Characteristics and in vitro fertilization ability of cauda epididymal and ejaculated ram sperm
KARAKTERISTIK DAN KEMAMPUAN FERTILISASI IN
VITRO SPERMATOZOA DOMBA YANG BERASAL DARI
KAUDA EPIDIDIMIS DAN EJAKULAT
FITRA AJI PAMUNGKAS
SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2012
2
PERNYATAAN MENGENAI TESIS DAN
SUMBER INFORMASI
Dengan ini saya menyatakan bahwa tesis Karakteristik dan Kemampuan
Fertilisasi In Vitro Spermatozoa Domba yang Berasal dari Kauda Epididimis dan
Ejakulat adalah karya saya dengan arahan dari komisi pembimbing dan belum
diajukan dalam bentuk apa pun kepada perguruan tinggi mana pun. Sumber
informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan maupun tidak
diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam
Daftar Pustaka di bagian akhir tesis ini.
Bogor,
Januari 2012
Fitra Aji Pamungkas
NIM. B352090031
3
ABSTRACT
FITRA AJI PAMUNGKAS. Characteristics and in vitro fertilization ability of
cauda epididymal and ejaculated ram sperm. Under direction of MOHAMAD
AGUS SETIADI and NI WAYAN KURNIANI KARJA.
The characteristic and in vitro fertilization ability of ram spermatozoa
collected from cauda epididymides was axamined. Ejaculated spermatozoa was
used as control group in this experiment. Characteristic of spermatozoa including
of percentage of progressive motility, viability, abnormalities and membrane
integrity were evaluated before and after freezing. Fertilization ability of postthawed of the spermatozoa in both group was examined based on the pronucleus
formation after in vitro fertilization of in vitro matured (IVM) oocytes. Results
from these study showed that there were no significant differences in the
characteristics between cauda epididymal and ejaculated spermatozoa before
freezing (P>0.05). After freezing, motility of ejaculated spermatozoa was higher
than epididymal spermatozoa (54.00±2.24% vs 48.00±4.47%), however the
membrane integrity of epididymal spermatozoa was higher than ejaculated
spermatozoa (75.38±9.32% vs 65.54±11.88%) (P0.05). These results
indicate that ram spermatozoa collected from cauda epididymal and then frozen
have the ability to fertilize ram ooctyes in vitro in the similar rate with ejaculated
spermatozoa. The new cryopreservation protocol and reproductive technology
describe here can enhance conservation of ram genetic resources.
Keywords : spermatozoa, cauda epididymal, ejaculate, in vitro fertilization, ram.
4
RINGKASAN
FITRA AJI PAMUNGKAS. Karakteristik dan Kemampuan Fertilisasi In Vitro
Spermatozoa Domba yang Berasal dari Kauda Epididimis dan Ejakulat.
Dibimbing oleh MOHAMAD AGUS SETIADI dan NI WAYAN KURNIANI
KARJA.
Materi genetik baik dari hewan yang mempunyai nilai ekonomis, terancam
punah atau populasinya yang semakin sedikit maupun satwa liar bisa hilang kapan
saja oleh kematian hewan secara tak terduga, libido yang rendah maupun
gangguan saluran reproduksi. Upaya yang dapat dilakukan untuk menghindari
hilangnya materi genetik hewan secara keseluruhan adalah dengan cara
menyelamatkan materi genetik tersebut untuk dapat digunakan kembali melalui
aplikasi teknologi. Salah satu kemungkinan yang dapat dilakukan dalam rangka
pelestarian plasma nutfah dari gamet jantan yaitu melalui penyelamatan dan
pemanfaatan spermatozoa dari kauda epididimis setelah kematian hewan
(postmortem). Bertolak dari hal tersebut maka penelitian ini dilakukan untuk
mengetahui karakteristik spermatozoa dari kauda epididimis domba dan
kemampuannya untuk memfertilisasi oosit secara in vitro setelah dibekukan.
Spermatozoa dari ejakulat digunakan sebagai kelompok kontrol.
Pada penelitian tahap I, proses kriopreservasi spermatozoa dari kauda
epididimis dan ejakulat menggunakan medium Niwa dan Sasaki Freezing (NSF)
sebagai bahan pengencer dilakukan dengan metode two-step freezing. Komposisi
medium freezing I (NSF I) terdiri dari 20% (v/v) kuning telur, 8,8% (w/v) laktosa
dan 200 μg/ml ampicillin, sedangkan medium freezing II (NSF II) terdiri dari
92,52% (v/v) medium freezing I, 1,48% (v/v) Orvus ES Paste dan 6% (v/v)
gliserol. Karakteristik spermatozoa yang diamati meliputi persentase motilitas,
viabilitas, abnormalitas dan integritas membran dari kauda epididimis dan ejakulat
yang dievaluasi sebelum dan setelah dibekukan. Pada penelitian tahap II, oosit
hasil seleksi dimaturasi dalam Tissue Culture Medium (TCM) 199 ditambahkan
5% Fetal Bovine Serum (FBS), 2 IU/ml Pregnant Mare Serum Gonadotrophin
(PMSG), 2 IU/ml human Chorionic Gonadotrophin (hCG), 0,06 g/l penicillin dan
0,1 g/l streptomycin. Oosit matang selanjutnya di fertilisasi in vitro menggunakan
spermatozoa dari kauda epididimis domba dan ejakulat setelah pembekuan.
Penentuan tingkat kemampuan fertilisasi in vitro spermatozoa domba setelah
pembekuan dilakukan berdasarkan pembentukan dan jumlah pronukleus (PN).
Oosit yang telah mengalami fertilisasi ditandai dengan terbentuknya dua
pronukleus (jantan dan betina, 2PN) atau lebih (>2PN) dalam sitoplasma oosit.
Tingkat fertilisasi merupakan perbandingan antara jumlah oosit yang dibuahi
(membentuk dua atau lebih pronukleus) dengan jumlah keseluruhan oosit yang
difertilisasi.
Data yang diperoleh pada penelitian tahap I menunjukkan bahwa
karakteristik spermatozoa dari kauda epididimis segera setelah dikoleksi tidak
berbeda dengan spermatozoa dari ejakulat (P>0,05). Motilitas spermatozoa kauda
epididimis lebih rendah dari spermatozoa ejakulat setelah equlibrasi ke-2
(65,00±3,54% vs 72,00±4,47%) dan setelah dibekukan (post-thawing)
(48,00±4,47% vs 54,00±2,24%) (P
VITRO SPERMATOZOA DOMBA YANG BERASAL DARI
KAUDA EPIDIDIMIS DAN EJAKULAT
FITRA AJI PAMUNGKAS
SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2012
2
PERNYATAAN MENGENAI TESIS DAN
SUMBER INFORMASI
Dengan ini saya menyatakan bahwa tesis Karakteristik dan Kemampuan
Fertilisasi In Vitro Spermatozoa Domba yang Berasal dari Kauda Epididimis dan
Ejakulat adalah karya saya dengan arahan dari komisi pembimbing dan belum
diajukan dalam bentuk apa pun kepada perguruan tinggi mana pun. Sumber
informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan maupun tidak
diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam
Daftar Pustaka di bagian akhir tesis ini.
Bogor,
Januari 2012
Fitra Aji Pamungkas
NIM. B352090031
3
ABSTRACT
FITRA AJI PAMUNGKAS. Characteristics and in vitro fertilization ability of
cauda epididymal and ejaculated ram sperm. Under direction of MOHAMAD
AGUS SETIADI and NI WAYAN KURNIANI KARJA.
The characteristic and in vitro fertilization ability of ram spermatozoa
collected from cauda epididymides was axamined. Ejaculated spermatozoa was
used as control group in this experiment. Characteristic of spermatozoa including
of percentage of progressive motility, viability, abnormalities and membrane
integrity were evaluated before and after freezing. Fertilization ability of postthawed of the spermatozoa in both group was examined based on the pronucleus
formation after in vitro fertilization of in vitro matured (IVM) oocytes. Results
from these study showed that there were no significant differences in the
characteristics between cauda epididymal and ejaculated spermatozoa before
freezing (P>0.05). After freezing, motility of ejaculated spermatozoa was higher
than epididymal spermatozoa (54.00±2.24% vs 48.00±4.47%), however the
membrane integrity of epididymal spermatozoa was higher than ejaculated
spermatozoa (75.38±9.32% vs 65.54±11.88%) (P0.05). These results
indicate that ram spermatozoa collected from cauda epididymal and then frozen
have the ability to fertilize ram ooctyes in vitro in the similar rate with ejaculated
spermatozoa. The new cryopreservation protocol and reproductive technology
describe here can enhance conservation of ram genetic resources.
Keywords : spermatozoa, cauda epididymal, ejaculate, in vitro fertilization, ram.
4
RINGKASAN
FITRA AJI PAMUNGKAS. Karakteristik dan Kemampuan Fertilisasi In Vitro
Spermatozoa Domba yang Berasal dari Kauda Epididimis dan Ejakulat.
Dibimbing oleh MOHAMAD AGUS SETIADI dan NI WAYAN KURNIANI
KARJA.
Materi genetik baik dari hewan yang mempunyai nilai ekonomis, terancam
punah atau populasinya yang semakin sedikit maupun satwa liar bisa hilang kapan
saja oleh kematian hewan secara tak terduga, libido yang rendah maupun
gangguan saluran reproduksi. Upaya yang dapat dilakukan untuk menghindari
hilangnya materi genetik hewan secara keseluruhan adalah dengan cara
menyelamatkan materi genetik tersebut untuk dapat digunakan kembali melalui
aplikasi teknologi. Salah satu kemungkinan yang dapat dilakukan dalam rangka
pelestarian plasma nutfah dari gamet jantan yaitu melalui penyelamatan dan
pemanfaatan spermatozoa dari kauda epididimis setelah kematian hewan
(postmortem). Bertolak dari hal tersebut maka penelitian ini dilakukan untuk
mengetahui karakteristik spermatozoa dari kauda epididimis domba dan
kemampuannya untuk memfertilisasi oosit secara in vitro setelah dibekukan.
Spermatozoa dari ejakulat digunakan sebagai kelompok kontrol.
Pada penelitian tahap I, proses kriopreservasi spermatozoa dari kauda
epididimis dan ejakulat menggunakan medium Niwa dan Sasaki Freezing (NSF)
sebagai bahan pengencer dilakukan dengan metode two-step freezing. Komposisi
medium freezing I (NSF I) terdiri dari 20% (v/v) kuning telur, 8,8% (w/v) laktosa
dan 200 μg/ml ampicillin, sedangkan medium freezing II (NSF II) terdiri dari
92,52% (v/v) medium freezing I, 1,48% (v/v) Orvus ES Paste dan 6% (v/v)
gliserol. Karakteristik spermatozoa yang diamati meliputi persentase motilitas,
viabilitas, abnormalitas dan integritas membran dari kauda epididimis dan ejakulat
yang dievaluasi sebelum dan setelah dibekukan. Pada penelitian tahap II, oosit
hasil seleksi dimaturasi dalam Tissue Culture Medium (TCM) 199 ditambahkan
5% Fetal Bovine Serum (FBS), 2 IU/ml Pregnant Mare Serum Gonadotrophin
(PMSG), 2 IU/ml human Chorionic Gonadotrophin (hCG), 0,06 g/l penicillin dan
0,1 g/l streptomycin. Oosit matang selanjutnya di fertilisasi in vitro menggunakan
spermatozoa dari kauda epididimis domba dan ejakulat setelah pembekuan.
Penentuan tingkat kemampuan fertilisasi in vitro spermatozoa domba setelah
pembekuan dilakukan berdasarkan pembentukan dan jumlah pronukleus (PN).
Oosit yang telah mengalami fertilisasi ditandai dengan terbentuknya dua
pronukleus (jantan dan betina, 2PN) atau lebih (>2PN) dalam sitoplasma oosit.
Tingkat fertilisasi merupakan perbandingan antara jumlah oosit yang dibuahi
(membentuk dua atau lebih pronukleus) dengan jumlah keseluruhan oosit yang
difertilisasi.
Data yang diperoleh pada penelitian tahap I menunjukkan bahwa
karakteristik spermatozoa dari kauda epididimis segera setelah dikoleksi tidak
berbeda dengan spermatozoa dari ejakulat (P>0,05). Motilitas spermatozoa kauda
epididimis lebih rendah dari spermatozoa ejakulat setelah equlibrasi ke-2
(65,00±3,54% vs 72,00±4,47%) dan setelah dibekukan (post-thawing)
(48,00±4,47% vs 54,00±2,24%) (P