% for analysis meloxicam in
± ± ±
human blood without internal standard; and 41,58% ± 1,108% , 61,60% ± 1,049% ,
56,88% 0,478% for analysis meloxicam in human blood within internal standard.
± Keyword: HPLC, quantity analysis, meloxicam, internal standard, in vitro.
PEN D A HULUA N strumen analisis yang mampu men-
Sejak tahun 1920-an, diprakarsai deteksi kadar obat dalam konsentrasi oleh Widmark yang meneliti proses yang sangat rendah (mikro – nano- d eto ksifikasi alko ho l, p erhatian gram per mililiter) yang terd apat ilmuwan dunia mulai terfokus pada dalam media biologis. (Kelly MT) studi metabolisme dan eliminasi obat Intensitas efek farmako lo g ik d i d alam tubuh. Bahkan samp ai suatu o bat sering kali d ikaitkan Perang Dunia II usai, ilmu analisis dengan dosis obat yang dikonsumsi. biofarmasi semakin dikenal secara Namun sebenarnya konsentrasi obat luas d an bahkan mulai d ilakukan bebas yang berikatan dengan resep- secara rutin dengan metode yang sis- tor-lah yang menentukan besarnya tematis. Hal ini juga didukung oleh efek farmako lo gik yang d iberikan perkembangan yang pesat dari in- oleh suatu obat. Reseptor sebagian besar terdapat dalam sel-sel jaringan. Oleh karena sebagian besar sel-sel jaringan diperfusi oleh darah, maka pemeriksaan kadar obat dalam darah merupakan suatu metode yang pa- ling akurat untuk pemantauan pengo- batan dan pengoptimalan manfaat terapi obat dalam pelayanan farmasi. (Shargel, Leon, 1941)
Penetap an kad ar o bat d alam cairan biologi membutuhkan metode dengan selektivitas tinggi, sensitivi- tas sampai tingkat bpj (bagian per juta), d an gangguan yang sed ikit mungkin dari zat pengganggu. Salah satu cara yang banyak digunakan ad alah meto d e kro mato grafi cair kinerja tinggi (KCKT). (Kelly MT)
Beberapa penelitian dari Depar- temen Farmasi FMIPA – UI mengenai analisis obat dalam darah telah dila- kukan. D iantarany a y aitu, J. A . Kaw ira dalam jurnalnya mengenai
problems of drug analysis in relation to therapeutic drug monitoring
menjelas- kan bahw a terdapat beberapa ken- dala serius dalam rangka analisis obat dalam darah yang mendorong perlu- nya pertimbangan terhadap berbagai aspek guna memperoleh hasil yang memuaskan, diantaranya perlunya pengadaptasian metode analisis ter- hadap kondisi spesifik dari labora- torium yang bersangkutan, pence- gahan terhadap adanya kontaminasi dari lingkungan labo rato rium dan peralatan, serta evaluasi terhadap prosedur isolasi yang tepat. (Kawira JA, 1994)
Sannaria U. Marpaung melaku- kan penelitian dengan memodifikasi metode penetapan kadar ambroksol dalam plasma manusia secara in vitro menurut Nobilis untuk memperoleh hasil perolehan kembali analisis yang optimum. Faktor-faktor yang dimo- d ifikasi ad alah fakto r-fakto r yang berkenaan dengan tahap isolasi an- tara lain kecepatan dan waktu sentri- fus, cara d an w aktu p engo co kan, serta cara pemisahan lapisan ekstrak.
Berdasarkan penelitiannya diperoleh bahwa kondisi optimum untuk isolasi ambroksol dari dalam plasma adalah d eng an m eng g unakan sentrifus dengan kecepatan 2000 rpm selama 6 menit, pencampuran dengan vor- teks selama 4 menit, dan cara pemi- sahan lapisan ekstrak dengan metode pembekuan. (Marpaung SU, 1995)
Penelitian di atas kemudian di- lanjutkan o leh Erlina yang d alam penelitiannya melakukan valid asi metode penetapan kadar ambroksol dalam plasma darah secara KCKT dengan menggunakan metode dari Nobilis. Parameter-parameter yang divalidasi adalah spesifitas, stabilitas, limit deteksi, ketelitian dan akurasi, dan linearitas, serta perolehan kem- bali. Hasil dari penelitian ini diper- o leh bahw a g ejala p eruraian z at dalam ekstrak terjadi setelah penyim- panan lebih dari 3 hari, nilai limit deteksi 10 ng/ mL dan limit kuan- titasi 20 ng/ mL, nilai akurasi 97,52% d an p resisi 15,14% , linearitas (r) 0,9991, serta perolehan kembali se- besar 78,21% dengan menggunakan papaverin HCl sebagai baku dalam. (Erlina, 1996)
Pada penelitian kali ini hendak dilakukan uji metode terhadap pene- tap an kad ar seny aw a melox icam dalam sampel darah
in vitro
meloxicam
adenin citrate dextran (A CD)
), Plasma d arah manusia (PMI), yang mengandung
M erck
), A kuabid estilata, N atrium hid ro ksid a (
M erck
Meloxicam (SUN Phar- maceutical Industries, India), Kofein anhidrat (BPFI),Trimetoprim (BPFI), Salisilamid (BPFI), Piroksikam (BPFI), Metanol (p.a, Merck ), Kloroform (p.a,
BA HA N D A N CA RA KERJA Bahan.
yang optimal dalam darah manusia in vitro dengan mengguna- kan senyawa baku dalam yang cocok dengan hipotesis bahwa penggunaan baku dalam yang tepat pada analisis obat dalam darah dapat mengurangi tingkat kesalahan pada tahap isolasi d an m ening katkan keakuratan analisis.
Tujuan p enelitian ini ad alah mencari meto d e penetapan kad ar
dengan melihat pengaruh penggunaan se- nyaw a baku d alam p ad a analisis sampel darah. Sampai saat ini Far- makope Indonesia belum melampir- kan metode baku untuk penetapan kadar meloxicam . British Pharmacopeia menyatakan bahwa
) yang tepat/ ideal pada analisis kuantitatif o bat d alam d arah diharapkan dapat meminimalisasi galat yang timbul selama tahap isolasi sampel darah sehingga diharapkan dapat diperoleh metode analisis yang akurat dan presisi. (Kelly MT; Johson EL, Robert S, 1991)
dard
Sampai saat ini masalah utama p ad a analisis o bat d alam samp el d arah ad alah rumitnya p ro sed ur isolasi, mengingat terjadinya ikatan antara molekul obat dengan protein dalam sampel darah, disamping juga faktor kompleksitas komponen yang terkandung dalam darah yang bisa ikut berinterferensi dalam analisis serta kecilnya konsentrasi obat yang dianalisis (Kawira JA, 1994). Hal ini bisa memberikan galat (kesalahan) yang cukup besar pada analisis obat d alam sampel d arah. Pilihan eks- traksi cair-cair dengan penggunaan senyaw a baku dalam ( internal stan-
m erup akan suatu senyawa terbaru dari golongan AINS (anti inflamasi non steroid), turunan o ksikam (feno lat), yang memiliki keunggulan kerjanya yang spesifik menghambat enzim siklooksigenase yang menyebabkan terjadinya infla- masi ( COX-2 ) sehingga efek samping gastrointestinal-nya sangat rendah dibandingkan obat-obat anti-rheu- matik lainnya yang telah ada. (Re- gional Drugs and Therapeutics Cen- tre, 1997)
M elox icam
dilakukan dengan maksud sebagai langkah aw al menuju analisis yang lebih berm anfaat y aitu analisis sampel darah in vivo .
in vitro
dapat ditetapkan kadarnya dengan meng- gunakan metode KCKT dengan fase gerak metanol/ air (70:30; v/ v) pada panjang gelombang 354 nm (Anonim, 2002). Uji sampel darah secara
meloxicam
sebagai antikoagulan, disimpan pada suhu 4 ± 2°C selam a tid ak lebih d ari 3 minggu.
meloxicam
melox icam
. (2) Mencari baku dalam (
internal standard
) yang cocok dengan langkah-langkah sebagai berikut: (a) Menghitung nilai koefisien distri- busi (K D ) beberap a z at p ilihan. Ditimbang seksama masing-masing 10,0 m g
melox icam
, p iro ksikam , trimetoprim, dan kofein kemudian dilarutkan dalam 100 mL air dalam labu ukur sehingga diperoleh masing- m asing ko nsentrasi 100 µg / mL (khusus untuk
meloxicam
dan pirok- sikam dilarutkan dalam metanol ter- lebih dahulu baru di-adkan dengan air). Masing-masing larutan tersebut kemudian diekstraksi dengan kloro- form, lalu diukur nilai serapan ma- sing -m asing ekstrak klo ro fo rm d engan spektro fo to meter UV-Vis. Nilai serapan masing-masing ekstrak dibandingkan terhadap serapan stan- dard dalam kloroform dengan kon- sentasi yang sama. Dihitung dan di- bandingkan nilai koefisien distribusi (K D ) dari keempat zat tersebut. (b) Membandingkan nilai waktu retensi beberapa zat terhadap waktu retensi
. D itim bang seksam a masing-masing 10,0 mg piroksikam, trimetoprim, dan kofein kemudian dilarutkan dalam 100 mL metano l dalam labu ukur hingga diperoleh konsentrasi masing-masing 100
- – NaOH 0,001 N (70:30; v/ v) M encari ko nd isi analisis.
cerkan hingga konsentrasi 1,0 µg/ mL, kemud ian d isuntikkan 20 µL pada kro mato graf dengan ko ndisi fase gerak metanol-NaOH 0,001 N (70:30; v/ v), kecepatan alir 1,0 mL/ menit dan panjang gelombang de- teksi 354 nm. Diperoleh waktu retensi
µg/ mL. Larutan tersebut d iencerkan hingga didapat masing-masing kon- sentrasi 1,0 µg/ mL. Masing-masing larutan tersebut kemudian disuntik- kan sebanyak 20
µL pada kromato- g raf d eng an ko nd isi y ang sam a seperti pada tahap 2. Diamati waktu retensi tiap zat dan dibandingkan terhadap w aktu retensi
meloxicam .
Dipilih kromatogram zat yang cocok sebagai baku dalam untuk analisis
melox icam
. (3) M encari p anjang gelombang analisis yang cocok. Di- buat larutan
melox icam
meloxi- cam . Larutan induk meloxicam dien-
A lat.
Shimadzu
Kromatograf cair kinerja tinggi, terdiri dari kolom W hatman Partisil5, ODS-3 25 cm x 6 mm; pompa
Shimadzu LC-10A D; d etekto r Shi- madzu
SPD-10A; integrator
Shimadzu
CBM-102, program komputer
Class LC-10 , Sp ektro fo to meter UV-Vis,
model UV-1601,
, dilengkapi d eng an integ rato r UV -PC v .3,9; Sheaker; Sentrifugator; Kipas angin; Lemari pendingin; Tabung reaksi, tabung sentrifuge dan rak.
(1) Mengetahui waktu retensi
Cara Kerja
Pem buatan larutan-larutan: (1) Pembuatan larutan induk
meloxi- cam ; ditimbang dengan seksama 10,0
mg
meloxicam
dilarutkan dalam 100 mL metanol-air (70:30; v/ v) dalam labu ukur untuk memperoleh larutan d eng an ko nsentrasi 100
µg / mL. (2) Pembuatan larutan fase gerak yang terdiri dari campuran metanol
d an baku dalam yang diperoleh dari tahap 3 di atas dengan konsentrasi masing- masing 10 µg/ mL. Masing-masing larutan tersebut kemudian diukur nilai serapannya pada spektrofoto- meter UV-Vis dan dibuat spektrum serapannya. Dipilih nilai panjang gelombang optimum untuk analisis kedua zat. (4) Uji kesesuaian sistem. Dibuat larutan melox icam d engan baku d alam d eng an ko nsentrasi masing-masing 400 ng/ mL dan 20 µg / mL, masing -masing larutan tersebut kemudian dipipet sebanyak 2,0 mL dan dicampurkan pada vial hingga diperoleh campuran larutan
meloxicam
meloxicam
meloxicam
r (ko efisien ko relasi) d ari ked ua kurva tersebut. (8) Pengujian akurasi dan presisi. ‘Dibuat larutan
me- loxicam dalam larutan. Dihitung nilai
kemud ian d isuntikkan sebany ak 20 µL secara berurutan tiap larutan tersebut pada kromatograf. Dibuat kurva persamaan garis regresi linier luas p uncak (p erband ing an luas puncak) terhad ap ko nsentrasi
,
dengan konsentrasi 20 ng/ mL, 40 ng/ mL, 100 ng/ mL, 200 ng/ mL; 400 ng/ mL, 600 ng/ mL, dan 1000 ng/ mL dari larutan induk (tanpa dan d eng an baku d alam 10 µg / mL)
) d ari kro m ato g ram p elarut. (7) Pengujian linearitas. Dibuat larutan
d engan ko nsentrasi 200 ng/ mL dan baku dalam dengan kon- sentrasi 10
noise
) d eng an membandingkan tinggi puncak analit dengan tinggi puncak derau (
signal to noise ratio
dengan ko nsen- trasi 1000 ng/ mL, 400 ng/ mL, dan 100 ng/ mL (tanpa dan dengan baku dalam 10 µg/ mL) . Masing-masing larutan tersebut d isim p an p ad a lemari pendingin dan disuntikkan masing-masing 20 µL secara berulang p ad a kro m ato g raf p ad a rentang waktu 0 hari, 3 hari, 1 minggu, dan 2 m ing g u. D iam ati ad any a g ejala ketidakstabilan zat dengan meng- hitung perbandingan luas puncak dan mengamati bentuk masing-masing kromatogramnya. (6) Mencari limit deteksi dan limit kuantitasi. Dibuat larutan meloxicam dengan ko nsen- trasi 100 ng/ mL, 40 ng/ mL, 20 ng/ mL, d an 10 ng / mL. Disuntikkan 20 µL masing-masing larutan tersebut p ad a kro mato g raf, kemud ian d i- hitung tinggi puncak masing-masing kromatogramnya. Dihitung nilai S/ N (
meloxicam
α) dari analit dan baku dalam (5) Pengujian stabilitas. Dibuat larutan
µg/ mL. Larutan campuran tersebut kemudian disuntikkan 20 µL pada kro mato graf dengan ko ndisi fase gerak metanol-NaOH 0,001 N (70:30; v/ v), kecepatan alir 1,0 mL/ menit dan panjang gelombang 300 nm. Dihitung nilai resolusi, efisiensi kolom, dan faktor ikutan dari kro- matogram yang diperoleh. Kemudian ditimbang seksama 10,0 mg urasil lalu dilarutkan dalam 100 mL meta- no l, kemud ian d iencerkan hingga didapat konsentrasi 10 µg/ mL. La- rutan tersebut kemudian disuntikkan pada kromatograf dengan fase gerak metanol-NaOH 0,001 N (70:30; v/ v), kecep atan alir 1,0 mL/ menit d an panjang gelombang 254 nm. Diper- oleh waktu retensi urasil, kemudian dihitung faktor kapasitas dan faktor selektifitas (
dengan konsentrasi 1000 ng/ mL, 400 ng/ mL, dan 100 ng/ mL dari larutan induk (tanpa dan dengan baku dalam
10 µg/ .mL), kemudian disuntikkan 20 µL masing-masing larutan tersebut secara berulang pada kromatograf.
d engan masing-masing konsentrasi 10 ppm, 4 ppm, dan 1 ppm dari larutan induk (tanpa dan dengan baku dalam 10 µg/ mL). Dip ip et 1,0 mL masing- masing larutan tersebut kemudian dicukupkan volumenya hingga 10,0 mL dengan darah segar dalam labu ukur sehingga diperoleh konsentrasi
recov- ery
selam a 10 m enit dengan kecepatan 100 rpm. Diambil bagian klo ro fo rm, kemud ian eks- traksi diulang untuk kedua kalinya. Dikump ulkan ekstrak klo ro fo rm kemudian diuapkan sampai kering (dengan kipas angin). Residu dilarut- kan d alam 2,0 mL metano l (p .a) kemudian masing-masing disuntik- kan sebanyak 20 µL pada kromato- g raf d eng an ko nd isi fase g erak metanol-NaOH 0,001 N (70:30; v/ v), p anjang g elo mbang 300 nm, d an kecepatan alir 1,0 mL/ menit. Dihi- tung nilai perolehan kembali (
sheaker
tersebut d isentrifug e selama 6 menit dengan kecepatan 2000 rpm, lalu diambil bagian plas- manya. Dipipet 2,0 mL plasma ter- sebut lalu diekstraksi dengan 4,0 mL klo ro fo rm d eng an cara d iko co k d eng an
melox icam
400 ng/ mL, dan 100 ng/ mL. Setelah itu darah yang telah ditambahkan
meloxicam dalam darah 1000 ng/ mL,
melox icam
Dihitung nilai % akurasi dan sim- p ang an baku relatif (SBR) d ari masing-masing larutan tersebut.(9) Uji ketang g uhan meto d e. Dibuat larutan
Dibuat larutan
µL pad a kro ma- to graf d engan ko nd isi fase gerak metanol-NaOH 0,001 N (70:30; v/ v), p anjang g elo mbang 300 nm, d an kecepatan alir 1,0 mL/ menit. Diamati adanya gangguan/ interferensi pada kro mato gram dari ekstrak plasma blanko. (b) Uji perolehan kembali.
Diambil 10,0 mL darah segar dalam labu ukur kemud ian d isentrifuge selama 6 menit dengan kecepatan 2000 rp m , lalu d iam bil bag ian plasmanya. Dipipet 2,0 mL plasma tersebut lalu diekstraksi dengan 4,0 mL kloroform dengan cara dikocok d eng an sheaker selam a 10 m enit dengan kecepatan 100 rpm. Diambil bagian klo ro fo rm, kemud ian eks- traksi diulang untuk kedua kalinya. Dikump ulkan ekstrak klo ro fo rm kemudian diuapkan sampai kering (dengan kipas angin). Residu dilarut- kan d alam 2,0 mL metano l (p .a) kemudian masing-masing disuntik- kan sebanyak 20
melox icam secara in v itro (a) Uji sp esifitas.
µg/ .mL), kemudian disuntikkan 20 µL masing- m asing larutan tersebut secara berulang pada kromatograf. Dihitung nilai % akurasi dan simpangan baku relatif (SBR) d ari masing-masing larutan tersebut untuk penyuntikkan inter hari. Diuji ketangguhan metode dengan menggunakan perhitungan statistik. (10) Pengujian sampel darah d eng an p enam bahan
dengan ko nsen- trasi 1000 ng/ mL, 400 ng/ mL, dan 100 ng/ mL dari larutan induk (tanpa dan dengan baku dalam 10
meloxicam
) dari setiap konsentrasi ekstrak metanol yang disuntikkan tersebut. Dibandingkan nilai perolehan kem- bali sampel tanpa penambahan baku dalam dan dengan penambahan baku dalam.
Hasil dan Pembahasan
96,322%, p iro ksikam 97,82% , trim eto p rim 90,69%, kofein 84,14%, dan salisila- mid 80,52%. (b) Koefisien distribusi menunjukkan nilai kepolaran suatu zat dengan membandingkan kela- rutannya d alam pelarut no npo lar terhadap pelarut polar. Dalam per- cobaan ini sebagai pelarut nonpolar d igunakan klo ro fo rm d an pelarut polar adalah air. Nilai K D dapat juga ditentukan sebagai fraksi terekstraksi (dalam pelarut nonpolar). Nilai K D akan menentukan nilai waktu tambat zat pada kolom. Mengingat salah satu syarat suatu baku dalam yang ideal adalah memiliki puncak yang dekat dengan analit na- mun terpisah serta diharapkan m am p u m eng urang i g alat p ad a tahap iso lasi sam p el darah (Johnson EL, Robert S, 1991), maka diharapkan dapat ditemukan zat yang memiliki nilai K D y ang d ekat/ m irip dengan
. (c) Membandingkan nilai waktu retensi beberapa zat terhadap waktu
cam
adalah piroksikam, tri- metoprim, kofein, dan salisilamid. Untuk mey akinkan p ilihan baku dalam yang tepat, maka setiap zat tersebut d ico ba d isuntikkan pad a kromatograf dan dibandingkan nilai w aktu retensinya terhadap meloxi-
loxicam
Dari tabel 1 (lihat halaman belakang) didapat diurutkan kedekatan sifat kepolaran dari zat-zat tersebut terhadap me-
dan dapat dijadikan sebagai baku dalam untuk analisis meloxicam dalam darah.
meloxicam
meloxicam
(1) Mengetahui w aktu retensi
) yang cocok (a) Menghitung nilai koefisien distribusi dari bebe- rapa zat pilihan. Ditentukan empat zat sebagai pilihan baku dalam yaitu piroksikam, trimetoprim, kofein, dan salisilamid. Diperoleh nilai koefisein d istribusi d ari
standard
(2) Mencari baku dalam ( internal
berekor pada waktu tambat 1,595 da- pat dilihat pada gambar 1.
meloxicam yang lebih tajam dan tidak
kan adalah metanol-NaOH 0,001 N (70:30; v / v ). D ip ero leh p uncak
meloxicam . Fase gerak yang diguna-
Gambar 1. Kromatogram meloxicam 1,012 µg/ mL dengan fase gerak metanol-NaOH 0,001 N (70:30; v/v), kecepatan alir 1,0 mL/menit dan panjang gelombang deteksi 354 nm. waktu (menit)
Tabel 1.Nilai serapan ekstrak kloroform dan standard dari meloxicam, piroksikam,
trimetoprim, kofein dan salisilamid disertai dengan hasil perhitungan konstanta
distribusi (K ) masing-masing zat. DSerapan Serapan zat ekstrak K (%) D standard kloroform
Meloxicam
3,612 3,999 96,322 Piroksikam 3,913 3,999 97,82 Trimetoprim 2,370 2,613 90,69 Kofein 3,311 3,935 84,14 Salisilamid 3,215 3,860 80,52 retensi meloxicam . Tiap larutan zat Trimeto prim memiliki puncak disuntikkan pada kromatograf de- yang cukup terpisah (t = 1,9 menit), R ng an ko nd isi y ang sama d eng an namun tidak stabil. Penyuntikkan
meloxicam
penyuntikkan , yaitu fase beberapa kali larutan trimeto prim gerak metanol-NaOH 0,001 N (70:30; menghasilkan nilai t yang selalu R v/ v). Kro mato gram hasil penyun- berubah-ubah, terkad ang ad a d i
meloxicam
tikkan tiap zat d itunjukkan p ad a depan puncak dan kadang gambar 2 yang merupakan
multi-
tampilan gabungan (
view ) tiap kromatogram.
Piroksikam memiliki ni-
piroxicam
lai kepolaran yang paling de- kat dengan meloxicam namun ternyata memiliki puncak
melo-
yang berimpit dengan
xicam , dimana puncak pirok-
sikam muncul pada t = 1,5 R m enit. A lternatif unutk
trimetoprim kofein meloxicam
pemisahan kedua puncak ini dapat dilakukan dengan pe- nam bahan d iam m o nium ortohidrogenfosfat pada fase
waktu (menit)
g erak (V el Parid ian P, Jaisw al J B, Harbw az R K, Gambar 2. Kromatogram multiview dari
meloxicam , piroksikam, trimetoprim, dan kofein
Gupita S K, 2000), namun
dengan kondisi fase gerak metanol-NaOH 0,001
alternatif ini tid ak d ipilih
N (70:30; v/v), kecepatan alir 1,0 mL.menit dan
karena dapat beresiko mem-
panjang gelombang 354 nm, guna melihat profil
internal standard perpendek umur kolom. yang cocok. panjang gelombang (nm) kofein meloxicam
ada dibelakang bahkan berimpit. Hal ini kemungkinan terjadi karena sifat trimetoprim yang sangat sensitif ter- hadap perubahan pH, dimana fase g erak m eng g unakan 30 bag ian NaOH 0,001 N.
Pada panjang gelombang ini serapan
Gambar 3. Spektrum serapan gabungan (multi- view
diperoleh N sebesar 787 dengan nilai HETP 0,0319 cm d an untuk p uncak ko fein diperoleh N sebesar 1.986,61 dengan nilai HETP 0,01258. Tamp ak bahw a ko fein me-
meloxi- cam
dengan konsentrasi 200 ng/ mL dan kofein dengan konsentrasi 10 µg/ mL. Hasil penghitungan secara manual m em berikan nilai reso lusi sebesar 5,538. Berd asarkan hasil perhitungan, jumlah pelat teoritis untuk puncak
meloxicam
(e) Uji kesesuaian sistem. Hasil penyuntikkan larutan
µg / mL d imana d ihasilkan resp o n luas p uncak sebesar ±6000 µv (gambar 4).
analisis tetap akurat untuk analisis dalam darah yang menuntut kepe- kaan analisis untuk kadar kecil (ng/ mL), sementara kofein sebagai baku d alam d ap at d ig unakan d eng an ko nsentrasi 10,0
meloxicam tetap cukup besar sehingga
λ maks ) 353,0 nm sed angkan ko fein pada 260,0 nm. Perbedaan λ maks yang cukup jauh ini mendorong perlunya o ptimasi/ mencari panjang gelo m- bang yang optimum untuk analisis ked ua zat secara bersamaan. Dari spektrum serapan kedua zat, dipilih panjang gelombang 300 nm untuk analisis yang merupakan perpotongan d ari serap an ked ua z at tersebut.
Kofein merupakan pilihan yang lebih baik dari yang lainnya karena memiliki kepolaran yang cukup dekat dan puncak yang cukup terpisah dari
maksimum pada panjang gelombang (
M elox icam m em iliki serap an
d an ko fein d alam m etano l terlam p ir p ad a gambar 3.
melox icam
(d) Mencari panjang gelombang analisis yang co co k. Spektrum se- rap an d ari
meloxicam dalam darah.
serta stabil (tidak sensitif terhadap perubahan pH). Salisilamid tidak disuntikkan karena sudah dapat diprediksi akan memberikan puncak dengan t R yang lebih jauh dari kofein karena kepo- larannya yang ada di bawah kofein, sehingga dengan melihat keefektifan- nya dari keempat zat di atas maka dipilih kofein sebagai baku dalam yang cocok untuk analisis
,
(t R = 2,8 menit)
meloxicam
) larutan meloxicam dan kofein dengan konsentrasi 10 µg/mL dalam metanol. waktu (menit)
miliki nilai N yang lebih besar dari- p ad a melox icam , sebab m em iliki w aktu retensi yang lebih besar. Pe- misahan berbagai komponen sampel oleh kolom tergantung kepada daya pisah ko lo m terhadap ko mpo nen- komponen tersebut. Daya pisah ini sangat dipengaruhi oleh faktor kapa- sitas tiap komponen sampel. Faktor kapasitas (k’ ) didefinisikan sebagai waktu tambahan yang diperlukan zat terlarut untuk terelusi, dibandingkan d eng an z at y ang tid ak tertahan (k’ =0). Pad a kro mato g ram tid ak dapat diidentifikasi adanya puncak pelarut sehingga diperlukan suatu zat yang tid ak tertambat (sangat po o lar) yang memberikan nilai t R yang dapat merepresentasikan nilai t M atau t untuk menghitung fakto r kap asitas ked ua z at. Suatu zat yang tidak tertambat yang d ap at d igunakan p ad a kro m ato g rafi fase terbalik diusulkan diantaranya adalah urasil atau larutan pekat dari natrium nitrat. Untuk kedua zat ini d eteksi d ap at d ilakukan pada panjang gelo mbang 210 nm (Snyd er LR, Kirkland JJ, Glajch JL,1997). Diperoleh nilai w aktu retensi urasil ad alah 1,3312 menit, sehingga fakto r kapasitas untuk kedua zat dapat d ihitung . Dip ero leh nilai k’ untuk meloxicam adalah 0,141 dan kofein adalah 1,112. Nilai relatif/ p erband ing an d ari ked ua fakto r kap asitas ini diberikan oleh parameter daya pisah ( α), yang mana diperoleh d ay a p isah untuk
melox icam
d an kofein yang cukup besar yaitu 7,889. Dap at d isimp ulkan bahw a untuk kep erluan uji kesesuaian sistem berdasarkan parameter R, N, Tf, k’ dan
α, sistem dengan menggunakan fase gerak metanol-NaOH 0,001 N (70:30; v/ v) dengan kecepatan alir 1,0 mL/ menit dapat dinyatakan efektif untuk analisis melox icam d eng an kofein sebagai baku dalam.
(f) Uji Stabilitas. Hasil uji sta- bilitas yang dilakukan dari hari ke- 1, 2, 6, dan 14 menunjukkan bahwa campuran meloxicam dan kofein masih stabil (F < F tabel ;
α = 0,05) ditunjukkan d eng an tid ak ad any a p erubahan yang bermakna pada perbandingan luas puncak
meloxicam dengan kofein.
Gambar 4. Kromatogram meloxicam 200 ng/ mL dengan baku dalam kofein 10 µg/mL dengan menggunakan fase gerak metanol- NaOH 0,001 N (70:30; v/v) dengan kecepatan alir 1,0 mL/menit dan panjang gelombang analisis 300 nm.
(g) Uji limit d eteksi d an limit kuantitasi. Dari hasil p eng ujian d ip ero leh limit d eteksi
meloxicam
baseline
(blangko) dapat dilihat pada gambar 5 pada lampiran. Darah yang digunakan pada analisis ini adalah darah total ( whole blood ). Pad a kro m ato g ram tam p ak ad a bagian-bagian
meloxicam
(k) Peng ujian samp el. (i) Uji spesifitas. Kro mato gram hasil pe- nyuntikkan ekstrak darah tanpa pe- nambahan
dengan penambah- an baku d alam untuk ko nsentrasi 1000 ng/ mL memberikan nilai aku- rasi dan presisi 92,09% ± 0,9084%, untuk konsentrasi 400 ng/ mL mem- berikan nilai akurasi d an p resisi 102,71% ± 0,5572% , d an untuk konsentrasi 100 ng/ mL memberikan nilai akurasi dan presisi 105,46% ± 0,3403%. Bila dibandingkan dengan data akurasi dan presisi yang dila- kukan pada hari pertama (tahap i di atas), maka dari data di atas (penyun- tikkan hari kedua) secara umum tidak memberikan perbed aan yang ber- makna/ signifikan ( α = 0,05) antara penyuntikkan intra hari dan penyun- tikkan inter hari (hari-2).
meloxicam
tanpa baku dalam untuk konsentrasi 1000 ng/ mL mem- berikan nilai akurasi d an p resisi 102,61% ± 1,4367%, untuk konsen- trasi 400 ng/ mL memberikan nilai akurasi dan presisi 95,27% ± 0,8512%, dan untuk konsentrasi 100 ng/ mL memberikan nilai akurasi dan presisi 104,90% ± 0,4698% . Sed ang kan larutan
(j) Uji ketang g uhan m eto d e. Larutan
melox icam
d eng an baku dalam memberikan nilai akurasi dan presisi 92,65% ± 0,8359, konsentrasi 400 ng/ mL memberikan nilai akurasi dan presisi 98,28% ± 0,5284%, dan konsentrasi 100 ng/ mL memberikan nilai akurasi dan presisi 104,57% ± 0,6048%. Syarat suatu metode yang akurat adalah memberikan nilai aku- rasi 90 – 110% (A no nim , 1990), sed ang kan sy arat p resisi ad alah memberikan nilai simpangan baku relatif (SBR) 2% atau kurang. Kriteria ini sebenarnya relatif/ bisa berubah tergantung banyaknya penyuntikkan yang dilakukan. Berdasarkan kriteria di atas dan data yang diperoleh dari hasil percobaan, maka dapat dikata- kan bahw a meto d e analisis yang digunakan memenuhi kriteria akurat dan presisi.
melox icam
(i) Pengujian akurasi dan presisi. Larutan meloxicam tanpa baku dalam, konsentrasi 1000 ng/ mL memberikan nilai akurasi dan presisi 105,18% ± 0,7622% , ko nsentrasi 400 ng / mL memberikan nilai akurasi dan presisi 103,94% ± 1,0047%, dan konsentrasi 100 ng/ mL memberikan nilai akurasi d an p resisi 103,44% ± 1,0593% . Larutan
tanpa baku dalam adalah 0,9988 dan untuk larutan melox icam d eng an baku d alam ad alah 0,9988. Ko nsentrasi yang digunakan adalah 20, 40, 100, 200, 400, dan 1000 ng/ ml.
meloxicam
(h) Pengujian linearitas. Berdasar- kan p erhitungan statistik regresi linier, diperoleh nilai koefisien kore- lasi untuk larutan
pada konsentrasi 20 ng/ mL.dan limit kuantitasi pada konsentrasi 120 ng/ mL.
yang tidak rata y ang berad a d i d aerah 1 sampai 5 menit, yang me- rupakan daerah munculnya puncak meloxicam dan kofein. Bagian-bagian tidak rata ini memang tidak membentuk suatu puncak yang sangat mengganggu, namun sedi- kitny a bisa tetap memp e- ng aruhi bentuk kro m ato - gram pada analisis kedua zat saat uji pero lehan kembali yang membutuhkan keaku- ratan y ang sang at ting g i. Peng g ang g u ini kem ung - kinan berasal dari komponen darah yang terbaw a ke da- lam ekstrak metano l p ad a tahap isolasi obat. Ekstraksi plasma d ilakukan d eng an meng g unakan kloroform, namun dari penyuntikkan ekstrak kloroform ternyata dihasil- kan puncak-puncak gangguan yang sangat besar, yang kemungkinan berasal dari komponen lemak darah y ang d ap at terekstrak ke d alam kloroform. Oleh karena itu, diupaya- kan memindahkan molekul obat ke dalam metanol dengan cara meng- uapkan klo ro fo rm di baw ah kipas angin (untuk menghindari peruraian zat karena pemanasan) lalu dilarut- kan ke dalam metanol, sehingga di- peroleh ekstrak metanol untuk disun- tikkan. Penyuntikkan ekstrak meta- nol relatif lebih bersih dan komponen lemak darah yang tidak ikut terbawa dan masuk ke dalam kolom.
(ii) Uji Perolehan Kembali. Kro- matogram hasil penyuntikkan hasil ekstraksi darah yang ditambahkan
Gambar 5. Kromatogram ekstrak sampel darah tanpa penambahan meloxicam (blangko) dengan fase gerak metanol-NaOH 0,001 N (70:30; v/v), kecepatan alir 1,0 mL/menit dan pada panjang gelombang 300 nm. waktu (menit)
larutan meloxicam tanpa baku dalam dan larutan
meloxicam
dengan baku dalam ditunjukkan pada gambar 6 dan 7. Kedua puncak, baik meloxicam dan kofein muncul pada nilai t R se- perti yang diharapkan. Secara umum iso lasi telah berjalan d engan baik karena dapat dianalisis puncak
me- loxicam dan kofein tanpa pengganggu
yang berarti. Melihat kompleksnya komponen-komponen dalam darah sampai sejauh ini pro sedur iso lasi tampaknya d apat d ikatakan telah berhasil. Permasalahan utama beri- kutnya yang harus diamati adalah besar perolehan kembali yang dihasil- kan oleh metode KCKT dan prosedur isolasi untuk menghasilkan perolehan kembali analit yang mendekati 100%.
Ekstrak
meloxicam
tanpa adanya baku dalam memberikan hasil per- o lehan kembali untuk ko nsentrasi 1000 ng/ mL sebesar 82,14% ± 1,937%, p ero lehan kembali untuk analisis sampel darah di atas 80% sebenarnya bisa dikata- kan baik. (Kaw ira JA,1994). Dari hasil uji perolehan kem- bali di atas, tampak bahw a penggunaan kofein sebagai
meloxicam
baku dalam untuk kurang efektif, karena justru dihasilkan nilai pero lehan
melox icam
kem bali y ang lebih besar tanpa pengguna- an baku dalam pada analisis.
Gambar 6. Kromatogram ekstrak metanol dari sampel darah dengan penambahan larutan meloxi-
Hal ini mendorong perlunya
cam tanpa baku dalam secara in vitro dengan fase
pertimbangan lebih lanjut
gerak metanol-NaOH 0,001 N (70:30; v/v),
dalam memilih baku dalam
kecepatan alir 1,0 mL/menit dan pada panjang
yang id eal. Salah satu hal gelombang 300 nm. yang utama yang harus di- untuk konsentrasi 400 ng/ mL sebe- evaluasi adalah fraksi ikatan protein
Fu = fraction of unbounded
sar 74,37% ± 0,711%, dan untuk kon- ( ) antara
melox icam n
sentrasi 100 ng/ mL sebesar 83,58% (analit) d eng an ko fei ± 3,802%. Sedangkan hasil perolehan (baku dalam).
meloxicam
kembali ekstrak de- ngan penggunaan baku dalam ko fein d ipero leh hasil untuk konsentrasi 1000 ng/ mL adalah 56,88% ± 0,478%, untuk konsen- trasi 400 ng/ mL adalah 61,60% ± 1,049%, dan untuk konsentrasi 100 ng/ mL ad alah 41,58% ± 1,108%. Penggunaan baku da- lam sebenarny a d iharap kan mampu meningkatkan % pero- lehan kembali dari analisis obat d alam d arah. Namun hal ini
waktu (menit)
sangat tergantung d ari keco -
Gambar 7. Kromatogram ekstrak metanol dari
cokan suatu zat untuk diguna-
sampel darah dengan penambahan larutan
kan sebagai baku dalam atau
meloxicam dan baku dalam secara in
bisa dikatakan bahwa tantangan vitro
dengan fase gerak metanol-NaOH 0,001 N (70:30; v/v), kecepatan alir 1,0 mL/menit dan
utama adalah menemukan sua- pada panjang gelombang 300 nm. tu baku dalam yang ideal. Hasil
KESIM PULA N
sis in Complex M atrices
, o leh Pad ma- winata K. Penerbit ITB Bandung, 1991: 213-321. Kawira J.A. Problems Of Drug Analy- sis in Relatio n to Therapeutic
Drug Mo nito ring.
D alam
:
A b- stracs, The 4 th Pan Pasific A sian Congress O n Clinical Pharmacy
. July 10 – 14, 1994, Horison Ho- tel, Jakarta – Indonesia. The In- donesian Pharmacist Association. 1994. hal.18. Kelly MT. Drug Analysis in Biologi- cal Fluids. Dalam : Chemical Analy-
. Dublin, Ireland. Hal.17-97. M arp aung SU. M odifikasi M etode
. Terj. dari
Penetapan Kadar Ambroksol dalam Plasma M anusia secara In V itro menurut Nobilis
. Skripsi Program Sarjana Farm asi FM IPA UI. Depok. 1995: 68+xiv. Regional Drug and Therapeutics Cen- tre. N ew D rug Ev aluation:
M elox icam . Juni 1997. 2 hlm .
http:/ / w w w .jpet.aspetjournals. org. 25 Maret 2004, pk.16.00. Shargel, Leon; A ndrew B.C.Yu.
A p- plied Biopharmaceutics and Phar- macokinetics, Third edition
. Apple- ton & Lange. 1941: 33-110. Vel Paridian P, Jaiswal J B, Harbwaz
Basic Liquid Chromatography
Dasar Kroma- tografi Cair
1. Analisis meloxicam tanpa baku dalam menggunakan metode KCKT dengan fase gerak metano l-NaOH 0,001 N (70:30; v/ v), kecepatan alir 1,0 mL/ menit dan panjang gelom- bang 354 nm memenuhi kriteria aku- rat, presisi, dan tangguh.
Hal 1110 – 1112. Anonim
2. Metode penetapan kadar melo-
xicam
dalam darah manusia
in vitro
dengan menggunakan baku dalam memberikan hasil yang kurang baik atau negatif dibandingkan dengan penetapan kadar tanpa menggunakan baku dalam.
D A FTA R PUSTA KA A nonim, British Pharmacopeia , 2002.
. Clarke’ s Isolation and Identi- fication of D rugs, second edition .
Medika - Jurnal Kedokteran dan Farmasi, 1994. Hal 49-51. Johnson EL, Robert S.
The Pharmaceutical Press. Lon- don, 1986. Hal. 212 – 213. Erlina.
V alidasi M etode Penetapan Kadar A mbroksol dalam Plasma D arah secara Kromatografi Cair Kinerja Tinggi
. Skripsi Program Sarjana Farm asi FM IPA UI. Depok. 1996: 51+xiv. Ibrahim, Slamet.
Penggunaan Statistika dalam Validasi Metode Analitik dan Penerapannya
. Dari: Pro sid ing Temu Ilmiah Nasio nal Bidang Farmasi VI. Hal 15 – 37.
Indrayanto, G.
M etoda V alidasi pada Analisis dengan Kromatografi . Dari:
R K, Gupita S K. Development and Validation of A New High Performance Liquid Chromatog- raphy Estimation Method of Mix in Biological Sample. Dari: Jour- nal Chro mato graphy and Bio - m ed Science. D ep artm ent o f Pharmacology, New Delhi, In- dia. 2000.