Analysis of genomic dna fragment involved in acid- aluminium tolerance in bradyrhizobium japonicum
ANALISIS FRAGMEN DNA GENOM YANG TERLIBAT
DALAM TOLERANSI ASAM-ALUMINIUM PADA
Bradyrhizobium japonicum
DINI NURDIANI
SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2006
PERNYATAAN MENGENAI TESIS DAN SUMBER
INFORMASI
Dengan ini saya menyatakan bahwa tesis Analisis Fragmen DNA Genom
yang Terlibat dalam Toleransi Asam-aluminium pada Bradyrhizobium japonicum
adalah karya saya sendiri dan belum diajukan dalam bentuk apa pun kepada
perguruan tinggi mana pun. Sumber informasi yang berasal dari atau dikutip dari
karya yang diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan
dalam teks dan dicantumkan dalam Daftar Pustaka di bagian akhir tesis ini.
Bogor, Januari 2006
Dini Nurdiani
NIM G351030021
ABSTRAK
DINI NURDIANI. Analisis Fragmen DNA Genom yang Terlibat dalam Toleransi
Asam-aluminium pada Bradyrhizobium japonicum melalui Mutagenesis dengan
Transposon. Dibimbing oleh ANJA MERYANDINI dan ARIS TRI WAHYUDI.
Bradyrhizobium japonicum merupakan salah satu spesies bakteri dari
kelompok Rhizobia yang umumnya dapat membentuk bintil akar pada tanaman
Kedelai (Glycine max). Asosiasi antara bakteri bintil akar (BBA) dengan tanaman
kelompok legum dapat menghasilkan fiksasi N2 atmosfer menjadi NH3 yang dapat
digunakan untuk pertumbuhan tanaman.
Keasaman tanah merupakan salah satu masalah yang secara signifikan
mempengaruhi produksi pertanian di banyak tempat di seluruh dunia. Penurunan
pH tanah mempengaruhi organisme tanah termasuk mikroflora. Salah satu sistem
biologi yang dipengaruhi oleh penurunan pH tanah adalah simbiosis antara BBA
dan tanaman kelompok legum. Hal ini dapat mempengaruhi hasil asosiasi antara
keduanya dalam fiksasi N2 menjadi NH3.
Beberapa galur B. japonicum telah dilaporkan memiliki toleransi yang
tinggi terhadap asam-Al, diantaranya yaitu BJ11, BJ38, dan KDR15. Adanya
galur-galur toleran tersebut dapat menjadi sumber eksplorasi materi genetik yang
berperan dalam toleransi B. japonicum pada media asam-Al, yaitu dengan
melakukan analisis gen penyandi ketahanan B. japonicum terhadap cekaman
asam-Al di lingkungannya. Penelitian ini bertujuan untuk melakukan analisis
fragmen DNA genom yang terlibat dalam toleransi B. japonicum terhadap
cekaman asam-aluminium.
Mutagenesis dengan transposon dilakukan melalui konjugasi antara
Escherichia coli S17-1 (λ pir) yang membawa pUTmini-Tn5Km1 dan B.
japonicum toleran asam-Al pada perbandingan 1:1. Frekuensi konjugasi berkisar
antara 10-8–10-6 sel/resipien dengan frekuensi konjugasi tertinggi dicapai oleh
galur BJ11 sebesar 7.1x10-6 sel/resipien pada waktu inkubasi mating 24 jam.
Mutagenesis ini menghasilkan tujuh mutan sensitif asam-Al yang tidak mampu
tumbuh pada media Ayanaba (pH 4.5 dan Al 50 µM). Salah satu mutan yaitu
AAS11.2 digunakan sebagai model analisis molekuler gen yang terlibat dalam
toleransi asam-Al. AAS11.2 dapat membentuk bintil pada tanaman siratro yang
menunjukkan gen yang terlibat dalam toleransi asam-Al tidak berhubungan
dengan nodulasi. Fragmen DNA genom yang terlibat dalam toleransi asam-Al
dari mutan AAS11.2 telah berhasil diisolasi dengan inverse PCR menghasilkan
amplikon yang berukuran 0.8 kb. Fragmen ini berhasil diklon ke dalam pGEM-T
Easy (∼3 kb) untuk memperoleh plasmid rekombinan yang didesain sebagai
pGEMT-11 (∼3.8 kb), dan disekuen. Hasil analisis sekuen menunjukkan sekuen
fragmen DNA tersebut memiliki similaritas yang tinggi dengan gen yhfK yang
menyandikan putative inner membrane protein dari Salmonella typhimurium
(79% identity dan 84% similarity, E-value= 1.0xe-100) yang berfungsi sebagai
efflux transporter.
ABSTRACT
DINI NURDIANI. Analysis of Genomic DNA Fragment Involved in AcidAluminium Tolerance in Bradyrhizobium japonicum. Under the direction of
ANJA MERYANDINI and ARIS TRI WAHYUDI.
Bradyrhizobium japonicum is one of Rhizobia species which generally
form root nodule on soybean plant (Glycine max). In association with leguminous
plant, root nodule bacteria (RNB) fix atmospheric nitrogen (N2) into NH3 which
can be used for plant growth.
Soil acidity is a significant problem affecting agricultural production in
many areas of the world. Lowering pH of the soil can affect soil organisms
including the microflora. Among the biological system affected by the decrease
in soil pH are those between RNB and leguminous plants. It could affect the
association result between them in fixing nitrogen.
In the previous work, screening indigenous B. japonicum strains which
tolerant to acid-aluminium has been reported. The potential strains were strains
BJ11, BJ38, and KDR15. These tolerant strains could become a source of genetic
material exploration which involved in acid-Al tolerance in B. japonicum.
Transposon delivery was carried out through conjugation between Escherichia
coli S17-1 (λ pir) carrying pUTmini-Tn5Km1 and acid-Al tolerant B. japonicum
at 1:1 ratio. Frequency of transconjugation was in the range of 10-8–10-6 cells per
recipients. A mutant AAS11.2 did not able to grow on the Ayanaba medium (pH
4.5) supplemented with 50 µM aluminium. AAS11.2 was able to form root
nodule on siratro plant indicating that the gene involved in acid-Al tolerance was
not related with nodulation. A 0.8 kb of the genomic DNA fragment flanking
transposon involved in acid-Al tolerance was successfully isolated by inverse
polymerase chain reaction (inverse PCR) from AAS11.2 genome. This fragment
was subsequently cloned into pGEM-T Easy (∼3 kb) to yield a recombinant
plasmid, designated as pGEMT-11 (∼3.8 kb), and sequenced. DNA sequenced
analysis revealed that the genomic DNA fragment sequence had high homology
with yhfK gene encoding putative inner membrane protein from Salmonella
typhimurium (79% identity and 84% similarity, E-value= 1.0xe-100) which
function as efflux transporter.
© Hak cipta milik Dini Nurdiani, tahun 2006
Hak cipta dilindungi
Dilarang mengutip dan memperbanyak tanpa izin tertulis dari
Institut Pertanian Bogor, sebagian atau seluruhnya dalam
bentuk apa pun, baik cetak, fotokopi, mikrofilm, dan sebagainya.
ANALISIS FRAGMEN DNA GENOM YANG TERLIBAT
DALAM TOLERANSI ASAM-ALUMINIUM PADA
Bradyrhizobium japonicum
DINI NURDIANI
Tesis
Sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
Magister Sains pada
Departemen Biologi
SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2006
Judul Tesis
Nama
NIM
: Analisis Fragmen DNA Genom yang Terlibat dalam Toleransi
Asam-aluminium pada Bradyrhizobium japonicum
: Dini Nurdiani
: G351030021
Disetujui
Komisi Pembimbing
Dr. Anja Meryandini, M.S.
Ketua
Dr. Aris Tri Wahyudi, M.Si.
Anggota
Diketahui
Ketua Program Studi Biologi
Dr. Ir. Dedy Duryadi S., DEA
Tanggal Ujian: 1 Februari 2006
Dekan Sekolah Pascasarjana
Prof. Dr. Ir. Syafrida Manuwoto, M.Sc.
Tanggal Lulus:
PRAKATA
Puji syukur penulis panjatkan kepada Allah SWT atas segala rahmat dan
karunia-Nya sehingga penulis dapat menyelesaikan karya ilmiah yang berjudul
Analisis Fragmen DNA genom yang Terlibat dalam Toleransi Asam-Aluminium
pada Bradyrhizobium japonicum. Penelitian ini dibiayai oleh Hibah Bersaing No.
XIII tahun 2005-2007.
Pada kesempatan ini penulis juga ingin mengucapkan terima kasih yang
sebesar-besarnya kepada Dr. Anja Meryandini, MS. dan Dr. Aris Tri Wahyudi,
MSi. selaku pembimbing atas saran, kritik, dan bimbingannya serta bantuan biaya
dan fasilitas bahan-bahan yang digunakan selama penelitian.
Kepada Prof. Dr. Ir. Antonius Suwanto, selaku kepala Laboratorium
Research Center for Microbial Diversity (RCMD), penulis mengucapkan terima
kasih atas fasilitas laboratorium yang diberikan terutama dalam telaah genetika
molekuler dari galur-galur mutan B. japonicum. Ucapan terima kasih juga penulis
sampaikan kepada ibu Ani Fitriani atas saran, bantuan dan kerjasamanya terutama
dalam menggunakan fasilitas di Laboratorium RCMD.
Ucapan terima kasih juga disampaikan kepada ayah, ibu, kakak-kakak dan
adik-adik, atas segala doa dan kasih sayangnya, serta kepada laboran dan temanteman di Laboratorium Mikrobiologi Rika, Elsie, Andini, Henry, Wulan, Risa,
Prima dan juga kepada teman-teman yang namanya tidak dapat disebutkan satu
persatu, atas bantuan dan kerjasamanya selama penelitian ini.
Akhir kata, penulis berharap semoga karya ilmiah ini bermanfaat.
Bogor, Januari 2006
Dini Nurdiani
RIWAYAT HIDUP
Penulis dilahirkan pada tanggal 17 Juli 1974 di Kuningan, Jawa Barat
sebagai anak kelima dari pasangan bapak Drs. H. Mahmud (alm.) dan ibu E.
Muthiah.
Tahun 1992 penulis lulus dari SMA Muhammadiyah Cirebon dan pada
tahun yang sama lulus seleksi masuk IPB melalui jalur Undangan Seleksi Masuk
IPB. Penulis memilih Jurusan Biologi, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, lulus pada tahun 1997. Sejak tahun 2000 penulis bekerja sebagai staf
pengajar di Universitas Kuningan.
Pada tahun 2003, penulis diterima pada program studi Biologi sub
program Mikrobiologi, Sekolah Pascasarjana IPB. Beasiswa pendidikan pascasarjana diperoleh dari Direktorat Pendidikan Tinggi melalui program BPPS.
DAFTAR ISI
Halaman
DAFTAR TABEL ………………………………………………………….
vi
DAFTAR GAMBAR ………………………………………………………
vii
DAFTAR LAMPIRAN …………………………………………………….
viii
PENDAHULUAN …………………………………………………………
1
TINJAUAN PUSTAKA
Bakteri Bintil Akar …………………………………………………….
Toleransi Bakteri Bintil Akar terhadap Cekaman Lingkungan Asam ...
Mutagenesis dengan Transposon pada Bakteri ………………………..
4
5
7
BAHAN DAN METODE
Waktu dan Tempat ………….…………………………………………
Metode ………………………………………………………………...
11
11
HASIL
Penentuan Resistensi terhadap Antibiotik ……………………………..
Mutagenesis dengan Transposon dan Seleksi Mutan B. japonicum
Sensitif Asam-Al ………………………………………………………
Uji Pembentukan Bintil Akar ………………………………………….
Isolasi DNA Genom Pengapit Transposon dengan Inverse PCR dan
Kloning Produk Inverse PCR ………………………………………….
Analisis Sekuen DNA Genom yang Terlibat dalam Toleransi Asam-Al
26
27
PEMBAHASAN …………………………………………………………...
29
SIMPULAN DAN SARAN ………………………………………………...
36
DAFTAR PUSTAKA ……………………………………………………...
37
LAMPIRAN ………………………………………………………………..
41
22
23
25
ANALISIS FRAGMEN DNA GENOM YANG TERLIBAT
DALAM TOLERANSI ASAM-ALUMINIUM PADA
Bradyrhizobium japonicum
DINI NURDIANI
SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2006
PERNYATAAN MENGENAI TESIS DAN SUMBER
INFORMASI
Dengan ini saya menyatakan bahwa tesis Analisis Fragmen DNA Genom
yang Terlibat dalam Toleransi Asam-aluminium pada Bradyrhizobium japonicum
adalah karya saya sendiri dan belum diajukan dalam bentuk apa pun kepada
perguruan tinggi mana pun. Sumber informasi yang berasal dari atau dikutip dari
karya yang diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan
dalam teks dan dicantumkan dalam Daftar Pustaka di bagian akhir tesis ini.
Bogor, Januari 2006
Dini Nurdiani
NIM G351030021
ABSTRAK
DINI NURDIANI. Analisis Fragmen DNA Genom yang Terlibat dalam Toleransi
Asam-aluminium pada Bradyrhizobium japonicum melalui Mutagenesis dengan
Transposon. Dibimbing oleh ANJA MERYANDINI dan ARIS TRI WAHYUDI.
Bradyrhizobium japonicum merupakan salah satu spesies bakteri dari
kelompok Rhizobia yang umumnya dapat membentuk bintil akar pada tanaman
Kedelai (Glycine max). Asosiasi antara bakteri bintil akar (BBA) dengan tanaman
kelompok legum dapat menghasilkan fiksasi N2 atmosfer menjadi NH3 yang dapat
digunakan untuk pertumbuhan tanaman.
Keasaman tanah merupakan salah satu masalah yang secara signifikan
mempengaruhi produksi pertanian di banyak tempat di seluruh dunia. Penurunan
pH tanah mempengaruhi organisme tanah termasuk mikroflora. Salah satu sistem
biologi yang dipengaruhi oleh penurunan pH tanah adalah simbiosis antara BBA
dan tanaman kelompok legum. Hal ini dapat mempengaruhi hasil asosiasi antara
keduanya dalam fiksasi N2 menjadi NH3.
Beberapa galur B. japonicum telah dilaporkan memiliki toleransi yang
tinggi terhadap asam-Al, diantaranya yaitu BJ11, BJ38, dan KDR15. Adanya
galur-galur toleran tersebut dapat menjadi sumber eksplorasi materi genetik yang
berperan dalam toleransi B. japonicum pada media asam-Al, yaitu dengan
melakukan analisis gen penyandi ketahanan B. japonicum terhadap cekaman
asam-Al di lingkungannya. Penelitian ini bertujuan untuk melakukan analisis
fragmen DNA genom yang terlibat dalam toleransi B. japonicum terhadap
cekaman asam-aluminium.
Mutagenesis dengan transposon dilakukan melalui konjugasi antara
Escherichia coli S17-1 (λ pir) yang membawa pUTmini-Tn5Km1 dan B.
japonicum toleran asam-Al pada perbandingan 1:1. Frekuensi konjugasi berkisar
antara 10-8–10-6 sel/resipien dengan frekuensi konjugasi tertinggi dicapai oleh
galur BJ11 sebesar 7.1x10-6 sel/resipien pada waktu inkubasi mating 24 jam.
Mutagenesis ini menghasilkan tujuh mutan sensitif asam-Al yang tidak mampu
tumbuh pada media Ayanaba (pH 4.5 dan Al 50 µM). Salah satu mutan yaitu
AAS11.2 digunakan sebagai model analisis molekuler gen yang terlibat dalam
toleransi asam-Al. AAS11.2 dapat membentuk bintil pada tanaman siratro yang
menunjukkan gen yang terlibat dalam toleransi asam-Al tidak berhubungan
dengan nodulasi. Fragmen DNA genom yang terlibat dalam toleransi asam-Al
dari mutan AAS11.2 telah berhasil diisolasi dengan inverse PCR menghasilkan
amplikon yang berukuran 0.8 kb. Fragmen ini berhasil diklon ke dalam pGEM-T
Easy (∼3 kb) untuk memperoleh plasmid rekombinan yang didesain sebagai
pGEMT-11 (∼3.8 kb), dan disekuen. Hasil analisis sekuen menunjukkan sekuen
fragmen DNA tersebut memiliki similaritas yang tinggi dengan gen yhfK yang
menyandikan putative inner membrane protein dari Salmonella typhimurium
(79% identity dan 84% similarity, E-value= 1.0xe-100) yang berfungsi sebagai
efflux transporter.
ABSTRACT
DINI NURDIANI. Analysis of Genomic DNA Fragment Involved in AcidAluminium Tolerance in Bradyrhizobium japonicum. Under the direction of
ANJA MERYANDINI and ARIS TRI WAHYUDI.
Bradyrhizobium japonicum is one of Rhizobia species which generally
form root nodule on soybean plant (Glycine max). In association with leguminous
plant, root nodule bacteria (RNB) fix atmospheric nitrogen (N2) into NH3 which
can be used for plant growth.
Soil acidity is a significant problem affecting agricultural production in
many areas of the world. Lowering pH of the soil can affect soil organisms
including the microflora. Among the biological system affected by the decrease
in soil pH are those between RNB and leguminous plants. It could affect the
association result between them in fixing nitrogen.
In the previous work, screening indigenous B. japonicum strains which
tolerant to acid-aluminium has been reported. The potential strains were strains
BJ11, BJ38, and KDR15. These tolerant strains could become a source of genetic
material exploration which involved in acid-Al tolerance in B. japonicum.
Transposon delivery was carried out through conjugation between Escherichia
coli S17-1 (λ pir) carrying pUTmini-Tn5Km1 and acid-Al tolerant B. japonicum
at 1:1 ratio. Frequency of transconjugation was in the range of 10-8–10-6 cells per
recipients. A mutant AAS11.2 did not able to grow on the Ayanaba medium (pH
4.5) supplemented with 50 µM aluminium. AAS11.2 was able to form root
nodule on siratro plant indicating that the gene involved in acid-Al tolerance was
not related with nodulation. A 0.8 kb of the genomic DNA fragment flanking
transposon involved in acid-Al tolerance was successfully isolated by inverse
polymerase chain reaction (inverse PCR) from AAS11.2 genome. This fragment
was subsequently cloned into pGEM-T Easy (∼3 kb) to yield a recombinant
plasmid, designated as pGEMT-11 (∼3.8 kb), and sequenced. DNA sequenced
analysis revealed that the genomic DNA fragment sequence had high homology
with yhfK gene encoding putative inner membrane protein from Salmonella
typhimurium (79% identity and 84% similarity, E-value= 1.0xe-100) which
function as efflux transporter.
© Hak cipta milik Dini Nurdiani, tahun 2006
Hak cipta dilindungi
Dilarang mengutip dan memperbanyak tanpa izin tertulis dari
Institut Pertanian Bogor, sebagian atau seluruhnya dalam
bentuk apa pun, baik cetak, fotokopi, mikrofilm, dan sebagainya.
ANALISIS FRAGMEN DNA GENOM YANG TERLIBAT
DALAM TOLERANSI ASAM-ALUMINIUM PADA
Bradyrhizobium japonicum
DINI NURDIANI
Tesis
Sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
Magister Sains pada
Departemen Biologi
SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2006
Judul Tesis
Nama
NIM
: Analisis Fragmen DNA Genom yang Terlibat dalam Toleransi
Asam-aluminium pada Bradyrhizobium japonicum
: Dini Nurdiani
: G351030021
Disetujui
Komisi Pembimbing
Dr. Anja Meryandini, M.S.
Ketua
Dr. Aris Tri Wahyudi, M.Si.
Anggota
Diketahui
Ketua Program Studi Biologi
Dr. Ir. Dedy Duryadi S., DEA
Tanggal Ujian: 1 Februari 2006
Dekan Sekolah Pascasarjana
Prof. Dr. Ir. Syafrida Manuwoto, M.Sc.
Tanggal Lulus:
PRAKATA
Puji syukur penulis panjatkan kepada Allah SWT atas segala rahmat dan
karunia-Nya sehingga penulis dapat menyelesaikan karya ilmiah yang berjudul
Analisis Fragmen DNA genom yang Terlibat dalam Toleransi Asam-Aluminium
pada Bradyrhizobium japonicum. Penelitian ini dibiayai oleh Hibah Bersaing No.
XIII tahun 2005-2007.
Pada kesempatan ini penulis juga ingin mengucapkan terima kasih yang
sebesar-besarnya kepada Dr. Anja Meryandini, MS. dan Dr. Aris Tri Wahyudi,
MSi. selaku pembimbing atas saran, kritik, dan bimbingannya serta bantuan biaya
dan fasilitas bahan-bahan yang digunakan selama penelitian.
Kepada Prof. Dr. Ir. Antonius Suwanto, selaku kepala Laboratorium
Research Center for Microbial Diversity (RCMD), penulis mengucapkan terima
kasih atas fasilitas laboratorium yang diberikan terutama dalam telaah genetika
molekuler dari galur-galur mutan B. japonicum. Ucapan terima kasih juga penulis
sampaikan kepada ibu Ani Fitriani atas saran, bantuan dan kerjasamanya terutama
dalam menggunakan fasilitas di Laboratorium RCMD.
Ucapan terima kasih juga disampaikan kepada ayah, ibu, kakak-kakak dan
adik-adik, atas segala doa dan kasih sayangnya, serta kepada laboran dan temanteman di Laboratorium Mikrobiologi Rika, Elsie, Andini, Henry, Wulan, Risa,
Prima dan juga kepada teman-teman yang namanya tidak dapat disebutkan satu
persatu, atas bantuan dan kerjasamanya selama penelitian ini.
Akhir kata, penulis berharap semoga karya ilmiah ini bermanfaat.
Bogor, Januari 2006
Dini Nurdiani
RIWAYAT HIDUP
Penulis dilahirkan pada tanggal 17 Juli 1974 di Kuningan, Jawa Barat
sebagai anak kelima dari pasangan bapak Drs. H. Mahmud (alm.) dan ibu E.
Muthiah.
Tahun 1992 penulis lulus dari SMA Muhammadiyah Cirebon dan pada
tahun yang sama lulus seleksi masuk IPB melalui jalur Undangan Seleksi Masuk
IPB. Penulis memilih Jurusan Biologi, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, lulus pada tahun 1997. Sejak tahun 2000 penulis bekerja sebagai staf
pengajar di Universitas Kuningan.
Pada tahun 2003, penulis diterima pada program studi Biologi sub
program Mikrobiologi, Sekolah Pascasarjana IPB. Beasiswa pendidikan pascasarjana diperoleh dari Direktorat Pendidikan Tinggi melalui program BPPS.
DAFTAR ISI
Halaman
DAFTAR TABEL ………………………………………………………….
vi
DAFTAR GAMBAR ………………………………………………………
vii
DAFTAR LAMPIRAN …………………………………………………….
viii
PENDAHULUAN …………………………………………………………
1
TINJAUAN PUSTAKA
Bakteri Bintil Akar …………………………………………………….
Toleransi Bakteri Bintil Akar terhadap Cekaman Lingkungan Asam ...
Mutagenesis dengan Transposon pada Bakteri ………………………..
4
5
7
BAHAN DAN METODE
Waktu dan Tempat ………….…………………………………………
Metode ………………………………………………………………...
11
11
HASIL
Penentuan Resistensi terhadap Antibiotik ……………………………..
Mutagenesis dengan Transposon dan Seleksi Mutan B. japonicum
Sensitif Asam-Al ………………………………………………………
Uji Pembentukan Bintil Akar ………………………………………….
Isolasi DNA Genom Pengapit Transposon dengan Inverse PCR dan
Kloning Produk Inverse PCR ………………………………………….
Analisis Sekuen DNA Genom yang Terlibat dalam Toleransi Asam-Al
26
27
PEMBAHASAN …………………………………………………………...
29
SIMPULAN DAN SARAN ………………………………………………...
36
DAFTAR PUSTAKA ……………………………………………………...
37
LAMPIRAN ………………………………………………………………..
41
22
23
25
DAFTAR TABEL
Halaman
1 Pertumbuhan galur B. japonicum dan E.coli pada media agar yang
mengandung antibiotik ……………………………………………………... 22
2 Frekuensi Konjugasi pUTmini-Tn5Km1 dari E. coli S17-1 (λ pir)
ke B. japonicum pada tiga waktu inkubasi mating yang berbeda ………….. 24
3 Hasil uji pembentukan bintil akar pada tanaman siratro
(Macroptilium atropupureum) dan kedelai (Glycine max) . …………….….. 26
DAFTAR GAMBAR
Halaman
1 A) Peta plasmid pUTmini-Tn5Km1. B) transposon mini-Tn5Km1 ……
2 Mutagenesis dengan transposon dari sel E. coli S17-1 (λ pir)
(pUTmini-Tn5Km1) ke sel B. japonicum melalui proses konjugasi ……..
3 Strategi amplifikasi DNA genom pengapit transposon dengan inverse
PCR ………………………………………………………………………
4 Penampilan pertumbuhan B. japonicum toleran asam-Al galur BJ11,
KDR15, dan BJ38 pada media YMA + CR 0.0025% + rifampisin
50 µg/ml setelah inkubasi selama 8 hari pada suhu ruang ……………....
5 A) Bintil akar tanaman siratro yang terbentuk hasil inokulasi dengan B.
japonicum KDR15 (WT), dengan B) akar tanaman siratro yang terbentuk
hasil inokulasi dengan mutan AAS15.2 …………………….....................
6 A) Elektroforesis gel agarosa DNA genom pengapit transposon yang
berhasil diamplifikasi dengan inverse PCR dari genom mutan B.
japonicum sensitif asam-Al AAS11.2 (1) dan M= marker DNA 1 kb
ladder plus. B) Peta plasmid rekombinan pGEMT-11 (∼3.8 kb) ……….
7 A) Hasil Elektroforesis gel agarosa plasmid rekombinan. M= Marker
DNA 1 kb ladder plus, 1 dan 2= pGEM-T11 yang dipotong dengan
EcoRI. B) Hasil verifikasi DNA sisipan (insert) dalam plasmid
rekombinan dengan PCR pada gel agarosa 1% …………………………...
8 Hasil pensejajaran (alignment) homologi antara sekuen fragmen DNA
genom yang terlibat dalam toleransi asam-Al pada B. japonicum dengan
S. typhimurium …………………………………………………………. ..
9
13
18
23
25
27
27
28
DAFTAR LAMPIRAN
Halaman
1 Tabel komposisi media agar Ayanaba (Ayanaba et al. 1983)……..………. 42
2 Komposisi larutan hara Ahmed dan Evans yang telah dimodifikasi
(Speidel & Wollum 1980)…………………………………………………. 43
3 Komposisi larutan hara bebas N menurut Alva et al. (1988) …………….. 44
PENDAHULUAN
Latar Belakang
Kedelai merupakan sumber protein penting dan menjadi komponen utama
sejumlah makanan yang biasa dikonsumsi masyarakat Indonesia. Nilai penting
kedelai semakin meningkat dengan adanya program diversifikasi pangan dari
pemerintah untuk mencapai kecukupan dan ketahanan dalam produksi pangan.
Meskipun hasil produksi per hektar dan luasan pertanaman kedelai meningkat
secara tetap, namun total produksi kedelai tidak mampu memenuhi kebutuhan di
dalam negeri. Untuk meningkatkan produksi kedelai melalui perluasan lahan
pertanian terdapat sejumlah kendala, karena pada lahan yang baru dibuka pada
umumnya memiliki karakteristik tanah asam seperti tingginya kandungan Al dan
Mn serta rendahnya kadar fosfat dan Ca (Saleh & Sumarno 1995).
Keasaman tanah merupakan suatu masalah yang secara signifikan
mempengaruhi produksi pertanian di banyak tempat di seluruh dunia (Watkin et
al. 1997).
Penurunan pH tanah mempengaruhi organisme tanah termasuk
mikroflora. Salah satu sistem biologi yang dipengaruhi oleh penurunan pH tanah
adalah simbiosis antara bakteri bintil akar (BBA) dan tanaman kelompok legum.
Asosiasi antara keduanya menghasilkan fiksasi N2 atmosfer menjadi NH3 yang
dapat digunakan untuk pertumbuhan tanaman (Tiwari et al. 1992).
Fiksasi
nitrogen melalui simbiosis Rhizobium-legum memiliki nilai penting di bidang
pertanian karena mekanisme ini mengarah pada meningkatnya nitrogen terikat di
dalam tanah. Defisiensi nitrogen seringkali terjadi pada lahan yang kurang subur,
tetapi legum yang mengalami nodulasi dapat tumbuh dengan baik pada lahan
tersebut, sedangkan tanaman lain tidak dapat tumbuh (Madigan et al. 2003).
Kegagalan simbiosis Rhizobium-legum dalam menambat N2 pada tanah asam
dikarenakan miskinnya ketahanan hidup dan pertumbuhan dari BBA, atau
hambatan inisiasi dan pembentukan bintil akar. Faktor-faktor yang berhubungan
dengan keasaman tanah yang berperanan penting dalam kegagalan tersebut adalah
tingginya konsentrasi proton, rendahnya konsentrasi kalsium dan fosfat (Watkin et
al. 1997), serta meningkatnya konsentrasi aluminium seiring dengan menurunnya
pH tanah yang bersifat toksik terhadap BBA (Tiwari et al. 1992). Oleh karena itu
2
perluasan pemanfaatan lahan asam untuk tanaman kedelai membutuhkan
introduksi galur BBA yang toleran terhadap kondisi asam tersebut.
Bradyrhizobium japonicum merupakan salah satu spesies bakteri dari
kelompok Rhizobia yang umumnya dapat membentuk bintil akar pada tanaman
kedelai (Glycine max). pH optimum bagi pertumbuhan Bradyrhizobium berkisar
antara 6-7 (Holt et al. 1994), akan tetapi isolat dari beberapa spesies
Bradyrhizobium telah diidentifikasi memiliki kemampuan toleransi yang unggul
terhadap cekaman pada tanah seperti pH rendah dan fosfat rendah (Bottomley
1992). Pada penelitian sebelumnya telah dilakukan seleksi terhadap galur-galur
B. japonicum indigenus toleran media asam-Al dan diperoleh tiga galur toleran
dengan nomor sandi galur BJ11 (Endarini et al. 1995), BJ38 (Fitri 1995), dan
KDR15 (Imas et al. 1994). Kemampuan tumbuh dari galur toleran seperti BJ11
pada media kaldu Ayanaba (pH 4.5; Al 50 µM) menunjukkan bahwa galur
tersebut mampu mengakumulasi ammonium yang menyebabkan peningkatan pH
media. Wahyudi et al. (1998) juga melaporkan bahwa galur BJ11 merupakan
galur yang kompetitif dan berpotensi untuk dikembangkan sebagai galur
introduksi (inokulan) pada lahan asam dengan menggunakan varietas kedelai yang
juga toleran asam. Adanya galur-galur toleran tersebut dapat menjadi sumber
eksplorasi materi genetik yang berperan dalam toleransi B. japonicum pada media
asam-Al, yaitu dengan melakukan analisis gen penyandi ketahanan B. japonicum
terhadap cekaman asam-Al di lingkungannya.
Semua gen yang berperan dalam nodulasi pada Bradyrhizobium sejauh ini
diketahui berlokasi pada kromosom. Umumnya, galur Rhizobium memiliki
plasmid simbiotik yang membawa gen-gen nod, nif, dan fix. Meskipun plasmid
yang berukuran besar ditemukan pada beberapa Bradyrhizobium, namun tidak
terdapat gen simbiotik yang berlokasi pada plasmid tersebut (Barbour et al. 1992).
Bahkan berdasarkan data hasil penelitian yang dilakukan oleh Sari (1998)
dilaporkan bahwa enam galur uji B. japonicum indigenus dengan sandi galur 09,
11, 15, 33, 43, dan 45 tidak mempunyai plasmid indigenus. Untuk mempelajari
gen yang terlibat dalam toleransi B. japonicum terhadap cekaman asam-Al dapat
dilakukan isolasi dan karakterisasi dari mutan B. japonicum sensitif asam-Al
melalui mutagenesis dengan transposon.
3
Transposon adalah elemen DNA yang dapat berpindah dari satu tempat ke
tempat lain dalam suatu genom (Madigan et al. 2003).
Insersi transposon
biasanya akan menimbulkan suatu gen menjadi inaktif. Salah satu kegunaan
penting dari transposon yaitu untuk mutagenesis, karena gen yang telah disisipi
oleh transposon akan mengalami mutasi yaitu gen tersebut tidak dapat terekspresi.
Kegunaan lain dari transposon yaitu dapat memudahkan untuk memetakan secara
fisik maupun genetik dari suatu gen yang telah disisipi transposon dengan
menggunakan enzim restriksi endonuklease (Snyder & Champness 1997).
Transposon yang digunakan pada penelitian ini adalah transposon mini-Tn5Km1
yang membawa gen resistensi terhadap kanamisin yang telah dikonstruksi dalam
plasmid pUT (didesain pUTmini-Tn5Km1).
Penyisipan yang stabil pada
kromosom dapat diperoleh ketika transposon mini-Tn5 berpindah tanpa membawa
gen transposase (Herrero et al. 1990). Analisis gen dari mutan B. japonicum
sensitif asam-Al dapat dilakukan dengan cara mengisolasi fragmen DNA yang
mengapit transposon mini-Tn5 menggunakan teknik inverse PCR.
Tujuan
Penelitian ini bertujuan melakukan analisis fragmen DNA genom yang
terlibat dalam toleransi B. japonicum terhadap cekaman asam-aluminium.
TINJAUAN PUSTAKA
Bakteri Bintil Akar
Salah satu interaksi bakteri dengan tanaman yang paling penting dan
menarik adalah antara tanaman legum dan bakteri dari genus Rhizobium,
Bradyrhizobium, Shinorhizobium, Mesorhizobium dan Azorhizobium.
Legum
merupakan suatu kelompok besar tanaman yang memiliki nilai ekonomi penting
seperti kedelai, semanggi (clover), alfafa, buncis, dan kapri.
Rhizobium,
Bradyrhizobium, Shinorhizobium, Mesorhizobium dan Azorhizobium adalah
bakteri gram negatif motil yang berbentuk batang. Infeksi akar tanaman legum
oleh spesies yang cocok dengan salah satu genus tersebut mengarah pada
pembentukan bintil akar yang dapat mengubah nitrogen yang berupa gas menjadi
nitrogen terikat, dan proses ini dinamakan fiksasi nitrogen. Pada umumnya bintil
terbentuk pada akar tanaman, namun bintil juga dapat terbentuk pada batang,
misalnya pada legum tropis Sesbania yang dinodulasi oleh Azorhizobium
caulinodans. Tanaman ini tersebar di daerah tropis yang tanahnya seringkali
mengalami defisiensi nitrogen (Madigan et al. 2003).
Sekitar 90% dari seluruh spesies tanaman legum dapat mengalami
nodulasi. Namun, terdapat spesifisitas antara legum dan galur Rhizobium. Suatu
galur Rhizobium umumnya dapat menginfeksi spesies legum tertentu dan tidak
pada spesies lainnya.
Sekelompok galur Rhizobium yang dapat menginfeksi
kelompok legum yang berkerabat dinamakan kelompok inokulasi silang.
Walaupun galur Rhizobium mampu menginfeksi legum tertentu, tetapi tidak selalu
dapat menghasilkan bintil yang memfiksasi nitrogen (Madigan et al. 2003).
Genus Bradyrhizobium hanya memiliki satu tipe spesies, yaitu
Bradyrhizobium japonicum (Holt et al. 1994). Menurut Perret et al. (2000), B.
japonicum termasuk salah satu anggota famili Rhizobiaceae yang memiliki
kisaran
inang
yang
luas
seperti
pada
tanaman
anggota
kelompok
Aeschynomeneae (Papilionoideae), Arachis spp., Phaseoleae (Papilionoideae),
Macroptilium, dan Vigna spp. Namun pada umumnya B. japonicum membentuk
bintil akar pada jenis legum anggota kelompok Phaseoleae (Papilionoideae) dan
Glycine spp.
5
B. japonicum memiliki karakteristik antara lain berbentuk batang dengan
ukuran 0.5-0.9 x 1.2-3.0 µm, tidak membentuk spora, dapat membentuk granul
poly-β-hidroksibutirat, motil dengan satu flagela polar atau subpolar, dan bersifat
aerobik. Temperatur optimum pertumbuhannya berkisar antara 25-30 oC sedangkan pH optimumnya 6-7 meskipun demikian galur yang berasal dari tanah asam
dapat hidup di bawah pH optimum (Holt et al. 1994).
Toleransi Bakteri Bintil Akar terhadap Cekaman Lingkungan Asam
Simbiosis Rhizobium-legum dipengaruhi oleh penurunan pH tanah.
Penurunan pH tanah tidak hanya menimbulkan peningkatan konsentrasi proton,
tetapi juga kelarutan logam seperti aluminium yang bersifat toksik terhadap BBA.
Respon BBA terhadap tanah asam tergantung pada interaksi sejumlah faktor
diantaranya konsentrasi H+, aktivitas Al3+ dan kemampuan kompetisi dan
persistensi dari galur Rhizobium (Tiwari et al.1992).
Isolasi dan karakterisasi BBA dilakukan untuk memperoleh galur yang
toleran terhadap lingkungan asam. Adanya BBA yang toleran asam-Al menjadi
sumber eksplorasi materi genetik yang berperan dalam respon toleransi bakteri
tersebut pada lingkungan asam. Telaah molekuler dilakukan dengan menggunakan mutan yang dihasilkan melalui mutagenesis dengan transposon seperti Tn5.
Goss et al. (1990) melakukan karakterisasi mutan galur Rhizobium meliloti
WSM419 yang dihasilkan melalui mutagenesis dengan Tn5. Galur liar R. meliloti
WSM419 dapat bertahan hidup dan memiliki kemampuan nodulasi pada tanah
asam (pH 5.6). Sementara itu galur mutannya menjadi sensitif terhadap asam dan
tidak mampu tumbuh pada pH 5.6. Hal ini menunjukkan pada galur mutan telah
kehilangan kemampuan untuk memelihara pH intraselulernya (pHi).
Hasil
analisis fragmen DNA yang membawa Tn5 dan klon sekuen pengapit dari mutan
tersebut menunjukkan lokus act (untuk acid tolerance) berada pada 4.4 kb dari
fragmen yang dipotong dengan EcoRI.
Selanjutnya Tiwari et al. (1992)
melakukan karakterisasi mutan yang diinduksi dengan Tn5 dari galur-galur R.
meliloti WSM419 dan R. leguminosarum WSM710. Hasil pemetaan melalui
pemotongan dengan enzim restriksi pada WSM419 menunjukkan bahwa gen yang
berperan dalam toleransi terhadap asam berada pada empat fragmen unik hasil
6
pemotongan dengan EcoRI. Pada galur mutan yang sensitif terhadap pH media di
bawah 6.0 (TG2-6) dengan kandungan Ca 1 mM, dapat diperbaiki kemampuan
ketahanan hidupnya pada pH media 5.5 dengan penambahan Ca 50 mM. Pada
galur ini peningkatan konsentrasi Ca media dapat memperkecil penurunan pHi.
Sementara itu pada WSM710, dua gen yang berperan dalam toleransi terhadap
asam berada pada fragmen hasil pemotongan dengan EcoRI yang terpisah yaitu
pada 12 kb dan 16 kb.
Karena galur-galur R. leguminosarum lebih toleran
terhadap asam daripada WSM419, maka terdapat kemungkinan untuk transfer
materi genetik dari galur yang lebih toleran ke galur yang kurang toleran.
Analisis sekuen DNA yang terlibat dalam respon toleransi BBA terhadap
lingkungan asam telah dipelajari pada R. tropici (Ricillo et al. 2000), R.
leguminosarum bv. viciae, dan S. meliloti (Reeve et al. 2002). Hasil analisis gen
yang mengalami penyisipan oleh Tn5-luxAB pada galur mutan R. tropici
CIAT899-13T2 yang tidak mampu tumbuh pada kondisi asam, menunjukkan
similaritas yang tinggi dengan gen gsh dari E. coli yang menyandikan enzim
glutathion synthetase. Kelimpahan Kalium dan pHi pada galur mutan tersebut
lebih rendah dibandingkan tipe liarnya (Ricillo et al. 2000). Pada galur mutan R.
leguminosarum bv. viciae, dan S. meliloti yang mengalami transposisi Tn5 pada
gen actP mengalami hambatan ekspresi dari P-type ATPase yang termasuk
subfamili CPx yang berperan dalam transport logam berat. Pada mutan yang
mengalami knockout pada gen actP tersebut menunjukkan sensitivitas terhadap
Cu.
Hal ini menunjukkan adanya keterlibatan logam berat tersebut dalam
mempertahankan pH media pada kondisi asam (Reeve et al. 2002).
Selain itu ketahanan terhadap pH juga dipelajari pada E. coli yang
memiliki kemampuan adaptasi terhadap perubahan lingkungannya. E. coli dapat
tumbuh pada kisaran pH eksternal yang luas yaitu antara 5-9. Pada E. coli
homeostasis pH tergantung pada konsentrasi K+ eksternal (White et al. 1992).
Arginin dekarboksilase yang disandikan oleh gen adi mengalami induksi pada pH
asam, anaerobiosis, dan media kaya. Hasil analisis sekuen DNA yang berukuran
3 kb dari kromosom E. coli yang menyandikan arginin dekarboksilase
menunjukkan bahwa sekuen ini menyandikan protein yang terdiri atas 755 asam
amino dan berukuran 84420 Da, serta memiliki homologi dengan dekarboksilase
7
lain dari E. coli yaitu CadA (lisin dekarboksilase), SpeC (ornitin dekarboksilase
biosintetik) dan SpeF (ornitin dekarboksilase biodegradatif) (Stim & Bennet
1993).
Mutagenesis dengan Transposon pada Bakteri
Masing-masing tipe bakteri membawa transposon yang unik, berikut ini
adalah beberapa tipe transposon yang umum terdapat pada bakteri antara lain: (i)
insertion sequence elements (elemen IS), (ii) transposon komposit, dan (iii)
transposon nonkomposit (Snyder & Champness 1997).
Elemen IS adalah transposon bakteri terkecil yang biasanya hanya
berukuran 750-2000 bp dan hanya mengkode enzim transposase yang dibutuhkan
dalam transposisinya.
Elemen IS tidak membawa gen penanda seleksi dan
ditemukan hanya karena elemen ini menimbulkan inaktivasi dari gen yang
disisipinya. Pada E. coli secara alami ditemukan empat elemen IS yang berbeda
yaitu IS1, IS2, IS3, dan IS4. Sampai saat ini telah ditemukan lebih dari 700
elemen IS pada bakteri, meskipun kebanyakan dapat digolongkan dalam 20
famili.
Kadang-kadang dua elemen IS dari tipe yang sama membentuk transposon
yang lebih besar, disebut tranposon komposit dengan membawa gen lain. Contoh
tipe transposon komposit yaitu Tn5, Tn9, dan Tn10. Untuk transposon komposit
Tn5 misalnya terdiri atas gen untuk resistensi terhadap kanamisin (Kanr) dan
resistensi streptomisin (Strr) yang diapit oleh elemen IS yang disebut IS50.
Transposon komposit bukan satu-satunya tipe transposon yang membawa
gen-gen resistensi terhadap antibiotik.
Gen-gen tersebut juga dapat menjadi
bagian dari transposon nonkomposit.
Gen-gen pada transposon nonkomposit
diapit oleh suatu inverted repeat dan tipe transposon ini minimal terdiri atas satu
gen resistensi saja. Contoh transposon nonkomposit adalah Tn3 yang memiliki
gen resistensi terhadap ampisilin.
Tidak semua tipe transposon dapat digunakan untuk mutagenesis. Suatu
transposon yang digunakan dalam mutagenesis harus memiliki kelengkapan
berikut ini: (i) memiliki kemampuan untuk berpindah dengan frekuensi yang
tinggi, (ii) pemilihan sekuen targetnya tidak terlalu selektif, (iii) membawa gen
8
penanda seleksi sederhana, seperti resistensi terhadap antibiotik, dan (iv) dapat
digunakan untuk transposisi ke berbagai macam bakteri yang berbeda (broad host
range). Tn5 ideal digunakan untuk mutagenesis acak pada bakteri gram negatif
karena memiliki kelengkapan di atas.
Tn5 tidak hanya berpindah dengan
frekuensi yang relatif tinggi, tetapi juga transposon ini hampir tidak ada
spesifisitas dalam pemilihan targetnya dan mampu bertransposisi pada setiap
bakteri gram negatif. Tn5 juga membawa gen resistensi terhadap kanamisin yang
dapat terekspresi pada hampir semua bakteri gram negatif (Snyder & Champness
1997).
Pada penelitian ini digunakan transposon mini-Tn5 yang merupakan
turunan dari transposon Tn5.
Keistimewaan transposon ini adalah tidak
membawa gen transposase yang berperan dalam proses transposisinya. Untuk
proses transposisi dari mini-Tn5, gen transposase dikonstruksi pada plasmid yang
membawanya yaitu pUT (pUTmini-Tn5) (Herrero et al. 1990). Setelah mini-Tn5
mengalami transposisi (berpindah) dalam hal ini dari plasmid ke kromosom, tidak
dapat melakukan transposisi kembali karena gen transposase-nya tetap berada di
dalam plasmid pUT.
Plasmid pUT merupakan turunan dari plasmid pGP704 dan memiliki
origin of replication dari plasmid R6K yang hanya dapat dipelihara pada bakteri
penghasil π protein. Plasmid ini juga membawa origin of transfer (oriT) dari
plasmid RP4, yang dapat menghasilkan transfer yang efisien ke sel resipien dari
galur donor yang mengekspresikan fungsi konjugatif dari RP4 seperti E. coli
SM10 (λ pir). pUT membawa gen tnp*, suatu mutan gen tnp dari IS50R yang
tidak memiliki situs NotI dan menyandikan transposase yang dibutuhkan untuk
transposisi dari elemen mini-Tn5 (Lorenzo et al. 1990). Penghilangan situs NotI
tersebut tidak merubah struktur dari produk gen tnp.
Gen transposase yang
dimodifikasi (dengan menghilangkan situs NotI), dinamakan gen tnp* dan diklon
pada situs SalI dari pGP704 derivatif dengan orientasi yang dapat mengatur
proses transposisi secara optimal. Konstruksi ini dinamakan pUTKm. Plasmid
pUTKm mengendalikan donor minitransposon dengan penanda resistensi
terhadap antibiotik kanamisin (Herrero et al. 1990). Mini-Tn5 diapit oleh ujung I
dan O yang terdiri atas 19 pasang basa.
Elemen mini-Tn5 kanamisin pada
9
pUT/Km terdiri atas tiga Kmr derivatif. Dua gen resistensi kanamisin berasal dari
transposon Tn903 dengan orientasi yang berlawanan, sedangkan yang ketiga
diisolasi dari Tn5 sendiri. Salah satu ciri penting dari elemen tersebut adalah
hilangnya inhibitor transposase bersama dengan pUT setelah transposisi, sehingga
satu galur resipien dapat digunakan untuk proses insersi berulang dengan
menggunakan minitransposon yang memiliki penanda seleksi yang berbeda
(Lorenzo et al. 1990). Gambar 1 menampilkan peta plasmid pUTmini-Tn5Km1
beserta transposon mini-Tn5Km1 yang digunakan dalam penelitian ini untuk
melakukan mutagenesis dengan transposon melalui proses konjugasi.
A)
pUTmini-Tn5Km1
7.055 kb
B)
Gambar 1 (A) Peta plasmid pUTmini-Tn5Km1 (7.055 bp). (B) Transposon miniTn5Km1.
Herrero et al. (1990) melaporkan hasil insersi transposon pada kromosom
melalui proses konjugasi antara E. coli SM10(λ pir) dengan Pseudomonas putida.
Dari hasil analisis pada 8 koloni ekskonjugan menunjukkan bahwa terjadi insersi
tunggal pada masing-masing ekskonjugan, insersi transposon pada kromosom
ekskonjugan terjadi pada lokasi yang berbeda, dan gen transposase tidak terdapat
10
pada ekskonjugan. Pada penelitian ini dilakukan mutagenesis dengan transposon
mini-Tn5Km1 dari E. coli S17-1 (λ pir) ke B. japonicum toleran asam-Al melalui
proses konjugasi dan dari ekskonjugan yang diperoleh diharapkan terdapat mutan
sensitif asam-Al. Selanjutnya dari galur mutan sensitif dilakukan isolasi gen yang
terlibat dalam toleransi asam-Al pada B. japonicum.
BAHAN DAN METODE
Waktu dan Tempat
Penelitian ini dilakukan di Laboratorium Mikrobiologi dan Research
Center for Microbial Diversity (RCMD), Departemen Biologi, FMIPA, IPB dari
bulan Januari sampai dengan Nopember 2005.
Bahan
Bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah tiga galur B. japonicum
toleran asam-aluminium dengan nomor sandi galur BJ11, BJ38, dan KDR15.
Ketiga galur tersebut digunakan sebagai resipien dalam konjugasi dan Escherichia
coli S17-1 (λ pir) (pUTmini-Tn5Km1) digunakan sebagai donor dalam
mutagenesis dengan transposon. Galur E. coli DH5 α digunakan sebagai inang
dalam kloning fragmen DNA. Vektor plasmid pGEM-T Easy digunakan untuk
TA-cloning fragmen DNA genom yang terlibat dalam toleransi asam-Al.
Metode
Media dan Kondisi Pertumbuhan
E. coli DH5 α secara rutin ditumbuhkan pada media Luria Bertani broth
(LB) (tryptone 10.0 g/l, NaCl 10.0 g/l, yeast extract 5.0 g/l) tanpa antibiotik. E.
coli S17-1 λ pir (pUTmini-Tn5Km1) secara rutin ditumbuhkan pada media LB
yang mengandung ampisilin (100 µg/ml) dan kanamisin (50 µg/ml) pada suhu 37
o
C. E.coli DH5 α yang membawa plasmid rekombinan pGEM-T dikulturkan pada
media LB yang mengandung ampisilin (100 µg/ml) dan kanamisin (50 µg/ml)
pada suhu 37 oC. Galur BJ11, BJ38, dan KDR15 dikulturkan secara aerobik pada
media yeast extract mannitol agar (YMA) (manitol 10.0 g/l, K2HPO4 0.5 g/l,
MgSO4·7H2O 0.2 g/l, NaCl 0.2 g/l, yeast extract 1.0 g/l).
Penentuan Resistensi terhadap Antibiotik
Tiga galur B. japonicum yang digunakan dalam penelitian ini dengan sandi
BJ11, BJ38, dan KDR15 terlebih dahulu harus diketahui sensitivitasnya terhadap
12
beberapa antibiotik untuk menentukan penanda antibiotik yang akan dipakai
dalam seleksi transkonjugan.
Sebelum dilakukan pengujian pada media dengan antibiotik terlebih
dahulu ketiga galur tersebut diremajakan pada media agar cawan YMA selama 78 hari pada suhu ruang. Selanjutnya masing-masing biakan tersebut digoreskan
pada agar cawan YMA + Congo Red (CR) 0.0025% + antibiotik. Antibiotik yang
digunakan dalam pengujian ketiga galur tersebut yaitu ampisilin 50 µg/ml dan 100
µg/ml, kanamisin 25 µg/ml dan 50 µg/ml, rifampisin 25 µg/ml dan 50 µg/ml, serta
tetrasiklin 25 µg/ml dan 50 µg/ml. Inkubasi dilakukan pada suhu ruang selama 78 hari dan diamati pertumbuhannya.
Biakan yang tumbuh berarti resisten,
sedangkan yang tidak tumbuh berarti sensitif terhadap antibiotik yang digunakan.
Pengujian resistensi terhadap antibiotik tersebut juga dilakukan pada E. coli S17-1
(λ pir) pada media agar cawan Luria agar (LA).
Penyiapan Kultur untuk Konjugasi
Galur BJ11, BJ38, dan KDR15 masing-masing ditumbuhkan pada 50 ml
media yeast extract mannitol broth (YMB) yang ditambah Rifampisin (50 µg/ml)
dan dikocok dengan mesin pengocok (shaker) kecepatan 200 rpm pada suhu
ruang dengan waktu inkubasi 60 jam sampai sel mencapai fase logaritmik (∼108
sel/ml). Galur E. coli S17-1 (λ pir) (pUTmini-Tn5Km1) ditumbuhkan pada 25 ml
LB yang ditambah dengan kanamisin (50 µg/ml). Pengocokan dilakukan dengan
kecepatan 200 rpm pada suhu 37 oC selama 18-20 jam.
Mutagenesis dengan Transposon
Introduksi transposon mini-Tn5Km1 (pUTmini-Tn5Km1, 7055 bp)
(Gambar 1) ke dalam sel B. japonicum dilakukan melalui konjugasi. Kultur B.
japonicum dan E. coli yang telah mencapai fase logaritmik disentrifugasi dengan
kecepatan 2300 g selama 3 menit dan peletnya dicuci sebanyak tiga kali dengan
NaCl 0.85% untuk membersihkan sel dari sisa antibiotik.
Pelet sel donor
disuspensikan dalam 40 µl kaldu LB modifikasi (tryptone 5.0 g/l, NaCl 1.0 g/l,
yeast extract 5.0 g/l) dan dicampurkan dengan pelet sel resipien dengan
perbandingan yang sama (1:1) masing-masing dengan konsentrasi sekitar 108
13
sel/ml.
Campuran ini selanjutnya diletakkan di atas filter nitroselulosa steril
(ukuran pori 0.45 µm) pada media LA modifikasi. Pada media tersebut dibuat
tiga juring sehingga pada tiap juring dapat diletakkan satu buah filter, masingmasing untuk donor (D), resipien (R), dan campuran antara D dan R (M). Gambar
2 memperlihatkan diagram skematik dalam melakukan mutagenesis dengan
transposon. Mating dilakukan secara aerobik pada suhu ruang dengan tiga waktu
lama inkubasi yaitu 12, 18, dan 24 jam.
Selanjutnya filter diangkat dan
dimasukkan ke dalam tabung mikro yang berisi 1 ml garam fisiologis (NaCl
0.85%) dan divorteks. Masing-masing suspensi sel sebanyak 100 µl disebarkan
pada media YMA ditambah kanamisin (50 µg/ml) dan rifampisin (50 µg/ml).
Inkubasi dilakukan pada suhu ruang selama 5-8 hari dan dihitung frekuensi
transkonjugasinya.
E. coli S17-1 (λ pir)
B. japonicum
Gambar 2 Mutagenesis dengan transposon dari sel E. coli S17-1 (λ pir)
(pUTmini-Tn5Km1) ke sel B. japonicum melalui proses konjugasi.
14
Seleksi Mutan B. japonicum Sensitif asam-Al
Koloni transkonjugan hasil sebar yang telah tumbuh pada media YMA +
CR 0.0025% + rifampisin (50 µg/ml) + kanamisin (50 µg/ml) direplika pada
media yang sama dan diseleksi sensitivitasnya terhadap asam-Al dengan
menggunakan media agar asam-Al Ayanaba (pH 4.5 ditambah 50 µM Al) yang
komposisinya dibuat sesuai dengan komposisi Ayanaba et al. (1983) (Tabel
Lampiran 1). Transkonjugan yang tidak tumbuh pada media tersebut adalah
mutan dari B. japonicum yang sensitif asam-Al.
Uji Pembentukan Bintil Akar
Galur-galur mutan B. japonicum sensitif asam-Al hasil konjugasi, masingmasing diuji kemampuannya untuk membentuk bintil akar. Uji pembentukan
bintil akar pada tanaman siratro (Macroptilium atropupureum) menggunakan
metode tabung sedangkan untuk pembentukan bintil akar pada tanaman kedelai
(Glycine max) digunakan botol Leonard berdasarkan metode Vincent yang
dimodifikasi seperti yang telah dilaporkan Wahyudi (1998).
Uji Pembentukan Bintil Akar pada Tanaman Siratro. Biji siratro yang
telah dipilih (tidak luka, tidak keriput, tidak terapung, dan memiliki ukuran
seragam) ditoreh kulit bijinya dengan silet untuk menghilangkan masa
dormansinya. Sterilisasi permukaan biji dilakukan dengan cara merendam biji
berturut-turut dalam alkohol 95% selama 10 detik, H2O2 5% selama 5 menit, dan
dibilas dengan akuades steril sebanyak 7 kali. Biji selanjutnya dikecambahkan
dalam cawan petri berisi kertas saring steril yang telah dibasahi akuades steril.
Perkecambahan dilakukan selama 2 hari pada suhu ruang dalam keadaan gelap.
Sementara itu media agar tegak (20 ml) disiapkan dalam tabung berukuran
25x200 mm. Media agar tersebut terdiri atas larutan hara yang komposisinya
dibuat berdasarkan komposisi Ahmed & Evans (Speidel & Wollum 1980) (Tabel
Lampiran 2) yang telah dimodifikasi dan ditambahkan agar Bacto 0.85%.
Kecambah siratro yang berumur 2 hari ditanam secara aseptik pada tabung agar
tegak tersebut masing-masing satu kecambah. Setelah kecambah berumur 2 hari
di dalam tabung (4 hari) dilakukan inokulasi B. japonicum mutan dan galur
liarnya.
Suspensi inokulum disiapkan dengan cara meremajakan galur pada
15
media agar YMA miring selama 8 hari.
Selanjutnya ke dalam biakan
ditambahkan 1 ml garam fisiologis steril untuk mendapatkan seluruh suspensi
dengan tingkat kekeruhan sekitar 109 sel/ml dan diinokulasikan ke dalam tabung
agar tegak yang telah ditumbuhi kecambah siratro.
Tabung-tabung tersebut
kemudian dibenamkan kurang lebih setinggi media agar tegak dalam bak pasir
yang telah dibasahi air dan disimpan di rumah kaca. Suhu pasir dijaga agar tidak
lebih dari 30 oC dengan cara menyiram pasir setiap 2-3 hari sekali. Pengamatan
bintil akar yang terbentuk dilakukan mulai hari ke-5 sampai ke-30 setelah
inokulasi.
Uji Pembentukan Bintil Akar pada Tanaman Kedelai. Biji kedelai
dipilih, disterilisasi, dan dikecambahkan dengan perlakuan yang sama seperti
yang dilakukan pada biji siratro. Kecambah yang berumur dua hari selanjutnya
ditanam dalam botol Leonard. Media yang digunakan berupa pasir dan arang.
Pasir yang digunakan adalah yang tertahan ayakan yang berukuran 50 mesh (0.31
mm) dan lolos ayakan 30 mesh (0.52 mm), yang
DALAM TOLERANSI ASAM-ALUMINIUM PADA
Bradyrhizobium japonicum
DINI NURDIANI
SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2006
PERNYATAAN MENGENAI TESIS DAN SUMBER
INFORMASI
Dengan ini saya menyatakan bahwa tesis Analisis Fragmen DNA Genom
yang Terlibat dalam Toleransi Asam-aluminium pada Bradyrhizobium japonicum
adalah karya saya sendiri dan belum diajukan dalam bentuk apa pun kepada
perguruan tinggi mana pun. Sumber informasi yang berasal dari atau dikutip dari
karya yang diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan
dalam teks dan dicantumkan dalam Daftar Pustaka di bagian akhir tesis ini.
Bogor, Januari 2006
Dini Nurdiani
NIM G351030021
ABSTRAK
DINI NURDIANI. Analisis Fragmen DNA Genom yang Terlibat dalam Toleransi
Asam-aluminium pada Bradyrhizobium japonicum melalui Mutagenesis dengan
Transposon. Dibimbing oleh ANJA MERYANDINI dan ARIS TRI WAHYUDI.
Bradyrhizobium japonicum merupakan salah satu spesies bakteri dari
kelompok Rhizobia yang umumnya dapat membentuk bintil akar pada tanaman
Kedelai (Glycine max). Asosiasi antara bakteri bintil akar (BBA) dengan tanaman
kelompok legum dapat menghasilkan fiksasi N2 atmosfer menjadi NH3 yang dapat
digunakan untuk pertumbuhan tanaman.
Keasaman tanah merupakan salah satu masalah yang secara signifikan
mempengaruhi produksi pertanian di banyak tempat di seluruh dunia. Penurunan
pH tanah mempengaruhi organisme tanah termasuk mikroflora. Salah satu sistem
biologi yang dipengaruhi oleh penurunan pH tanah adalah simbiosis antara BBA
dan tanaman kelompok legum. Hal ini dapat mempengaruhi hasil asosiasi antara
keduanya dalam fiksasi N2 menjadi NH3.
Beberapa galur B. japonicum telah dilaporkan memiliki toleransi yang
tinggi terhadap asam-Al, diantaranya yaitu BJ11, BJ38, dan KDR15. Adanya
galur-galur toleran tersebut dapat menjadi sumber eksplorasi materi genetik yang
berperan dalam toleransi B. japonicum pada media asam-Al, yaitu dengan
melakukan analisis gen penyandi ketahanan B. japonicum terhadap cekaman
asam-Al di lingkungannya. Penelitian ini bertujuan untuk melakukan analisis
fragmen DNA genom yang terlibat dalam toleransi B. japonicum terhadap
cekaman asam-aluminium.
Mutagenesis dengan transposon dilakukan melalui konjugasi antara
Escherichia coli S17-1 (λ pir) yang membawa pUTmini-Tn5Km1 dan B.
japonicum toleran asam-Al pada perbandingan 1:1. Frekuensi konjugasi berkisar
antara 10-8–10-6 sel/resipien dengan frekuensi konjugasi tertinggi dicapai oleh
galur BJ11 sebesar 7.1x10-6 sel/resipien pada waktu inkubasi mating 24 jam.
Mutagenesis ini menghasilkan tujuh mutan sensitif asam-Al yang tidak mampu
tumbuh pada media Ayanaba (pH 4.5 dan Al 50 µM). Salah satu mutan yaitu
AAS11.2 digunakan sebagai model analisis molekuler gen yang terlibat dalam
toleransi asam-Al. AAS11.2 dapat membentuk bintil pada tanaman siratro yang
menunjukkan gen yang terlibat dalam toleransi asam-Al tidak berhubungan
dengan nodulasi. Fragmen DNA genom yang terlibat dalam toleransi asam-Al
dari mutan AAS11.2 telah berhasil diisolasi dengan inverse PCR menghasilkan
amplikon yang berukuran 0.8 kb. Fragmen ini berhasil diklon ke dalam pGEM-T
Easy (∼3 kb) untuk memperoleh plasmid rekombinan yang didesain sebagai
pGEMT-11 (∼3.8 kb), dan disekuen. Hasil analisis sekuen menunjukkan sekuen
fragmen DNA tersebut memiliki similaritas yang tinggi dengan gen yhfK yang
menyandikan putative inner membrane protein dari Salmonella typhimurium
(79% identity dan 84% similarity, E-value= 1.0xe-100) yang berfungsi sebagai
efflux transporter.
ABSTRACT
DINI NURDIANI. Analysis of Genomic DNA Fragment Involved in AcidAluminium Tolerance in Bradyrhizobium japonicum. Under the direction of
ANJA MERYANDINI and ARIS TRI WAHYUDI.
Bradyrhizobium japonicum is one of Rhizobia species which generally
form root nodule on soybean plant (Glycine max). In association with leguminous
plant, root nodule bacteria (RNB) fix atmospheric nitrogen (N2) into NH3 which
can be used for plant growth.
Soil acidity is a significant problem affecting agricultural production in
many areas of the world. Lowering pH of the soil can affect soil organisms
including the microflora. Among the biological system affected by the decrease
in soil pH are those between RNB and leguminous plants. It could affect the
association result between them in fixing nitrogen.
In the previous work, screening indigenous B. japonicum strains which
tolerant to acid-aluminium has been reported. The potential strains were strains
BJ11, BJ38, and KDR15. These tolerant strains could become a source of genetic
material exploration which involved in acid-Al tolerance in B. japonicum.
Transposon delivery was carried out through conjugation between Escherichia
coli S17-1 (λ pir) carrying pUTmini-Tn5Km1 and acid-Al tolerant B. japonicum
at 1:1 ratio. Frequency of transconjugation was in the range of 10-8–10-6 cells per
recipients. A mutant AAS11.2 did not able to grow on the Ayanaba medium (pH
4.5) supplemented with 50 µM aluminium. AAS11.2 was able to form root
nodule on siratro plant indicating that the gene involved in acid-Al tolerance was
not related with nodulation. A 0.8 kb of the genomic DNA fragment flanking
transposon involved in acid-Al tolerance was successfully isolated by inverse
polymerase chain reaction (inverse PCR) from AAS11.2 genome. This fragment
was subsequently cloned into pGEM-T Easy (∼3 kb) to yield a recombinant
plasmid, designated as pGEMT-11 (∼3.8 kb), and sequenced. DNA sequenced
analysis revealed that the genomic DNA fragment sequence had high homology
with yhfK gene encoding putative inner membrane protein from Salmonella
typhimurium (79% identity and 84% similarity, E-value= 1.0xe-100) which
function as efflux transporter.
© Hak cipta milik Dini Nurdiani, tahun 2006
Hak cipta dilindungi
Dilarang mengutip dan memperbanyak tanpa izin tertulis dari
Institut Pertanian Bogor, sebagian atau seluruhnya dalam
bentuk apa pun, baik cetak, fotokopi, mikrofilm, dan sebagainya.
ANALISIS FRAGMEN DNA GENOM YANG TERLIBAT
DALAM TOLERANSI ASAM-ALUMINIUM PADA
Bradyrhizobium japonicum
DINI NURDIANI
Tesis
Sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
Magister Sains pada
Departemen Biologi
SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2006
Judul Tesis
Nama
NIM
: Analisis Fragmen DNA Genom yang Terlibat dalam Toleransi
Asam-aluminium pada Bradyrhizobium japonicum
: Dini Nurdiani
: G351030021
Disetujui
Komisi Pembimbing
Dr. Anja Meryandini, M.S.
Ketua
Dr. Aris Tri Wahyudi, M.Si.
Anggota
Diketahui
Ketua Program Studi Biologi
Dr. Ir. Dedy Duryadi S., DEA
Tanggal Ujian: 1 Februari 2006
Dekan Sekolah Pascasarjana
Prof. Dr. Ir. Syafrida Manuwoto, M.Sc.
Tanggal Lulus:
PRAKATA
Puji syukur penulis panjatkan kepada Allah SWT atas segala rahmat dan
karunia-Nya sehingga penulis dapat menyelesaikan karya ilmiah yang berjudul
Analisis Fragmen DNA genom yang Terlibat dalam Toleransi Asam-Aluminium
pada Bradyrhizobium japonicum. Penelitian ini dibiayai oleh Hibah Bersaing No.
XIII tahun 2005-2007.
Pada kesempatan ini penulis juga ingin mengucapkan terima kasih yang
sebesar-besarnya kepada Dr. Anja Meryandini, MS. dan Dr. Aris Tri Wahyudi,
MSi. selaku pembimbing atas saran, kritik, dan bimbingannya serta bantuan biaya
dan fasilitas bahan-bahan yang digunakan selama penelitian.
Kepada Prof. Dr. Ir. Antonius Suwanto, selaku kepala Laboratorium
Research Center for Microbial Diversity (RCMD), penulis mengucapkan terima
kasih atas fasilitas laboratorium yang diberikan terutama dalam telaah genetika
molekuler dari galur-galur mutan B. japonicum. Ucapan terima kasih juga penulis
sampaikan kepada ibu Ani Fitriani atas saran, bantuan dan kerjasamanya terutama
dalam menggunakan fasilitas di Laboratorium RCMD.
Ucapan terima kasih juga disampaikan kepada ayah, ibu, kakak-kakak dan
adik-adik, atas segala doa dan kasih sayangnya, serta kepada laboran dan temanteman di Laboratorium Mikrobiologi Rika, Elsie, Andini, Henry, Wulan, Risa,
Prima dan juga kepada teman-teman yang namanya tidak dapat disebutkan satu
persatu, atas bantuan dan kerjasamanya selama penelitian ini.
Akhir kata, penulis berharap semoga karya ilmiah ini bermanfaat.
Bogor, Januari 2006
Dini Nurdiani
RIWAYAT HIDUP
Penulis dilahirkan pada tanggal 17 Juli 1974 di Kuningan, Jawa Barat
sebagai anak kelima dari pasangan bapak Drs. H. Mahmud (alm.) dan ibu E.
Muthiah.
Tahun 1992 penulis lulus dari SMA Muhammadiyah Cirebon dan pada
tahun yang sama lulus seleksi masuk IPB melalui jalur Undangan Seleksi Masuk
IPB. Penulis memilih Jurusan Biologi, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, lulus pada tahun 1997. Sejak tahun 2000 penulis bekerja sebagai staf
pengajar di Universitas Kuningan.
Pada tahun 2003, penulis diterima pada program studi Biologi sub
program Mikrobiologi, Sekolah Pascasarjana IPB. Beasiswa pendidikan pascasarjana diperoleh dari Direktorat Pendidikan Tinggi melalui program BPPS.
DAFTAR ISI
Halaman
DAFTAR TABEL ………………………………………………………….
vi
DAFTAR GAMBAR ………………………………………………………
vii
DAFTAR LAMPIRAN …………………………………………………….
viii
PENDAHULUAN …………………………………………………………
1
TINJAUAN PUSTAKA
Bakteri Bintil Akar …………………………………………………….
Toleransi Bakteri Bintil Akar terhadap Cekaman Lingkungan Asam ...
Mutagenesis dengan Transposon pada Bakteri ………………………..
4
5
7
BAHAN DAN METODE
Waktu dan Tempat ………….…………………………………………
Metode ………………………………………………………………...
11
11
HASIL
Penentuan Resistensi terhadap Antibiotik ……………………………..
Mutagenesis dengan Transposon dan Seleksi Mutan B. japonicum
Sensitif Asam-Al ………………………………………………………
Uji Pembentukan Bintil Akar ………………………………………….
Isolasi DNA Genom Pengapit Transposon dengan Inverse PCR dan
Kloning Produk Inverse PCR ………………………………………….
Analisis Sekuen DNA Genom yang Terlibat dalam Toleransi Asam-Al
26
27
PEMBAHASAN …………………………………………………………...
29
SIMPULAN DAN SARAN ………………………………………………...
36
DAFTAR PUSTAKA ……………………………………………………...
37
LAMPIRAN ………………………………………………………………..
41
22
23
25
ANALISIS FRAGMEN DNA GENOM YANG TERLIBAT
DALAM TOLERANSI ASAM-ALUMINIUM PADA
Bradyrhizobium japonicum
DINI NURDIANI
SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2006
PERNYATAAN MENGENAI TESIS DAN SUMBER
INFORMASI
Dengan ini saya menyatakan bahwa tesis Analisis Fragmen DNA Genom
yang Terlibat dalam Toleransi Asam-aluminium pada Bradyrhizobium japonicum
adalah karya saya sendiri dan belum diajukan dalam bentuk apa pun kepada
perguruan tinggi mana pun. Sumber informasi yang berasal dari atau dikutip dari
karya yang diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan
dalam teks dan dicantumkan dalam Daftar Pustaka di bagian akhir tesis ini.
Bogor, Januari 2006
Dini Nurdiani
NIM G351030021
ABSTRAK
DINI NURDIANI. Analisis Fragmen DNA Genom yang Terlibat dalam Toleransi
Asam-aluminium pada Bradyrhizobium japonicum melalui Mutagenesis dengan
Transposon. Dibimbing oleh ANJA MERYANDINI dan ARIS TRI WAHYUDI.
Bradyrhizobium japonicum merupakan salah satu spesies bakteri dari
kelompok Rhizobia yang umumnya dapat membentuk bintil akar pada tanaman
Kedelai (Glycine max). Asosiasi antara bakteri bintil akar (BBA) dengan tanaman
kelompok legum dapat menghasilkan fiksasi N2 atmosfer menjadi NH3 yang dapat
digunakan untuk pertumbuhan tanaman.
Keasaman tanah merupakan salah satu masalah yang secara signifikan
mempengaruhi produksi pertanian di banyak tempat di seluruh dunia. Penurunan
pH tanah mempengaruhi organisme tanah termasuk mikroflora. Salah satu sistem
biologi yang dipengaruhi oleh penurunan pH tanah adalah simbiosis antara BBA
dan tanaman kelompok legum. Hal ini dapat mempengaruhi hasil asosiasi antara
keduanya dalam fiksasi N2 menjadi NH3.
Beberapa galur B. japonicum telah dilaporkan memiliki toleransi yang
tinggi terhadap asam-Al, diantaranya yaitu BJ11, BJ38, dan KDR15. Adanya
galur-galur toleran tersebut dapat menjadi sumber eksplorasi materi genetik yang
berperan dalam toleransi B. japonicum pada media asam-Al, yaitu dengan
melakukan analisis gen penyandi ketahanan B. japonicum terhadap cekaman
asam-Al di lingkungannya. Penelitian ini bertujuan untuk melakukan analisis
fragmen DNA genom yang terlibat dalam toleransi B. japonicum terhadap
cekaman asam-aluminium.
Mutagenesis dengan transposon dilakukan melalui konjugasi antara
Escherichia coli S17-1 (λ pir) yang membawa pUTmini-Tn5Km1 dan B.
japonicum toleran asam-Al pada perbandingan 1:1. Frekuensi konjugasi berkisar
antara 10-8–10-6 sel/resipien dengan frekuensi konjugasi tertinggi dicapai oleh
galur BJ11 sebesar 7.1x10-6 sel/resipien pada waktu inkubasi mating 24 jam.
Mutagenesis ini menghasilkan tujuh mutan sensitif asam-Al yang tidak mampu
tumbuh pada media Ayanaba (pH 4.5 dan Al 50 µM). Salah satu mutan yaitu
AAS11.2 digunakan sebagai model analisis molekuler gen yang terlibat dalam
toleransi asam-Al. AAS11.2 dapat membentuk bintil pada tanaman siratro yang
menunjukkan gen yang terlibat dalam toleransi asam-Al tidak berhubungan
dengan nodulasi. Fragmen DNA genom yang terlibat dalam toleransi asam-Al
dari mutan AAS11.2 telah berhasil diisolasi dengan inverse PCR menghasilkan
amplikon yang berukuran 0.8 kb. Fragmen ini berhasil diklon ke dalam pGEM-T
Easy (∼3 kb) untuk memperoleh plasmid rekombinan yang didesain sebagai
pGEMT-11 (∼3.8 kb), dan disekuen. Hasil analisis sekuen menunjukkan sekuen
fragmen DNA tersebut memiliki similaritas yang tinggi dengan gen yhfK yang
menyandikan putative inner membrane protein dari Salmonella typhimurium
(79% identity dan 84% similarity, E-value= 1.0xe-100) yang berfungsi sebagai
efflux transporter.
ABSTRACT
DINI NURDIANI. Analysis of Genomic DNA Fragment Involved in AcidAluminium Tolerance in Bradyrhizobium japonicum. Under the direction of
ANJA MERYANDINI and ARIS TRI WAHYUDI.
Bradyrhizobium japonicum is one of Rhizobia species which generally
form root nodule on soybean plant (Glycine max). In association with leguminous
plant, root nodule bacteria (RNB) fix atmospheric nitrogen (N2) into NH3 which
can be used for plant growth.
Soil acidity is a significant problem affecting agricultural production in
many areas of the world. Lowering pH of the soil can affect soil organisms
including the microflora. Among the biological system affected by the decrease
in soil pH are those between RNB and leguminous plants. It could affect the
association result between them in fixing nitrogen.
In the previous work, screening indigenous B. japonicum strains which
tolerant to acid-aluminium has been reported. The potential strains were strains
BJ11, BJ38, and KDR15. These tolerant strains could become a source of genetic
material exploration which involved in acid-Al tolerance in B. japonicum.
Transposon delivery was carried out through conjugation between Escherichia
coli S17-1 (λ pir) carrying pUTmini-Tn5Km1 and acid-Al tolerant B. japonicum
at 1:1 ratio. Frequency of transconjugation was in the range of 10-8–10-6 cells per
recipients. A mutant AAS11.2 did not able to grow on the Ayanaba medium (pH
4.5) supplemented with 50 µM aluminium. AAS11.2 was able to form root
nodule on siratro plant indicating that the gene involved in acid-Al tolerance was
not related with nodulation. A 0.8 kb of the genomic DNA fragment flanking
transposon involved in acid-Al tolerance was successfully isolated by inverse
polymerase chain reaction (inverse PCR) from AAS11.2 genome. This fragment
was subsequently cloned into pGEM-T Easy (∼3 kb) to yield a recombinant
plasmid, designated as pGEMT-11 (∼3.8 kb), and sequenced. DNA sequenced
analysis revealed that the genomic DNA fragment sequence had high homology
with yhfK gene encoding putative inner membrane protein from Salmonella
typhimurium (79% identity and 84% similarity, E-value= 1.0xe-100) which
function as efflux transporter.
© Hak cipta milik Dini Nurdiani, tahun 2006
Hak cipta dilindungi
Dilarang mengutip dan memperbanyak tanpa izin tertulis dari
Institut Pertanian Bogor, sebagian atau seluruhnya dalam
bentuk apa pun, baik cetak, fotokopi, mikrofilm, dan sebagainya.
ANALISIS FRAGMEN DNA GENOM YANG TERLIBAT
DALAM TOLERANSI ASAM-ALUMINIUM PADA
Bradyrhizobium japonicum
DINI NURDIANI
Tesis
Sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
Magister Sains pada
Departemen Biologi
SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2006
Judul Tesis
Nama
NIM
: Analisis Fragmen DNA Genom yang Terlibat dalam Toleransi
Asam-aluminium pada Bradyrhizobium japonicum
: Dini Nurdiani
: G351030021
Disetujui
Komisi Pembimbing
Dr. Anja Meryandini, M.S.
Ketua
Dr. Aris Tri Wahyudi, M.Si.
Anggota
Diketahui
Ketua Program Studi Biologi
Dr. Ir. Dedy Duryadi S., DEA
Tanggal Ujian: 1 Februari 2006
Dekan Sekolah Pascasarjana
Prof. Dr. Ir. Syafrida Manuwoto, M.Sc.
Tanggal Lulus:
PRAKATA
Puji syukur penulis panjatkan kepada Allah SWT atas segala rahmat dan
karunia-Nya sehingga penulis dapat menyelesaikan karya ilmiah yang berjudul
Analisis Fragmen DNA genom yang Terlibat dalam Toleransi Asam-Aluminium
pada Bradyrhizobium japonicum. Penelitian ini dibiayai oleh Hibah Bersaing No.
XIII tahun 2005-2007.
Pada kesempatan ini penulis juga ingin mengucapkan terima kasih yang
sebesar-besarnya kepada Dr. Anja Meryandini, MS. dan Dr. Aris Tri Wahyudi,
MSi. selaku pembimbing atas saran, kritik, dan bimbingannya serta bantuan biaya
dan fasilitas bahan-bahan yang digunakan selama penelitian.
Kepada Prof. Dr. Ir. Antonius Suwanto, selaku kepala Laboratorium
Research Center for Microbial Diversity (RCMD), penulis mengucapkan terima
kasih atas fasilitas laboratorium yang diberikan terutama dalam telaah genetika
molekuler dari galur-galur mutan B. japonicum. Ucapan terima kasih juga penulis
sampaikan kepada ibu Ani Fitriani atas saran, bantuan dan kerjasamanya terutama
dalam menggunakan fasilitas di Laboratorium RCMD.
Ucapan terima kasih juga disampaikan kepada ayah, ibu, kakak-kakak dan
adik-adik, atas segala doa dan kasih sayangnya, serta kepada laboran dan temanteman di Laboratorium Mikrobiologi Rika, Elsie, Andini, Henry, Wulan, Risa,
Prima dan juga kepada teman-teman yang namanya tidak dapat disebutkan satu
persatu, atas bantuan dan kerjasamanya selama penelitian ini.
Akhir kata, penulis berharap semoga karya ilmiah ini bermanfaat.
Bogor, Januari 2006
Dini Nurdiani
RIWAYAT HIDUP
Penulis dilahirkan pada tanggal 17 Juli 1974 di Kuningan, Jawa Barat
sebagai anak kelima dari pasangan bapak Drs. H. Mahmud (alm.) dan ibu E.
Muthiah.
Tahun 1992 penulis lulus dari SMA Muhammadiyah Cirebon dan pada
tahun yang sama lulus seleksi masuk IPB melalui jalur Undangan Seleksi Masuk
IPB. Penulis memilih Jurusan Biologi, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, lulus pada tahun 1997. Sejak tahun 2000 penulis bekerja sebagai staf
pengajar di Universitas Kuningan.
Pada tahun 2003, penulis diterima pada program studi Biologi sub
program Mikrobiologi, Sekolah Pascasarjana IPB. Beasiswa pendidikan pascasarjana diperoleh dari Direktorat Pendidikan Tinggi melalui program BPPS.
DAFTAR ISI
Halaman
DAFTAR TABEL ………………………………………………………….
vi
DAFTAR GAMBAR ………………………………………………………
vii
DAFTAR LAMPIRAN …………………………………………………….
viii
PENDAHULUAN …………………………………………………………
1
TINJAUAN PUSTAKA
Bakteri Bintil Akar …………………………………………………….
Toleransi Bakteri Bintil Akar terhadap Cekaman Lingkungan Asam ...
Mutagenesis dengan Transposon pada Bakteri ………………………..
4
5
7
BAHAN DAN METODE
Waktu dan Tempat ………….…………………………………………
Metode ………………………………………………………………...
11
11
HASIL
Penentuan Resistensi terhadap Antibiotik ……………………………..
Mutagenesis dengan Transposon dan Seleksi Mutan B. japonicum
Sensitif Asam-Al ………………………………………………………
Uji Pembentukan Bintil Akar ………………………………………….
Isolasi DNA Genom Pengapit Transposon dengan Inverse PCR dan
Kloning Produk Inverse PCR ………………………………………….
Analisis Sekuen DNA Genom yang Terlibat dalam Toleransi Asam-Al
26
27
PEMBAHASAN …………………………………………………………...
29
SIMPULAN DAN SARAN ………………………………………………...
36
DAFTAR PUSTAKA ……………………………………………………...
37
LAMPIRAN ………………………………………………………………..
41
22
23
25
DAFTAR TABEL
Halaman
1 Pertumbuhan galur B. japonicum dan E.coli pada media agar yang
mengandung antibiotik ……………………………………………………... 22
2 Frekuensi Konjugasi pUTmini-Tn5Km1 dari E. coli S17-1 (λ pir)
ke B. japonicum pada tiga waktu inkubasi mating yang berbeda ………….. 24
3 Hasil uji pembentukan bintil akar pada tanaman siratro
(Macroptilium atropupureum) dan kedelai (Glycine max) . …………….….. 26
DAFTAR GAMBAR
Halaman
1 A) Peta plasmid pUTmini-Tn5Km1. B) transposon mini-Tn5Km1 ……
2 Mutagenesis dengan transposon dari sel E. coli S17-1 (λ pir)
(pUTmini-Tn5Km1) ke sel B. japonicum melalui proses konjugasi ……..
3 Strategi amplifikasi DNA genom pengapit transposon dengan inverse
PCR ………………………………………………………………………
4 Penampilan pertumbuhan B. japonicum toleran asam-Al galur BJ11,
KDR15, dan BJ38 pada media YMA + CR 0.0025% + rifampisin
50 µg/ml setelah inkubasi selama 8 hari pada suhu ruang ……………....
5 A) Bintil akar tanaman siratro yang terbentuk hasil inokulasi dengan B.
japonicum KDR15 (WT), dengan B) akar tanaman siratro yang terbentuk
hasil inokulasi dengan mutan AAS15.2 …………………….....................
6 A) Elektroforesis gel agarosa DNA genom pengapit transposon yang
berhasil diamplifikasi dengan inverse PCR dari genom mutan B.
japonicum sensitif asam-Al AAS11.2 (1) dan M= marker DNA 1 kb
ladder plus. B) Peta plasmid rekombinan pGEMT-11 (∼3.8 kb) ……….
7 A) Hasil Elektroforesis gel agarosa plasmid rekombinan. M= Marker
DNA 1 kb ladder plus, 1 dan 2= pGEM-T11 yang dipotong dengan
EcoRI. B) Hasil verifikasi DNA sisipan (insert) dalam plasmid
rekombinan dengan PCR pada gel agarosa 1% …………………………...
8 Hasil pensejajaran (alignment) homologi antara sekuen fragmen DNA
genom yang terlibat dalam toleransi asam-Al pada B. japonicum dengan
S. typhimurium …………………………………………………………. ..
9
13
18
23
25
27
27
28
DAFTAR LAMPIRAN
Halaman
1 Tabel komposisi media agar Ayanaba (Ayanaba et al. 1983)……..………. 42
2 Komposisi larutan hara Ahmed dan Evans yang telah dimodifikasi
(Speidel & Wollum 1980)…………………………………………………. 43
3 Komposisi larutan hara bebas N menurut Alva et al. (1988) …………….. 44
PENDAHULUAN
Latar Belakang
Kedelai merupakan sumber protein penting dan menjadi komponen utama
sejumlah makanan yang biasa dikonsumsi masyarakat Indonesia. Nilai penting
kedelai semakin meningkat dengan adanya program diversifikasi pangan dari
pemerintah untuk mencapai kecukupan dan ketahanan dalam produksi pangan.
Meskipun hasil produksi per hektar dan luasan pertanaman kedelai meningkat
secara tetap, namun total produksi kedelai tidak mampu memenuhi kebutuhan di
dalam negeri. Untuk meningkatkan produksi kedelai melalui perluasan lahan
pertanian terdapat sejumlah kendala, karena pada lahan yang baru dibuka pada
umumnya memiliki karakteristik tanah asam seperti tingginya kandungan Al dan
Mn serta rendahnya kadar fosfat dan Ca (Saleh & Sumarno 1995).
Keasaman tanah merupakan suatu masalah yang secara signifikan
mempengaruhi produksi pertanian di banyak tempat di seluruh dunia (Watkin et
al. 1997).
Penurunan pH tanah mempengaruhi organisme tanah termasuk
mikroflora. Salah satu sistem biologi yang dipengaruhi oleh penurunan pH tanah
adalah simbiosis antara bakteri bintil akar (BBA) dan tanaman kelompok legum.
Asosiasi antara keduanya menghasilkan fiksasi N2 atmosfer menjadi NH3 yang
dapat digunakan untuk pertumbuhan tanaman (Tiwari et al. 1992).
Fiksasi
nitrogen melalui simbiosis Rhizobium-legum memiliki nilai penting di bidang
pertanian karena mekanisme ini mengarah pada meningkatnya nitrogen terikat di
dalam tanah. Defisiensi nitrogen seringkali terjadi pada lahan yang kurang subur,
tetapi legum yang mengalami nodulasi dapat tumbuh dengan baik pada lahan
tersebut, sedangkan tanaman lain tidak dapat tumbuh (Madigan et al. 2003).
Kegagalan simbiosis Rhizobium-legum dalam menambat N2 pada tanah asam
dikarenakan miskinnya ketahanan hidup dan pertumbuhan dari BBA, atau
hambatan inisiasi dan pembentukan bintil akar. Faktor-faktor yang berhubungan
dengan keasaman tanah yang berperanan penting dalam kegagalan tersebut adalah
tingginya konsentrasi proton, rendahnya konsentrasi kalsium dan fosfat (Watkin et
al. 1997), serta meningkatnya konsentrasi aluminium seiring dengan menurunnya
pH tanah yang bersifat toksik terhadap BBA (Tiwari et al. 1992). Oleh karena itu
2
perluasan pemanfaatan lahan asam untuk tanaman kedelai membutuhkan
introduksi galur BBA yang toleran terhadap kondisi asam tersebut.
Bradyrhizobium japonicum merupakan salah satu spesies bakteri dari
kelompok Rhizobia yang umumnya dapat membentuk bintil akar pada tanaman
kedelai (Glycine max). pH optimum bagi pertumbuhan Bradyrhizobium berkisar
antara 6-7 (Holt et al. 1994), akan tetapi isolat dari beberapa spesies
Bradyrhizobium telah diidentifikasi memiliki kemampuan toleransi yang unggul
terhadap cekaman pada tanah seperti pH rendah dan fosfat rendah (Bottomley
1992). Pada penelitian sebelumnya telah dilakukan seleksi terhadap galur-galur
B. japonicum indigenus toleran media asam-Al dan diperoleh tiga galur toleran
dengan nomor sandi galur BJ11 (Endarini et al. 1995), BJ38 (Fitri 1995), dan
KDR15 (Imas et al. 1994). Kemampuan tumbuh dari galur toleran seperti BJ11
pada media kaldu Ayanaba (pH 4.5; Al 50 µM) menunjukkan bahwa galur
tersebut mampu mengakumulasi ammonium yang menyebabkan peningkatan pH
media. Wahyudi et al. (1998) juga melaporkan bahwa galur BJ11 merupakan
galur yang kompetitif dan berpotensi untuk dikembangkan sebagai galur
introduksi (inokulan) pada lahan asam dengan menggunakan varietas kedelai yang
juga toleran asam. Adanya galur-galur toleran tersebut dapat menjadi sumber
eksplorasi materi genetik yang berperan dalam toleransi B. japonicum pada media
asam-Al, yaitu dengan melakukan analisis gen penyandi ketahanan B. japonicum
terhadap cekaman asam-Al di lingkungannya.
Semua gen yang berperan dalam nodulasi pada Bradyrhizobium sejauh ini
diketahui berlokasi pada kromosom. Umumnya, galur Rhizobium memiliki
plasmid simbiotik yang membawa gen-gen nod, nif, dan fix. Meskipun plasmid
yang berukuran besar ditemukan pada beberapa Bradyrhizobium, namun tidak
terdapat gen simbiotik yang berlokasi pada plasmid tersebut (Barbour et al. 1992).
Bahkan berdasarkan data hasil penelitian yang dilakukan oleh Sari (1998)
dilaporkan bahwa enam galur uji B. japonicum indigenus dengan sandi galur 09,
11, 15, 33, 43, dan 45 tidak mempunyai plasmid indigenus. Untuk mempelajari
gen yang terlibat dalam toleransi B. japonicum terhadap cekaman asam-Al dapat
dilakukan isolasi dan karakterisasi dari mutan B. japonicum sensitif asam-Al
melalui mutagenesis dengan transposon.
3
Transposon adalah elemen DNA yang dapat berpindah dari satu tempat ke
tempat lain dalam suatu genom (Madigan et al. 2003).
Insersi transposon
biasanya akan menimbulkan suatu gen menjadi inaktif. Salah satu kegunaan
penting dari transposon yaitu untuk mutagenesis, karena gen yang telah disisipi
oleh transposon akan mengalami mutasi yaitu gen tersebut tidak dapat terekspresi.
Kegunaan lain dari transposon yaitu dapat memudahkan untuk memetakan secara
fisik maupun genetik dari suatu gen yang telah disisipi transposon dengan
menggunakan enzim restriksi endonuklease (Snyder & Champness 1997).
Transposon yang digunakan pada penelitian ini adalah transposon mini-Tn5Km1
yang membawa gen resistensi terhadap kanamisin yang telah dikonstruksi dalam
plasmid pUT (didesain pUTmini-Tn5Km1).
Penyisipan yang stabil pada
kromosom dapat diperoleh ketika transposon mini-Tn5 berpindah tanpa membawa
gen transposase (Herrero et al. 1990). Analisis gen dari mutan B. japonicum
sensitif asam-Al dapat dilakukan dengan cara mengisolasi fragmen DNA yang
mengapit transposon mini-Tn5 menggunakan teknik inverse PCR.
Tujuan
Penelitian ini bertujuan melakukan analisis fragmen DNA genom yang
terlibat dalam toleransi B. japonicum terhadap cekaman asam-aluminium.
TINJAUAN PUSTAKA
Bakteri Bintil Akar
Salah satu interaksi bakteri dengan tanaman yang paling penting dan
menarik adalah antara tanaman legum dan bakteri dari genus Rhizobium,
Bradyrhizobium, Shinorhizobium, Mesorhizobium dan Azorhizobium.
Legum
merupakan suatu kelompok besar tanaman yang memiliki nilai ekonomi penting
seperti kedelai, semanggi (clover), alfafa, buncis, dan kapri.
Rhizobium,
Bradyrhizobium, Shinorhizobium, Mesorhizobium dan Azorhizobium adalah
bakteri gram negatif motil yang berbentuk batang. Infeksi akar tanaman legum
oleh spesies yang cocok dengan salah satu genus tersebut mengarah pada
pembentukan bintil akar yang dapat mengubah nitrogen yang berupa gas menjadi
nitrogen terikat, dan proses ini dinamakan fiksasi nitrogen. Pada umumnya bintil
terbentuk pada akar tanaman, namun bintil juga dapat terbentuk pada batang,
misalnya pada legum tropis Sesbania yang dinodulasi oleh Azorhizobium
caulinodans. Tanaman ini tersebar di daerah tropis yang tanahnya seringkali
mengalami defisiensi nitrogen (Madigan et al. 2003).
Sekitar 90% dari seluruh spesies tanaman legum dapat mengalami
nodulasi. Namun, terdapat spesifisitas antara legum dan galur Rhizobium. Suatu
galur Rhizobium umumnya dapat menginfeksi spesies legum tertentu dan tidak
pada spesies lainnya.
Sekelompok galur Rhizobium yang dapat menginfeksi
kelompok legum yang berkerabat dinamakan kelompok inokulasi silang.
Walaupun galur Rhizobium mampu menginfeksi legum tertentu, tetapi tidak selalu
dapat menghasilkan bintil yang memfiksasi nitrogen (Madigan et al. 2003).
Genus Bradyrhizobium hanya memiliki satu tipe spesies, yaitu
Bradyrhizobium japonicum (Holt et al. 1994). Menurut Perret et al. (2000), B.
japonicum termasuk salah satu anggota famili Rhizobiaceae yang memiliki
kisaran
inang
yang
luas
seperti
pada
tanaman
anggota
kelompok
Aeschynomeneae (Papilionoideae), Arachis spp., Phaseoleae (Papilionoideae),
Macroptilium, dan Vigna spp. Namun pada umumnya B. japonicum membentuk
bintil akar pada jenis legum anggota kelompok Phaseoleae (Papilionoideae) dan
Glycine spp.
5
B. japonicum memiliki karakteristik antara lain berbentuk batang dengan
ukuran 0.5-0.9 x 1.2-3.0 µm, tidak membentuk spora, dapat membentuk granul
poly-β-hidroksibutirat, motil dengan satu flagela polar atau subpolar, dan bersifat
aerobik. Temperatur optimum pertumbuhannya berkisar antara 25-30 oC sedangkan pH optimumnya 6-7 meskipun demikian galur yang berasal dari tanah asam
dapat hidup di bawah pH optimum (Holt et al. 1994).
Toleransi Bakteri Bintil Akar terhadap Cekaman Lingkungan Asam
Simbiosis Rhizobium-legum dipengaruhi oleh penurunan pH tanah.
Penurunan pH tanah tidak hanya menimbulkan peningkatan konsentrasi proton,
tetapi juga kelarutan logam seperti aluminium yang bersifat toksik terhadap BBA.
Respon BBA terhadap tanah asam tergantung pada interaksi sejumlah faktor
diantaranya konsentrasi H+, aktivitas Al3+ dan kemampuan kompetisi dan
persistensi dari galur Rhizobium (Tiwari et al.1992).
Isolasi dan karakterisasi BBA dilakukan untuk memperoleh galur yang
toleran terhadap lingkungan asam. Adanya BBA yang toleran asam-Al menjadi
sumber eksplorasi materi genetik yang berperan dalam respon toleransi bakteri
tersebut pada lingkungan asam. Telaah molekuler dilakukan dengan menggunakan mutan yang dihasilkan melalui mutagenesis dengan transposon seperti Tn5.
Goss et al. (1990) melakukan karakterisasi mutan galur Rhizobium meliloti
WSM419 yang dihasilkan melalui mutagenesis dengan Tn5. Galur liar R. meliloti
WSM419 dapat bertahan hidup dan memiliki kemampuan nodulasi pada tanah
asam (pH 5.6). Sementara itu galur mutannya menjadi sensitif terhadap asam dan
tidak mampu tumbuh pada pH 5.6. Hal ini menunjukkan pada galur mutan telah
kehilangan kemampuan untuk memelihara pH intraselulernya (pHi).
Hasil
analisis fragmen DNA yang membawa Tn5 dan klon sekuen pengapit dari mutan
tersebut menunjukkan lokus act (untuk acid tolerance) berada pada 4.4 kb dari
fragmen yang dipotong dengan EcoRI.
Selanjutnya Tiwari et al. (1992)
melakukan karakterisasi mutan yang diinduksi dengan Tn5 dari galur-galur R.
meliloti WSM419 dan R. leguminosarum WSM710. Hasil pemetaan melalui
pemotongan dengan enzim restriksi pada WSM419 menunjukkan bahwa gen yang
berperan dalam toleransi terhadap asam berada pada empat fragmen unik hasil
6
pemotongan dengan EcoRI. Pada galur mutan yang sensitif terhadap pH media di
bawah 6.0 (TG2-6) dengan kandungan Ca 1 mM, dapat diperbaiki kemampuan
ketahanan hidupnya pada pH media 5.5 dengan penambahan Ca 50 mM. Pada
galur ini peningkatan konsentrasi Ca media dapat memperkecil penurunan pHi.
Sementara itu pada WSM710, dua gen yang berperan dalam toleransi terhadap
asam berada pada fragmen hasil pemotongan dengan EcoRI yang terpisah yaitu
pada 12 kb dan 16 kb.
Karena galur-galur R. leguminosarum lebih toleran
terhadap asam daripada WSM419, maka terdapat kemungkinan untuk transfer
materi genetik dari galur yang lebih toleran ke galur yang kurang toleran.
Analisis sekuen DNA yang terlibat dalam respon toleransi BBA terhadap
lingkungan asam telah dipelajari pada R. tropici (Ricillo et al. 2000), R.
leguminosarum bv. viciae, dan S. meliloti (Reeve et al. 2002). Hasil analisis gen
yang mengalami penyisipan oleh Tn5-luxAB pada galur mutan R. tropici
CIAT899-13T2 yang tidak mampu tumbuh pada kondisi asam, menunjukkan
similaritas yang tinggi dengan gen gsh dari E. coli yang menyandikan enzim
glutathion synthetase. Kelimpahan Kalium dan pHi pada galur mutan tersebut
lebih rendah dibandingkan tipe liarnya (Ricillo et al. 2000). Pada galur mutan R.
leguminosarum bv. viciae, dan S. meliloti yang mengalami transposisi Tn5 pada
gen actP mengalami hambatan ekspresi dari P-type ATPase yang termasuk
subfamili CPx yang berperan dalam transport logam berat. Pada mutan yang
mengalami knockout pada gen actP tersebut menunjukkan sensitivitas terhadap
Cu.
Hal ini menunjukkan adanya keterlibatan logam berat tersebut dalam
mempertahankan pH media pada kondisi asam (Reeve et al. 2002).
Selain itu ketahanan terhadap pH juga dipelajari pada E. coli yang
memiliki kemampuan adaptasi terhadap perubahan lingkungannya. E. coli dapat
tumbuh pada kisaran pH eksternal yang luas yaitu antara 5-9. Pada E. coli
homeostasis pH tergantung pada konsentrasi K+ eksternal (White et al. 1992).
Arginin dekarboksilase yang disandikan oleh gen adi mengalami induksi pada pH
asam, anaerobiosis, dan media kaya. Hasil analisis sekuen DNA yang berukuran
3 kb dari kromosom E. coli yang menyandikan arginin dekarboksilase
menunjukkan bahwa sekuen ini menyandikan protein yang terdiri atas 755 asam
amino dan berukuran 84420 Da, serta memiliki homologi dengan dekarboksilase
7
lain dari E. coli yaitu CadA (lisin dekarboksilase), SpeC (ornitin dekarboksilase
biosintetik) dan SpeF (ornitin dekarboksilase biodegradatif) (Stim & Bennet
1993).
Mutagenesis dengan Transposon pada Bakteri
Masing-masing tipe bakteri membawa transposon yang unik, berikut ini
adalah beberapa tipe transposon yang umum terdapat pada bakteri antara lain: (i)
insertion sequence elements (elemen IS), (ii) transposon komposit, dan (iii)
transposon nonkomposit (Snyder & Champness 1997).
Elemen IS adalah transposon bakteri terkecil yang biasanya hanya
berukuran 750-2000 bp dan hanya mengkode enzim transposase yang dibutuhkan
dalam transposisinya.
Elemen IS tidak membawa gen penanda seleksi dan
ditemukan hanya karena elemen ini menimbulkan inaktivasi dari gen yang
disisipinya. Pada E. coli secara alami ditemukan empat elemen IS yang berbeda
yaitu IS1, IS2, IS3, dan IS4. Sampai saat ini telah ditemukan lebih dari 700
elemen IS pada bakteri, meskipun kebanyakan dapat digolongkan dalam 20
famili.
Kadang-kadang dua elemen IS dari tipe yang sama membentuk transposon
yang lebih besar, disebut tranposon komposit dengan membawa gen lain. Contoh
tipe transposon komposit yaitu Tn5, Tn9, dan Tn10. Untuk transposon komposit
Tn5 misalnya terdiri atas gen untuk resistensi terhadap kanamisin (Kanr) dan
resistensi streptomisin (Strr) yang diapit oleh elemen IS yang disebut IS50.
Transposon komposit bukan satu-satunya tipe transposon yang membawa
gen-gen resistensi terhadap antibiotik.
Gen-gen tersebut juga dapat menjadi
bagian dari transposon nonkomposit.
Gen-gen pada transposon nonkomposit
diapit oleh suatu inverted repeat dan tipe transposon ini minimal terdiri atas satu
gen resistensi saja. Contoh transposon nonkomposit adalah Tn3 yang memiliki
gen resistensi terhadap ampisilin.
Tidak semua tipe transposon dapat digunakan untuk mutagenesis. Suatu
transposon yang digunakan dalam mutagenesis harus memiliki kelengkapan
berikut ini: (i) memiliki kemampuan untuk berpindah dengan frekuensi yang
tinggi, (ii) pemilihan sekuen targetnya tidak terlalu selektif, (iii) membawa gen
8
penanda seleksi sederhana, seperti resistensi terhadap antibiotik, dan (iv) dapat
digunakan untuk transposisi ke berbagai macam bakteri yang berbeda (broad host
range). Tn5 ideal digunakan untuk mutagenesis acak pada bakteri gram negatif
karena memiliki kelengkapan di atas.
Tn5 tidak hanya berpindah dengan
frekuensi yang relatif tinggi, tetapi juga transposon ini hampir tidak ada
spesifisitas dalam pemilihan targetnya dan mampu bertransposisi pada setiap
bakteri gram negatif. Tn5 juga membawa gen resistensi terhadap kanamisin yang
dapat terekspresi pada hampir semua bakteri gram negatif (Snyder & Champness
1997).
Pada penelitian ini digunakan transposon mini-Tn5 yang merupakan
turunan dari transposon Tn5.
Keistimewaan transposon ini adalah tidak
membawa gen transposase yang berperan dalam proses transposisinya. Untuk
proses transposisi dari mini-Tn5, gen transposase dikonstruksi pada plasmid yang
membawanya yaitu pUT (pUTmini-Tn5) (Herrero et al. 1990). Setelah mini-Tn5
mengalami transposisi (berpindah) dalam hal ini dari plasmid ke kromosom, tidak
dapat melakukan transposisi kembali karena gen transposase-nya tetap berada di
dalam plasmid pUT.
Plasmid pUT merupakan turunan dari plasmid pGP704 dan memiliki
origin of replication dari plasmid R6K yang hanya dapat dipelihara pada bakteri
penghasil π protein. Plasmid ini juga membawa origin of transfer (oriT) dari
plasmid RP4, yang dapat menghasilkan transfer yang efisien ke sel resipien dari
galur donor yang mengekspresikan fungsi konjugatif dari RP4 seperti E. coli
SM10 (λ pir). pUT membawa gen tnp*, suatu mutan gen tnp dari IS50R yang
tidak memiliki situs NotI dan menyandikan transposase yang dibutuhkan untuk
transposisi dari elemen mini-Tn5 (Lorenzo et al. 1990). Penghilangan situs NotI
tersebut tidak merubah struktur dari produk gen tnp.
Gen transposase yang
dimodifikasi (dengan menghilangkan situs NotI), dinamakan gen tnp* dan diklon
pada situs SalI dari pGP704 derivatif dengan orientasi yang dapat mengatur
proses transposisi secara optimal. Konstruksi ini dinamakan pUTKm. Plasmid
pUTKm mengendalikan donor minitransposon dengan penanda resistensi
terhadap antibiotik kanamisin (Herrero et al. 1990). Mini-Tn5 diapit oleh ujung I
dan O yang terdiri atas 19 pasang basa.
Elemen mini-Tn5 kanamisin pada
9
pUT/Km terdiri atas tiga Kmr derivatif. Dua gen resistensi kanamisin berasal dari
transposon Tn903 dengan orientasi yang berlawanan, sedangkan yang ketiga
diisolasi dari Tn5 sendiri. Salah satu ciri penting dari elemen tersebut adalah
hilangnya inhibitor transposase bersama dengan pUT setelah transposisi, sehingga
satu galur resipien dapat digunakan untuk proses insersi berulang dengan
menggunakan minitransposon yang memiliki penanda seleksi yang berbeda
(Lorenzo et al. 1990). Gambar 1 menampilkan peta plasmid pUTmini-Tn5Km1
beserta transposon mini-Tn5Km1 yang digunakan dalam penelitian ini untuk
melakukan mutagenesis dengan transposon melalui proses konjugasi.
A)
pUTmini-Tn5Km1
7.055 kb
B)
Gambar 1 (A) Peta plasmid pUTmini-Tn5Km1 (7.055 bp). (B) Transposon miniTn5Km1.
Herrero et al. (1990) melaporkan hasil insersi transposon pada kromosom
melalui proses konjugasi antara E. coli SM10(λ pir) dengan Pseudomonas putida.
Dari hasil analisis pada 8 koloni ekskonjugan menunjukkan bahwa terjadi insersi
tunggal pada masing-masing ekskonjugan, insersi transposon pada kromosom
ekskonjugan terjadi pada lokasi yang berbeda, dan gen transposase tidak terdapat
10
pada ekskonjugan. Pada penelitian ini dilakukan mutagenesis dengan transposon
mini-Tn5Km1 dari E. coli S17-1 (λ pir) ke B. japonicum toleran asam-Al melalui
proses konjugasi dan dari ekskonjugan yang diperoleh diharapkan terdapat mutan
sensitif asam-Al. Selanjutnya dari galur mutan sensitif dilakukan isolasi gen yang
terlibat dalam toleransi asam-Al pada B. japonicum.
BAHAN DAN METODE
Waktu dan Tempat
Penelitian ini dilakukan di Laboratorium Mikrobiologi dan Research
Center for Microbial Diversity (RCMD), Departemen Biologi, FMIPA, IPB dari
bulan Januari sampai dengan Nopember 2005.
Bahan
Bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah tiga galur B. japonicum
toleran asam-aluminium dengan nomor sandi galur BJ11, BJ38, dan KDR15.
Ketiga galur tersebut digunakan sebagai resipien dalam konjugasi dan Escherichia
coli S17-1 (λ pir) (pUTmini-Tn5Km1) digunakan sebagai donor dalam
mutagenesis dengan transposon. Galur E. coli DH5 α digunakan sebagai inang
dalam kloning fragmen DNA. Vektor plasmid pGEM-T Easy digunakan untuk
TA-cloning fragmen DNA genom yang terlibat dalam toleransi asam-Al.
Metode
Media dan Kondisi Pertumbuhan
E. coli DH5 α secara rutin ditumbuhkan pada media Luria Bertani broth
(LB) (tryptone 10.0 g/l, NaCl 10.0 g/l, yeast extract 5.0 g/l) tanpa antibiotik. E.
coli S17-1 λ pir (pUTmini-Tn5Km1) secara rutin ditumbuhkan pada media LB
yang mengandung ampisilin (100 µg/ml) dan kanamisin (50 µg/ml) pada suhu 37
o
C. E.coli DH5 α yang membawa plasmid rekombinan pGEM-T dikulturkan pada
media LB yang mengandung ampisilin (100 µg/ml) dan kanamisin (50 µg/ml)
pada suhu 37 oC. Galur BJ11, BJ38, dan KDR15 dikulturkan secara aerobik pada
media yeast extract mannitol agar (YMA) (manitol 10.0 g/l, K2HPO4 0.5 g/l,
MgSO4·7H2O 0.2 g/l, NaCl 0.2 g/l, yeast extract 1.0 g/l).
Penentuan Resistensi terhadap Antibiotik
Tiga galur B. japonicum yang digunakan dalam penelitian ini dengan sandi
BJ11, BJ38, dan KDR15 terlebih dahulu harus diketahui sensitivitasnya terhadap
12
beberapa antibiotik untuk menentukan penanda antibiotik yang akan dipakai
dalam seleksi transkonjugan.
Sebelum dilakukan pengujian pada media dengan antibiotik terlebih
dahulu ketiga galur tersebut diremajakan pada media agar cawan YMA selama 78 hari pada suhu ruang. Selanjutnya masing-masing biakan tersebut digoreskan
pada agar cawan YMA + Congo Red (CR) 0.0025% + antibiotik. Antibiotik yang
digunakan dalam pengujian ketiga galur tersebut yaitu ampisilin 50 µg/ml dan 100
µg/ml, kanamisin 25 µg/ml dan 50 µg/ml, rifampisin 25 µg/ml dan 50 µg/ml, serta
tetrasiklin 25 µg/ml dan 50 µg/ml. Inkubasi dilakukan pada suhu ruang selama 78 hari dan diamati pertumbuhannya.
Biakan yang tumbuh berarti resisten,
sedangkan yang tidak tumbuh berarti sensitif terhadap antibiotik yang digunakan.
Pengujian resistensi terhadap antibiotik tersebut juga dilakukan pada E. coli S17-1
(λ pir) pada media agar cawan Luria agar (LA).
Penyiapan Kultur untuk Konjugasi
Galur BJ11, BJ38, dan KDR15 masing-masing ditumbuhkan pada 50 ml
media yeast extract mannitol broth (YMB) yang ditambah Rifampisin (50 µg/ml)
dan dikocok dengan mesin pengocok (shaker) kecepatan 200 rpm pada suhu
ruang dengan waktu inkubasi 60 jam sampai sel mencapai fase logaritmik (∼108
sel/ml). Galur E. coli S17-1 (λ pir) (pUTmini-Tn5Km1) ditumbuhkan pada 25 ml
LB yang ditambah dengan kanamisin (50 µg/ml). Pengocokan dilakukan dengan
kecepatan 200 rpm pada suhu 37 oC selama 18-20 jam.
Mutagenesis dengan Transposon
Introduksi transposon mini-Tn5Km1 (pUTmini-Tn5Km1, 7055 bp)
(Gambar 1) ke dalam sel B. japonicum dilakukan melalui konjugasi. Kultur B.
japonicum dan E. coli yang telah mencapai fase logaritmik disentrifugasi dengan
kecepatan 2300 g selama 3 menit dan peletnya dicuci sebanyak tiga kali dengan
NaCl 0.85% untuk membersihkan sel dari sisa antibiotik.
Pelet sel donor
disuspensikan dalam 40 µl kaldu LB modifikasi (tryptone 5.0 g/l, NaCl 1.0 g/l,
yeast extract 5.0 g/l) dan dicampurkan dengan pelet sel resipien dengan
perbandingan yang sama (1:1) masing-masing dengan konsentrasi sekitar 108
13
sel/ml.
Campuran ini selanjutnya diletakkan di atas filter nitroselulosa steril
(ukuran pori 0.45 µm) pada media LA modifikasi. Pada media tersebut dibuat
tiga juring sehingga pada tiap juring dapat diletakkan satu buah filter, masingmasing untuk donor (D), resipien (R), dan campuran antara D dan R (M). Gambar
2 memperlihatkan diagram skematik dalam melakukan mutagenesis dengan
transposon. Mating dilakukan secara aerobik pada suhu ruang dengan tiga waktu
lama inkubasi yaitu 12, 18, dan 24 jam.
Selanjutnya filter diangkat dan
dimasukkan ke dalam tabung mikro yang berisi 1 ml garam fisiologis (NaCl
0.85%) dan divorteks. Masing-masing suspensi sel sebanyak 100 µl disebarkan
pada media YMA ditambah kanamisin (50 µg/ml) dan rifampisin (50 µg/ml).
Inkubasi dilakukan pada suhu ruang selama 5-8 hari dan dihitung frekuensi
transkonjugasinya.
E. coli S17-1 (λ pir)
B. japonicum
Gambar 2 Mutagenesis dengan transposon dari sel E. coli S17-1 (λ pir)
(pUTmini-Tn5Km1) ke sel B. japonicum melalui proses konjugasi.
14
Seleksi Mutan B. japonicum Sensitif asam-Al
Koloni transkonjugan hasil sebar yang telah tumbuh pada media YMA +
CR 0.0025% + rifampisin (50 µg/ml) + kanamisin (50 µg/ml) direplika pada
media yang sama dan diseleksi sensitivitasnya terhadap asam-Al dengan
menggunakan media agar asam-Al Ayanaba (pH 4.5 ditambah 50 µM Al) yang
komposisinya dibuat sesuai dengan komposisi Ayanaba et al. (1983) (Tabel
Lampiran 1). Transkonjugan yang tidak tumbuh pada media tersebut adalah
mutan dari B. japonicum yang sensitif asam-Al.
Uji Pembentukan Bintil Akar
Galur-galur mutan B. japonicum sensitif asam-Al hasil konjugasi, masingmasing diuji kemampuannya untuk membentuk bintil akar. Uji pembentukan
bintil akar pada tanaman siratro (Macroptilium atropupureum) menggunakan
metode tabung sedangkan untuk pembentukan bintil akar pada tanaman kedelai
(Glycine max) digunakan botol Leonard berdasarkan metode Vincent yang
dimodifikasi seperti yang telah dilaporkan Wahyudi (1998).
Uji Pembentukan Bintil Akar pada Tanaman Siratro. Biji siratro yang
telah dipilih (tidak luka, tidak keriput, tidak terapung, dan memiliki ukuran
seragam) ditoreh kulit bijinya dengan silet untuk menghilangkan masa
dormansinya. Sterilisasi permukaan biji dilakukan dengan cara merendam biji
berturut-turut dalam alkohol 95% selama 10 detik, H2O2 5% selama 5 menit, dan
dibilas dengan akuades steril sebanyak 7 kali. Biji selanjutnya dikecambahkan
dalam cawan petri berisi kertas saring steril yang telah dibasahi akuades steril.
Perkecambahan dilakukan selama 2 hari pada suhu ruang dalam keadaan gelap.
Sementara itu media agar tegak (20 ml) disiapkan dalam tabung berukuran
25x200 mm. Media agar tersebut terdiri atas larutan hara yang komposisinya
dibuat berdasarkan komposisi Ahmed & Evans (Speidel & Wollum 1980) (Tabel
Lampiran 2) yang telah dimodifikasi dan ditambahkan agar Bacto 0.85%.
Kecambah siratro yang berumur 2 hari ditanam secara aseptik pada tabung agar
tegak tersebut masing-masing satu kecambah. Setelah kecambah berumur 2 hari
di dalam tabung (4 hari) dilakukan inokulasi B. japonicum mutan dan galur
liarnya.
Suspensi inokulum disiapkan dengan cara meremajakan galur pada
15
media agar YMA miring selama 8 hari.
Selanjutnya ke dalam biakan
ditambahkan 1 ml garam fisiologis steril untuk mendapatkan seluruh suspensi
dengan tingkat kekeruhan sekitar 109 sel/ml dan diinokulasikan ke dalam tabung
agar tegak yang telah ditumbuhi kecambah siratro.
Tabung-tabung tersebut
kemudian dibenamkan kurang lebih setinggi media agar tegak dalam bak pasir
yang telah dibasahi air dan disimpan di rumah kaca. Suhu pasir dijaga agar tidak
lebih dari 30 oC dengan cara menyiram pasir setiap 2-3 hari sekali. Pengamatan
bintil akar yang terbentuk dilakukan mulai hari ke-5 sampai ke-30 setelah
inokulasi.
Uji Pembentukan Bintil Akar pada Tanaman Kedelai. Biji kedelai
dipilih, disterilisasi, dan dikecambahkan dengan perlakuan yang sama seperti
yang dilakukan pada biji siratro. Kecambah yang berumur dua hari selanjutnya
ditanam dalam botol Leonard. Media yang digunakan berupa pasir dan arang.
Pasir yang digunakan adalah yang tertahan ayakan yang berukuran 50 mesh (0.31
mm) dan lolos ayakan 30 mesh (0.52 mm), yang