Pengembangan Metode Deteksi Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis pada Benih Tomat

PENGEMBANGAN METODE DETEKSI
Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis
PADA BENIH TOMAT

TITI SUMARTI

SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2009

2

PERNYATAAN MENGENAI TESIS DAN
SUMBER INFORMASI
Dengan ini saya menyatakan bahwa tesis Pengembangan Metode Deteksi
Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis pada Benih Tomat karya saya
dengan arahan dari komisi pembimbing dan belum diajukan dalam bentuk apa
pun kepada perguruan tinggi manapun. Sumber informasi yang berasal atau
dikutip dari karya yang diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari penulis lain telah
disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam Daftar Pustaka di bagian akhir

tesis ini.

Bogor, Februari 2009

Titi Sumarti
NIM A451064124

3

ABSTRACT
TITI SUMARTI. The Development of Detection Method for Clavibacter
michiganensis subsp. michiganensis on Tomato Seed. Supervised by
GIYANTO and KIKIN HAMZAH MUTAQIN.
Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis (Cmm), the causal agent
of bacterial cancer of tomato, is of special interest because of its damage and
worldwide distribution. Cmm is recorded as an important pathogen in the pest
quarantine list in the European Community and many other countries. The
objective of this research is to develop detection method for Cmm on tomato
seed which has some advantages i.e. easy, quick, and accurate. The research
was conducted in Bacteriology and Bio-molecular Laboratories at Balai Besar Uji

Standar Karantina Pertanian, Jakarta, during July 2008-February 2009. The
research included isolation and identification of Cmm from plant, comparison of
nucleic acid extraction methods and PCR conditions, and detection of Cmm from
eight tomato seed varieties. This study showed that Cmm was detected on
tomato stem obtained from Solok, West Sumatera. Identification of bacterial
isolates as Cmm was carried out with BiologTM, ELISA, and PCR assay.
Extraction methods of Cmm from SCM broth in which bacterium-artificially
inoculated tomato seed was grown with different incubation periods (6, 12, and
24 hours) resulted in positive detection with ELISA. Absorbance value of sample
extracted from bacterium-grown SCM broth was higher than that of extracted
from PBS buffer. Detection using PCR assay showed that Cmm was positively
detected in both SCM broth and PBS buffer grown with tomato seed that
artificially infested with Cmm at 107 CFU/ml and were incubated for 24 hour.
Cmm was detected on one of eight varieties of tomato seed using PCR test.
Key words: tomato seed, C. michiganensis subsp. michiganensis, detection,
isolation, identification, incubation, Biolog, ELISA, PCR

4

RINGKASAN

TITI SUMARTI. Pengembangan Metode Deteksi Clavibacter michiganensis
subsp. michiganensis pada Benih Tomat. Dibimbing oleh GIYANTO dan KIKIN
HAMZAH MUTAQIN.
Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis (Cmm) adalah penyebab
penyakit kanker bakteri pada tanaman tomat yang mendapat perhatian khusus
karena tersebar luas di dunia. Cmm merupakan patogen tanaman yang
termasuk dalam daftar patogen karantina di negara-negara Eropa bahkan di
dunia internasional.
Penelitian ini bertujuan untuk mengembangkan dan
mendapatkan metode deteksi Cmm pada benih tomat yang mudah, cepat dan
akurat.
Penelitian dilaksanakan pada bulan Juli 2008 sampai dengan Februari
2009 di Laboratorium Bakteriologi dan Laboratorium Bio Molekuler Balai Besar
Uji Standar Karantina Pertanian, Jakarta.
Penelitian meliputi isolasi dan
identifikasi Cmm dari tanaman tomat bergejala, perbandingan metode ekstraksi
DNA dan kondisi PCR, uji beberapa metode deteksi Cmm pada benih tomat
dengan inokulasi buatan, dan deteksi Cmm pada beberapa varietas benih tomat.
Hasil penelitian menunjukkan bahwa Cmm sudah ditemukan di Indonesia
dan berhasil diisolasi dari batang tanaman tomat bergejala asal kabupaten Solok,

Sumatera Barat. Isolat yang diduga Cmm dikonfirmasi dengan metode Biolog,
ELISA, dan PCR.
Hasil uji konfirmasi dengan ketiga metode tersebut
menunjukkan bahwa koloni berwarna abu-abu dengan bentuk tidak beraturan
adalah bakteri Cmm.
Metode ekstraksi DNA dilakukan dengan empat metode, dan metode
ekstraksi menurut Lee et al. (metode 2) merupakan metode ekstraksi DNA
terbaik dibandingkan tiga metode ekstraksi DNA lainnya. Kondisi PCR Hadas et
al. menghasilkan pita DNA lebih jelas dibandingkan kondisi PCR Santos et al.
Metode ekstraksi dengan media cair SCM dengan inkubasi selama 6, 12, dan
24 jam mampu mendeteksi keberadaan keberadaan Cmm pada benih tomat
yang diinokulasi secara buatan dengan konsentrasi bakteri 106 - 107 CFU per ml.
Nilai absorbansi ELISA pada sampel ekstrak benih dengan media cair SCM
umumnya lebih tinggi dibandingkan nilai absorbansi pada ekstrak benih dengan
media bufer PBS. Deteksi Cmm berdasarkan uji PCR menunjukkan bahwa Cmm
hanya terdeteksi pada benih yang diinokulasi buatan dengan konsentrasi 107
dengan lama inkubasi 24 jam, baik pada ekstraksi dengan media cair SCM
maupun bufer PBS.
Pengujian dengan metode PCR pada delapan varietas benih tomat yang
beredar di pasaran mampu mendeteksi keberadaan Cmm pada salah satu

varietas benih tomat, sedangkan pengujian dengan metode ELISA terhadap
sampel yang sama menunjukkan hasil negatif. Hal ini karena teknik PCR
memiliki sensitifitas yang lebih tinggi dibandingkan dengan ELISA sehingga
keberadaan Cmm dalam konsentrasi yang rendah pada benih masih mampu
terdeteksi.
Kata kunci : benih tomat, C. michiganensis subsp. michiganensis, deteksi,
isolasi, identifikasi, inkubasi, Biolog, ELISA, PCR

5

© Hak Cipta milik IPB, tahun 2009
Hak Cipta dilindungi Undang-Undang
Dilarang mengutip sebagian atau seluruh karya tulis ini tanpa mencantumkan
atau menyebutkan sumbernya. Pengutipan hanya untuk kepentingan pendidikan,
penelitian, penulisan karya ilmiah, penyusunan laporan, penulisan kritik, atau
tinjauan suatu masalah; dan pengutipan tersebut tidak merugikan kepentingan
yang wajar IPB
Dilarang mengumumkan dan memperbanyak sebagian atau seluruh karya tulis
dalam bentuk apa pun tanpa izin IPB

6

PENGEMBANGAN METODE DETEKSI
Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis
PADA BENIH TOMAT

TITI SUMARTI

Tesis
sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
Magister Sains pada
Program Studi Entomologi/Fitopatologi

SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2009

7

Penguji Luar Komisi pada Ujian Tesis: Ir. Riza Desnurvia, MSc.

8

Judul Tesis

: Pengembangan Metode Deteksi Clavibacter
michiganensis subsp. michiganensis pada Benih
Tomat

Nama Mahasiswa

: Titi Sumarti

NIM

: A451064124

Disetujui :
Komisi Pembimbing

Dr. Ir. Giyanto, MSi.
Ketua

Dr. Ir. Kikin Hamzah Mutaqin, MSi.
Anggota

Diketahui

Ketua Program Studi
Entomologi/Fitopatologi

Dekan Sekolah Pascasarjana IPB

Dr. Ir. Sri Hendrastuti Hidayat, MSc.

Prof. Dr. Ir. Khairil Anwar Notodiputro, MS.

Tanggal Ujian : 20 Februari 2009

Tanggal Lulus :

9

PRAKATA
Segala puji dan syukur kepada Allah SWT atas limpahan rahmat dan
hidayah-Nya kepada penulis sehingga dapat menyelesaikan penulisan tesis yang
berjudul “Pengembangan Metode Deteksi Clavibacter michiganensis subsp.
michiganensis pada Benih Tomat”. Salawat dan salam tercurah kepada
Rasullulah SAW, keluarga, para sahabat, dan para pengikutnya.
Penulis menyampaikan rasa terima kasih yang tidak terhingga kepada
Dr. Ir. Giyanto, MSi. dan Dr. Ir. Kikin Hamzah Mutaqin, MSi. atas bimbingan,
kesabaran, pengkayaan wawasan, saran, kritik dan dukungan moril yang sangat
besar peranannya dalam penyelesaian penulisan tesis ini. Ucapan terima kasih
juga disampaikan kepada Ir. Riza Desnurvia, MSc. yang bersedia menjadi
Penguji Luar Komisi pada Ujian Tesis.
Ucapan terima kasih juga disampaikan kepada Ir. Syukur Iwantoro, MS.,
MBA, Dr. Ir. Eliza S. Rusli, MSi., Dr. Ir Catur Putra Budiman, MAgric. atas
kesempatan yang diberikan kepada penulis untuk mengikuti program magister di
IPB.

Penulis juga menyampaikan terimakasih kepada rekan-rekan di Balai Besar
Uji Standar Karantina Pertanian Nurjanah, Jati Adiputra, Dwi Sugipriatini,
Rumenda Ginting, Yani Dawi, Ummu Salamah R, dan seluruh pegawai BBUSKP
atas persahabatan dan kerjasamanya.
Rasa hormat yang setinggi-tingginya penulis sampaikan kepada kedua
orang tua tercinta, ayahanda Resa Sumarno, ibunda Kamsiyah dan kakak dan
adik yang telah mencurahkan kasih sayang, doa dan bimbingan. Ucapan terima
kasih disampaikan pula pada Bapak (alm.) dan Ibu mertua, kakak dan adik ipar
atas doa, dorongan semangat dan bantuan moril selama ini.
Ucapan terima kasih yang tidak terhingga juga penulis ucapkan kepada
suami tercinta Nana Supriatna dan ananda tercinta Pramudita Ayu Putri
Permana atas kesabaran, kasih sayang dan dukungannya.
Akhir kata saya haturkan terima kasih kepada semua pihak dan semoga
hasil penelitian ini bermanfaat untuk kepentingan umat manusia dan ilmu
pengetahuan.

Bogor, Februari 2009

Titi Sumarti

10

RIWAYAT HIDUP
Titi Sumarti, SP. dilahirkan di Cilacap pada tanggal 23 September 1976,
sebagai anak kelima dari enam bersaudara dari pasangan Bapak Resa Sumarno
dan Ibu Kamsiyah. Penulis menempuh pendidikan dasar di SDN II Penyarang di
Cilacap pada tahun 1982-1988, tahun 1988-1991 bersekolah di SMPN I Sidareja
di Cilacap, dan tahun 1991-1994 bersekolah di SMAN Sidareja di Cilacap.
Penulis melanjutkan ke pendidikan tinggi di Universitas Padjadjaran, Fakultas
Pertanian, Jurusan Hama dan Penyakit Tumbuhan di Bandung pada tahun
1995-2001 melalui jalur UMPTN (Ujian Masuk Perguruan Tinggi Negeri).
Penulis

pernah

bekerja

sebagai

Supporting

Data

Technical

di

PT. AGRICON, Bogor pada tahun 2001-2005. Pada Tahun 2005-2006 penulis
diterima sebagai Tenaga Pengendali Organisme Pengganggu Tumbuhan di
Stasiun Karantina Tumbuhan Kelas I Samarinda, Kalimantan Timur. Sejak tahun
Juli 2006 penulis bekerja sebagai Tenaga Teknis di Balai Besar Uji Standar
Karantina Pertanian, Jakarta.
Pada tahun 2007 penulis berkesempatan melanjutkan pendidikan ke
Program Magister Sains pada Sekolah Pascasarjana, Institut Pertanian Bogor,
Program Studi Entomologi dan Fitopatologi. Beasiswa pendidikan pascasarjana
diperoleh dari Badan Karantina Pertanian Departemen Pertanian RI.

11

DAFTAR ISI
Halaman
DAFTAR TABEL .........................................................................................

xii

DAFTAR GAMBAR .....................................................................................

xiii

DAFTAR LAMPIRAN ..................................................................................

xiv

PENDAHULUAN ........................................................................................

1

Latar Belakang ....................................................................................

1

Tujuan ................................................................................................

2

Manfaat Penelitian .............................................................................

3

TINJAUAN PUSTAKA ...............................................................................

4

Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis ..............................

4

Klasifikasi ...............................................................................

4

Biologi dan ekologi . ...............................................................

4

Kisaran inang .........................................................................

5

Gejala .....................................................................................

6

Dampak ekonomi ...................................................................

7

Sebaran geografi ...................................................................

7

Deteksi

dan

Identifikasi

Clavibacter

michiganensis

subsp.

michiganensis ....................................................................................

8

Deteksi dan identifikasi Cmm berdasarkan morfologi dan
fisiologi ..................................................................................

8

Identifikasi berdasarkan uji Biolog .........................................

8

Identifikasi berdasarkan uji DAS-ELISA ................................

9

Identifikasi berdasarkan uji PCR.............................................

9

BAHAN DAN METODE ..............................................................................

11

Tempat dan Waktu Penelitian .............................................................

11

Isolasi

dan

Identifikasi

Clavibacter

michiganensis

subsp.

michiganensis dari Tanaman Tomat Bergejala ..................................

11

Isolasi Cmm dari tanaman tomat bergejala ............................

11

Identifikasi Cmm berdasarkan uji Biolog ................................

11

Identifikasi Cmm berdasarkan uji ELISA ................................

12

Identifikasi Cmm berdasarkan uji PCR ...................................

12

x

12
Perbandingan Metode Ekstraksi DNA dan Kondisi PCR ....................
Perbandingan

metode

ekstraksi

DNA

13

Clavibacter

michiganensis subsp. michiganensis .....................................

13

Perbandingan kondisi PCR .....................................................

14

Uji Beberapa Metode Deteksi Clavibacter michiganensis subsp.
michiganensis pada Benih Tomat dengan Inokulasi Buatan ..............

14

Inokulasi buatan (Artificial inoculation) ...................................

14

Ekstraksi Cmm pada benih tomat ...........................................

14

Deteksi Cmm dengan metode ELISA .....................................

15

Deteksi Cmm dengan metode PCR ........................................

16

Deteksi Cmm pada Beberapa Varietas Benih Tomat yang Dijual
Bebas di Pasaran ................................................................................
HASIL DAN PEMBAHASAN ......................................................................
Isolasi

dan

Identifikasi

Clavibacter

michiganensis

Identifikasi Cmm berdasarkan uji Biolog ................................
Identifikasi Cmm dengan uji ELISA ........................................
Identifikasi Cmm dengan uji PCR ..........................................
Perbandingan Metode Ekstraksi DNA dan Kondisi PCR ....................
metode

ekstraksi

DNA

17

subsp.

michiganensis dari Tanaman Tomat Bergejala .................................

Perbandingan

16

17
18
19
19
20

Clavibacter

michiganensis subsp. michiganensis ......................................

20

Perbandingan kondisi PCR ....................................................

21

Uji Beberapa Metode Deteksi Clavibacter michiganensis subsp.
michiganensis pada Benih Tomat dengan Inokulasi Buatan ..............

22

Deteksi Cmm dengan metode ELISA .....................................

22

Deteksi Cmm dengan metode PCR ........................................

25

Deteksi Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis pada
Beberapa Varietas Benih Tomat yang Dijual Bebas di Pasaran .......

27

Deteksi Cmm dengan metode ELISA ....................................

27

Deteksi Cmm dengan metode PCR .......................................

28

KESIMPULAN DAN SARAN ......................................................................

30

DAFTAR PUSTAKA .................................................................................

31

xi

13

DAFTAR TABEL
Halaman
1 Jenis sampel benih tomat yang diuji ....................................................

16

2 Hasil isolasi bakteri yang diduga Clavibacter michiganensis subsp.
michiganensis, hasil konfirmasi pada medium YDC dan identifikasi
dengan uji Biolog ................................................................................

19

3 Hasil uji ELISA terhadap dua koloni bakteri yang diduga
Cmm ....................................................................................................

19

4 Hasil pengukuran konsentrasi DNA yang diperoleh dengan empat
metode ekstraksi DNA .........................................................................
5 Hasil uji DAS-ELISA terhadap benih tomat yang diinokulasi secara
buatan .................................................................................................
6 Jumlah koloni Cmm yang tumbuh pada media SCM pada
pengamatan hari ke-9 setelah plating .................................................
7 Hasil pengujian DAS-ELISA terhadap beberapa varietas benih tomat.

xii

21

23

24
27

14

DAFTAR GAMBAR
Halaman
1

Gejala penyakit kanker bakteri pada tanaman tomat .......................

17

2

Koloni Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis pada media
SCM dan media YDC ........................................................................

18

3

Hasil PCR Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis ...........

20

4

Hasil PCR pada DNA hasil empat metode ekstraksi DNA ...............

21

5

Hasil PCR pada dua kondisi PCR ....................................................

22

6

Hasil uji ELISA pada benih tomat dengan lama inkubasi 3 jam,
6 jam, 12 jam, dan 24 jam .......................................................

24

Hasil PCR terhadap templat hasil ekstraksi Cmm pada media cair
yang diinkubasikan selama 3 jam, 6 jam, 12 jam, dan 24 jam .........

25

8

Contoh beberapa kemasan benih tomat yang beredar di Indonesia .

27

9

Hasil uji ELISA pada beberapa varietas benih tomat .......................

10

Hasil PCR pada beberapa varietas benih tomat ...............................

7

xiii

28
28

15

DAFTAR LAMPIRAN
Halaman
1

Hasil pembacaan Biolog MicroStation Reader ...................................

34

2

Komposisi media untuk isolasi dan deteksi Clavibacter
michiganensis subsp. michiganensis ...............................................

35

Komposisi larutan bufer yang digunakan dalam penelitian ...............

37

3

PENDAHULUAN
Latar Belakang
Tomat (Lycopersicum esculentum L.) merupakan salah satu komoditas
hortikultura yang terus dikembangkan karena mempunyai nilai ekonomi cukup
tinggi dan potensi ekspor yang besar. Namun demikian, banyak kendala yang
dihadapi dalam upaya mendukung pengembangan, peningkatan produksi dan
mutu produk untuk memenuhi kebutuhan nasional dan ekspor komoditas tomat,
di antaranya adalah gangguan hama dan penyakit yang belum dapat diatasi
dengan efektif.

Salah satu penyakit penting yang menyebabkan penurunan

produksi tomat adalah penyakit kanker bakteri yang disebabkan oleh Clavibacter
michiganensis subsp. michiganensis (selanjutnya disebut Cmm).
Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis adalah penyebab penyakit
kanker bakteri pada tanaman tomat dan tersebar luas di dunia. Penyakit ini
dapat menyebabkan kerugian ekonomi hingga 60% dari produksi tomat di
seluruh dunia (Strider 1969 dalam Dreier et al. 1997).

Menurut Sahin et al.

(2002), kejadian penyakit kanker bakteri di Turki pada tahun 2001 mendekati
100% dan mengakibatkan kerugian besar pada pertanaman tomat.

Produksi

bibit tomat di rumah kaca yang terserang penyakit ini mengakibatkan kerugian
sebesar 300 ribu dolar AS per tahun di Michigan (Hausbeck et al. 2000).
Selain menyerang tanaman tomat, patogen ini juga dilaporkan menginfeksi
tanaman cabe di lapangan.

Menurut Thompson (1986) dalam Dreier et al.

(1997), menyatakan bahwa tidak ada kultivar tomat yang resisten terhadap
penyakit kanker bakteri ini dan belum ada pengendalian secara kimia yang efektif.
Patogen yang terbawa dalam benih tomat merupakan sumber inokulum yang
sangat penting bagi bakteri ini (Fatmi and Schaad 1995). Penularan penyakit
kanker bakteri melalui benih dilaporkan antara 0.25% hingga 100% (Fatmi and
Schaad 1995, CAB International 2007).
Cmm merupakan patogen tanaman yang termasuk dalam daftar patogen
karantina di negara-negara Eropa bahkan di dunia internasional (European
Union (1995) dalam Jahr et al. (2000), Kahn (1982) dan Franken et al. (1993)
dalam Dreier et al. 1997).

Berdasarkan surat keputusan Menteri Pertanian

No.38/Kpts/HK.060/1/2006 tanggal 27 Januari 2006, tentang Jenis-jenis
Organisme Pengganggu Tumbuhan Karantina (OPTK) Golongan I Kategori A1
dan A2, Golongan II Kategori A1 dan A2, Tanaman Inang, Media Pembawa dan
Daerah Sebarnya, Cmm merupakan salah satu jenis OPTK kategori A1 (OPTK

2
yang belum ada di Indonesia) yang harus dicegah penularannya ke dalam
wilayah Indonesia. Ketergantungan Indonesia terhadap benih tomat impor dan
importasi benih-benih tanaman lainnya memberikan tantangan bagi Badan
Karantina Pertanian dalam melakukan deteksi terhadap kemungkinan masuknya
Cmm ke dalam wilayah Indonesia melalui benih impor.
Hasil penelitian Anwar (2004) menunjukkan bahwa bakteri Cmm sudah
masuk ke Indonesia melalui benih tomat impor.

Bakteri Cmm berhasil diisolasi

dari benih tomat komersial yang tidak menunjukkan gejala. Berdasarkan laporan
Balai Besar Uji Standar Karantina Pertanian (BBUSKP) tahun 2006, 2007, dan
2008, Cmm telah terdeteksi pada tanaman tomat bergejala yang merupakan
sampel pemantauan dari Unit Pelaksana Teknis (UPT) Teluk Bayur Sumatera
Barat dengan uji ELISA. CAB International (2007), menyebutkan bahwa bakteri
penyebab kanker pada tomat ini juga telah ditemukan di Indonesia yaitu di Jawa
dan masuk pada tahun 2002. Akan tetapi sampai saat ini belum banyak data
yang menunjukkan bahwa bakteri tersebut telah ditemukan di Indonesia dan
sejauh mana penyebarannya. Sebagai OPT baru yang mempunyai potensi
menyerang, menetap dan/atau menyebar ke kawasan tertentu, maka perlu
dilakukan tindakan karantina untuk mencegah penyebaran yang lebih luas.
Dalam rangka mencegah penyebaran Cmm yang lebih luas, maka diperlukan
teknik deteksi patogen yang mudah, cepat dan akurat.
Metode

pengujian

kesehatan

benih

banyak

dikembangkan

seperti

penggunaan medium semi selektif, uji morfologi, dan uji fisiologi. Metode ini
memerlukan waktu yang cukup lama, dan tidak cukup sensitif karena banyaknya
antagonis dari flora saprofitik. Metode deteksi yang banyak dikembangkan dan
saat ini dilaporkan cukup sensitif dan cepat untuk deteksi patogen tanaman
termasuk bakteri patogen yang terbawa benih adalah metode Enzyme-linked
immunosorbent assay (ELISA) dan Polymerase Chain Reaction (PCR).
Berdasarkan hal tersebut di atas maka perlu dilakukan penelitian tentang
pengembangan metode deteksi bakteri Clavibacter michiganensis subsp.
michiganensis untuk memperoleh metode deteksi yang relatif cepat dan akurat
sehingga dapat digunakan sebagai metode pengujian kesehatan benih dalam
rangka tindakan karantina.
Tujuan Penelitian
Penelitian ini bertujuan untuk mengembangkan dan memperoleh teknik
deteksi Cmm pada benih tomat yang mudah, cepat dan akurat.

Penelitian juga

3
dilakukan untuk melihat metode ekstraksi dan lama inkubasi ekstrak yang paling
sesuai untuk mendeteksi Cmm pada benih tomat.
Manfaat Penelitian
Hasil penelitian

ini diharapkan dapat digunakan sebagai teknik deteksi

Cmm pada benih tomat yang mudah, cepat dan akurat dalam rangka tindakan
karantina

.

TINJAUAN PUSTAKA
Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis
Klasifikasi
Klasifikasi bakteri penyebab kanker pada tomat berdasarkan Agrios (2005);
adalah sebagai berikut : Clavibacter termasuk ke dalam kingdom Procaryotae,
division Firmicutes, kelas Thallobacteria, genus Clavibacter.
Clavibacter mempunyai enam spesies yaitu C. iranicum, C. michiganensis,
C. rathayi, C. tritici, C. toxicus, dan C. xyli (Schaad et al. 2001) .

Spesies

Clavibacter michiganensis terdiri atas lima subspesies yaitu C. m. subsp.
insidiosus (Cmi), C. m. subsp. michiganensis (Cmm), C. m. subsp. nebraskensis
(Cmn), C. m. subsp. sepedonicus (Cms), dan C. m. subsp. tessellarius (Cmt)
(Louws et al. (1998), Pastrik and Rainey (1999), Schaad et al. (2001),
Gartemann et al. (2003), Burokiene et al. 2005). Clavibacter michiganensis
sebelumnya sering disebut dengan nama Corynebacterium michiganense.
Biologi dan ekologi
Penyakit kanker bakteri dapat ditularkan melalui benih dan mampu
bertahan dalam periode waktu yang lama pada benih tomat (Chang et al. 1992).
Berdasarkan Fatmi and Schaad (1995) dan CAB International

(2007),

penularan penyakit kanker bakteri melalui benih antara 0.25% hingga 100%.
Kejadian penyakit pada tanaman tomat di lahan produksi yang berasal dari
benih terinfeksi relatif rendah.

Meskipun demikian, benih terinfeksi adalah

sumber inokulum utama di lahan produksi. Inokulum dari sedikit tanaman sakit
yang tumbuh dari benih terinfeksi dapat menghasilkan infeksi sekunder yang
tinggi akibat kegiatan seperti pemangkasan, pengikatan, dan pemanenan (Chang
et al. 1992).
Selain ditularkan melalui benih, penyakit ini juga dapat bertahan pada sisa
tanaman tomat, inang alternatif, di dalam tanah, dan menyebar ke tanaman
melalui percikan air hujan, aplikasi pestisida, dan air irigasi sehingga Cmm
tumbuh pada permukaan daun (Chang et al. 1992). Penyakit ini juga dapat
menyebar ke bibit dan tanaman yang lain melalui kegiatan seperti pemangkasan
dan pengemasan bibit tanaman, pengikatan dan pemasangan ajir tanaman tomat,
membuang daun tua berpenyakit dan rusak, mengurangi tunas dan pengikatan
tanaman di rumah kaca, dan umumnya melalui percikan air hujan, irigasi, atau
penyemprotan bahan kimia.

Infeksi pembuluh disebabkan oleh pekerjaan

5
manual dan dapat menyebabkan tanaman menjadi kerdil, layu, dan kematian
pada tahap awal pertumbuhan (CAB International, 2007).
Cmm dapat menyebar dari tanaman dengan infeksi primer ke tanaman
sekitarnya melalui percikan air, berpindahnya mesin pertanian, atau melalui
pekerja saat kondisi lahan basah, nekrosis pinggir daun dan buah (Ricker and
Riedel (1993) dalam CAB International 2007). Bakteri ini juga dapat bertahan
sebagai epifit pada permukaan daun tomat. Patogen ini menyebabkan layu pada
daun dan mengurangi produksi tanaman (Tsiantos (1987) dan Gleason et al.
(1991) dalam CAB International 2007, Chang et al. 1992).
Populasi bakteri Cmm menurun dengan cepat ketika sisa tanaman
membusuk di tanah, tetapi bakteri ini dapat bertahan cukup lama pada sisa
tanaman di permukaan tanah dan dapat menimbulkan penyakit pada musim
tanam berikutnya (Gleason et al. 1991 dalam CAB International 2007, Chang et
al. 1992. Cmm juga dapat bertahan pada tanaman tomat yang tersisa setelah
panen dan pada inang alternatif (Strider 1969 dalam CAB International 2007 ).
Menurut van Vaerenbergh and Chauveau (1985), tanaman muda lebih
rentan terhadap bakteri kanker. Lama waktu inkubasi bervariasi tergantung pada
umur tanaman, tingkat resistensi, temperatur, dan konsentrasi inokulum.
Cmm terdapat pada jaringan xylem (Leyns and De Cleene 1983 dalam
CAB International 2007) yang menyebabkan rongga kosong karena lisis.
Patogen menghasilkan bahan beracun glikopeptida yang mempunyai aktifitas
biologi (Miura et al. 1986 dalam CAB International 2007). Menurut Ueno et al.
(1994) dalam CAB International (2007) bahwa Cmm menghasilkan suatu toksin
dan polisakarida yang tahan panas. Suatu polisakarida dengan berat molekul
yang tinggi yang dihasilkan bakteri secara in vitro ditemukan sama dengan yang
dihasilkan oleh tanaman dan diperkirakan berasosiasi dengan gejala layu yang
dihasilkan pada tanaman tomat (Bulk et al. 1991 dalam CAB International 2007).
Kisaran inang
Menurut CAB International (2007), Inang utama Cmm adalah tomat
(Lycopersicon esculentum), sedangkan inang sekundernya adalah paprika
(Capsicum annuum) dan tumbuhan liar black nightshade (Solanum nigrum).
Gejala
Benih tomat dan tanaman di pembibitan di rumah kaca dengan infeksi
berat kadang-kadang tidak menunjukkan gejala dan terlihat normal.

Gejala

pertama di lapangan adalah mengeringnya bagian pinggir daun, kemudian

6
secara perlahan mengering dengan atau tanpa terlihat layu. Tanaman muda
yang terinfeksi menjadi kerdil dan layu dengan cepat. Pada infeksi stadium awal,
bakteri Cmm mengkoloni pada pembuluh xylem, kemudian berlanjut ke
pembuluh phloem, inti sel, dan kortex. Gejala pada bagian atas tanaman, baru
terlihat pada stadium akhir. Gejala layu pada tanaman merupakan akibat dari
tersumbatnya pembuluh xylem oleh koloni Cmm dalam konsentrasi tinggi dan
adanya produksi exopolysaccharides (EPS) dengan berat molekul yang tinggi
(Bermpohl et al. dan Meletzus et al. 1993 dalam Jahr et al. 2000).
Penyakit kanker bakteri pada tanaman tomat memperlihatkan gejala seperti
bintik pada daun, batang, dan buah, serta mengakibatkan kelayuan pada daun
dan tunas.

Pada kondisi penyakit yang parah, akhirnya seluruh tanaman

menjadi layu dan roboh. Kanker yang sangat kecil dapat terjadi pada batang dan
tulang daun (Agrios 2005).
Daun bagian bawah seringkali berwarna putih, lepuh seperti bintik-bintik
pada pinggiran daun, menjadi coklat seiring bertambahnya umur tanaman dan
akhirnya bintik-bintik tersebut menyatu. Daun layu, menggulung ke atas dan ke
dalam, kemudian berubah menjadi coklat dan layu tetapi daun tidak rontok. Layu
dapat berkembang secara berangsur-angsur dari satu daun ke daun berikutnya
sampai seluruh daun menjadi hancur. Pada batang, tunas, dan tangkai daun
terlihat adanya garis berwarna terang, biasanya diantara lipatan petiol dan
batang. Terakhir, garis tersebut berkembang menjadi retak dan terbentuk kanker.
Pada kondisi yang lembab atau basah massa bakteri melalui permukaan batang
yang retak menyebar ke daun dan buah dan menyebabkan infeksi sekunder.
Buah yang berkembang menjadi kecil, dengan bintik putih pada bagian tengah
yang akhirnya berubah menjadi coklat dan kasar.

Kemudian bintik tersebut

berubah menjadi bintik yang menyerupai mata burung (bird’s eye spot), dengan
warna kecoklatan pada bagian tengah dan halo putih yang merupakan
karakteristik dari penyakit ini. Pada batang yang terinfeksi, bagian longitudinal
jaringan pembuluh berwarna coklat dengan rongga besar timbul dalam inti dan
korteks sampai permukaan luar batang, dan membentuk kanker (Agrios 2005,
Fahy and Persley 1983).
Infeksi lanjut ditunjukkan dengan gejala perubahan warna pada pembuluh
berbentuk garis-garis coklat pada batang dan petiole. Pada potongan batang,
petiole dan tangkai terutama pada bagian sambungan terjadi perubahan warna
putih krem, kuning, atau coklat kemerahan dari jaringan pembuluh dan jaringan

7
gabus. Rongga pada jaringan gabus akan terlihat, dan pada kondisi tertentu,
garis-garis berwarna coklat pada batang menjadi gelap dan terbuka menjadi
kanker (CAB International 2007, Moffet et al. 1983).
Menurut Werner et al. (2002), gejala tanaman yang terinfeksi Cmm adalah
terjadinya kelayuan, tanaman menjadi kerdil, terjadi penurunan hasil, dan
matinya tanaman. Gejala pada daun yaitu terjadinya nekrosis yang di kelilingi
klorosis, luka pada buah berupa bintik berwarna putih yang berkembang menjadi
nekrotik.
Dampak ekonomi
Penyakit kanker bakteri pertama kali dilaporkan di USA pada tahun 1910
dan telah menyebar ke seluruh dunia. Penyakit yang disebabkan bakteri Cmm
ini dapat mengakibatkan kehilangan hasil yang serius pada tanaman tomat yang
ditanam di rumah kaca dan di lapangan. Kerugian hasil yang disebabkan kanker
bakteri di Amerika Serikat, Kanada, dan Kenya dilaporkan mencapai 50 - 80%
Chang et al. (1992).

Menurut Hausbeck et al. (2000), penyakit kanker bakteri

dapat mengakibatkan kerugian sebesar 300 ribu dolar AS per tahun pada
pertanaman di Michigan.
Sebaran geografi
CABI (2007) menyatakan bahwa Cmm telah terdapat di negara-negara
Eropa (Austria, Belarus, Belgium, Bulgaria, Cyprus, Czech Republic, Former
USSR, France, Germany, Greece, Hungary, Italy, Lithuania, Netherlands, Poland,
Romania, Russian Federation, Serbia and Montenegro, Slovenia, Spain,
Switzerland, Ukraine), negara-negara di Asia (Armenia, Azerbaijan, China, India,
Indonesia, Iran, Israel, Japan, Lebanon, Turkey), negara-negara di Afrika (Egypt,
Kenya, Madagascar, Morocco, South Africa, Tanzania, Togo, Tunisia, Uganda,
Zambia, Zimbabwe), negara-negara di Amerika Tengah dan Caribbean (Belize,
Costa Rica, Cuba, Dominica, Dominican Republic, Grenada, Guadeloupe,
Panama), negara-negara di Amerika Utara (Canada, Mexico, USA), negaranegara di Amerika Selatan (Argentina, Brazil, Chile, Colombia, Ecuador, Peru,
Uruguay), dan negara-negara di Oceania (Australia, New Zealand, Tonga).
Di Indonesia, berdasarkan hasil pengujian BBUSKP terhadap sampel
pemantauan dari UPT Teluk Bayur (2006, 2007, dan 2008) diketahui bahwa
Cmm telah terdeteksi pada tanaman tomat bergejala dari sentra pertanaman
tomat di kabupaten Solok Sumatera Barat. Anwar (2004) berhasil mengisolasi

8
Cmm berhasil dari dua lot benih komersial yang tidak menunjukkan gejala pada
tahun 2002.
Deteksi dan Identifikasi Cmm
Deteksi dan identifikasi berdasarkan morfologi dan fisiologi
Cmm merupakan bakteri gram positif, aerob, non-motil, tidak berspora
katalase positif, oksidase negatif, berbentuk batang lengkung (CAB International
2007, Schaad et al. 2001). Pada medium SCM, koloni Cmm agak cembung,
iregular, mukoida, dengan warna abu-abu sampai hitam (gray-to-black),
sedangkan pada media YDC koloni Cmm berwarna kuning cerah sampai kuning
tua, cembung, dan mukoida (Fatmi and Schaad 1998).
Identifikasi berdasarkan uji Biolog
Biolog

Microstation

adalah

suatu

alat

yang

digunakan

untuk

mengidentifikasi bakteri, kapang, dan jamur dengan membandingkan karakter
organisme dengan data base pada software.

Data base yang tersedia

mencakup lebih dari 1900 spesies bakteri aerob, bakteri anaerob, jamur, dan
kapang.
Biolog

TM

Identifikasi bakteri gram positif (termasuk Cmm) berdasarkan uji
dengan

menggunakan

mikroplate

GP2

yang

didesain

untuk

mengidentifikasi bakteri gram positif yang bersifat aerobik. Mikroplate yang
digunakan terdiri dari 95 sumur yang berisi sumber karbon yang berbeda-beda,
serta satu sumur berisi air steril sebagai kontrol. Sumuran pada mikroplate yang
telah di isi dengan suspensi bakteri, akan bereaksi secara serentak dan
memberikan reaksi metabolik dan membentuk pola yang khas sehingga sering
disebut “metabolic fingerprint”.

Pola reaksi metabolik pada mikroplate Biolog

memberikan informasi yang sangat baik. Pola metabolik fingerprint kemudian
dibandingkan dan diidentifikasi dengan data base pada software

MicrologTM.

Identifikasi dengan uji Biolog didasarkan pada reduksi tetrazolium yang
merupakan respon dari proses metabolisme (seperti respirasi). Terbentuknya
warna ungu pada sumuran mikroplate menunjukkan reaksi positif (Biolog 2003).
Identifikasi berdasarkan uji Double Antibody Sandwich Enzyme-Linked
Immunosorbent Assay (DAS-ELISA)
Deteksi bakteri menggunakan teknik serologi telah meningkat pesat sejalan
dengan

penggunaan

antibodi

monoklonal

dan

rekombinan.

Keduanya

memungkinkan seleksi target epitop spesifik untuk menghindari hasil positif yang
salah (Lopez et al 2003). Metode serologi adalah metode pengujian yang

9
didasarkan pada keberadaan protein dari bahan yang diuji. Prinsip uji serologi
adalah terjadinya reaksi spesifik antara antigen dengan antibodi yang akan
membentuk kompleks antigen-antibodi.
Salah satu diantara teknik serologi yang banyak digunakan adalah ELISA
(Enzyme Linked Immunosorbent Assay) karena akurasi, kemudahan dan biaya
yang rendah. Teknik ini menggunakan antibodi yang didapatkan dari hewan
untuk mengenali protein dari bakteri target. Antibodi dilekatkan pada permukaan
sumur dalam microplate dan ekstrak sap tanaman ditambahkan ke dalam sumur.
Jika bakteri target terdapat pada tanaman, bakteri tersebut akan melekat pada
antibodi. Ekstrak yang tidak terikat akan tercuci sebelum antibodi kedua yang
mengenali antibodi pertama ditambahkan. Antibodi sekunder menyebabkan
terjadinya pengenalan tidak langsung dari bakteri karena terdapat molekul
reporter yang melekat pada antibodi sekunder.

Biasanya enzim bereaksi

terhadap substrat yang berubah warna, kemudian dideteksi secara visual
menggunakan microplate reader yang telah dikalibrasi secara hati-hati (Webster
et al. 2004).
Identifikasi berdasarkan Polymerase Chain Reaction (PCR)
Polymerase Chain reaction (PCR) merupakan suatu reaksi in vitro untuk
menggandakan jumlah molekul DNA pada target tertentu dengan cara
mensintesis molekul DNA baru yang berkomplemen dengan molekul DNA target
tersebut dengan bantuan enzim dan oligonukleotida sebagai primer dalam suatu
Thermocycler.

Teknik ini dipakai untuk menggandakan atau memperbanyak

urutan basa DNA spesifik.

Deteksi bakteri menggunakan PCR telah banyak

digunakan karena sangat sensitif.

PCR adalah metode pengujian yang

didasarkan pada perbedaan di dalam asam nukleat. Metode deteksi dengan
PCR mempunyai keunggulan karena sistem analisisnya cepat, mempunyai
sensitifitas yang tinggi, dan dapat mengidentifikasi bakteri patogen dengan
titer/jumlah yang sedikit (Babaloka (2003), Lee et al. (1997), Lopez et al. (2003),
Pastrik and Rainey (1999).
Metode PCR memerlukan DNA polymerase, dNTPs, molekul DNA template,
serta dua buah oligonukleotida sebagai primer.

Reaksi amplifikasi sangat

tergantung pada keberadaan enzim polymerase sebagai katalisator, terutama
yang bersifat tahan panas. Produk PCR kemudian dielektroforesis melalui gel
agarose dengan persentase tertentu untuk memisahkan DNA sesuai dengan
ukuran molekulnya, kemudian hasil elektroforesis divisualisasi di bawah lampu

10
ultraviolet. Hasil penelitian Alvarez dan Kaneshiro (2007) menunjukkan bahwa
pasangan primer CM3 dan CM4 merupakan pasangan primer yang lebih sensitif
dibandingkan pasangan primer CMM-5 dan CMM-6 dalam mendeteksi bakteri
Cmm dari benih tomat.
Dalam bidang fitopatologi, metode PCR banyak digunakan untuk tujuan
deteksi patogen, identifikasi patogen, maupun karakterisasi keanekaragaman
patogen.

Dengan demikian, metode PCR secara kontinyu dikembangkan

bersama-sama dengan metode konvensional, maupun metode pengujian lainnya
untuk mengidentifikasi Cmm.

BAHAN DAN METODE
Tempat dan Waktu Penelitian
Penelitian dilaksanakan pada bulan Juli 2008 sampai dengan Februari
2009 di Laboratorium Bakteriologi dan Laboratorium Bio-Molekuler Balai Besar
Uji Standar Karantina Pertanian, Jakarta.
Isolasi dan Identifikasi Cmm dari Tanaman Tomat Bergejala
Isolasi Cmm dari tanaman tomat bergejala
Tanaman tomat bergejala kanker bakteri diperoleh dari Unit Pelaksana
Teknis (UPT) Karantina Teluk Bayur pada bulan Juli 2008 yang berasal dari
pertanaman tomat di Kabupaten Solok, Sumatera Barat. Batang tanaman tomat
bergejala disterilisasi permukaan dengan alkohol 70%, kemudian dibilas dengan
akuades steril, dipotong dan ditimbang sebanyak 5 gram. Kemudian ditambah
50 ml bufer PBS dan dihancurkan dengan grinder selama 1 menit dan diinkubasi
selama 6 jam pada suhu ruang. Supernatan dipindahkan ke tabung steril, dan
dilakukan pengenceran berseri 100-10-10.

Dari setiap pengenceran dilakukan

plating pada media SCM dalam cawan petri. Kemudian diinkubasikan pada 27oC,
dan diamati setiap hari selama 14 hari.
Koloni bakteri yang diduga Cmm dimurnikan pada media YDC.

Koloni

bakteri yang berwarna kuning pada media YDC, dilakukan uji Gram. Koloni yang
merupakan gram Positif, kemudian diidentifikasi dengan uji BiologTM, ELISA, dan
PCR.
Identifikasi Cmm berdasarkan uji Biolog
Identifikasi koloni yang diduga Cmm dilakukan menggunakan Biolog
Microlog 3TM dengan langkah sebagai berikut: Biakan dipanen dengan cotton
swab steril dan disuspensikan dalam GN/GP inoculation fluid atau akuades steril,
kemudian diukur turbiditasnya dengan Biolog turbiditimeter hingga transmisi 20%.
Setelah itu ditambahkan 3 tetes thioglycolate, di campur dengan hati-hati
sehingga tidak terbentuk gelembung udara, kemudian suspensi dituangkan
dalam cawan petri steril atau reservoir.

Masing-masing lubang mikroplat GP2

diisi 150 µl suspensi bakteri, kemudian diinkubasikan pada 35-370C selama 4-24
jam dan dibaca menggunakan Biolog MicroStation Reader.

12
Identifikasi Cmm berdasarkan uji ELISA
Koloni yang diduga Cmm di deteksi dengan metode serologi DAS-ELISA
menurut protokol Agdia™, berturut-turut adalah sebagai berikut: antibodi
poliklonal dicampur coating buffer dengan perbandingan 1:200, kemudian plat
ELISA diisi sebanyak 100 µl per sumur dan diinkubasikan selama 4 jam pada
suhu ruang atau semalam pada refrigerator (4 oC). Plat ELISA dikosongkan, dan
dicuci dengan PBST 1x (diulang 4-8 kali), kemudian diisi dengan suspensi
bakteri, bufer, kontrol negatif, dan kontrol positif, masing-masing sebanyak 100 µl
per sumur sesuai lay out pengujian.

Suspensi bakteri disiapkan dengan

mencampur isolat dengan General extraction buffer (GEB) dengan perbandingan
1 : 10. Plat ELISA diinkubasikan selama 2 jam pada suhu ruang atau semalam
pada refrigerator (4 oC).
(diulang 4-8 kali),

Plat ELISA dikosongkan, dan dicuci dengan PBST 1x

enzim konjugat dicampur dalam ECM buffer dengan

perbandingan 1:200, kemudian dimasukkan sebanyak 100 µl per sumur dan
inkubasikan selama 2 jam pada temperatur ruang. Plat ELISA dikosongkan, dan
dicuci dengan PBST 1x (diulang 4-8 kali), Substrat PNP dilarutkan dalam PNP
buffer dengan perbandingan 1 mg: 1 ml, kemudian diisikan dalam plat sebanyak
100 µl per sumur dan inkubasikan selama 15 sampai 60 menit pada suhu ruang.
Pengamatan dilakukan terhadap perubahan warna pada sumur. Apabila warna
berubah menjadi kuning menunjukkan bakteri yang diuji positif dan apabila tetap
bening menunjukkan bakteri yang diuji negatif.

Pengamatan dapat dilakukan

dengan membaca absorbansi pada microplate reader pada panjang gelombang
405 nm.

Hasil dinyatakan positif apabila nilai absorbansi sampel ≥ 2x nilai

absorbansi kontrol negatif. Untuk menghentikan reaksi, di tambahkan 3M NaOH
sebanyak 50 µl per sumur.
Identifikasi Cmm berdasarkan uji PCR
Ekstraksi DNA.

Koloni bakteri yang diduga Cmm ditumbuhkan pada

medium YDC dan diinkubasikan pada suhu 27oC selama 48-72 jam. Koloni yang
tumbuh disuspensikan dalam akuades steril, 5 µl suspensi dicampur dengan 50
µl NaOH (0,05 M) dan direbus selama 15 menit (Anwar 2004).
Amplifikasi. DNA hasil ekstraksi diamplifikasi dengan teknik PCR sebagai
berikut:

hasil lisis (3 µl) ditambahkan ke dalam 22 µl campuran master mix

(FermentasTM), ddH2O, dan primer, dengan kondisi PCR sebagai berikut: pra
denaturasi 94oC, 5 menit; denaturasi 94oC, 1 menit; penempelan (annealing)

13
62oC, 1 menit, sintesis 72oC, 30 detik, dan pasca PCR 72oC, 5 menit. Amplifikasi
dilakukan sebanyak 40 siklus (Hadas et al. 2005).
Pasangan primer yang digunakan adalah CM3-5’ CCT CGT GAG TGC
CGG GAA CGT ATC C 3’ DAN CM4-5’ CCA CGG TGG TTG ATG CTC GCG
AGA T 3’. Amplifikasi DNA spesifik Cmm dengan pasangan primer CM3 dan
CM4 menghasilkan potongan DNA dengan ukuran 645 bp (Hadas et al. 2005,
Santos et al. 1977 dalam Anwar 2004).
Visualisasi DNA.

Hasil amplifikasi dianalisis melalui elektroforesis gel

agarose 1,5% mengandung ethidium bromida (0,5 µg/ml) dalam bufer TAE 1x,
voltase 70 V selama 60 menit, kemudian diamati dengan UV transiluminator.
Hasil positif dengan pasangan primer CM3 dan CM4 berupa pita DNA berukuran
645 bp.
Perbandingan Metode Ekstraksi DNA dan Kondisi PCR
Perbandingan metode ekstraksi DNA Clavibacter michiganensis subsp.
michiganensis
Ekstraksi DNA terhadap biakan murni Cmm dibandingkan dalam empat
metode di bawah ini.

Metode 1: Sebanyak 5 µl suspensi dicampur dengan

50 µl NaOH (0,05M) dan dilisis dengan pemanasan dalam air mendidih selama
15 menit (Anwar 2004).

Metode 2: Sebanyak 5 µl suspensi dimasukkan ke

tabung mikro dan disentrifugasi pada 16000 g selama 10 menit.

Pelet

disuspensikan dalam 25 µl NaOH (0,25N) dan direbus selama 2 menit. Suspensi
ditambah 25 µl HCl (0,25N), dan 12,5 µl Tris-HCl (pH 8) yang mengandung 0,1%
(v/v) Tween 20, dan disentrifugasi 6000 g selama 2 menit. Pelet disuspensikan
dalam 62,5 µl TE buffer (pH 7,5).

Metode 3: Sebanyak 5 µl suspensi

dimasukkan ke tabung mikro dan disentrifugasi 16000 g selama 10 menit. Pelet
disuspensikan dalam 25 µl NaOH (0,25N) dan 25 µl HCl (0,25 N), kemudian
dipresipitasi dengan 0,6x volume isopropanol pada suhu -20oC selama 20 menit.
Selanjutnya disentrifugasi pada 16000 g selama 20 menit. Pelet disuspensikan
dalam 62,5 µl TE buffer (pH 7,5).

Metode 4: Sebanyak 5 µl suspensi

dimasukkan ke tabung mikro dan disentrifugasi pada 16000 g selama 10 menit.
Pelet disuspensikan dalam 100 µl TEN buffer (pH 8 mengandung 4 mg
lysozyme), dan dibiarkan selama 1 jam, kemudian ditambahkan 100 µl Sodium
Dodecyl Sulphate (SDS) 20% dan divortex, diinkubasikan pada suhu 65oC
selama 30 menit.

Selanjutnya ditambahkan 100 µl Na-acetate (3M) dan

dimasukkan dalam es selama 10 menit, kemudian disentrifugasi pada 12000

14
rpm selama 10 menit.

Supernatan dipindahkan ke dalam tabung baru,

ditambahkan Phenol: Chloroform: Isoamylalcohol (25: 24: 1) dengan volume
yang sama dan disentrifugasi pada 12000 rpm selama 5 menit, supernatan
dipindahkan ke tabung mikro steril dan ditambahkan 1x volume isopropanol,
disentrifugasi pada 12000 rpm selama 10 menit. Pelet ditambah 150 µl ethanol
70% dan disentrifugasi pada 12000 rpm selama 10 menit. Pelet dikeringkan,
kemudian disuspensikan dalam 62,5 µl TE buffer (pH 7,5) (Lee et al. 2000).
Perbandingan kondisi PCR
Perbandingan kondisi PCR menggunakan isolat Cmm dengan dua kondisi
PCR, yaitu Kondisi 1: pra denaturasi 940C, 1 menit; denaturasi 940C, 1,5 menit;
annealing

600C, 1 menit; sintesis 720C, 1,5 menit; dan pasca PCR 720C,

10 menit. Amplifikasi dilakukan sebanyak 35 siklus (Santos et al. (1977) dalam
Anwar (2004).

Kondisi 2: pra denaturasi 94oC, 5 menit; denaturasi 94oC,

1 menit; annealing 62oC, 1 menit; sintesis 72oC, 30 detik; dan post PCR 72oC,
5 menit. Amplifikasi diulang sebanyak 40 siklus (Hadas et al. 2005).
Uji Beberapa Metode Deteksi Clavibacter michiganensis subsp.
michiganensis pada Benih Tomat dengan Inokulasi Buatan
Inokulasi buatan
Inokulasi buatan pada benih tomat dilakukan dengan merendam benih
tomat (varietas San Marino) dalam suspensi Cmm. Biakan murni Cmm berumur
48 jam disuspensikan dalam akuades steril dan diukur optical density (OD)
dengan spectrophotometer pada 480 nm pada nilai OD sebesar 0,67 (setara
dengan

108 cfu/ml) (Hadas et al., 2005). Suspensi bakteri tersebut diencerkan

secara berseri untuk konsentrasi 100-107 cfu/ml.
Benih tomat yang akan diinokulasi buatan sebelumnya diambil sebagian
untuk diekstrak, dan diplating media SCM untuk mengetahui konsentrasi Cmm
yang ada pada benih tomat tersebut. Setiap gram benih dicampur dengan 1 ml
suspensi bakteri dari setiap pengenceran, kemudian diaduk sampai merata
dengan spatula steril dan dibiarkan selama 1 jam pada suhu ruang. Selanjutnya
dikeringanginkan selama ± 24 jam pada suhu ruang hingga mendekati kondisi
sebelum direndam suspensi bakteri.

Benih disimpan selama 3 minggu pada

suhu ruang sebelum digunakan dalam penelitian.

15
Ekstraksi Cmm pada benih tomat
Benih yang diinokulasi buatan dibagi menjadi 8 bagian masing-masing
2 gram, kemudian dihancurkan dengan grinder, ditambah 20 ml SCM broth dan
atau bufer PBS. Masing-masing ekstrak dishaker pada suhu ruang selama 3 jam,
6 jam, 12 jam, dan 24 jam, dan disentrifugasi pada 1000 rpm selama 10 menit,
kemudian supernatan dipindah ke dalam tabung steril. Untuk uji ELISA, ekstrak
diambil sebanyak 1 ml dan disentrifugasi pada 6000 g selama 10 menit,
kemudian pelet disuspensikan dalam akuades steril sebanyak 2x, dan
disentrifugasi kembali

pada 6000 g selama 10 menit, selanjutnya pelet

disuspensikan dalam 1 ml GEB.

Sedangkan untuk PCR, ekstrak diambil

sebanyak 200 µl dan disentrifugasi pada 16000 g selama 10 menit.

Pelet

disuspensikan dalam akuades steril sebanyak 2x, dan sentrifugasi pada 6000 g
selama 10 menit, kemudian pelet digunakan untuk ekstraksi DNA.
Deteksi Cmm dengan metode ELISA
Koloni yang diduga Cmm di deteksi dengan metode serologi DAS-ELISA
menurut protokol Agdia™, berturut-turut adalah sebagai berikut: antibodi
dicampur coating buffer dengan perbandingan 1:200, kemudian plat ELISA diisi
sebanyak 100 µl per sumur dan inkubasikan selama 4 jam pada suhu ruang atau
semalam pada refrigerator (4 oC). Plat ELISA dikosongkan, dan dicuci dengan
PBST 1x (diulang 4-8 kali), kemudian diisi dengan suspensi bakteri (isolat
disuspensikan dalam GEB, bufer, kontrol negatif, dan kontrol positif, masingmasing sebanyak 100 µl per sumur sesuai lay out pengujian.

Plat ELISA

diinkubasikan selama 2 jam pada suhu ruang atau semalam pada refrigerator
(4 oC).

Plat ELISA dikosongkan, dan dicuci dengan PBST 1x (diulang 4-8 kali),

enzim konjugat dicampur dalam ECM buffer dengan perbandingan 1:200,
kemudian dimasukkan sebanyak 100 µl per sumur dan inkubasikan selama 2 jam
pada temperatur ruang. Plat ELISA dikosongkan, dan dicuci dengan PBST 1x
(diulang 4-8 kali), Substrat PNP dilarutkan dalam PNP buffer dengan
perbandingan 1 mg: 1 ml, kemudian diisikan dalam plat sebanyak 100 µl per
sumur dan inkubasikan selama 15 sampai 60 menit pada suhu ruang.
Pengamatan dilakukan terhadap perubahan warna pada sumur. Apabila warna
berubah menjadi kuning menunjukkan bakteri yang diuji positif dan apabila tetap
bening menunjukkan bakteri yang diuji negatif.

Pengamatan dapat dilakukan

dengan membaca absorbansi pada microplate reader pada panjang gelombang
405 nm.

Hasil dinyatakan positif apabila nilai absorbansi sampel ≥ 2x nilai

16
absorbansi kontrol negatif. Untuk menghentikan reaksi, di tambahkan 3M NaOH
sebanyak 50 µl per sumur.
Deteksi Cmm dengan metode PCR
Ekstraksi DNA yang digunakan untuk deteksi Cmm pada benih yang
diinokulasi buatan adalah teknik dengan hasil terbaik dari perbandingan empat
metode ekstraksi DNA yang dilakukan sebelumnya.

DNA hasil ekstraksi

diamplifikasi dengan teknik PCR sebagai berikut: Sebanyak 5 µl hasil ekstraksi
DNA ditambahkan ke dalam 20 µl campuran master mix (FermentasTM), ddH2O,
dan pasangan primer CM3 dan CM4, dengan kondisi PCR terbaik dari
perbandingan 2 metode yang telah dilakukan sebelumnya.
Deteksi Cmm pada Beberapa Varietas Benih Tomat yang Beredar
di Pasaran
Deteksi Cmm pada beberapa varietas benih tomat yang diperoleh dari
pasaran dilakukan dengan menggunakan metode deteksi dan ekstraksi terbaik
pada percobaan yang telah dilakukan sebelumnya.

Jumlah yang digunakan

dalam penelitian ini masing-masing varietas adalah 2000 benih. Deteksi Cmm
pada beberapa varietas benih tomat dilakukan dengan metode ELISA dan PCR.
Be