Isolasi dan Identifikasi Produk Biotransformasi Artemisinin oleh Galur Mikroorganisme Endofit Artemisia annua

ISOLASI DAN IDENTIFIKASI PRODUK
BIOTRANSFORMASI ARTEMISININ OLEH
GALUR MIKROORGANISME ENDOFIT
Artemisia annua

OLEH :
DIAN MALINI OKTOVINA

PROGRAM PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
2002

"Katakanlah : Kalau sekiranya lautan menjadi tinta untuk (menulis) kalimat-kalimat
Tuhanku, sungguh habislah taut i t u sebelum habis (ditulis) kalimat-kalimat Tuhanku,
meskipun kami datangkan tambahan sebanyak i t u (pula)"
(Al-Kahfi : 109)

DIBALIK STERILISASI
(Jeda sesaat di Laboratorium KBA, Agustus 2001)

.

Bila saatnya tiba ... diriku terbungkus kertas-kertas usang
.
dan terlipat-lipat kaku, membujur di antara himpitan karet-karet gelang
tentu tak kubayangkan betapa sesak, panas, dan pengapnya udara
siang dan malam ...
biriku tertumpuk dalam barisan ke-99 di antara 584 peserta sterilisasi yang lain
sakit mungkin,
Tapi ku tak berdaya, diam dan hanya menunggu menit-menit terakhir
setelah letup mengeluarkan asapnya,
tiba-tiba tekananku menjadi tinggi seiring naiknya jarum pressure
bahsyat ... ku terguncang dan makin terhimpit di antara yang lainnya
Buat apa mengeluh ...
ternyata diriku masih beruntung berada dalam dinding besi yang kokoh, ...
bila ku lihat yang lainnya pecah dalam himpitan
Setelah semua uap menyelimuti tubuhku ...
Seketika ku terhentak, tersentak ketika dinding besi dibuka
Panas berganti udara luar menyeruak
Nyaris ku terbatuk, tapi papa tak kunjung mengangkatku
dari kepulan asap panas

kemudian ku didudukkan dalam ruang tunggu yang nyaris panas juga
Oh malang ...
Kini ku hanya diam menunggu uap-uap air ini tersapu
ban ku hanya mampu berkata lirih,
Mama ...

Kupersembahkan untuk :
Kedua orang tuaku serta orang-orang terkasih

ABSTRACT
DIAN MALINI OKTOVINA. Isolation and Identification of the Biotransformation
Product Artemisinin by Endophitic Microorganism Strains of Artemisia annua. Under
the direction of ENDANG GUMBIRA-SA'ID, MULYORNI RAHAYUNINGSIH,
and PARTOMUAN SIMANJUNTAK.
Isolation of the biotransforrnation product artemisinin from endophitic bacteria is
a new alternative for the production of the multidrug-resistant malaria compounds.
The bacteria strain, AT 12, has been proved particularly potential as an artemisinin
source (0,75 % w/w).
This study was carried out to isolate and to identify the biotransformation
product artemisinin as an antimalarial active compound from endophitic

microorganism strains of Artemisia annua. The product was determined using TLC,
HPLC-UV, IR spectroscopy, and GC-MS methods.
The initial positively identification of artemisinin was indicated with the same

Rf.

The IR spectrum exhibited the chara~teristicbands for 6-lactone (1750-1735

cm'l, 1250-1111 cm-') and endoperoxide fimction (-1 115 crn-', 890-830 cm-I).
Comparison of chromatogram data of the HPLC-UV with the standmd convinced
they were the same compound.

As a result, the GC-MS

gave a positively

~
identification for the majority of GC peaks. The mass spectrum af the peak ( t 27.94
min) has a molecular ion of
representing (M.'

- 1).

artemisinin with one hydrogen loss at m/z 281,

ISOLASI DAN IDENTIFIKASI PRODUK
BIOTRANSFORMASI ARTEMISININ OLEH
GALUR MIKROORGANISME ENDOFIT
Artemisia annua

DIAN MALINI OKTOVINA

Tesis
sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
Magister Sains pada .
Program Studi Teknologi Industri Pertanian

PROGRAM PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
2002

Judul Tesis

: Isolasi dan Identifikasi Produk Biotransformasi Artemisinin

Narna Mahasiswa
Nomor Pokok
Program Studi

: Dian Malini Oktovina
: 99584
: Teknologi Industri Pertanian

oleh Galur Mikroorganisme Endofit Artemisia annua

Menyetujui,

(Prof. Dr. Ir. Endang

ira-Sa'id, MADev)

KetL
i

Ir. Mulvorini R a h a d n g s i h , MSi

Dr. Partomuan Simaniuntak, MSc

Anggota

Anggota
Mengetahui,

2.

Ketua Program Studi

3. Direktur Program Pascasarjana

Teknologi Industri Pzrtanian

'

(Dr. Ir. Irawadi Jamaran)

Tanggal Lulus : 16 Januari 2002

9

'

(Prof. Dr. Ir. Svafrida Manuwoto, MSc)

RIWAYAT HIDUP
Penulis dilahirkan di Pekalongan pada tanggal 26 Oktober 1976 sebagai anak
kedua dari tiga bersaudara, anak dari pasangan Moezarnil Zamahsari d m Azizah.
Pendidikan sarjana ditempuh di Jurusan Biologi, Fakultas Matematika d m Ilmu
Pengetahuan Alam IPB, lulus pada tahun 1999. Pada tahun yang sama, penulis
diterima di Program Studi Teknologi Industri Pertanian pada Program Pascasarjana
IPB.

Selama mengikuti program S2, penulis menjadi anggota Lembaga Swadaya
Masyarakat Konsorsium Nasional Pengendalian Hutan dan Alam Indonesia
(KONPHALINDO) dan Himpunan Kimia Bahan Alam Indonesia (HKBAI). Penulis
juga aktif mengajar di beberapa lcnlbaga pendidikan dan bimbingan belajar di Bogor
dan Jakarta.

PRAKATA
Puji dan syukur penulis panjatkan kepada Allah SWT atas segala karunia-Nya
sehingga tesis dengan judul Isolasi dan Identifikasi Produk Biotransforrnasi
Artemisinin oleh Galur Mikroorganisme Endofit Artemisia annua ini berhasil
diselesaikan.
Terima kasih penulis ucapkan kepada Bapak Prof. Dr. Ir. Endang GumbiraSa'id, MADev, Ibu Ir. Mulyorini Rahayuningsih, MSi, dan Bapak Partomuan
Simanjuntak, MSc selaku pembimbing, serta Ibu Dr. Ir. Ratna Siri Hadioetomo yang
telah memberi saran.

Di samping itu penghargaan diberikan kepada staf Unit

Laboratorium Kimia Bahan Alam, Pusat Penelitian Bioteknologi-LIPI, Cibinong
Mbak Titi, Mas Judhi Rachrnat, Bustan, dan Teguh yang telah membantu selarna
pelaksanaan penelitian. Kepada Ibu, Bapak, Nenek, Mas Anto, dan Fitra, penulis

ucapkan terima kasih atas segala doa dan kasih sayangnya. Ungkapan terima kasih
juga disampaikan kepada Nani, Pak Sugeng, rekan-rekan TIP'99 khususnya Arief dan
Linda, warga Cirahayu 6 khususnya Rina dan Jeanny, rekan-rekan KSM dan
Tribisswara.
Semoga tesis ini dapat bermanfaat.

Bogor, Januari 2002
Dian Malini Oktovina

DAFTAR IS1

Halaman

DAFTAR TABEL ....................
.
....................................................................................... ix
DAFTAR GAMBAR.............................

.
.

.........................................................................
x

DAFTAR LAMPIRAN .........................................................................................................
PENDAHULUAN ........................

xi

.
.
.
..................................................................................1

Latar Belakang ............................................................................................................. 1
Tujuan .......................................................................................................................
2
Hipotesis............
.....
................................................................................................
3

Ruang Lingkup ............................................................................................................3
TINJAUAN PUSTAKA .......................................................................................................4
Artemisinin dan Turunannya ..........................................................................................
4
.............................................................
Struktur M a Artemisinin.................
.
4
Sifat Fisiko-Kimia Artemisinin .......................... .
.
......................................7
Perkembangan Metode Isolasi Artemisinin .........................
............................8
Produk Biotransformasi dan Potensi Mikroorganisme Endofit ..............:..................
9

.
.
.
.

METODOLOGI PENELITIAN ...........................................................................................1 1
Waktu dan Tempat Penelitian ...................................................................................
11
Bahan dan Alat .............................................................................................................
11
.
Metode Penelltian.........................................................................................................1 1
Penyiapan Contoh Isolat Kultur ......................................................................... 1 1
Penapisan Contoh Isolat Kultur .......................................................................
12
Penyiapan Medium Fermentasi ..........................................................................13
Penyiapan Inokulum .............,................................................................................
13
Fermentasi Kultur ...............
. . . ........................................................................ 13
Isolasi Produk Biotransformasi Arternisinin ..........................
.
..........................14
Identifikasi dan Karakterisasi Struktur ....:.......................
.
...............................14

.

HASIL DAN PEMBAHASAN ..............................................................................................
17
Penapisan Contoh Isolat Kultur....................................................................................
17
Karakteristik Isolat Terpilih .....................
............................................................. 22
.
Fermentasi Kultur Terpillh................ ...................................................................
2 2
Pengaruh Tingkat Perturnbuhan Kultur Terhadap Produksi Senyawa
Biotransformasi Artemisinin.................................................................................... 2 5
. . .
Ekstraksi dan Fraksinasi ................
.....................................................................
2 6
Identifikasi Produk Biotransformasi Artemisinin .....................
.
.
.
.......................26
Uji.. TLC ...............................,................................................................................
26

.

Uji HPLC

.
.

..........................................................................................................
vii

28

Identifikasi dan Karakterisasi Struktur....................................................................... 3 1
Spektnun IR ...................................................................................................... 3 1
GC-MS ....................................
..................3 2

.
.
.
.

KESIMPULAN DAN SARAN ............................

.
.............................................................
38

Kesimpulan .............................................................................................................
38
Saran..................
.. .................................................................................................3 9
DAFTAR PUSTAKA ........................ . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

...............4 0

LAMPIRAN ...................................................................................................................... 4 4

viii

DAFTAR TABEL
Halaman

Hasil uji TLC kultur fermentasi fungi endofit AT 21 dan AT 22 .................. 19
Hasil uji TLC kultur fermentasi bakteri endofit AT 11 dan AT 12 ...............21
Hasil uji TLC kultur fermentasi bakteri endofit AT 12 ...........................

28

Identifikasi berbagai gugus fhgsi dalam spektrum IR contoh kultur
bakteri AT 12 dengan artemisinin standar ..............................................

31

Perbandingan kromatogram GC contoh kultur bakteri AT 12 dan
artemisinin standar terhadap puncak-puncak dengan waktu retensi sama ..... 33
Hasil analisis fiagrnentasi MS contoh kultur bakteri AT 12 dan
artemisinin standar .....................................................................................
I

34

DAFTAR GAMBAR

Berbagai senyawa kimia artemisinin),dan turunannya hasil

. . . . . ................

.5

Struktur kimia artemisinin ................................................................

6

isolasi dari tanaman Artemisia spp. .................................

Tahapan isolasi, purifikasi mikroorgzrnisme endofit, ekstraksi dan
identifikasi produk biotransformasi attemisinin ..................... ......

..... ..... 16

Pertumbuhan sel kultur fungi endofit AT 2 1 dan AT 22 selama

.

fermentasi 14 hari .,......................
.
.. ..........

. . ... . .,.,. . . ,,,. .. ........,..... 18

Perubahan nilai pH kultur fungi endofit AT 2 1 dan AT 22 selama
fermentasi 14 hari .,............................

.,....,., . ,... ... ,.,... , . . , . .,,. ... ............ 18
,

Morfologi sel bakteri endofit AT 12 pada perbesaran 1000 kali ................... 22
Pertumbuhan sel dan perubahan nilai pH kultur bakteri endofit

AT 12 selama fermentasi...........
......

.............................................23

Penampakan daerah refraktil subterminal sel bakteri AT 12 pada
kultur fermentasi jam ke-30 ..........................

.
..............................24

Kromatogram hasil uji HPLC-detektdr UV artemisinin standar dan
contoh kultur AT 12 .....................,.......,.,.,,,,.,,.

. . . . .,,. ....... ,,, . . ... . 30
.
..... 36
Kromatogram GC-contoh kultur bakteri endofit AT 12 .......................
.
.
............... ......... .. 37
Kromatogram GC-artemisinin standar .....,......

DAFTAR LAMPIRAN

Kromatogram hasil uji HPLC-detektor UV artemisinin standar

.......................45
dan contoh biomassa kultur fungi AT 22 .........................
.
.
Kromatogram hasil uji HPLC-detektor UV artemisinin standar
46
dan contoh kultur bakteri AT 11 hari ke-3 .....................................................
Kromatogram hasil uji HPLC-detektor UV artemisinin standar
dan contoh kultur bakteri AT 11 hari ke-7 .................................................... 47
Kromatogram hasil uji HPLC-detektor UV artemisinin standar
dan contoh kultur bakteri AT 12 hari ke-1 .................................................. 48
Kromatogram hasil uji HPLC-detektor UV artemisinin standar
dan contoh kultur bakteri AT 12 hari ke-7 ....................................................49
Morfologi sel bakteri endofit AT 11 pada perbesaran 1000 kali ................... 50
Perhitungan kadar produk biotransformasi artemisinin (% blb)

............................... 51
dalam kultur bakteri endofit AT 12 ......................
.
.
.
Spektrum IR artemisinin standar dan contoh kultur sel bakteri AT 12 .......... 52
Morfologi sel hngi endofit AT 21 pada perbesaran 1000 kali ...................... 53
Morfologi sel fungi endofit AT 22 pada perbesaran 1000 kali ......................53
Spektrum massa artemisinin standar dan contoh kultur bakteri AT 12
(tR13.77 menit) ...........................................................................................

54

Spektrum massa artemisinin standar dan contah kultur bakteri A T 12

.................................................................... 55
(tR 14. 3 1 menit) .....................
.
Spektrwn massa artemisinin standar dan contoh kultur bakteri AT 12
56
(tR2 1. 74 menit) ...............................................................................................
Spektrum rnassa artemisinin standar dan contoh kultur bakteri AT 12
(tR 27. 94 menit) ............................................................................................. 57

Spektrum massa contoh kultur bakteri AT 12 ( t 22,
~ 84 menit) .....................58
Kromatogram hasil uji TLC artemisinin standar dan contoh kultur
bakteri AT 12 selama fermentasi 72 jam

.....................................................

59

PENDAHULUAN
Latar Belakang

Penyakit malaria merupakan masalah kesehatan yang utama di banyak negara
di dunia. Bagi negara-negara tropis keadaan tersebut cukup mengkhawatirkan karena
tingkat mortalitas penderita yang tinggi. WHO (1996) melaporkan bahwa sekitar
300-500 juta orang dijangkiti oleh parasit malaria. Hasil konferensi malaria di India
pada Agustus 1997 melaporkan bahwa setiap tahunnya sekitar tiga juta orang
meninggal akibat malaria dan sepertiganya adalah anak-anak. Malaria bahkan lebih
mematikan dibanding penyakit AIDS karena dapat mengakibatkan kematian hanya
dalam waktu 40 jam.
Obat antimalaria yang pertama kali digunakan adalah kuinin, suatu alkaloid
yang diekstrak dari kulit batang pohon kina (Cinchona). Selain itu juga digunakan
obat-obat sintetik seperti klorokuin, meflokuin, primakuin, pirimetamin, halofantrin,
dan sebagainya (Sukarban dan Zunilda 1995). Namun pengendalian malaria menjadi
bertambah sulit karena meningkatnya resistensi parasit Plasmodium terhadap obatobat tersebut. Beberapa galur P. falciparum menjadi kebal terhadap klorokuin dan
obat antimalaria lainnya. Oleh karena itu sangat perlu untuk meneliti senyawasenyawa antimalaria baru yang diperlukan sebagai ohat alternatif yang lebih ampuh
untuk mengatasi malaria, termasuk malaria resisten multidrugs (Ziffer et al. 1992;
Geldre et al. 1997).
Artemisinin (dikenal sebagai qinghaosu), suatu seskuiterpena lakton yang
memiliki jembatan endoperoksida, adalah senyawa aktif yang berkhasiat antimalaria
(Titulaer et al.

1990). Selama ini produksi artemisinin dan prekursornya, asam

artemisinat, mengandalkan beberapa herba genus Artemisia. Kohler et al. (1997)
melaporkan teknik ekstraksi dengan supercritical carbon dioxide (SOD) dari surnber
A. annua sementara Sari (2000) telah berhasil mengisolasi senyawa yang sama dari

spesies yang lain, yaitu A. sacrorum Ledeb. Hasil .uji aktivitas secara in vitro maupun
in vivo membuktikan bahwa artemisinin mampu bereaksi cepat dengan daya bunuh

tinggi dalam memerangi P. ./irlcij>trrlrnr baik yang peka maupun kebal klorokuin
(QACRG 1979).
Sebagaimana rnetabolit sekunder umumnya, kandungan artemisinin dalam
tanaman sangat rendah (0,O 1-0,5%). Hanya empat spesies dari sekitar 300 spesies
dalam genus Artemisia yang mengandung artemisinin, yaitu A. annua, A, apiacea, A.
lancea, dan A. sacrorum (Klayman 1993; Chan et al. 1997; Sari 2000). Hal

tersebut telah menyebabkan kesulitan dalam penyediaan artemisinin skala besar
disamping harganya yang relatif mahal (Geldre et al. 1997).
Salah satu cara terbaru dalam memproduksi senyawa metabolit sekunder sejenis
yang terdapat dalam tanaman adalah dengan memanfaatkan mikroorganisme endofit
yang hidup dalam jaringan tanaman. Mikroorganisme endofit adalah mikroorganime
yang hidup dan berasosiasi di dalam jaringan tanaman inang. Asosiasi yang terjadi
umumnya bersifat mutualistik, namun ada beberapa di antaranya yang bersifat
patogenetik. Mikroorganisme endofit diisolasi dari jaringan tanaman diturnbuhkan
pada medium fermentasi dengan komposisi tertentu. Di dalam medium fermentasi,
mikroorganisme endofit menghasilkan senyawa sejenis seperti yang terkandung pada
tanaman dengan bantuan aktivitas enzim. (Petrini et al.

1992).

Eksplorasi

mikroorganisme endofit potensial merupakan alternatif baru untuk mendapatkan
rendemen artemisinin dan turunannya secara lebih ekonomis dan menculcupi.
Penelitian ini dilatarbelakangi oleh masih adanya kesulitan dalarn penyediaan
artemisinin skala besar sebagai senyawa altarnatif antimalaria. Selama ini hanya
herba yang secara serius digali potensinya sebagai sumber artemisinin. Oleh karena
itu perlu dilakukan eksplorasi galur mikroorganisme endofit sebagai sumber potensial
artemisinin.
Tujuan

Penelitian ini bertujuan untuk mengisolasi dan mengidentifikasi produk
biotransformasi artemisinin sebagai zat aktif antimalaria dari galur mikroorganisme
endofit Artemisia annua terpilih. Galur tersebut berkemampuan memicu sekresi
artemisinin secara optimal.

Hipotesis

Galur mikroorganisme (fungi dan bakteri) endofit. yang sesuai dapat
ditumbuhkan dalam komposisi medium optimal. Produk biotransformasi mempunyai
profil kromatografi dan spektrum yang sama dengan artemisinin standar. Galur yang
terpilih mengandung artemisinin, sehingga juga dapat dijadikan sebagai sumber
potensial artemisinin.
Ruang Lingkup

Ruang lingkup penelitian ini n~eliputi:(i) penapisan isolat milroorganisme
endofit terpilih dalam medium pertumbuhan optimal, (ii) fermentasi kultur terpilih,
(iii) isolasi produk biotransformasi artemisinin, dan (iv) identifikasi serta
karakterisasi struktur.

TINJAUAN PUSTAKA
Artemisinin dan Turunnnnya

Artemisinin, suatu seskuiterpena lakton tipe kadinan yang memiliki jembatan
endoperoksida, adalah senyawa aktif yang berkhasiat antimalaria dan efektif terhadap
parasit Plasmodium yang resisten terhadap klorokuin dan malaria serebral (Titulaer et

al. 1990). Tinjauan oleh Edwards (1997), Bagchi et al. (1997), dan Kawamoto et al.
(1998) menyebutkan bahwa turunan semi sintetik artemisinin (Gambar 1) yang
banyak digunakan ialah artemether, arteether, dan artesunat, yaitu eter metil, eter etil,
dan ester hemisuksinat dari dihidroartemisinin serta arteannuin

Bydeoksiartemisinin,

asarn artemisinat, dan sodium artelinat.
Struktur Kimia Artemisinin

Hasil analisis spektrum massa resolusi tinggi ( d z 282,1470 M.') dan
analisis unsur (63,72% C; 7,86% H; dan 28,42% 0 ) menunjukkan bahwa rumus
molekul artemisinin adalah C15Hz205(Zheng 1994). Analisis kristalografi
sinar-X menunjukkan bahwa 15 atom karbon dan 5 atom oksigen dalam
molekul artemisinin terangkai dalam empat cincin heterosiklik.

Cincin A

merupakan sikloheksana berkonformasi kursi. Cincin D adalah 6-lakton yang
berperan terhadap bentuk pelekukan kursi.

Cincin B dan C merupakan

oksiheterosiklik jenuh. Data parameter struktural membuktikan bahwa cincin
AID, A/B, dan CID semuanya terikat secara cis, sedangkan D/B secara trans
(China Cooperative Research Group 1982). Gambar 2 menunjukkan hasil
interpretasi struktur kimia artemisinin (Klayman 1993). Bicchi dan Rubiolo
(1996) melaporkan bahwa artemisinin memiliki rangka karbon kadinan dengan
massa relatif 282.

THO?
,,llll~
q
-.

artemloW n

art emisiten

-

-

arteannuin B

.-

deoksbrtemidrin

4q W P
HO'

HOOC

0

HdOC

0

am mkdBfenisinat

a ~ ~mm # m t

edemida albhol

artemido leton

H

rnanru h A

rrtaidtul

R WJ artsmother
r

W$l$ rttetttrer

N,

oodiwm artelinate

artsrunsts

Ga~nbar1 . Berbagai senyawa ki~niaartemisinin dan turunannya hasil isolasi dari tanaman
Arlemisia spp. (Brown 1994; Ferreira dan Janick 1996; Meslinick et al. 1996;

Bagchi et al. 1997; Edwards 1997; Kawamoto et a/. 1998).

Artemisinin memiliki struktur unik yang berbeda dengan senyawa
antimalaria yang telah ada. Umumnya senyawa antimalaria memiliki cincin
heterosiklik yang mengandung atom nitrogen (termasuk golongan alkaloid),
seperti kuinin dan klorokuin (Meshnick et al. 1996). Namun artemisinin
merupakan golongan seskuiterpena dengan gugus endoperoksida tanpa adanya
atom nitrogen. Tinjauan oleh Meshnick et al. (1996) menduga bahwa kunci
aktivitas antimalaria terletak pada gugus endoperoksida karena senyawa
turunan yang tidak mempunyai gugus endoperoksida, seperti deoksiartemisinin,
dihidrodeoksiartemisinin,

artemisilakton, arteannuin

A,

arteannuin

E,

artemisinol, artemisia alkohol, dan artemisia keton ternyata tidak aktif.
Bagchi et 'al. (1997) turut melaporkan bahwa uji toksisitas artemisinin dan
arteether lebih tinggi dibandingkan senyawa turunan tanpa jembatan
endoperoksida (arteannuin B dan asam artemisinat). Struktur cincin kompleks
dari artemisinin.. tidak penting dan hanya jembatan endoperoksida yang
dibutuhkan untuk aktivitas trioksan, fenosan 50F, tetrosan, dan diterpen

peroksida (beberapa contoh peroksida organik) yang terbukti mempunyai
aktivitas antimalaria. Mekanisme aksi artemisinin diduga melibatlcan dua tahap
reaksi, yaitu aktivasi dan alkilasi. Artemisinin diaktivasi oleh besi molekuler
untuk

menghasilkan

radikal

bebas

dan

senyawa

antara

elektrofilik

(pengalkilasi) melalui pemenggalan jembatan endoperoksida. Spesies reaktif
tersebut akan bereaksi dengan merusak protein membran parasit.
Sifat Fisiko-Kimia Artemisinin
Artemisinin merupakan kristal jarum dengan sistem kristal ortorombik
(Chan et a1

1997), [ a ] " ~+66,3 dengan densitas 1,30 g/cm3. Beberapa

literatur menunjukkan kisaran titik leleh yang bervariasi, antara lain 156-157 OC
(QACRG 1979), 153-154 OC (Klayman et al. 1984), 150-152 OC (Acton et al.
1986), dan 154

OC

(ElSohly et al. 1990). Senyawa seskuiterpena ini larut

dalam pelarut aprotik, seperti kloroform, aseton, etil eter, dan etil asetat, tetapi
sedikit larut dalarn pelarut air dan minyak (Klayman 1985). Tinjauan oleh
Geldre et al. (1997) menyatakan bahwa studi stabilitas termal menunjukkan
stabilitas artemisinin sampai 150 OC, tetapi akan terdegradasi menjadi beberapa
produk bila dipanaskan pada 180-200 'c.
Tinjauan oleh Kohler et al. (1997) dan Brown (1994) menyebutkan
beberapa metode analisis artemisinin, di antaranya dengan uji kromatografi cair
kinerja tinggi dengan deteksi ultra violet dan elektro kimia (HPLC-UVIEC),
kromatografi lapis tipis (TLC), kromatografi gas (GC), enzimatis (enzymeimmunoassay), resonansi magnetik inti proton dan karbon ('H

- I3cNMR), dan

spektroskopi massa resolusi tinggi (MSIMS). Analisis artemisinin cukup sulit
dilakukan karena beberapa faktor. Senyawa ini relatif tidak stabil, kandungan
di dalam tanaman rendah, dan senyawa lain di dalam ekstrak kasar dapat
mengganggu pendeteksiannya. Identifikasi dengan TLC tidak dapat diandalkan
karena penampakan noda molekul kurang jelas. Hal ini disebabkan kurangnya
gugus kromofor pada artemisinin dan kurang kuatnya interaksi molekul dengan
silika gel.

Sementara itu, adanya konstituen yang terserap pada panjang

gelombang 2 10 nm dalain identifikasi menggunakan HPLC-UV n~enyebabkan
puncak artemisinin tidak tampak (Geldre et al. 1997).

.

Perkenlbangan Mctode Isolasi Artemisinin

Berbagai metode isolasi arten~isininterus diteliti dan dikembangkan. Hal ini
disebabkan kandungan arten~isininyung rendah dalam tanaman (< 0,13%) (Chan et

al. 1995) sehingga dibutuhkan sumber lain (seperti dari mikroorganisme endofit)
untuk dapat menghasilkan artemisinin dengan rendemen tinggi.
Pada tahun 1972, QACRG melakukan isolasi artemisinin dari A. annua yang
tumbuh di Cina. Kimiawan Cina yang tergabung dalam QACRG tersebut hanya
mengatakan bahwa pelarut yang digunakan adalah dietil eter, tanpa menjelaskan
prosedurnya dengan rinci.
Klayman et al. (1984) melakukan penelitian secara menyeluruh mengenai
isolasi artemisinin dari A. annua yang tumbuh di Washington, D.C. Pelarut yang
digunakan adalah berbagai pelarut organik bertitik didih rendah, seperti dikloro
metana, kloroform, dietil eter, petroleum eter, dan dimetil keton.

Hasil seleksi

menunjukkan bahwa jenis pelarut petroleum eter (td. 30-60 OC) dinilai paling baik
untuk kepentingan tersebut.

Sementara fraksinasi dilakukan dengan metode

kromatografi kolom menggunakan fase gerak 7,5% etil asetatlkloroform. Ekstraksi
daun A. annua menghasilkan 0,06% artemisinin (153-154 OC). Namun metode ini
masih memiliki kelemahan karena artemisinin yang dihasilkan masih terkotori oleh
-1 0% artemisiten, sehingga perlu pemurnian lebih lanjut dengan metode HPLC.
Acton et al. (1986) menyarankan penggunaan Ito multilayer coil separator-

extractor untuk fraksinasi dan pemurnian artemisinin. Penggunaan radas Ito ini
diketahui lebih praktis dan ekonomis dibandingkan dengan HPLC.

Sementara

ekstraksi dari A. annua yang tumbuh di Silver Spring, MD, Amerika Serikat
!

menghasilkan 0,07% artemisinin murni (1 50-152 OC).

Kohler et al. (1997)

melaporkan teknik isolasi terbaru dengan mengekstraksi artemisinin berikut
prekursornya (asam arternisinat) dari A. unnua menggunakan supercritical carbon
dioxide (S 0 D).

Produk Biotransformasi dan Potensi Mikroorganisme Endofit
Beberapa cara sintesis artemisinin telah dilaporkan, namm akibat molekul yang
agak kompleks maka senyawa ini tidak mungkin disintesis secara kimia dengan cara
yang murah. Vandenberghe et al. (1995) menambahkan bahwa herba A. annua tetap
merupakan sumber yang praktis bagi senyawa antimalaria ini.

Salah satu

pendekatannya ialah meningkatkan kadar atau produktivitas biosintesis artemisinin
melalui rekayasa genetika. Hal ini hanya dapat dilakukan apabila proses enzimatik
yang mengatur jalur biosintesis artemisinin diketahui, sehingga jalur ini dapat
dikendalikan. Prekursor utama seskuiterpena, farnesil pirofosfat, disintesis dari asam
mevalonat. Farnesil pirofosfat dapat bersiklikasi menghasilkan antara lain rangka
germakran dan kadinan.

Setelah oksidasi, dihasilkan asam artemisinat (asam

artenuat). Telah disarankan oleh Nair dan Basile (1993) bahwa asam artemisinat ini
dapat mengalami biokonversi menjadi arteannuin B, dan selanjutnya via artemisiten
menjadi artemisinin.
Beberapa galur fungi diketahui berperan dalam hidroksilasi mikrobial senyawa
seskuiterpena. Adanya gugus hidroksil tunggal di dalam senyawa artemisinin
membatasi jumlah dan macam turunan yang diproduksi. Hidroksilasi mikrobial dapat
memungkinkan preparasi senyawa-senyawa baru turunan artemisinin yang lebih
beragam dengan aktivitas antimalarianya. Penentuan suatu metode mikrobial yang
dapat mengintroduksikan suatu gugus hidroksil ke dalam salah satu metil yang tidak
teraktivasi atau gugus metilen perlu diperhatikan (Ziffer et al. 1992).
Hufford et al. (1995) melaporkan bahwa arteether yang diperoleh dari
.

dihidroartemisinin, suatu hasil reduksi artemisinin dengan NaBH4, mengalami
metabolisme

oleh mikrooorganisme Cunninghamella elegans ATCC

9245

menghasilkan la-hidroksiarteether dan 9P-hidroksiarteether yang dapat dipisahkan
dari kultur C. elegans,
,
metabolit dapat dipisahkan dari kultur fermentasi Streptomyces

lavendular L 105.
Produksi metabolit sekunder ini dapat dilakukan dengan beberapa cara.
Psopagasi kultur miksoorganisme yang potensial dapat dilakukan sehingga diperoleh
hasil yang serupa ckstraksi dari hihir ~ ~ n a m abahkan
n
dengan rendemen yang lebih

besar dan waktu yang lebih singkat. Produksinya dapat pula dilakukan secara
langsung, yaitu dengan menyiapkan kultur contoh yang dilanjutkan dengan kultur
dalam fermentor.
Beberapa galur mikroorganisme endofit digunakan untuk mengintroduksi gugus
hidroksil ke dalam senyawa artemisinin dan berbagai turunannya.
(1992) menggunakan

spesies fungi Beauveria

sulfurescens

Ziffer et al.
dalam proses

biotransformasinya sehingga dihasilkan senyawa intermediet atau prekursor untuk
sintesis senyawa turunan lebih lanjut.
Produksi turunan artemisinin melalui hidroksilasi mikrobial pada kondisi
preservasi jembatan endoperoksida diperlukan untuk aktivitas antimalaria. Turunanturunan

artemisinin yang

terhidroksilasi

tersebut

dapat

digunakan

untuk

menghasilkan alternatif artemisinin yang berguna. Produk turunan disiapkan dengan
mereduksi lakton menjadi suatu ketal yang memiliki gugus hidroksil (Ziffer et al.
1992). Tinjauan oleh Kawamoto et al. (1998) menyebutkan bahwa spesies fungi

Mucor mucedo dan Aspergillus flavipes dilaporkan dapat menghasilkan epimerik 3hidroksi asam artemisinat.

METODOLOGI PENELITIAN
Waktu dan Tempat Penelitian
Penelitian ini dilaksanakan mulai dari bulan Juni sampai November 2001 di
Laboratorium Kilnia Bahan Alam, Laboratorium Fermentasi, dan Laboratorium
Pakan, Pusat Penelitian Biotcknologi-LIPI, Cibinong. Analisis spektroskopi infra
merah (IR) dan kromatograti gas spcktrum lnassa (GC-MS) masing-masing dilakukan
di Laboratorium Terpadu-II'B, Bogor dan Laboratorium Pengawasan DopingDepartemen Kesehatan, Jakarta.
Bahan dan Alat
Bahan-bahan yang digunakan adalah isolat beberapa galur fungi endofit (AT 21
dan AT 22) serta bakteri endofit (AT 11 dail AT 12) koleksi Laboratorium Kimia
Bahan Alam, medium (xyz, potato dextrose agar (PDA), sabouraud dextrose agar
(SDA), nutrient agar (NA)), bahan kimia lain (asam borat, kloroform, n-heksana, etil
asetat, metanol, asetonitril, serium sulfat, lcristal ungu, iodin, safranin) silika gel,
pasir laut, alkohol, dan akuades.
Alat-alat yang digunakan meliputi shaker, laminar air flow, vorteks,
microwave, pH meter, spektrofotometer UV-Vis, IR, instrumen CC, TLC, HPLC, dan
GC-MS, mikroskop, otoklaf, neraca analitik, vaccum Jilter, kertas saring, serta
peralatan gelas. Sebagai standar digunakan artemisinin produksi Aldrich, Chem. Co.,
USA.
Metode Penelitian
Penyiapan Contoh Isolat Kultur
Isolat yang diujikan adalah beberapa galur mikroorganisme endofit, yaitu
fungi AT 21 dan AT 22, serta bakteri AT 11 dan AT 12 koleksi Laboratoriurn
Kimia Bahan Alam, Pusat Penelitian Bioteknologi-LIPI, Cibinong.

Isolat

murni yang didapatkan disegarkan pada mediym sahouraud ckxtrose agar

-

(SDA) miring (untuk fungi) dan nutrient agar (NA) miring (untuk bakteri)
dalam tabung reaksi untuk selanjutnya diinkubasi selama tujuh dan dua hari
pada suhu ruang. Isolat tersebut ditapis dalam medium xyz untuk selanjutnya
disimpan dalanlfreezer sampai waktunya dipergunakan.
Penapisan Contoh Isoiat Kultur

Sebanyak satu lup dari tiap-tiap isolat diinokulasikan ke dalam 20 ml
medium xyz dalam tabung reaksi 50 ml secara simplo. Kultur selanjutnya
diinkubasi dalam shaker pada 200 rpm, suhu ruang, selama 7-14 hari.
Pengamatan dilakukan setiap hari selama berlangsungnya ferrnentasi,
meliputi: (i) penentuan konsentrasi sel bakteri dengan metode turbidimetri pada
panjang gelombang 660 nrn, (ii) penentuan biomassa kering sel fungi, (iii)
pengukuran pH dengan menggunakan pH meter, dan (iv) pengamatan
mikroskopis dengan perbesaran 400 dan 1000 kali.
Isolasi dilakukan dengan mengekstraksi sebanyak tiga kali terhadap f 20
ml contoh fermentasi dengan 15 ml kloroform dan diuapkan.

Contoh

diekstraksi dengan cara dihomogenisasi dengan alat vorteks hingga tercampur
rata. Lapisan bawah (jernih) yang terbentuk merupakan filtrat yang terdiri atas
kloroform dan campuran metabolit sekunder.

Sernentara lapisan atas

merupakan medium yang terekstraksi bersama pelarut. Masing-masing filtrat
yang terbentuk dipisahkan dan dilteringkan. Ekstrak kering selanjutnya diuji
dengan TLC dan HPLC. Kemurnian produk diuji dengan melakultan purifikasi
lebih lanjut dengan menginjeksikan contoh pada instrumen HPLC setelah
dilakukan fraksinasi dengan kromatografi kolom.
Contoh isolat yang digunakan merupakan isolat terpilih hasil penapisan
dalain medium xyz, selanjutt~yadigunakan dalam fermentasi dan isolasi produk
biotransformasi.

Penyiapan Medium Fermcntasi

Medium fermentasi yang digunakan dalam penelitian ini adalah medium
xyz.

Inforniasi nicngenai komposisi medium tersebut belum dapat

dipublikasikan. Medium fermentasi disiapkan dalam labu Erlenmeyer
berukuran 250 ml dengan volume kerja 100 ml. Bahan-bahan medium tersebut
selanjutnya disterilisasi dalam otoklaf pada suhu 121°c, 1 atm selama 15 menit.
Setelah dingin semua bahan dicampurkan secara aseptis.
Penyiapan Inokulum

Tnokulum disiapkan dengan dua tahapan. Mula-mula biakan disegarkan
pada medium potato dextrose agar (PDA) miring (untuk fungi) dan nutrient

agar (NA) miring (untuk bakteri) dalam tabung reaksi untuk selanjutnya
diinkubasi selama tujuh dan dua hari pada suhu ruang. Selanjutnya, biakan
diinokulasikan ke dalam 100 ml medium pembibitan dengan inenggunakan 5
ml air steril. Medium pembibitan dibuat dengan komposisi yang sama dengan
medium fermentasi, Kultur pembibitan selanjutnya dinkubasi dalam shaker
pada 200 rpm dan suhu ruang, selama 24 jam.
Fermentasi Kultur

Sebanyak 10% inokulum dari labu pembibitan diiinokulasikan ke dalam
100 ml medium fermentasi dalam labu Erlenmeyer 250 ml secara duplo. Kultur
selanjutnya dinkubasi dalam shaker pada 200 rpm dan suhu ruang, selama 7-14
hari.
Pengamatan dilakukan setiap hari selama berlangsungnya ferrnentasi,
meliputi: (i) penentuan konsentrasi sel bakteri dengan metode turbidimetri pada
panjang gelombang 660 nrn, (ii) penwtuan biomassa kering sel fungi, (iii)
pengukuran pH dengan menggunakm pH meter, dan (iv) pengamatan
mikroskopis dengan perbesaran 400 dan 1000 kali.
Kultur sel terpilih difermentasi kembali dengan peningkatan skala
masing-masing bervolume kerja 300 ml dan 600 ml.

Produksi pertama

dilakukan dalam enam labu Erlenmeyer 250 ml dengan tiap-tiap volume kerja
50 ml. Produksi kedua dilakukan secara simplo dalam botol Schott 1000 ml
dengan volume kerja 600 nll yang dilengkapi dengan aerator.
Isolasi Produk Iliotransformasi Artcmisinin
Isolasi dilakukan dengan mcngekstraksi sebanyak tiga kali terhadap 5 ml
conto11 fermentasi dengan 5

1111 kloroform

dan diuapkan. Contoh diekstraksi

dengan cara dihomogenisasi dengan alat vorteks hingga tercampur rata.
Lapisan bawal~(jernih) yang terbentuk merupakan filtrat yang terdiri atas
kloroform dan campuran metabolit sekunder.

Sementara lapisan atas

merupakan medium yang terekstraksi bersama pelarut. Masing-masing filtrat
yang terbentuk dipisahkan dan dikeringkan. Ekstrak kering selanjutnya diuji
dengan TLC dan HPLC. Kemurnian produk diuji dengan melakukan purifikasi
lebih lanjut dengan menginjeksikan contoh pada instrumen HPLC setelah
dilakukan fraksinasi dengan kromatografi kolom.
Identifikasi dan Karakterisasi Struktur
Mula-mula ekstrak kering dilarutkan dengan beberapa tetes kloroform.
Uji TLC dilakukan dengan menotolkan contoh dan standar pada pelat TLC
(silika gel 60

F254),

Fase geraknya terdiri atas n-heksana : etil asetat (5:l).

Penanda noda yang digunakan adalah serium sulfat. Hasil uji TLC digunakan
untuk identifikasi dengan uji HPLC. Uji ini menggunakan identifikasi nilai Rf
contoh terhadap standar. Nilai Rf diperoleh berdasarkan perbandingan antara
jarak yang ditempuh zat dalam contoh dengan jarak yang ditempuh pelarut.
Uji TLC yang menunjukkan adanya noda dengan warna khas dilanjutkan
dengan uji HPLC.

Ekstrak kering dilarutkan dengan 0,5 ml kloroform

kemudian dipekatkan. Sebanyak 10-50 p1 hasil preparasi ini diinjeksikan pada
instrumen HPLC. Fase geraknya terdiri atas bebeiapa sistem yang divariasikan,
yaitu: (i) n-heksana : etil asetat (5:l); (ii) asetonitril : air (1:l); (iii) asetonitril :
air ( 1 0: 1); (iv) asetonitril : air (1: 10); dan (v) metanol : air (1 0: 1). Senyawa

yang terdeteksi akan keluar berupa puncak kromatogram dengan waktu retensi
yang dibandingkan dengan standar.

Identifikasi produk biotransformasi

artemisinin dan turunannya dilakukan dengan menginterpretasikan data-data
spektrum IR dan kromatogram GC-MS dari artemisinin hasil isolasi dengan
artemisinin standar.

Sampel Tanaman Artemisia annua
batang (kayu + kulit)
preparasi :
dicuci dengan air kran (10 menit)
dipotong 1 cm

+

4
Batang Keras
disterilisasi dengan :
etanol 75% (1 menit)

disterilisasi dengall :
etanol 75% (1 menit)
kloroks (5 menit)

dikeringkan dengan kertas steril
dibelah menjadi 2 bagian memanjang
diletakkan dan dibiakkan dalam cawan agar
(2 jenis medium)

v

4

inkubasi 3-5 hari pada
suhu kamar

Corn Meal Malt Agar + Kloramfenikol
(untuk fungi)

1

4
Nutrient Agar + Nistatin

(untuk bakteri)

I

4
Purifkasi (teknik cawan gores)

.......,....,......,...,.. . . ... ..... .,........,.....,,..,....... ... ,

,

pada medium Potato Dextrose Agar dan Nutrient Agar
........
. ....
..............................................................................
......................................................

I

lsolat Murni

penyegaran isolat pada
Sabouraud Dextrose Agar
Nutrient Agar

+

v
Penapisan lsolat Terpil;ih pada Medium xyz
pengkulturan + fermentasi isolat
pada medium cair

v

Produksi

Kultur Cair (100 ml)

fermentasi 7-14 hari

sampling 5 ml (steril)

4 ,

4

Pengukuran OD, biomassa kering, pH,
Pengamatan mikroskopik

Ekstrak Kering
*

ldentifikasi + Karakterisasi Struktur

Uji TLC, HPLC

4
Sampel Murni

Gambar 3. Tallapan isolasi, purifikasi mik~.oorganisrneendofit, ekstraksi dan identifikasi produk
biotransforlnasi artcmisinin.

HASIL DAN BEMBAHASAN

Panapisan Contoh Isolat Kultur
Isolat yang diujikan pada awal percobaah meliputi beberapa galur
mikroorganisme endofit, yaitu fungi AT 21 dan AT 22 serta bakteri AT 11 dan AT
12 koleksi Laboratorium Kimia Bahan Alan, Pusat Penelitian Biotelaologi-LIPI,
Cibinong. Di antara keempat galur tersebut, bakteri AT 12 mempunyai profil uji
p r ~ d u k biotransformasi artemisinin yang dinilai paling memadai.

Beberapa

parameter yang menentukan antara lain: (i) pertumbuhan sel kultur, (ii) nilai pH
selama fermentasi kultur, serta (iii) uji TLC dan HPLC.
Gambar 4 memperlihatkan bahwa laju pertumbuhan sel kultur fungi AT 22
lebih tinggi dari pada fungi AT 21. Hal ini ditandai dengan bobot biomassa kering
sel AT 22 yang 13 kali lebih besar (0,65 g) dibandingkan AT 21 (0,05 g) setelah
fermentasi berlangsung 14 hari.
Sementara profil pH selama fermentasi 14 hari unt~lkkedua galur tersebut
relatif sama seperti tampak pada Gambar 5 dengan kisaran nilai pH 4,Q5-5,93.
Ki~arantersebut terrnasuk kedalam kisaran pH optimum pertumbuhan (43-53) bagi
fungi (Crueger dan Crueger 1984). Nilai pH kultur pada awal fermentasi mengalami
pemurunan. Pada kultur fungi AT 21 terdeteksi penurunan nilai pH dari 5,93 menjadi
5,06. Demikian pula pada kultur fungi AT 22, nilai pH semula 5 9 3 menjadi 5,08.
Produk biotransformasi artemisinin yang terdeteksi pun masih relatif rendah. Diduga,
katalisis enzim ekstrasel yang kurang sempwrna mempengaruhi ha1 tersebut. Perlu
adanya penambahan buffer ataupun sistem kontrol pH untuk menjaga kisaran nilai
pH. Menurut Judoamidjojo et al. (1989), fluktuasi nilai pH berkaitan dengan
kestabilan pembentukan dall katalisis enzim, fungsi membran dan komponen sel.
Tampaknya, nilai pH yang teramati cenderung fluktuatif sehingga mengganggu
pertumbuhan sel dan produksi metabolit yang diinginkan (Darwis dan Sukara 1990).
Identifikasi produk biotransformasi artemisinin dengan uji TLC menunjukkan
bahwa produk tersebut dapat dijii~npai baik pada filtrat maupun biomassa.

Kromatogram TLC AT 21 menunjukkan uji positif setelah fermentasi hari ke-10.
Berbeda halnya dengan kromatogram TLC AT 22 yang menunjukkan uji positif
segera setelah hari ke-3.

Dengan demikian, kultur AT 22 diduga lebih cepat

menghasilkan produk biotransformasi arternisinin meskipun sempat tidak dapat
diindera pada hari ke-6 (Tabel 1). Ketidakstabilan penampakan noda pada beberapa
contoh uji dimungkinkan terjadi karena ketidakstabilan produksi senyawa
biotransformasi artemisinin, kurangnya gugus kromofor pada artemisinin, dan kurang
kuatnya interaksi molekul dengan silika gel.
h

0.62
0.52
0.42

y 0.32

1 0.22

g

0.12
0.02
1

2

3

5

4

6

7

9

8

1 0 ' 1 1 1 2 1 3 1 4

Waktu Fermentasi (Hari)

Gambar 4. Pertumbuhan sel kultur fungi endofit AT 21 dan AT 22 selama fer~nentasi14
hari. Data yang disajikan berasal dari fei-mentasi simplo.

6.0
5.5

5

.R 5.0

+AT21

2
4.5
4.0

0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

1011121314

W u Fermentasi (Hari)
Gambar 5 .

Perubahan nilai pH kultur fungi endofit AT 21 dan AT 22 selama fermentasi 14
hari'. Data yang disajikan berasal dari fermentasi simplo.

coklat (2)

6

7

8

Biomassa

(-1

(+I

Filtrat
Biomassa
Filtrat

(-1

(-)

(-1

Biomassa
Filtrat

2

ungu
coklat

(+I

3

ungu
coklat (2)

(-1

(+I

3

ungu (2)

(-)

(+)

4

coklat
ungu (2)

(-)

coklat (2)

9

Biomassa

(-1

(+)

3

ungu (2)

Filtrat

(-1

(+)

4

coklat
ungu (2)
kuning (2)

10

Biomassa
~iltrat-

(-)

(-1

(+)

1

ungu

025

4

ungu

(+)

3

(+I

1
1
1
1
1
1

hijau
ungu-merah
(2)
coklat
coklat
coklat
coklat
coklat
coklat

0,67
0,52
0,33
0,25
0,28
0,21
0,17
0,35
0,22
0,34
0,22
0,34
0,22

1

ungu-hitam

0,25

1
1

ungu-hitam
coklat
ungu-hitam
coklat
ungu-hitan~

0,25
0,20
0,25
020
0,25

1

coklat

0,25

I

11

12
13
14

Filtrat
Biomassa
Filtrat
Biomassa
Filtrat
Bion~assa
Filtrat
Biomassa

(-)
(+)
(-)
(+)
(+)
(+)

(+I
(+)

1
I
I

0,20
0,s 1
0,61
0,28
0,16
035
0,35
0,28
0,67
0,57
0,25
0,17
0,55
0,34
0,25
0,70
0,53

(+)
(+)
j

Biomassa

0,28
0,65
0,27
0,59

(+)
(+)
(+)
(+)
(+)

(-1
(+)

Hasil uji HPLC terhadap contoh kultwr fungi endofit menunjukkan bahwa
kromatogram dengan identifikasi positif hanya dijurnpai pada c ~ n t o hbiomassa kultur

AT 22 hari ke-4 (Lampiran 1). Pada kromatogram HPLC standar artemisinin terlihat
pita elusi dengan waktu retensi 9,15 menit. Sementara pada kromatogram contoh
terlihat dua pita elusi yang saling berdekatan dengan8waktu retensi masing-masing
9,22 menit dan 10,09 menit. Pita elusi pertarna diidentifikasi sebagai puncak produk
biotransformasi artemisinin sedangkan pita elusi kedua diduga sebagai senyawa
pengotor ataupun produk dekomposisi.
Berdasarkan hasil perbandingan parameter uji terhadap dua kultur sel bakteri
endofit, yaitu AT 11 dan AT 12 terpilih kdtur AT 12.

Fermentasi' pada tahap

penapisan ini berlangsung selama tujuh hari. Profil tingkat pertumbuhan kultur dan
nilai pH tidak mengikuti pola kurva pertumbuhan Monod. Fermentasi kultur sel
bakteri umumnya berlangsung singkat (54-72 jam), namun pada tahap ini tidak
dilakukan sampling pada setiap kurun waktu kritis pembelahan yang biasanya
berkisar tiga jam sampai berakhirnya fase logaritmik. Namun diketahui dari profil
urnum tingkat pertumbuhan kultur bahwa nilai OD kultur sel AT 12 lebih tinggi
(0,56) dibandingkan nilai OD kultur sel AT 11 (0,15) pada saat pemanenan produk di
akhir fermentasi. Sementara profil pH selarna fermentasi untuk kedua galur tersebut
relatif sama. Kisaran pH kultur fermentasi AT 11 adalah 4,80-5,38 sementara kultur

AT 12 memiliki kisaran nilai pH antara 4,34-4,99.
Identifikasi produk biotransformasi artemisinin dengan uji TLC menunjukkan
identifikasi positif, yaitu seluruh noda contoh relatif sejajar senyawa artemisinin
standar (Tabel 2). Seluruh contoh uji memiliki nilai kisaran Rf yang hampir sama
dengan nilai Rf senyawa artemisinin standar yakni antara 0,29-0,39. Noda senyawa
artemisinin standar berwarna kuning-jingga sementara noda contoh berwarna
keunguan. Diduga, residu-residu contoh uji masih bercampur dengan senyawa
pengotor yang terdapat dalam kultur fermentasi sehingga memiliki penampakan
warna yang berbeda dengan sc.nyi1u.a standarnya yang relatif murni.

Hasil uji HPLC terhadap contoh kultur bakteri endofit AT 11 dan AT 12
menunjukkan identifikasi positif (Lampiran 2-5). Pada kromatogram HPLC standar
artemisinin terlihat pita elusi dengan waktu retensi 1,0,20 menit, sedangkan pada
kromatogram contoh kultur AT 11 hari ke-3 dan hari ke-7 terlihat pita-pita elusi
dengan waktu retensi masing-masing 11,55 dan 11,71 menit. Kromatogram contoh
kultur AT 12 hari ke-1 dan hari ke-7 memperlihtttkan pita-pita elusi dengan waktu
retensi masing-masing 11,36 menit dan 11,42 menit.

Produk biotransformasi

artemisinin yang dihasilkan oleh kultur AT 12 diduga berkadar lebih tinggi
dibandingkan kultur AT 11. Hal ini dapat dilihat dari perbandingan luas puncak
keduanya seperti terlihat pada Lampiran 2-5.
Hasil pengamatan mikroskopis dengan perbesaran 1000 kali memperlihatkan
bahwa sel vegetatif bakteri basil AT 12 berukuran lebih besar (Gambar 6 ) daripada
sel vegetatif bakteri basil AT 11 (Lampiran 6). Hal ini kemungkinan berkaitan
dengan kadar enzim ekstrasel yang disekresikan oleh kantung kelenjar sel tersebut
dalam memicu pembentukan produk biotransformasi artemisinin.
I

Karakteristik 1sdat Terpilih
lsolat terpilih yang digunakan dalam fermentasi dan isolasi produk
biotransformasi adalah bakteri endofit galur AT 12. Galur AT 12 sengaja dipilih
dengan beberapa pertimbangan antara lain waktu fermentasi relatif singkat (72 jam),
laju pertumbuhan sel kultur relatif tinggi, nilai pH yang cenderung stabil (4,52-5,76),
dan uji positif pada kromatogram TLC dan HPLC untuk menghasilkan produk
biotransformasi artemisinin.
Hasil identifikasi menunjukkan bahwa galur AT 12 merupakan bakteri Gram
positif dengan sel vegetatif berbentuk batang (basil) serta bersifat motil.

Pada

medium padat, koloninya tarnpak berwarna putih kekuningan dengan permukaan
kasar dan tepian tidak teratur. Galur AT 12 juga memiliki endospora di bagian
subterminal sel seperti tampak pada Gambar 6 berikut.

Gambar 6. Morfologi sel bakteri endofit AT 12 pada perbesaran 1000 kali. Sel
dengan endospora subterminal ditunjukkan di dalam lingkaran.
Fermentasi Kultur Terpilih
Fermentasi kultur terpilih dilakukan dalam sistem batch.

Pada sistem ini,

setelah medium diinokulasi tidak dili~kukan lagi pengaturan konsentrasi substrat
ataupun metabolit-metabolit cair yang dihasilkan selama fermentasi (Stanbury dan
Whitaker 1993).
Perigamatan'terhadap pertumbuhan sel kultur bakteri AT 12 dan perubahan pH
selama fermentasi terlihat pada Gambar 7.

Skala fermentasi yang dicobakan

memperlihatkan adanya fase lag yang cukup panjang, yaitu berlangsung sampai 15
jam. Hal ini disebabkan karena medium fermentasi tidak dikondisikan pada pH netral
atau pH optimum pertumbuhan. Menurut Stanbury dan Whitaker (1993), fase lag
umumnya diusahakan berlangsung sesingkat mungkin. Kondisi medium fermentasi
dibuat sedemikian untuk mengetahui kondisi alamiah kultur. Oleh karena itu sel-sel
bakteri AT 12 tidak segera membelah dengan cepat sehingga baru memasuki fase
logaritmi k setelah jam ke- 15. Pertumbuhan secara eksponensial ini berlangsung
hingga jam ke-30. Setelah memasuki jam ke-30, pertumbuhan sel kultur terlihat
statis hingga akhir jam ke-58, walaupun cenderung mengalami penurunan segera
setelah jam ke-42. Fermentasi kultur diakhiri setelah berlangsung 72 jam karena
pertumbuhan sel telah terhenti.
Pengamatan terhadap nilai pH selama berlangsungnya fase logaritmik
memperlihatkan adanya penurunan, yakni dari 4,9 menjadi 4,6. P e n m a n pH
disebabkan karena proses katabolisme surnber karbon oleh sel AT 12 yang
menyebabkan terakumulasinya asam di dabarn medium.

Menurut Benoit et al.

(1990), asam-asam yang terakumulasi dari proses tersebut pada umumnya meliputi
asam laktat, asam piruvat, dan asarn asetat.
B

E
8
'9

'

0.8

0.6

.z

0.4
0.2

2

0

.-

+pH
0 3 6 9 12 15 18 24 30 36 42 48 54 58 72

4.5

Waktu Fermentasi (Jam)

Gambar 7. Pertumbuhan sel dan perubahan nildi pH kultdr bakteri endofit AT 12 selama
fermentasi. Data yang disajikan merupakan nilai rata-rata dua ulangan
fet-mentasi.

Pertumbuhan sel kultur AT 12 tampak tidak optimum karena kondisi aerasi
minimum.

Menurut Flores

el

ul. (1997), banyaknya transfer .oksigen ke dalam

medium kultur fermentasi bakteri sejenis mendukung pembentukan spora yang lebih
banyak.
Kultur mulai memasuki fase stasioner setelah 24 jam fermentasi. Diduga,
bersamaan itu pula sel mengalami sporulasi. Proses ini ditandai dengan terbentuknya
daerah refraktil yan