Sintesis turunan arilamida-5 dan uji aktivitas in vitro terhadap enzim matrix metalloproteinase-9 (MMP-9) sebagai kandidat anti-kanker payudara - USD Repository

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

SINTESIS TURUNAN ARILAMIDA-5 DAN UJI AKTIVITAS IN VITRO
TERHADAP ENZIM MATRIX METALLOPROTEINASE-9 (MMP-9)
SEBAGAI KANDIDAT ANTI-KANKER PAYUDARA
SKRIPSI
Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat
Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S.Farm)
Program Studi Farmasi

Diajukan oleh :
Reynaldo Tiara
NIM : 158114097

FAKULTAS FARMASI
UNIVERSITAS SANATA DHARMA
YOGYAKARTA
2019

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

SINTESIS TURUNAN ARILAMIDA-5 DAN UJI AKTIVITAS IN VITRO
TERHADAP ENZIM MATRIX METALLOPROTEINASE-9 (MMP-9)
SEBAGAI KANDIDAT ANTI-KANKER PAYUDARA
SKRIPSI
Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat
Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S.Farm)
Program Studi Farmasi

Diajukan oleh :
Reynaldo Tiara
NIM : 158114097

FAKULTAS FARMASI
UNIVERSITAS SANATA DHARMA
YOGYAKARTA
2019
i

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

ii

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

iii

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

HALAMAN PERSEMBAHAN

2 Korintus 10:4
Karena senjata kami dalam perjuangan bukanlah senjata duniawi, melainkan
senjata yang diperlengkapi dengan kuasa Allah, yang sanggup untuk meruntuhkan
benteng-benteng.

KARYA INI KUPERSEMBAHKAN UNTUK:
Allah Bapa, Tuhan Yesus Kristus, dan Roh Kudus yang telah menuntunkan
dalam setiap perjalanan kehidupanku dengan semua hikmat dan kasih setiaNya.
Papah Tersayang Andry Yatti dan Mamah Tercinta Linda Sunarto atas cinta,
kasih sayang, dan senantiasa mendoakan kesuksesanku.

Kedua adik kesayanganku, Figo Stefanus Tiara dan Varel Tiara. You are my
best brothers ever.
dan tentunya,
Almamaterku terkasih Universitas Sanata Dharma

iv

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

v

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

vi

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

PRAKATA
Puji Tuhan penulis panjatkan pada Tuhan Yang Maha Esa, karena atas
penyertaan dan cinta kasih-Nya, skripsi yang berjudul Sintesis Turunan

Arilamida-5

dan

Uji

Aktivitas

In

Vitro

Terhadap

Enzim

Matrix

Metalloproteinase-9 (MMP-9) Sebagai Kandidat Anti-Kanker Payudara dapat
diselesaikan dengan baik dan tepat waktu. Penelitian ini merupakan bagian dari

penelitian Maywan Hariono, Ph.D., Apt. yang didanai oleh Indonesia Toray
Science Foundation (ITSF) Periode 2017-2018 dengan judul “Synthesis,
Enzymatic Assay, and Molecular Modelling of Purine Derivatives Targeting
Hemopexin Domain of Matrix Metalloproteinase-9 (PEX-9) in The Discovery of
Novel Anti-Breast Cancer”. Skripsi ini disusun sebagai syarat untuk memperoleh
gelar Sarjana Farmasi (S.Farm.) di Universitas Sanata Dharma Yogyakarta.
Penyelesaian naskah skripsi ini tidak lepas dari dukungan berbagai pihak,
baik langsung maupun tidak langsung. Oleh karena itu, dengan kerendahan hati
penulis mengucapkan terima kasih sebesar-besarnya kepada:
1.

Ibu Dr. Yustina Sri Hartini, Apt. selaku Dekan Fakultas Farmasi Universitas
Sanata Dharma Yogyakarta.

2.

Ibu Dr. Christine Patramurti, Apt. selaku Ketua Program Studi Farmasi
Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma Yogyakarta.

3.

Bapak Maywan Hariono, Ph.D., Apt. selaku dosen pembimbing skripsi yang
telah membimbing tim penelitian dengan sabar, kasih, semangat, dukungan,
motivasi, kritik, dan saran dari awal hingga akhir penyusunan skripsi ini.

4.

Ibu Dr. Christine Patramurti, Apt. dan Ibu Damiana Sapta Candrasari, S.Si.,
M.Sc. selaku dosen penguji yang telah memberikan masukan dan saran yang
sangat berharga dalam penulisan naskah ini dari awal hingga akhir.

5.

Papah Andry Yatti dan Mamah Linda Sunarto yang telah memberikan
pengertian, dukungan, semangat, cinta, kasih, dan doa dalam penulisan
naskah ini dari awal dan akhir.

6.

Figo Stefanus Tiara dan Varel Tiara yang telah memberikan dukungan,

semangat, dan doa dalam penulisan ini dari awal hingga akhir serta penulis
berharap agar adik-adik tersayang kelak sukses selalu.
vii

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

7.

Wisnu, Krisna, Kevin, Sangga, dan Ervan, selaku teman seperjuangan skripsi,
penulis berterima kasih karena telah bersedia menanggung beban kehidupan
bersama dan bertahan hingga akhir.

8.

Kelompok “Unknown” Bryant, Tommy, Vani, Alicia, Pipit, Siska, Epen,
Elsa, dan Tata, selaku sahabat seperjuangan dan sepermainan selama
menjalani aktivitas perkuliahan dari awal hingga akhir. Penulis mengucapkan
terima kasih atas persahabatan yang dijalani.

9.

Kelompok “Dolan Squad” Wisnu, Krisna, Retha, Lina, Inge, dan Mas Rudi,
selaku teman kelas yang berjuang melewati dunia perkuliahan. Penulis
mengucapkan terima kasih atas persahabatan yang dijalani.

10. Denny, Chintya, Davor, Beben, dan Alen, selaku sahabat terbaik. Penulis
mengucapkan terima kasih atas persahabatan yang dijalani.
11. Bapak Parlan, Mas Kunto, Pak Wagiran, dan Mas Bimo, selaku laboran yang
telah membantu penulis dalam pelaksanaan penelitian.
12. Seluruh anggota Drug Discovery Research Group, terutama Tito, Diana, Eko,
Pandu, Jason, Try, Angel, dan Wiwy, serta Divisi Penelitian dan
Pengembangan BEMF Farmasi 2018 penulis berterima kasih atas kerjasama
dan dukungan moralnyaselama perjalanan ini.
13. Kak Donny dan Kak Resti, selaku teman Divisi Pengabdian Masyarakat
BEMF Farmasi yang selalu memberikan dukungan bagi penulis.
14. Teman-teman FSM C 2015 serta Angkatan 2015 Farmasi yang telah
memberikan banyak kenangan dalam masa perkuliahan.
15. Semua pihak yang tidak dapat disebutkan satu per satu yang telah mendukung
dalam penyelesaian penyusunan naskah skripsi ini.
Penulis menyadari bahwa naskah penelitian ini masih jauh dari kata

sempurna dan masih memiliki banyak kekurangan. Oleh karena itu, penulis sangat
mengharapkan kritik dan saran yang dapat membangun. Terima kasih.
Yogyakarta, 30 Januari 2019
Penulis

viii

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

ABSTRAK
Salah satu indikator kanker payudara tipe triple negative dan HER2positive adalah terjadinya over ekspresi enzim Matrix Metalloproteinase-9
(MMP-9). Enzim ini mendegradasi matriks ekstraseluler yang mengawali
terjadinya migrasi sel kanker dan proses metastasis. Penghambat enzim MMP-9
yang telah dirancang selama ini hanya untuk menghambat MMP pada sisi
catalytic domain sehingga gagal pada tahap uji klinik, karena bersifat non-selektif
terhadap salah satu jenis MMP dan menyebabkan efek samping yang merugikan
seperti contohnya nyeri muskuloskeletal dan inflamasi. Penelitian ini bertujuan
untuk mensintesis senyawa turunan arilamida-5 serta menguji aktivitasnya sebagai
penghambat MMP-9 secara selektif, karena dirancang untuk berikatan dengan
hemopexin domain. Sintesis telah dilakukan dengan mereaksikan sulfamerazin

dan 3-bromopropionil klorida dengan katalisator piridin pada suhu kamar.
Senyawa hasil sintesis yang terbentuk berupa serbuk kuning, negatif terhadap
DAB-HCl, larut dalam DMSO, dan memiliki titik lebur 193-200°C dengan
rendemen sebesar 67,13%. Senyawa hasil sintesis berhasil dipastikan strukturnya
dengan metode spektrofotometri inframerah, spektrometri resonansi magnetik inti,
dan kromatografi gas-spektrometri massa. Senyawa hasil sintesis diuji
aktivitasnya terhadap MMP-9 secara in vitro dan didapatkan nilai persentase
penghambatan terhadap enzim MMP-9 sebesar 93% pada 200 µg/mL dan nilai
IC50 sebesar 199 µM. Kesimpulannya senyawa turunan arilamida-5 aktif
menghambat MMP-9, sehingga poten sebagai kandidat obat kanker payudara.
Kata kunci: arilamida-5, hemopexin domain, kanker payudara, MMP-9, uji
aktivitas in vitro

ix

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

ABSTRACT
One of indicators in triple negative and HER2-positive breast cancer is
the overexpression of the Matrix Metalloproteinase-9 (MMP-9) enzyme. This

enzyme degrades the extracellular matrix which initiates cancer cell migration and
metastasis. To date, MMP-9 enzyme inhibitors have been designed only to inhibit
MMP on the catalytic domain which unfortunately fails at the clinical trial, due to
the non-selective inhibition across MMP subfamilies while causing adverse side
effects such as musculoskeletal pain and inflammation. This study aims to
synthesize arylamide-5 and test its activity as MMP-9 inhibitors. The synthesis
was carried out by reacting sulfamerazine and 3-bromopropionyl chloride using
pyridine as the catalyst at room temperature. The physical appearance of the
synthesized compound (yield 67,13%) is yellow powder, which negatively reacts
with DAB-HCl, soluble in DMSO, and having melting range: 193-200°C. The
synthesized compound was successfully confirmed its structure by FTIR, NMR,
and GC-MS. The synthesized compound was tested for its activity against MMP-9
in vitro showing percentage inhibition of the MMP-9 enzyme being 93% at 200
µg/mL while the IC50 value was equal to 199 µM associating with its potency as
breast cancer drug candidate.
Keywords: arylamide-5, hemopexin domain, breast cancer, MMP-9, in vitro
assay

x

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

DAFTAR ISI
Halaman
HALAMAN JUDUL...................................................................................
i
HALAMAN PERSETUJUAN PEMBIMBING .........................................
ii
HALAMAN PENGESAHAN.....................................................................
iii
HALAMAN PERSEMBAHAN .................................................................
iv
PERNYATAAN KEASLIAN KARYA .....................................................
v
PERNYATAAN PERSETUJUAN PUBLIKASI .......................................
vi
PRAKATA ..................................................................................................
vii
ABSTRAK ..................................................................................................
ix
ABSTRACT ................................................................................................
x
DAFTAR ISI ...............................................................................................
xi
DAFTAR TABEL .......................................................................................
xii
DAFTAR GAMBAR .................................................................................. xiii
DAFTAR LAMPIRAN ............................................................................... xiv
PENDAHULUAN ......................................................................................
1
METODE PENELITIAN ............................................................................
3
HASIL DAN PEMBAHASAN ...................................................................
5
KESIMPULAN ...........................................................................................
19
SARAN .......................................................................................................
19
UCAPAN TERIMA KASIH .......................................................................
19
DAFTAR PUSTAKA .................................................................................
20
LAMPIRAN ................................................................................................
23
BIOGRAFI PENULIS ................................................................................
31

xi

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

DAFTAR TABEL
Halaman
Tabel I. Hasil uji kelarutan senyawa turunan arilamida-5 .......................... 9
Tabel II. Perhitungan %penghambatan turunan arilamida-5 terhadap
MMP-9 .......................................................................................... 18

xii

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

DAFTAR GAMBAR
Halaman
Gambar 1. Struktur dan farmakofor dari (a) compound 2; (b) senyawa
Adhipandito dan Ludji ; dan (c) turunan arilamida-5 ............... 2
Gambar 2. Mekanisme reaksi substitusi nukleofilik asil (SNA) antara
sulfamerazin dan 3-bromopropionil klorida menggunakan
katalisator piridin ...................................................................... 6
Gambar 3. Produk hasil sintesis senyawa turunan arilamida-5 setelah
dilakukan proses penetralan pH dan pengeringan (a) dan
sulfamerazin (b) ....................................................................... 7
Gambar 4. Hasil KLT sintesis senyawa turunan arilamida-5 yang
menunjukkan 2 noda yang berbeda, yaitu sulfamerazin (A)
dan senyawa turunan arilamida-5 (B) ....................................... 8
Gambar 5. Spektrum IR senyawa turunan arilamida-5 .............................. 10
Gambar 6. Spektrum IR sulfamerazin (diadaptasi dari Prajapat et al.,
2018) ......................................................................................... 10
Gambar 7. Spektrum resonansi magnetik inti 1H senyawa turunan
arilamida-5 ................................................................................ 13
Gambar 8. Spektrum resonansi magnetik inti 13C senyawa turunan
arilamida-5 ................................................................................ 15
Gambar 9. Kromatogram hasil kromatografi gas senyawa turunan
arilamida-5 ................................................................................ 16
Gambar 10. Spektrum massa senyawa turunan arilamida-5 ......................... 16
Gambar 11. Kurva hubungan log konsentrasi turunan arilamida-5 dengan
persentase inhibisi ..................................................................... 19

xiii

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

DAFTAR LAMPIRAN
Halaman
Lampiran 1. Tahap sintesis senyawa turunan arilamida-5 .......................
23
Lampiran 2. Mekanisme reaksi sulfamerazin dengan DAB-HCl ............
23
Lampiran 3. Hasil uji DAB-HCl ..............................................................
24
Lampiran 4. Perhitungan bahan dan rendemen .......................................
24
Lampiran 5. Perbesaran pada sinyal 2,85 ppm dan 2,98 ppm .................
25
Lampiran 6. Perbesaran pada sinyal 3,72 ppm dan 3,87 ppm .................
25
Lampiran 7. Perbesaran pada sinyal 7,76 ppm dan 7,93 ppm .................
26
Lampiran 8. Perbesaran pada sinyal 7,62 ppm dan 8,31 ppm .................
26
Lampiran 9. Mekanisme pola fragmentasi m/z 334.................................
27
Lampiran 10. Mekanisme pola fragmentasi base peak m/z 55 ..................
27
Lampiran 11. Rancangan microwell plate untuk uji aktivitas in vitro .......
28
Lampiran 12. Perhitungan Nilai IC50 Senyawa Turunan Arilamida-5.......
29

xiv

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

PENDAHULUAN
Kanker merupakan penyakit yang ditandai dengan sel yang tumbuh
secara tidak normal dan disebabkan oleh mutasi genetik. Mutasi tersebut terjadi
berulang kali dan menyebabkan sel dapat menghindari mekanisme pengendalian
normal (Pecorino, 2012). Salah satu enzim yang berperan penting dalam
perkembangan kanker adalah Matrix Metalloproteinase (MMP). MMP merupakan
protease yang akan mendegradasi matriks ekstraseluler (ECM) dan menyebabkan
metastasis, sehingga sel kanker dapat bermigrasi (Merdad et al., 2014). MMP-9
diekspresikan oleh sel kanker payudara jenis triple-negative dan HER2-positive
dalam jumlah yang lebih banyak dibandingkan pada sel payudara normal,
sehingga kedua jenis kanker payudara tersebut disebut sebagai highly metastatic
(Mehner et al., 2014; Yousef et al., 2014).
Marimastat merupakan salah satu MMP-9 inhibitor yang telah dirancang
untuk menghambat progresi dari kanker payudara namun tidak selektif dalam
menghambat salah satu jenis MMP, sehingga mengakibatkan efek samping berupa
nyeri muskuloskeletal dan inflamasi (Cathcart et al., 2015). Seluruh kelompok
MMP memiliki struktur berupa signal peptide, pro-peptide domain, catalytic
domain, dan hemopexin domain (Bauvois, 2012). Marimastat dirancang dengan
menargetkan catalytic domain yang memiliki homologi sekuens asam amino yang
cukup tinggi (43-65%) pada seluruh jenis MMP, sehingga aktivitas dari MMP
selain MMP-9 akan terhambat (Vandenbroucke dan Libert, 2014). Sedangkan
pada hemopexin domain MMP-9 (PEX-9) hanya terdapat homologi sebesar 2535% dengan PEX pada MMP lainnya. Hal ini menjadikan PEX-9 sebagai target
protein yang lebih selektif dalam menghambat MMP-9 (Dufour et al., 2011).
Penelitian mengenai MMP inhibitor yang selektif terhadap PEX-9 telah
dilakukan oleh Dufour et al., (2011) yang menemukan senyawa CID135415473
(~{N}-[4-(difluoromethoxy)phenyl]-2-[(6-oxo)-4-propyl-1~{H}-pyrimidin-2-yl)
sulfanyl]acetamide)

(www.pubchem.ncbi.nlm.nih.gov)

atau

disebut

juga

Compound 2 dengan nilai Kd = 2,2 μM. Gugus yang diduga berperan penting
dalam aktivitas penghambatan PEX-9 adalah cincin planar yang berinteraksi
dengan kantung aktif pada blade PEX-9 yang dihubungkan oleh rantai alkil yang
1

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

memberikan efek fleksibel bagi cincin arilamida untuk berinteraksi di permukaan
kantung aktif yang disajikan pada Gambar 1a.
1a Interaksi tersebut diduga berperan
dalam penghambatan proses pembentukan homodimer pada PEX
PEX-9, sehingga
dapat mencegah proses migrasi sel kanker (Dufour et al,, 2010). Sementara itu,
gugus difluorometoksi
ksi (-OCF
(
Electron Withdrawing
2) yang bersifat EWG (Electron
Group) dan EDG (Electron
Electron Donating Group
Group)) belum dijelaskan pengaruhnya
PEX
terhadap aktivitas penghambatan PEX-9.
Cincin arilamida

Rantai alkil
Cincin planar

Gugus
difluorometoksi

(a)

(b)

Gugus sulfonamid-4-metilpirimidin
metilpirimidin

(c)

Gambar 1. Struktur dan farmakofor dari (a) compound 2;; (b) senyawa
Adhipandito (2017; R= H) dan Ludji (2017; R= NO2); dan (c) turunan arilamida
arilamida-5
Alford et al.,
al (2017) juga telah menemukan senyawa yang aktif dan
selektif terhadap MMP-9
MMP yaitu Senyawa 3c dengan Kd = 0,32 µ
µM dan memiliki
farmakofor yang serupa dengan Compound 2. Adhipandito (2017) dan Ludji
(2017) mensintesis 2 senyawa turunan arilamida (Gambar 1b) yang merupakan
fragmen dari Compound 2 dengan %penghambatan terhadap MMP
MMP-9 sebesar
masing-masing 11% dan 67%. Berdasarkan strukturnya, penambahan gugus EWG
seperti nitro pada turunan arilamida, meningkatkan aktivitas penghambatan
terhadap MMP-9.. Penelitian ini melanjutkan seri dari senyawa
senyawa Adhipandito dan
Ludji dengan menambahkan gugus sulfonamid-4-metilpirimidin
sulfonamid
pirimidin (Gambar 1c)
yang bersifat EWG dan EDG sehingga diharapkan meningkatkan aktivitas
penghambatan terhadap MMP-9.
MMP

2

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

METODE PENELITIAN
Bahan Penelitian
Seluruh bahan kimia yang digunakan bermutu analisis, kecuali
disebutkan lain. Bahan utama yang digunakan untuk sintesis antara lain
sulfamerazin

(4-amino-N-(4-methylpyrimidin-2-yl)benzenesulfonamide)

mutu

obat, 3-bromopropionil klorida, piridin, natrium karbonat mutu teknis (Na2CO3)
10%, akuades, n-heksana, etil asetat, dimetilsulfoksida (DMSO), plat silika gel
GF254 (Merck 7730), dan dimetilaminobenzaldehid HCl (DAB-HCl). Bahan untuk
elusidasi struktur yaitu pellet kalium bromida untuk spektrofotometri inframerah
dan pelarut DMSO-D6 untuk spektrometri resonansi magnetik inti. Bahan untuk
uji aktivitas in vitro yaitu kit enzim MMP-9 yang didapatkan dari Biovision terdiri
dari enzim MMP-9 yang terliofilisasi, substrat peptida Fluorescence Resonance
Energy Transfer (FRET)-based MMP-9, dapar Tris HCl, peptida NNGH inhibitor
(Asparagin-Asparagin-Glisin-Histidin) sebagai kontrol positif, gliserol untuk
mengencerkan enzim, dan dimetilsulfoksida sebagai pelarut sampel.
Alat Penelitian
Alat yang digunakan dalam penelitian ini antara lain timbangan analitik
(Mettler Toledo®), pompa vakum (GAST model DOA-P504-BN), oven
(Memmert GmbH+Co.KG), labu alas bulat (Pyrex), pengaduk magnetik, lempeng
panas, bejana (chamber) kromatografi lapis tipis (KLT), lampu UV254, alat uji titik
lebur (Mettler Toledo®), dan alat gelas pada umumnya. Alat untuk elusidasi
struktur digunakan spektrofotometer inframerah (Shimadzu), spektrometer
nuclear magnetic resonance (Bruker 176 dan 700MHz), kromatografi gasspektrometer massa (GC-MS QP2010S Shimadzu). Alat untuk uji aktivitas in
vitro digunakan pipet mikro (Eppendorf), micro well plate 96, pipet tips,
inkubator, vortex, dan ELISA microplate reader fluorescence (Tecan Infinite 200
PRO).
Prosedur Penelitian
Sintesis Senyawa Turunan Arilamida-5 (Diadaptasi dari Arifiyanto, 2001)
Dalam labu alas bulat, dimasukkan sulfamerazin sebanyak 3,59 mmol
(0,95 g) dan ditambahkan piridin sebagai katalisator sebanyak 7,18 mmol (0,58
3

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

mL). Campuran diaduk selama 10 menit pada suhu kamar lalu ditambahkan 3bromopropionil klorida tetes demi tetes sebanyak 5,39 mmol (0,61 mL).
Campuran diaduk kembali selama 30 menit pada suhu kamar. Hasil sintesis
disaring kemudian dinetralkan dengan Na2CO3 10% hingga pH netral dan dicuci
dengan akuades serta dikeringkan di oven pada suhu 40ºC.
Uji Pendahuluan dan Elusidasi Struktur
Produk hasil sintesis yang terbentuk dilakukan uji pendahuluan dengan
menggunakan DAB-HCl. Kemudian dilanjutkan pengujian dengan KLT
menggunakan fase diam plat silika gel GF254 dan fase gerak n-heksana : etil asetat
(1:3). Kemudian produk hasil sintesis diuji secara organoleptis (bentuk dan
warna), kelarutan, titik lebur, dan perhitungan rendemen senyawa hasil sintesis.
Elusidasi struktur dilakukan dengan metode spektrofotometri inframerah,
spektrometri resonansi magnetik inti (1H dan

13

C), dan kromatografi gas-

spektrometri massa yang dilakukan di Fakultas MIPA Universitas Gadjah Mada
dan Institut Farmasetikal dan Nutrasetikal Malaysia.
Uji Aktivitas In Vitro
Uji aktivitas in vitro dilakukan di Universitas Padjadjaran. Enzim yang
terliofilisasi direkonstitusi dengan 110 µL gliserol 30% dalam deionised water.
Enzim yang telah terekonstitusi dilarutkan dalam 550 µL dapar dan siap
digunakan untuk pengujian. Senyawa sampel disiapkan dengan cara dilarutkan
dalam DMSO dengan konsentrasi akhir 200 µg/mL di dalam 96-microwell plate.
Konsentrasi akhir DMSO dalam wellplate tidak lebih dari 2%. Sampel sebanyak 1
µL dicampurkan dengan dapar (44 µL) dan enzim (5 µL) pada setiap sumuran.
Sebanyak 2 µL inhibitor NNGH (2mM) dipipet dan dimasukkan ke dalam
sumuran lainnya dan ditambahkan 5 µL enzim MMP-9 dan 43 µL dapar sebagai
kontrol positif. Kemudian sebanyak 5 µL enzim MMP-9 dipipet dan dimasukkan
ke dalam sumuran lainnya dan ditambahkan 45 µL dapar sebagai kontrol negatif.
Dapar dipipet sebanyak 100 µL dan dimasukkan ke dalam sumuran lainnya
sebagai blanko. Kemudian diinkubasi pada suhu 37°C selama 30 menit. Setelah
inkubasi selesai, masing-masing sumuran ditambahkan dengan 50 µL larutan

4

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

substrat dan diinkubasi kembali pada suhu 37°C selama 60 menit. Rancangan
microwell plate secara lengkap dapat dilihat pada Lampiran 11.
Setelah inkubasi selesai, fluorosensi dari masing-masing sumuran dibaca
dengan menggunakan Tecan Infinite 200 Pro Microplate Reader pada panjang
gelombang eksitasi 325 nm dan panjang gelombang emisi 393 nm. Hasil
fluorosensi senyawa sampel, kontrol positif, dan kontrol negatif dikurangi dengan
blanko dan akan didapatkan persentase aktivitas enzim dengan rumus
(

x 100%).

Persentase penghambatan enzim

MMP-9 didapatkan dengan rumus (100% - persentase aktivitas enzim (%)). Pada
perhitungan IC50, dibuat seri larutan dengan 4 konsentrasi 50 µg/mL, 100 µg/mL,
200 µg/mL, dan 300 µg/mL. IC50 dihitung dengan menggunakan persamaan nonregresi linier polinomial y = ax2 + bx + c yang didapatkan dari kurva hasil
pengukuran seri larutan.
HASIL DAN PEMBAHASAN
Sintesis Senyawa Turunan Arilamida-5
Senyawa turunan arilamida-5 disintesis dengan mengadaptasi farmakofor
berupa cincin arilamida dengan perpanjangan rantai alkil. Pada posisi para cincin
arilamida ditambahkan gugus sulfonamid-4-metilpirimidin yang bertujuan untuk
mengeksplorasi fungsi gugus -OCF2 pada Compound 2 berdasarkan karakternya
yang bersifat penarik elektron sekaligus pendonor elektron. Pada penelitian ini,
kedua karakter tersebut diwakili oleh gugus sulfonamid-4-metilpirimidin sehingga
diharapkan memiliki kontribusi dalam aktivitas penghambatan terhadap MMP-9 .
Dalam tahap sintesis senyawa turunan arilamida-5, berlangsung reaksi
substitusi nukleofilik asil (SNA) antara sulfamerazin sebagai nukleofil karena
memiliki amina primer dan 3-bromopropionil klorida yang memiliki gugus asil
dengan menggunakan katalisator piridin yang berfungsi untuk mempercepat
reaksi. Piridin akan mensubstitusi gugus klorida, karena gugus klorida masih
bersifat elektronegatif yang terikat kuat dengan C karbonil yang bersifat
elektropositif dengan membentuk 3-bromopropionil piridin. Piridin sebagai gugus
pergi sangat reaktif, karena N positif cenderung tolak-menolak dengan C karbonil

5

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

yang elektropositif, sehingga amina primer dari sulfamerazin akan lebih mudah
menyerang. Gugus amida dapat disintesis melalui beberapa metode, salah ssatunya
dengan mereaksikan amina primer dengan asil klorida sehingga Cl pada C
karbonil akan tersubstitusi oleh amina. Reaksi SNA berlangsung ketika nu
nukleofil
(amina primer (-NH2) yang memiliki pasangan elektron bebas dari sulfamerazin)
menyerang
ang C karbonil pada 3-bromopropionil piridin dan gugus piridin akan lepas
sebagai gugus pergi yang menghasilkan senyawa turunan arilamida
arilamida-5 (Koltunov
et al., 2016). Mekanisme reaksinya ditunjukkan pada Gambar 2.

Gambar 2. Mekanisme reaksi substitusi nukleofilik asil (SNA) antara
sulfamerazin dan 3-bromopropionil
3 bromopropionil klorida menggunakan katalisator piridin
Uji Pendahuluan
Produk awal sintesis yang dihasilkan berupa semisolid berwarna kuning.
Produk masih berada dalam pH asam, karena produk samping yang dihasilkan
berupa asam klorida (HCl).
(HCl). HCl dapat menghidrolisis gugus C karbonil pada
cincin arilamida, sehingga perlu dinetralkan dengan Na2CO3 10% dengan
membentuk NaCl, H2O, dan CO2 yang dapat dicuci dengan akuades. Senyawa
kemudian dikeringkan dan menjadi serbuk berwarna kuning seperti ditunjukkan
pada Gambar 3. Serbuk sulfamerazin berwarna putih dan serbuk senyawa turunan
arilamida-55 berwarna kuning, sehingga sintesis dinyatakan telah berhasil
dilakukan. Perubahan warna antara hasil sintesis dengan bahan awal disebabkan
oleh perpanjangan kromofor (ikatan rangkap yang terkonjugasi) sehingga menjadi
berwarna.

6

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

(a)

(b)

Gambar 3. Produk hasil sintesis senyawa turunan arilamida-5 setelah dilakukan
proses penetralan pH dan pengeringan (a) dan sulfamerazin (b)
Senyawa hasil sintesis diuji dengan DAB-HCl untuk identifikasi awal
bahwa senyawa turunan arilamida-5 telah berhasil disintesis. Senyawa yang
mengandung gugus amina primer akan bereaksi dengan DAB-HCl untuk
membentuk basa Schiff yang berwarna jingga, sedangkan jika senyawa amina
primer sudah tersubstitusi, maka tidak dapat bereaksi dengan DAB-HCl
(Adegoke, 2011). Senyawa turunan arilamida-5 tidak menghasilkan basa Schiff
jingga karena gugus amina primernya sudah tersubstitusi. Senyawa hasil sintesis
sudah berwarna kuning sehingga perubahan intensitas warnanya tidak terlalu
tampak ketika ditambahkan DAB-HCl. Hal ini telah berbeda dengan sulfamerazin
yang berwarna jingga ketika bereaksi dengan DAB-HCl sehingga untuk sementara
dapat disimpulkan produk sintesis sudah terbentuk. Mekanisme reaksi DAB-HCl
dengan sulfamerazin ditunjukkan pada Lampiran 2 dan hasil reaksinya berupa
produk berwarna jingga ditunjukkan pada Lampiran 3.
Pengujian dilanjutkan dengan KLT untuk melihat bahwa senyawa baru
telah terbentuk beserta kemurniannya. Gambar 4 merupakan profil KLT dengan
fase gerak n-heksana : etil asetat (1:3) yang menunjukkan bahwa senyawa hasil
sintesis mempunyai noda yang berbeda dari bahan baku yang digunakan untuk
sintesis (sulfamerazin). Hal tersebut juga ditunjukkan dengan nilai Rf (Retention
Factor) yang berbeda antara sulfamerazin dengan 0,51 dan senyawa hasil sintesis
dengan 0,55. Perbedaan Rf antara sulfamerazin dan senyawa hasil sintesis sebesar
0,04 disebabkan oleh kemiripan polaritas dari kedua sampel. Pada senyawa hasil
sintesis meskipun terjadi penambahan gugus etilen yang bersifat non polar namun
diimbangi dengan C karbonil dan atom Br yang bersifat polar.
7

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

Hasil rendemen dari senyawa turunan arilamida-5 yang terbentuk adalah
sebanyak 67,13%. Perhitungan rendemen ditunjukkan pada Lampiran 4.
Rendemen yang dihasilkan sudah lebih dari 50% namun masih dapat dioptimasi
dengan cara melakukan variasi metode sintesis seperti mol reaktan, suhu reaksi,
dan waktu pengadukan pada penelitian selanjutnya.

Rf= 0,55

B

A

Rf= 0,51

Gambar 4. Hasil KLT sintesis senyawa turunan arilamida-5 yang menunjukkan 2
noda yang berbeda, yaitu sulfamerazin (A) dan senyawa turunan arilamida-5 (B)
Setelah diperoleh senyawa turunan arilamida-5, produk diuji titik
leburnya yang bertujuan untuk mengetahui titik lebur senyawa hasil sintesis dan
mendukung kualitas kemurniannya. Hasil yang diperoleh menunjukkan bahwa
titik lebur produk hasil sintesis adalah 193-200ºC yang sudah berbeda dengan
sulfamerazin yang memiliki titik lebur 234-238ºC (O’Neil et al., 2001). Sehingga
dapat disimpulkan bahwa produk hasil sintesis berbeda dari senyawa awalnya
yang dilihat dari perbedaaan jarak leburnya. Suatu senyawa dinyatakan murni jika
jarak leburnya adalah 0,5-1,5ºC (Mohrig et al., 2014). Jarak lebur produk hasil
sintesis adalah sebesar 7ºC, sehingga dapat disimpulkan bahwa masih terdapat
impurities pada produk hasil sintesis. Hal ini disebabkan karena tidak dilakukan
proses pemurnian kembali untuk mendapatkan senyawa hasil sintesis yang murni.
Selain organoleptis, uji warna, dan titik lebur juga dilakukan uji kelarutan
senyawa, terutama untuk kepentingan pengujian secara spektroskopi. Uji
kelarutan senyawa turunan arilamida-5 ditunjukkan pada Tabel I. Dari hasil uji
kelarutan, senyawa turunan arilamida-5 bersifat semipolar karena larut dalam
pelarut semipolar, seperti DMSO.

8

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

Tabel I. Hasil uji kelarutan senyawa turunan arilamida-5
Pelarut
Senyawa Turunan Arilamida-5
n-heksana
tidak larut
Kloroform
tidak larut
Etil asetat
tidak larut
Aseton
agak sukar larut (1:80)
Etanol
tidak larut
Air
tidak larut
DMSO
larut (1:20)
Elusidasi Struktur Terhadap Senyawa Turunan Arilamida-5
Spektrofotometri Inframerah
Elusidasi struktur yang dilakukan dengan menggunakan spektrofotometri
inframerah (IR) bertujuan untuk mengidentifikasi keberadaan gugus-gugus
fungsional pada senyawa hasil sintesis. Gugus fungsional dengan momen dipol
yang tinggi sangat efektif dalam menyerap radiasi IR, sehingga menyebabkan
ikatannya bervibrasi secara mengulur (stretching) maupun menekuk (bending)
(Supratman, 2010).
Hasil elusidasi struktur senyawa turunan arilamida-5 dan keberadaan
gugus-gugus

fungsionalnya

dengan

menggunakan

spektrofotometri

IR

ditunjukkan pada Gambar 5. Berdasarkan spektrum yang dihasilkan, terdapat pita
pada daerah dengan bilangan gelombang (ῡ) 1500 cm-1 yang menunjukkan gugus
karbonil (C=O). Gugus karbonil tersebut diprediksi sebagai gugus C=O amida
pada daerah dengan ῡ 1597 cm-1. Keberadaan gugus amida tersebut juga diperkuat
dengan adanya pita yang melebar pada daerah dengan ῡ 3387–3479 cm-1 yang
diduga sebagai gugus -NH amida. Senyawa turunan arilamida-5 diprediksi telah
terbentuk dengan dukungan pada daerah sidik jari dengan ῡ 500-1500 cm-1 yang
berbeda dengan daerah sidik jari sulfamerazin sebagai starting material yang
ditunjukkan pada Gambar 6. Pada spektrum IR sulfamerazin tidak dijumpai pita
ulur tajam pada daerah dengan ῡ 1500 cm-1. Pada daerah dengan bilangan
gelombang 3300 cm-1, pita gugus NH terlihat sebagai pita kembar yang tidak
melebar, hal ini dikarenakan gugus amina pada sulfamerazin tidak tersubstitusi
(Vollhardt dan Schore, 2014). Hasil ini menandakan bahwa produk hasil sintesis
sudah sesuai pada aspek gugus fungsionalnya.
9

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

Daerah sidik jari

Gambar 5. Spektrum IR senyawa turunan arilamida-5
Daerah sidik jari

Gambar 6. Spektrum IR sulfamerazin (diadaptasi dari Prajapat et al., 2018)
Spektrometri Resonansi Magnetik Inti 1H dan 13C
Berdasarkan hasil uji kelarutan, senyawa turunan arilamida-5 larut dalam
dimetilsufoksida (DMSO), sehingga digunakan DMSO-d6 sebagai pelarut pada
pengujian dengan spektrometri resonansi magnetik inti 1H dan

13

C. Elusidasi

struktur yang dilakukan dengan menggunakan spektrometri resonansi magnetik
inti 1H dan

13

C bertujuan untuk mengetahui kerangka hidrokarbon dari senyawa

hasil sintesis (Supratman, 2010). Spektrum resonansi magnetik inti 1H senyawa
turunan arilamida-5 ditunjukkan pada Gambar 7.
Sinyal pada geseran kimia 2,00–3,00 ppm merupakan daerah proton alkil
(Vollhardt dan Schore, 2014). Sinyal pada geseran kimia 2,31 ppm (integrasi= 3)
menunjukkan sinyal dari proton HG. Proton HG merupakan proton rantai alkil
10

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

yang berada pada gugus metil yang berdekatan dengan cincin pirimidin. Sinyal
pada geseran kimia 2,31 ppm menunjukkan sinyal singlet (tunggal). Hal ini telah
sesuai dengan teori, karena tidak memiliki proton tetangga dalam lingkungan
kimia yang berbeda.
Sinyal pada geseran kimia 3,72 ppm (integrasi= 2) (J= 6,3 Hz) dan 3,87
ppm (integrasi= 2) (J= 6,3 Hz) menunjukkan sinyal dari proton HA, sedangkan
sinyal yang terdapat pada geseran kimia 2,85 ppm (integrasi= 2) (J= 7 Hz) dan
2,98 ppm (integrasi= 2) (J= 7 Hz) menunjukkan sinyal dari proton HB. Dengan
munculnya set proton HA dan HB yang merupakan rantai etilen, menegaskan
bahwa senyawa turunan arilamida-5 telah terbentuk. Proton HA merupakan proton
pada rantai etilen yang berdekatan dengan atom halogen (Br), sedangkan proton
HB merupakan proton pada rantai etilen yang berdekatan dengan gugus karbonil.
Proton HA terdapat pada geseran kimia yang lebih jauh daripada proton HB,
karena berdekatan dengan atom Br yang bersifat lebih elektronegatif
dibandingkan dengan gugus karbonil pada amida sehingga proton HA kurang
terlindungi dari medan magnet luar (de-shielded). Kedua sinyal tersebut
seharusnya menunjukkan pola splitting masing-masing satu triplet, karena kedua
set proton tersebut memiliki jumlah proton yang tidak ekuivalen secara magnetik
sebanyak dua. Namun hasil penelitian menunjukkan adanya dua sinyal triplet
pada jarak yang berdekatan untuk masing-masing proton HA dan HB. Hal ini
kemungkinan disebabkan oleh efek ikatan tunggal pada rantai etilen bersifat
rotatable, sehingga pada sudut tertentu proton yang terikat pada atom C yang
sama dapat memiliki lingkungan kimia yang berbeda. Hal ini menyebabkan setiap
proton mengenali tetangganya sebanyak dua kali sehingga muncul dua sinyal
triplet. Fenomena ini dipastikan dengan jumlah integrasi dua triplet tersebut
sebanding dengan dua proton. Nilai J coupling constant untuk kedua sinyal triplet
tersebut adalah 6,3 dan 7 Hz, yang menunjukkan bahwa kedua set proton tersebut
bertetangga secara langsung. Perbesaran spektrum proton HA dan HB ditunjukkan
pada Lampiran 5 dan 6.
Sinyal pada geseran kimia 7,00–8,00 ppm merupakan daerah proton
aromatik (Vollhardt dan Schore, 2014). Pada geseran kimia tersebut ditemukan 4
11

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

sinyal yang berbeda, yaitu pada 7,62 ppm (integrasi= 1) (J= 8,4 Hz); 7,76 ppm
(integrasi= 2) (J= 8,4 Hz); 7,93 ppm (integrasi= 2) (J= 9,1 Hz); dan 8,31 ppm
(integrasi= 1) (J= 5,6 dan 6,3 Hz).
Sinyal pada geseran kimia 7,76 ppm menunjukkan proton HC, sedangkan
sinyal pada geseran kimia 7,93 ppm merupakan proton HD. Proton HC dan HD
merupakan proton yang berada pada gugus benzena cincin arilamida. Proton HC
lebih terlindungi (shielded) dibandingkan dengan proton HD, karena proton HC
berada pada lingkungan kimia yang berdekatan dengan gugus NH yang memiliki
karakter EWG yang lebih lemah dibandingkan dengan gugus O=S=O yang
berdekatan dengan proton HD. Sinyal pada geseran kimia 7,76 ppm dan 7,93 ppm
menunjukkan sinyal doublet. Hal ini telah sesuai dengan teori, karena memiliki
satu proton tetangga dalam lingkungan kimia yang berbeda. Perbesaran spektrum
proton HC dan HD ditunjukkan pada Lampiran 7.
Sinyal pada geseran kimia 7,62 ppm menunjukkan proton HF, sedangkan
sinyal pada geseran kimia 8,31 ppm merupakan proton HE. Proton HF dan HE
merupakan proton yang berada pada cincin pirimidin. Proton HF terletak pada
posisi para dari gugus sulfonamida sehingga lebih terlindungi dari medan magnet
luar (shielded). Sementara itu, proton HE kurang terlindungi dari medan magnet
luar (de-shielded) dibandingkan dengan proton HF, karena terletak pada posisi
meta dari gugus sulfonamida. Sinyal pada geseran kimia 7,62 ppm menunjukkan
sinyal doublet. Hal ini telah sesuai dengan teori, karena memiliki satu proton
tetangga dalam lingkungan kimia yang berbeda. Sinyal pada geseran kimia 8,31
ppm menunjukkan sinyal triplet. Hal ini tidak sesuai dengan teori yang
seharusnya muncul sebagai sinyal doublet, karena memiliki satu proton tetangga
dalam lingkungan kimia yang berbeda. Namun, fenomena ini mungkin terjadi
disebabkan oleh long range coupling. Fenomena ini muncul, karena antara proton
HE dan salah satu atom H pada HG terhubung oleh rantai hidrokarbon yang
membentuk seperti huruf ‘W’, sehingga jaraknya semakin mendekat dan dapat
merasakan proton tetangga yang jauh. Proton ini muncul sebagai triplet, karena
bisa merasakan dua proton tetangga yang berasal dari HF dan HG (Dona et al.,
2016). Perbesaran spektrum proton HE dan HF ditunjukkan pada Lampiran 8.
12

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

Gambar 7. Spektrum resonansi magnetik inti 1H senyawa turunan arilamida-5
Spektrometri resonansi magnetik inti

13

C hanya dapat digunakan untuk

mengindikasikan pergeseran kimia dan tidak mengindikasikan pola splitting,
integrasi, dan J coupling constant. Hal ini disebabkan karena 13C memiliki momen
magnetik yang rendah yaitu 67,28% radians/Tesla. Selain itu, kelimpahan

13

C di

alam sangat rendah, yaitu sebesar 1,08% sehingga menyebabkan pola splitting dan
integrasi menjadi tidak spesifik (Pavia et al., 2015). Spektrum resonansi magnetik
inti 13C senyawa turunan arilamida-5 ditunjukkan pada Gambar 8.
Menurut tabel geseran kimia untuk spektrometri resonansi magnetik inti
13

C, rantai alkil berada pada rentang geseran kimia 10,0-60,0 ppm (Vollhardt dan

Schore, 2014). Atom CM berada pada geseran kimia 22,8 ppm yang menunjukkan
atom C pada alkil yang berdekatan dengan cincin pirimidin. Atom CB berada pada
geseran kimia 28,3 ppm yang menunjukkan atom C yang berdekatan dengan
gugus karbonil pada amida, sedangkan atom CA berada pada geseran kimia 39,4
ppm yang menunjukkan atom C yang berdekatan dengan atom Br yang bersifat
elektronegatif dibandingkan dengan gugus karbonil pada amida sehingga kurang
terlindungi dari medan magnet luar (de-shielded).
Pada gugus benzena yang tersubstitusi, geseran kimia berada pada
rentang 100,0-160,0 ppm (Vollhardt dan Schore, 2014). Atom CD, CE, CF, dan CG

13

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

merupakan atom C yang terletak pada gugus benzena cincin arilamida. Atom CE
berada pada geseran kimia 111,4 ppm, sedangkan atom CF pada 127,2 ppm. Atom
CF kurang terlindungi dibandingkan dengan atom CE, karena atom CF terletak
berdekatan dengan gugus O=S=O yang memiliki karakter EWG yang lebih kuat
daripada gugus NH yang berdekatan dengan atom CE. Atom CD berada pada
geseran kimia 129,4 ppm, sedangkan atom CG pada 168,1 ppm. Atom CG kurang
terlindungi dibandingkan dengan atom CD, hal ini juga disebabkan karena atom
CG berdekatan dengan gugus O=S=O yang memiliki karakter EWG yang lebih
kuat daripada gugus NH yang berdekatan dengan atom CD.
Pada cincin pirimidin, terdapat atom CI, CJ, CK, dan CL yang berada pada
geseran kimia 156,3 ppm; 142,1 ppm; 117,6 ppm; dan 128,5 ppm secara berturutturut. Atom CK paling terlindungi (shielded) dibandingkan dengan ketiga atom C
lainnya pada cincin pirimidin, karena atom CK tidak berdekatan dengan atom
elektronegatif. Atom CL berikatan dengan atom N yang bersifat elektronegatif dan
gugus metil, sehingga lebih terlindungi dibandingkan dengan atom CJ yang
berikatan dengan atom N dan atom H. Hal ini disebabkan, karena gugus metil
bersifat EDG dibandingkan dengan atom H. Atom CI paling tidak terlindungi (deshielded), karena atom CI berikatan dengan atom N heterosiklik yang bersifat
EWG.
C karbonil (C=O) amida berada pada rentang geseran kimia 150,0-180,0
ppm (Silverstein et al., 2005). Hasil elusidasi struktur menunjukkan bahwa atom
C pada amida berada pada geseran kimia 168,3 ppm yaitu atom CC sehingga telah
sesuai dengan teori.
Berdasarkan hasil elusidasi struktur dengan menggunakan spektrometri
resonansi magnetik inti

1

H dan

13

C, dapat disimpulkan bahwa struktur

hidrokarbon produk hasil sintesis telah sesuai dengan struktur senyawa turunan
arilamida-5.

14

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

Gambar 8. Spektrum resonansi magnetik inti 13C senyawa turunan arilamida-5
Kromatografi Gas-Spektrometri Massa
Elusidasi struktur dengan kromatografi gas-spektrometri massa bertujuan
untuk mengetahui bobot molekul senyawa hasil sintesis. Kromatografi gas dapat
dilakukan pada senyawa hasil sintesis, karena berdasarkan hasil dari uji titik lebur
menunjukkan titik lebur senyawa hasil sintesis 1,5°C) yang menunjukkan bahwa masih terdapat impurities pada produk hasil
sintesis, namun dengan kemurnian setidaknya 80% senyawa masih dapat dibaca
spektra massanya (Triono, 2007). Pada penelitian selanjutnya, disarankan untuk
melakukan pemurnian lebih lanjut. Puncak C pada waktu retensi 37 menit
merupakan puncak tertinggi yang menunjukkan bahwa puncak tersebut adalah

15

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

senyawa turunan arilamida-5,
arilamida karena memiliki intensitas relatif yang paling tinggi.
Kromatogram dari produk hasil si
sintesis
ntesis ditunjukkan pada Gambar 99.
C

A

B

Gambar 9. Kromatogram hasil kromatografi gas senyawa turunan arilamida
arilamida-5
dengan intensitas relatif A (15%), B (22,5%), dan C (62,5
62,5%)
Bobot molekul dari puncak yang terpisah akan dideteksi dengan
spektrometer massa yang menunjukkan massa relatif per ion (m/z) terbesar adalah
334. Bobot molekul utuh produk hasil sintesis seharusnya adalah 399. Kehilangan
massa relatif per ion sebesar 65 diduga akibat fenomena fragmentasi SO2.
sulfonamida
Fenomena yang unik dari setiap senyawa yang memiliki gugus sulfonamid
adalah selalu terjadi proses fragmentasi SO2 diikuti dengan penataan ulang gugus
amina pada sulfonamida yang terikat pada posisi para dari benzena setelah SO2
terlepas sebagai m/z 65 (Sun et al.,., 2008). Mekanisme fragmentasi dan penataan
ulang ini dapat dilihat
ilihat pada Lampiran 9.. Fragmen yang tertinggi ((base peak)
menunjukkan fragmentasi yang paling banyak te
terjadi dan stabil yang muncul pada
massa relatif per ion sebesar 55. Mekanisme fragmentasi yang menghasilkan base
peak dapat dilihat pada Lampiran 10.

Gambar 10.
arilamida-5
10 Spektrum massa senyawa turunan arilamida

16

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

Secara keseluruhan berdasarkan hasil elusidasi struktur dengan
spektrofotometri inframerah, spektrometri resonansi magnetik inti 1H dan 13C, dan
kromatografi gas-spektrometer massa dapat disimpulkan bahwa produk hasil
sintesis dipastikan strukturnya sebagai senyawa turunan arilamida-5.
Uji Aktivitas In Vitro Terhadap Enzim MMP-9
Setelah senyawa turunan arilamida-5 berhasil disintesis, dilakukan uji
aktivitas in vitro untuk melihat aktivitas penghambatannya terhadap enzim MMP9. Enzim MMP-9 merupakan suatu protease, sehingga dapat memotong ikatan
peptida pada substrat melalui aktivitas proteolisis. Substrat yang digunakan dalam
pengujian merupakan suatu peptida yang terikat dengan gugus fluorofor. Enzim
MMP-9 akan memotong ikatan peptida pada substrat, sehingga fluorofor akan
terlepas dan terbaca fluorosensinya ketika dilakukan pengukuran dengan
menggunakan spektrofluorometer pada panjang gelombang 325/393 nm yang
menunjukkan aktivitas enzim. Semakin tinggi fluorosensi yang terbaca
menunjukkan semakin tinggi pula aktivitas enzim dalam memotong ikatan peptida
pada substrat (Nicolotti, 2012).
Senyawa turunan arilamida-5 memiliki aktivitas penghambatan terhadap
enzim MMP-9 yang ditunjukkan dengan persentase penghambatan sebesar 93%
pada konsentrasi 200 µg/mL. Senyawa turunan arilamida-5 menunjukkan
persentase penghambatan lebih dari 50 %, sehingga dapat ditentukan nilai IC50nya. IC50 merupakan konsentrasi terkecil dari sampel yang dapat menghambat
aktivitas enzim sedikitnya 50%. Nilai IC50 didapatkan dengan membuat 4 seri
konsentrasi larutan, yaitu 50, 100, 200, dan 300 µg/mL. Kurva hubungan log
konsentrasi turunan arilamida-5 dengan persentase inhibisi ditunjukkan pada
Gambar 9. Kurva tersebut menunjukkan peningkatan konsentrasi sampel
proporsional terhadap persentase inhibisi enzim MMP-9. Secara statistik, korelasi
dapat dikatakan kuat karena memiliki r2 sebesar 0,989. Berdasarkan non-regresi
linier polinomial, diperoleh persamaan y = -169,6x2 + 807,6x – 878,0. y adalah
persentase inhibisi dan x adalah log konsentrasi sampel. Untuk mendapatkan nilai
IC50, angka 50 dimasukkan sebagai y sehingga diperoleh x sebagai konsentrasi
minimal yang menghambat 50% aktivitas enzim MMP-9. Menurut Zhu et al.,
17

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

(2013), spektrum aktivitas secara umum untuk aktivitas biologi dari suatu
senyawa dibagi menjadi 6 yaitu 500 µM (tidak
aktif). IC50 yang terhitung adalah 199 µM sehingga aktivitas dari senyawa turunan
arilamida-5 termasuk dalam kategori aktivitas rendah. Namun Zhu et al., (2013)
juga menyebutkaan dalam review-nya bahwa terdapat 56 publikasi penelitian yang
menyatakan bahwa IC50 100-500 µM sudah dapat dikatakan aktif untuk studi
pendahuluan seperti yang dilakukan dalam penelitian ini. Sintesis dan uji aktivitas
in vitro senyawa turunan arilamida-5 merupakan studi pendahuluan yang belum
pernah dilakukan sebelumnya. Sehingga dapat disimpulkan bahwa senyawa
turunan arilamida-5 aktif dalam menghambat enzim MMP-9 secara in vitro. Tabel
II menyajikan pengolahan data uji aktivitas in vitro arilamida-5.
Tabel II. Perhitungan %penghambatan turunan arilamida-5 terhadap MMP-9
Sampel
Reading 1
Reading 2
Reading 3
Purata
Blanko

9683

9349

9217

9416

Kontrol Negatif

32989

33687

30321

32332

Kontrol Positif

5946

5946

7898

6597

Senyawa Turunan

10903

11453

10444

10933

Arilamida-5
Sampel

Purata –

Aktivitas

Inhibisi

Blanko

Enzim (%)

Enzim (%)

Kontrol Negatif (KN)

22916

100

0

Kontrol Positif (KP)

-2819

-12

112

Senyawa Turunan Arilamida-

1517

7

93

Blanko (B)

5 (S)

18

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

Log konsentrasi

Gambar 11. Kurva hubungan log konsentrasi turunan arilamida-5 dengan
%penghambatan
KESIMPULAN
Hasil penelitian menunjukkan bahwa senyawa turunan arilamida-5 dapat
disintesis dengan mereaksikan sulfamerazin dan 3-bromopropionil klorida dengan
katalisator piridin melalui mekanisme reaksi substitusi nukleofilik asil (SNA).
Senyawa turunan arilamida-5 memiliki aktivitas penghambatan terhadap enzim
MMP-9 setelah melalui uji in vitro. Pada uji aktivitas in vitro menunjukkan
persentase penghambatan sebesar 93% pada konsentrasi 200 µg/mL dan nilai IC50
sebesar 199 µM dalam menghambat aktivitas enzim MMP-9 sedikitnya 50%.
SARAN
Berdasarkan hasil dari uji aktivitas in vitro senyawa turunan arilamida-5
dalam menghambat enzim MMP-9, dapat dilakukan penelitian lebih lanjut yaitu
uji aktivitas in vitro senyawa turunan arilamida-5 pada sel kanker payudara MDA
MB-231.
UCAPAN TERIMA KASIH
Penulis berterima kasih kepada Indonesia Toray Science Foundation
(ITSF) Periode 2017-2018 dan Divisi Penelitian & Pengembangan BEMF
Farmasi USD 2018 atas dukungan dana untuk penelitian ini.

19

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

DAFTAR PUSTAKA
Adegoke, O.A., 2011. Analytical, Biochemical, and Synthetic Applications of
Para-Dimethylaminobenzaldehyde.
International
Journal
of
Pharmaceutical Sciences Review and Research, 11 (2), 17-29.
Adhipandito, C.F., 2017. Sintesis Analog Purin (FFUSD-001) dan Studi In Silico
Terhadap Matrix Metalloproteinase-9 Hemopexin Domain sebagai
Kandidat Anti-Kanker Payudara. Skripsi. Universitas Sanata Dharma.
Arifiyanto, A., 2001. Pengaruh Penambahan Basa Natrium Hidroksida dan Piridin
dalam Sintesis Benzoilanilida. Skripsi. Universitas Sanata Dharma.
Alford, V.M., Kamath, A., Ren, X., Kumar, K., Gan, Q., Awwa, M., et al., 2017.
Targeting the Hemopexin-like Domain of Latent Matrix
Metalloproteinase-9 (proMMP-9) with a Small Molecule Inhibitor
Prevents the Formation of Focal Adhesion Junctions. ACS Chemical
Biology, 12, 1-44.
Bauvois, B., 2012. New facets of matrix metalloproteinases MMP-2 and MMP-9
as cell surface transducers: Outside-in signaling and relationship to tumor
progression. Biochimica et Biophysica Acta, 1825, 29-36.
Cathcart, J., Pulkoski-Gross, A., dan Cao, J., 2015. Targeting matrix
metalloproteinases in cancer: Bringing new life to old ideas. Genes &
Diseases, 2, 26-34.
Dirjen POM RI. 2014. Farmakope Indonesia. Edisi V. Kementerian Kesehatan
Republik Indonesia. Jakarta.
Dona, A.C., Kyriakides, M., Scottb, F., Shephardb, E.A., Varshavic, D.,
Veselkov, K., dan Everettc, J.R., 2016. A guide to the identification of
metabonomics/metabolomics experiments. Computational and Structural
Biotechnology Journal, 19.
Dufour, A., Zucker, S., Sampson, N.S., Kuscu, C., dan Cao, J., 2010. Role of
Matrix Metalloproteinase-9 Dimers in Cell Migration: Design of
Inhibitory Peptides. Journal of Bio