Study on pseudomonas producing ACC deaminase in increasing growth and survival of soybean against disease
STUDI PSEUDOMONAS PENGHASIL ACC DEAMINASE
DALAM MENINGKATKAN PERTUMBUHAN DAN
KETAHANAN TANAMAN KEDELAI TERHADAP PENYAKIT
EDI HUSEN
SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2012
PERNYATAAN MENGENAI DISERTASI
DAN SUMBER INFORMASI
Dengan ini saya menyatakan bahwa disertasi ”Studi Pseudomonas
Penghasil ACC Deaminase dalam Meningkatkan Pertumbuhan dan Ketahanan
Tanaman Kedelai terhadap Penyakit” adalah karya saya dengan arahan dari
komisi pembimbing dan belum diajukan dalam bentuk apapun kepada perguruan
tinggi manapun. Sumber informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang
diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks
dan dicantumkan dalam Daftar Pustaka di bagian akhir disertasi ini.
Bogor, Januari 2012
Edi Husen
NRP: G361070062
ABSTRACT
EDI HUSEN. Study on Pseudomonas Producing ACC Deaminase in Increasing
Growth and Survival of Soybean Against Disease. Under direction of ARIS TRI
WAHYUDI, ANTONIUS SUWANTO and GIYANTO.
1-aminocyclopropane-1-carboxylate (ACC) deaminase-producing bacteria
have been known to help plant growth by preventing the inhibition-effect of
increase concentration of ethylene in higher plants, which is commonly triggered
by high concentration of indole-3-acetic acid (IAA) and/or by the presence of
plant pathogens in the vicinity of the root. The enzyme degrades ACC (precursor
of ethylene) into ammonia and α-ketobutirate as bacterial sole source of nitrogen.
This study examined the potential use of Pseudomonas isolates producing ACC
deaminase in increasing soybean growth and survival against pathogenic fungi
Fusarium oxysporum, Sclerotium rolfsii and Rhizoctonia solani. Eighty one
isolates of IAA-producing Pseudomonas (1.13 to 20.49 µg IAA ml-1) were
screened in planta for their ability to promote soybean growth in growth chamber
conditions. The selected isolates were assessed in vitro for their ACC deaminase
activity and compatibility with root-nodule bacteria Bradyrhizobium japonicum
BJ11 and Sinorhizobium fredii Rif5, and tested to promote soybean growth and
reduce disease incidence caused by F. oxysporum, S. rolfsii and R. solani under
greenhouse conditions. The results showed that 13 out of 81 isolates significantly
increased soybean root length and weight, up to 50% from untreated plants. Of 13
isolates, 11 isolates were able to use ACC as their sole source of nitrogen as an
indication of their ACC deaminase activities. Two isolates that did not show ACC
deaminase activities had lower capacity to produce IAA (5.45 to 6,31 µg IAA ml1
). Three out of 11 isolates inhibited at least one strain of root-nodule bacteria,
thereby limiting their use for soybean. Eight selected isolates increased soybean
height and fresh weight although not all were significantly different from
untreated control. On the other hand, most isolates significantly increased the
survival rates of soybean in soil containing pathogenic fungi. Disease suppression
of the isolates caused by F. oxysporum, S. rolfsii and R. solani was 17.1, 36.4 and
64.5%, respectively. The higher the destructive effect of the pathogens as shown
by S. rolfsii and R. solani treatments, the better was the ability of the isolates to
reduce the disease. Further work is worth to evaluate whether or not the fertility
status of the soil or a particular pathogen influence the beneficial effects of these
bacteria on soybean.
Key words: ACC deaminase, Fusarium oxysporum, growth promotion, IAA,
Pseudomonas, Rhizoctonia solani, Sclerotium rolfsii, soybean disease.
RINGKASAN
EDI HUSEN. Studi Pseudomonas Penghasil ACC Deaminase dalam Meningkatkan Pertumbuhan dan Ketahanan Tanaman Kedelai terhadap Penyakit. Dibimbing
oleh ARIS TRI WAHYUDI, ANTONIUS SUWANTO dan GIYANTO.
Enzim 1-aminocyclopropane-1-carboxylate deaminase (ACC deaminase)
(E.C.4.1.99.4) merupakan enzim yang diproduksi oleh beberapa rizobakteri untuk
mendegradasi substrat ACC (prekursor hormon etilen) sebagai sumber nitrogen.
Degradasi ACC secara aktif oleh rizobakteri akan mengurangi biosintesis hormon
etilen. Dalam banyak kasus, biosintesis etilen yang berlebihan dalam jaringan akar
akan menghambat perkembangan akar dan melemahkan ketahanan tanaman
terhadap serangan penyakit. Beberapa faktor pemicu biosintesis etilen pada
tanaman banyak terkait dengan cekaman (stres) akibat kondisi lingkungan yang
tidak mendukung, serangan hama penyakit, dan peningkatan konsentrasi hormon
asam indol asetat (indole acetic acid, IAA). Dari berbagai hasil penelitian,
inokulasi bakteri penghasil ACC deaminase terbukti mampu meningkatkan
pertumbuhan tanaman dengan mengoptimalkan peran IAA dalam memacu
pertumbuhan tanaman dan meningkatkan daya tahan tanaman terhadap serangan
patogen.
Di Indonesia, studi penggunaan rizobakteri penghasil ACC deaminase
sebelum penelitian ini belum pernah dilaporkan. Pemanfaatannya pada tanaman
kedelai merupakan salah satu alternatif teknologi yang menjanjikan untuk
meningkatkan kualitas pertumbuhan tanaman dan mengatasi banyaknya serangan
penyakit pada pertanaman kedelai. Penggunaan bakteri ini dapat mengurangi
pemakaian senyawa agrokimia sintetik yang berlebihan (pupuk dan pestisida)
yang berpotensi mencemari lingkungan. Tantangannya adalah terletak pada
kemampuan menapis dan memilih bakteri penghasil ACC deaminase yang unggul
yang dapat bekerja secara sinergis dengan bakteri bintil akar kedelai (rhizobia).
Penelitian ini bertujuan untuk mendapatkan isolat-isolat Pseudomonas
lokal penghasil enzim ACC deaminase dan mempelajari kemampuannya
meningkatkan pertumbuhan dan ketahanan tanaman kedelai terhadap penyakit
melalui serangkaian penelitian di laboratorium dan rumah kaca. Untuk mencapai
tujuan ini dilakukan penapisan (screening) isolat secara in planta dan in vitro di
laboratorium. Isolat-isolat terbaik selanjutnya diuji keefektivannya pada tanaman
kedelai menggunakan tanah steril dan non-steril.
Mikroba yang digunakan mencakup isolat Pseudomonas asal rizosfer
tanaman kedelai, yaitu 81 isolat penghasil IAA (1,13 – 20,49 µg IAA ml-1) dan 1
isolat bukan-penghasil IAA; cendawan patogen Rhizoctonia solani, Sclerotium
rolfsii, dan Fusarium oxysporium; bakteri bintil akar Bradyrhizobium japonicum
BJ11 dan Sinorhizobium fredii Rif5. Varietas kedelai yang digunakan adalah
varietas Wilis. Tanah untuk percobaan pot menggunakan tanah pertanian yang
diperoleh dari areal pertanian di sekitar Leuwiliang-Jasinga, Bogor.
Hasil penapisan in planta menggunakan media steril kantong-tumbuh
(growth pouch) di ruang penumbuh (growth chamber) diperoleh 13 dari 81 isolat
Pseudomonas penghasil IAA yang mampu meningkatkan panjang dan bobot akar
bibit kedelai sampai 50% dibanding perlakuan kontrol. Dari 13 isolat ini, 11
diantaranya memiliki aktivitas ACC deaminase berdasarkan kemampuannya
mendegradasi substrat ACC pada media garam minimal. Hasil yang diperoleh
memperlihatkan peran fisologis bakteri penghasil ACC deaminase dalam memacu
pertumbuhan tanaman kedelai tanpa terpengaruh oleh peran isolat ini yang juga
mampu mensintesis hormon IAA. Dua isolat yang tidak memiliki aktivitas ACC
deaminase, yaitu Pseudomonas Crb31 dan Crb86, tergolong isolat yang rendah
kemampuannya menghasilkan IAA (5,45 dan 6,31 µg IAA ml-1) dibanding isolat
lain.
Hasil uji kompatibilitas isolat dengan bakteri bintil akar menunjukkan
bahwa 3 dari 11 isolat Pseudomonas penghasil ACC deaminase bersifat antagonis
terhadap bakteri bintil akar B. japonicum Bj11 dan/atau S. fredii Rif5. Sifat
antagonis ini diindikasikan oleh zona penghambatan pertumbuhan di sekeliling
koloni Pseudomonas yang ditumbuhkan bersama dengan bakteri bintil akar pada
media agar. Ketiga isolat ini tidak potensial digunakan untuk tanaman kedelai.
Delapan isolat penghasil ACC deaminase yang tidak antagonis terhadap bakteri
bintil akar, yaitu Pseudomonas Crb5, Crb12, Crb17, Crb24, Crb46, Crb47, Crb49,
dan Crb56.
Inokulasi kedelai dengan masing-masing dari delapan isolat Pseudomonas
penghasil ACC deaminase sebagian mampu meningkatkan pertumbuhan tanaman
kedelai (umur 14 hari) pada tanah steril dan non-steril di rumah kaca. Data tinggi
dan bobot tanaman yang diinokulasi dengan isolat ini lebih tinggi dibanding
tanaman yang tidak diinokulasi (kontrol). Hasil terbaik peningkatan pertumbuhan
kedelai pada tanah steril ditunjukkan oleh isolat Pseudomonas Crb5, Crb24,
Crb46, dan Crb 56, sedangkan pada tanah non-steril oleh isolat Crb12, Crb17, dan
Crb24. Berbedanya respon tanaman kedelai pada tanah steril dan non-steril diduga
terkait dengan interaksi isolat terhadap mikroba alami, baik yang bersifat positif
maupun negatif terhadap isolat yang diintroduksi. Isolat Crb5, Crb46, dan Crb56
mampu meningkatkan bobot akar pada tanah steril, namun tidak berpengaruh
pada tanah non-steril. Sedangkan isolat Crb12, Crb17, dan Crb47 justru efektif
meningkatkan pertumbuhan kedelai pada tanah non-steril atau dengan kehadiran
mikroba alami. Rendahnya tingkat kesuburan tanah yang digunakan dalam
penelitian ini diduga juga berpengaruh terhadap keefektivan isolat dalam
meningkatkan pertumbuhan tanaman kedelai.
Inokulasi kedelai dengan isolat Pseudomonas penghasil ACC deaminase
mampu meningkatkan ketahanan tanaman terhadap cendawan patogen Fusarium
oxysporum, Sclerotium rolfsii, dan Rhizoctonia solani. Tingkat penekanan
penyakit oleh isolat yang disebabkan oleh patogen F. oxysporum, S. Rolfsii, dan R.
solani berturut-turut mencapai 17,1%; 36,4%; dan 64,5%. Kemampuan isolat
meningkatkan ketahanan tanaman terhadap penyakit cenderung meningkat dengan
meningkatnya tingkat cekaman patogen. Jumlah tanaman yang mati yang
disebabkan oleh F. oxysporum, S. Rolfsii, dan R. solani berturut-turut mencapai
15%, 31%, dan 42%. Diduga induksi pembentukan ACC deaminase pada isolat
meningkat dengan semakin meningkatnya tingkat cekaman patogen. Studi
mendalam tentang sifat spesifik maupun generik peran Pseudomonas penghasil
ACC deaminase dalam meningkatkan ketahanan tanaman kedelai terhadap
penyakit sangat berharga untuk dilakukan.
© Hak cipta milik IPB, tahun 2012
Hak cipta dilindungi Undang-Undang
Dilarang mengutip sebagian atau seluruh karya tulis ini tanpa mencantumkan
atau menyebutkan sumbernya. Pengutipan hanya untuk kepentingan pendidikan,
penelitian, penulisan karya ilmiah, penyusunan laporan, penulisan kritik atau
tinjauan suatu masalah; dan pengutipan tersebut tidak merugikan kepentingan
yang wajar IPB.
Dilarang mengumumkan dan memperbanyak sebagian atau seluruh karya tulis
dalam bentuk apapun tanpa izin IPB.
STUDI PSEUDOMONAS PENGHASIL ACC DEAMINASE
DALAM MENINGKATKAN PERTUMBUHAN DAN
KETAHANAN TANAMAN KEDELAI TERHADAP PENYAKIT
EDI HUSEN
Disertasi
sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
Doktor pada
Mayor Mikrobiologi
SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2012
Penguji pada Ujian Tertutup: Dr. Ir. Suryo Wiyono, MSc.Agr
Dr. Ir. Dyah Manohara, MS
Penguji pada Ujian Terbuka: Prof. Dr. Iswandi Anas, M.Sc
Dr. Pingkan Aditiawati
Judul Disertasi
: Studi Pseudomonas Penghasil ACC Deaminase dalam
Meningkatkan Pertumbuhan dan Ketahanan Tanaman
Kedelai terhadap Penyakit
Nama
: Edi Husen
NRP
: G361070062
Disetujui
Komisi Pembimbing
Dr. Aris Tri Wahyudi, M.Si
Ketua
Dr. Ir. Giyanto, M.Si
Anggota
Prof. Dr. Ir. Antonius Suwanto, M.Sc
Anggota
Diketahui:
Koordinator Mayor Mikrobiologi
Dekan Sekolah Pascasarjana IPB
Dr. Ir. Gayuh Rahayu
Dr. Ir. Dahrul Syah, M.Sc.Agr
Tanggal ujian: 26 Oktober 2011
Tanggal lulus:
PRAKATA
Puji syukur penulis panjatkan kepada Allah SWT atas segala rahmat dan
kasih sayang-Nya, sehingga disertasi yang berjudul “Studi Pseudomonas
Penghasil ACC Deaminase dalam Meningkatkan Pertumbuhan dan Ketahanan
Tanaman Kedelai terhadap Penyakit” telah berhasil diselesaikan.
Terima kasih penulis sampaikan kepada Dr. Aris Tri Wahyudi, Prof. Dr.
Antonius Suwanto, dan Dr. Giyanto yang telah memberikan bimbingan dan
arahan selama pelaksanaan penelitian dan penulisan disertasi. Penelitian ini
terlaksana berkat dukungan dana dari proyek Kerjasama Kemitraan Penelitian
Pertanian dengan Perguruan Tinggi (KKP3T) antara Badan Litbang Pertanian dan
Institut Pertanian Bogor tahun 2007-2009 dan dari Program Insentif Peningkatan
Kapasitas Iptek Sistem Produksi RISTEK tahun 2010-2011 atas nama Dr. Aris Tri
Wahyudi. Oleh karena itu, penulis mengucapkan banyak terima kasih. Terima
kasih kepada Pimpinan dan seluruh staf Departemen Biologi, FMIPA IPB dan
Laboratorium Mikrobiologi atas segala bantuan fasilitas dan penggunaan alat.
Terima kasih penulis sampaikan kepada Dr. Sri Rochayati, kepala Balai Penelitian
Tanah (Balittanah), Dr. Achmad Rachman (d/h kepala Balittanah), Dr. Muhrizal
Sarwani, kepala Balai Besar Litbang Sumberdaya Lahan Pertanian (BBSDLP),
dan Prof. Dr. Irsal Las (d/h kepala BBSDLP) atas izin sekolah dan dukungan yang
diberikan. Ucapan terima kasih juga penulis sampaikan kepada Pimpinan dan
seluruh staf Kelompok Peneliti Biologi dan Kesehatan Tanah dan teman-teman
peneliti lingkup Balittanah yang senantiasa memberikan dukungan moril dalam
penyelesaian studi.
Terima kasih kepada Dr. Dyah Manohara (Balai Penelitian Tanaman Obat
dan Aromatik, Balittro, Bogor) dan Dr. Suryo Wiyono (Departemen Proteksi
Tanaman, Fakultas Pertanian, IPB) atas kesediannya sebagai penguji luar komisi
pada ujian tertutup dan saran perbaikan yang diberikan. Terima kasih kepada Prof.
Dr. Iswandi Anas (Departemen Ilmu Tanah dan Sumberdaya Lahan, Fakultas
Pertanian, IPB) dan Dr. Pingkan Aditiawati (Sekolah Ilmu dan Teknologi Hayati,
ITB, Bandung) atas kesediaannya sebagai penguji luar komisi pada ujian terbuka
dan saran perbaikan yang diberikan.
Ucapan terima kasih kepada istri, Dra. Asih Hendarsih, dan ananda
Mahirawan Setiadhi atas kesabaran dan dukungannya yang senantiasa diberikan.
Semoga karya ilmiah ini bermanfaat.
Bogor, Januari 2012
Edi Husen
RIWAYAT HIDUP
Penulis dilahirkan di Bukittinggi pada tanggal 10 September 1960, sebagai
anak keempat dari Bapak Nazaruddin Chatib Basa dan Ibu Masitah. Penulis
mengenal pertanian sejak menempuh pendidikan pertanian di Sekolah Pertanian
Menengah Atas (SPMA) Negeri Bogor tahun 1978-1981 dan mengenal ilmu tanah
setelah menempuh Pendidikan Kedinasan di Pusat Pelatihan Manajemen dan
Kepemimpinan Pertanian (PPMKP) (d/h IPLPP) Ciawi, Bogor pada tahun 19811982. Pendidikan Sarjana Biologi diselesaikan di Fakultas Matematika dan Ilmu
Pengetahuan Alam, Universitas Pakuan Bogor pada tahun 1987. Pendidikan
Master of Science dalam bidang Mikrobiologi Tanah diselesaikan di University of
the Philippines, Los Banos (UPLB), Philippines pada tahun 2002 dan memperoleh
penghargaan Gamma Sigma Delta dari UPLB. Selanjutnya, penulis melanjutkan
sekolah S3 Jalur Penelitian (by Research) di Program Studi Mikrobiologi, Sekolah
Pascasarjana, Institut Pertanian Bogor pada tahun 2007.
Penulis adalah staf Peneliti Mikrobiologi Tanah di Balai Penelitian Tanah,
Balai Besar Litbang Sumberdaya Lahan Pertanian, Bogor. Selama menjadi
mahasiswa S3, penulis telah mempresentasikan sebagian hasil penelitian disertasi
pada Seminar Nasional dan Internasional, Perhimpunan Mikrobiologi Indonesia,
pada tahun 2008 di Purwokerto dan pada tahun 2010 di Bogor, dengan judul
“Growth Enhancement and Disease Reduction of Soybean by ACC DeaminaseProducing Pseudomonads”. Selain melaksanakan penelitian disertasi, penulis juga
aktif dalam kerja sama penelitian dengan lembaga riset nasional dan internasional,
antara lain proyek REDD-ALERT (Reducing Emissions from Deforestation and
Degradation through Alternative Landuses in Rainforests of the Tropics),
khususnya aspek aktivitas mikroba pada gambut. Pada bulan Juli – Agustus 2011
penulis mendapat kesempatan mengikuti pelatihan soil microbiological extraction
and quantification techniques, khususnya microbial community fingerprinting
using PLFA analysis di Faculty of Bioscience Engineering, University of Gent,
Belgia. Penulis juga aktif mempublikasikan berbagai hasil penelitian di media
cetak ilmiah maupun populer. Selama masa studi S3, penulis telah
mempublikasikan hasil penelitian disertasi ini pada:
1) Microbiology Indonesia, Vol. 2 (3): 107-111, 2008, Prospective use of 1aminocyclopropane-1-carboxylate deaminase-producing bacteria for plant
growth promotion and defense against biotic and abiotic stresses in peat-soil
agriculture.
2) Indonesian Journal of Agricultural Science, Vol. 10 (1) 2009: 19-25, Soybean
seedling root growth promotion by 1-aminocyclopropane-1-carboxylate
deaminase-producing pseudomonads.
3) American Journal of Agricultural and Biological Sciences, Vol. 6 (2) 2011:
273-278, Soybean response to 1-aminocyclopropane-1-carboxylate
deaminase-producing Pseudomonas under field soil conditions.
4) American Journal of Applied Sciences, 8: 1073-1080, 2011, Growth
enhancement and disease reduction of soybean by 1-aminocyclopropane-1carboxylate deaminase-producing Pseudomonas.
DAFTAR ISI
Halaman
DAFTAR ISI ... ................................................................................................ xix
DAFTAR TABEL ... ........................................................................................ xxi
DAFTAR GAMBAR ... .................................................................................. xxiii
DAFTAR LAMPIRAN ... ................................................................................ xxv
PENDAHULUAN ............................................................................................... 1
Latar Belakang ......................................................................................... 1
Tujuan Penelitian ..................................................................................... 3
Hipotesis ................................................................................................. 3
Manfaat Penelitian.................................................................................... 4
Temuan Baru (Novelty) ............................................................................ 4
TINJAUAN PUSTAKA ...................................................................................... 5
Rizobakateri Pemacu Pertumbuhan Tanaman (PGPR) .............................. 5
Enzim ACC Diaminase dan Etilen ............................................................ 5
Bakteri Penghasil ACC Deaminase sebagai Pemacu Tumbuh
Tanaman .................................................................................................. 6
Bakteri Penghasil ACC Deaminase sebagai Agen Hayati Pengendali
Patogen .................................................................................................... 9
Cendawan Patogen Tular Tanah pada Kedelai .......................................... 9
BAHAN DAN METODE .................................................................................. 11
Tempat Penelitian .................................................................................. 11
Bahan Penelitian..................................................................................... 11
Tahapan Penelitian ................................................................................. 13
Penapisan in planta Pseudomonas Pemacu Tumbuh .............................. 15
Pengujian Aktivitas Enzim ACC Deaminase .......................................... 18
Uji Kompatibilitas Pseudomonas dengan Rhizobia ................................. 19
Uji Pemacu Tumbuh di Rumah Kaca ..................................................... 20
Uji Penekanan Penyakit ......................................................................... 21
HASIL DAN PEMBAHASAN .......................................................................... 27
Hasil Penapisan Psedomonas Pemacu Tumbuh Tanaman Kedelai .......... 27
Aktivitas ACC Deaminase ..................................................................... 31
Uji Kompatibilitas Pseudomonas dengan Rhizobia ................................. 34
Pengaruh Pseudomonas terhadap Peningkatan Pertumbuhan Kedelai ..... 36
Pengaruh Pseudomonas terhadap Penekanan Penyakit ............................ 37
SIMPULAN DAN SARAN ............................................................................... 47
Simpulan ................................................................................................ 47
Saran ..................................................................................................... 47
DAFTAR PUSTAKA ........................................................................................ 49
LAMPIRAN ...................................................................................................... 53
DAFTAR TABEL
Halaman
1
Isolat-isolat Pseudomonas dan kemampuannya menghasilkan IAA
yang digunakan dalam penelitian ini ....................................................... 12
2
Isolat-isolat Pseudomonas pada masing-masing set percobaan ............... 16
3
Aktivitas ACC-deaminase pada media garam minimal DworkinFoster (DF) ditambah amonium sulfat dan ACC sebagai sumber N ........ 32
4
Reaksi penghambatan (antagonis) isolat Pseudomonas terhadap
bakteri bintil akar Bradyrhizobium japonicum Bj11 dan
Sinorhizobium fredii Rif5 pada media cawan agar King’s B.................... 35
5
Pertumbuhan kedelai (umur 14 hari setelah tanam) yang diinokulasi
dengan isolat Pseudomonas (Crb) penghasil ACC deaminase pada
media tanah non-steril di rumah kaca ...................................................... 36
6
Penekanan penyakit dan bobot basah tanaman kedelai yang
diinokulasi dengan isolat Pseudomonas (Crb) penghasil ACC
deaminase pada tanah yang diinfestasi dengan cendawan patogen
Fusarium oxysporum (Fo) di rumah kaca ................................................ 39
7
Penekanan penyakit dan bobot basah tanaman kedelai yang
diinokulasi dengan isolat Pseudomonas (Crb) penghasil ACC
deaminase pada tanah yang diinfestasi dengan cendawan patogen
Sclerotium rolfsii (Sr) di rumah kaca....................................................... 41
8
Penekanan penyakit dan bobot basah tanaman kedelai yang
diinokulasi dengan isolat Pseudomonas (Crb) penghasil ACC
deaminase pada tanah yang diinfestasi dengan cendawan patogen
Rhizoctonia solani (Rs) di rumah kaca .................................................... 43
DAFTAR GAMBAR
Halaman
1
Biosintesis etilen pada tanaman (Diringkas dan digambar ulang dari
Ose et al. 2003) ......................................................................................... 6
2
Skema mekanisme penurunan konsentrasi hormon etilen dalam
jaringan tanaman oleh bakteri penghasil enzim ACC deaminae untuk
mencegah terbentuknya etilen berlebihan yang dapat menghambat
perkembangan akar (Sumber: diadaptasi dari Glick et al. 1998) .................. 8
3
Diagram alir tahapan penelitian ................................................................ 14
4
Penapisan Pseudomonas pemacu tumbuh pada media steril kantong
tumbuh. Rak kantong tumbuh (A), penempatan kantong tumbuh pada
rak (B), dan penempatan kecambah kedelai pada tiap kantong tumbuh
(C) ............................................................................................................ 15
5
Biji kedelai yang sudah diinokulasi dengan isolat Pseudomonas dan
dikecambahkan pada cawan Petri (A), dan penempatan kecambah
kedelai umur 2 hari pada media kantong tumbuh (B) ................................ 18
6
Skema penempatan pot secara acak dalam uji pemacu tumbuh pada
media tanah steril dan tanah non-steril di rumah kaca (K = kontrol
tanpa inokulasi; Crb17 adalah kedelai yang diinokulasi dengan isolat
Pseudomonas Crb17; angka 1 sampai 5 adalah nomor ulangan) ................ 21
7
Hambatan perkembangan dan pertumbuhan tanaman kedelai pada
media agar semi-padat yang diinfestasi dengan cendawan patogen F.
oxysporum, S. rolfsii, dan R. solani ........................................................... 22
8
Skema penempatan pot pada pengujian ketahanan tanaman kedelai
inokulasi dengan Pseudomonas penghasil ACC deaminase terhadap
cendawan patogen pada tanah steril (atas) dan non-steril (bawah) di
rumah kaca. (FS46-1 = inokulasi tanah steril dengan Fusarium
oxysporum dan Pseudomonas Crb46 pada ulangan 1; FN56-3 =
inokulasi tanah steril dengan Fusarium oxysporum dan Pseudomonas
Crb56 pada ulangan 3, dan seterusnya) ..................................................... 24
9
Pengaruh isolat Pseudomonas terhadap pertambahan panjang dan
bobot akar (%) tanaman kedelai umur 7 hari pada percobaan A. Tanda
* = berbeda nyata dibanding perlakuan kontrol ......................................... 28
10
Pengaruh isolat Pseudomonas terhadap pertambahan panjang dan
bobot akar (%) tanaman kedelai umur 7 hari pada percobaan B. Tanda
* = berbeda nyata dibanding perlakuan kontrol ......................................... 28
11
Pengaruh isolat Pseudomonas terhadap pertambahan panjang dan
bobot akar (%) tanaman kedelai umur 7 hari pada percobaan C. Tanda
* = berbeda nyata dibanding perlakuan kontrol ......................................... 29
12
Pengaruh isolat Pseudomonas terhadap pertambahan panjang dan
bobot akar (%) tanaman kedelai umur 7 hari pada percobaan D. Tanda
* = berbeda nyata dibanding perlakuan kontrol ......................................... 29
13
Pengaruh isolat Pseudomonas terhadap pertambahan atau
pengurangan panjang dan bobot akar (%) tanaman kedelai umur 7 hari
pada percobaan E. Inokulasi Pseudomonas tidak nyata meningkatkan
panjang maupun bobot akar ...................................................................... 30
14
Pengaruh isolat Pseudomonas terhadap pertambahan atau
pengurangan panjang dan bobot akar (%) tanaman kedelai umur 7 hari
pada percobaan E. Inokulasi Pseudomonas tidak nyata meningkatkan
panjang maupun bobot akar dan isolat cenderung menghambat panjan
dan bobot akar .......................................................................................... 29
15
Pertumbuhan isolat Pseudomonas pada cawan-agar media M26 (A),
DF + amonium sulfat (B), dan DF + ACC (C). .......................................... 31
16
Uji kompatibilitas Pseudomonas dengan rhizobia pada agar cawan
King's B, yaitu reaksi antagonis B. japonicum Bj11 terhadap
Pseudomonas Crb26 (A) yang ditunjukkan oleh zona penghambatan
warna terang di sekeliling koloni isolat (bulatan kertas saring) dan
reaksi tidak antagonis S. fredii Rif5 terhadap Pseudomonas Crb56 (B)...... 35
DAFTAR LAMPIRAN
Halaman
1
Hasil analisis contoh tanah komposit Ultisols dari daerah Leuwiliang,
Jasinga, Bogor untuk penelitian di rumah kaca ......................................... 53
2
Data hasil analisis varian dan rata-rata perlakuan pada tiap set
percobaan di ruang penumbuh (growth chamber) ..................................... 54
3
Daftar publikasi hasil penelitian selama masa studi yang diterbitkan
pada journal nasional dan international terakreditasi, periode 20072011 ......................................................................................................... 60
PENDAHULUAN
Latar Belakang
Berbagai jenis bakteri yang menguntungkan dari kelompok rizobakteri
pemacu tumbuh tanaman banyak diteliti dan dikembangkan, antara lain dari genus
Pseudomonas, Enterobacter, Bacillus, Serratia, Acetobacter, Azotobacter, dan
Azospirillum. Selain mampu menghasilkan senyawa pemacu tumbuh dan
mengendalikan penyakit, beberapa rizobakteri seperti Pseudomonas juga dikenal
sebagai bakteri kompetitif dan paling efisien memanfaatkan sumber hara di
lingkungan rhizosfer (Kloepper & Schroth 1981). Manfaat rizobakteri ini terhadap
pertumbuhan tanaman telah banyak dilaporkan. Beberapa galur mampu
mensintesis zat pengatur tumbuh (fitohormon), menghasilkan enzim 1aminocyclopropane-1-carboxylate (ACC) deaminase untuk mengurangi sintesis
hormon etilen yang berlebihan pada masa pertumbuhan vegetatif tanaman,
memfasilitasi penyerapan unsur hara di dalam tanah (Glick 1995; Cattelan et al.
1999; Tenuta 2006), dan menghasilkan senyawa atau metabolit seperti
siderophore, -1,3-glukanase, kitinase, antibiotik, dan sianida untuk menekan
aktivitas patogen (Kloepper 1993; Cattelan et al. 1999; Wang et al. 2000). Di
antara berbagai peran penting ini, bakteri penghasil enzim ACC deaminase mulai
banyak diteliti untuk membantu pertumbuhan tanaman.
Rizobakteri penghasil ACC deaminase mampu memacu pertumbuhan dan
meningkatkan daya tahan tanaman terhadap cekaman (stress) yang disebabkan
berbagai faktor biotik dan abiotik (lingkungan) yang ekstrim, antara lain tingginya
hormon IAA (Mayak et al. 1997), genangan (Grichko & Glick 2001), kekeringan
(Mayak et al. 2004), adanya polutan organik dan anorganik (Reed & Glick 2005;
Belimov et al. 2001), tingginya kadar garam (Saravanakumar & Samiyappan
2007), dan serangan patogen (Wang et al. 2000; Dey et al. 2004; Shaharoona et al.
2006). Enzim ini berperan mendegradasi ACC (prekursor hormon etilen) menjadi
amonia dan α-ketobutirat untuk mengurangi pembentukan hormon etilen dalam
jaringan akar yang dipicu oleh berbagai faktor biotik dan abiotik ekstrim tersebut
(Abeles et al. 1992; Glick 1995). Sebagai hormon senescence yang berperan
penting dalam pembungaan dan pematangan buah, peningkatan konsentrasi
2
hormon etilen pada awal masa pertumbuhan tanaman menghambat perkembangan
akar (Glick 1995; Mayak et al. 1997) dan pembentukan bintil akar (Ma et al.
2003), dan dalam banyak kasus melemahkan ketahanan tanaman terhadap
penyakit (Wang et al. 2000; 2006; Dey et al. 2004). Tanaman yang terinfeksi
patogen juga dilaporkan sering mengalami cekaman etilen dengan diproduksinya
hormon ini dalam jumlah yang berlebihan, sehingga memperparah serangan
penyakit (Lund et al. 1998; Van Loon et al. 2006). Dengan demikian,
pemanfaatan rizobakteri penghasil ACC deaminase untuk mengendalikan sintesis
etilen, terutama pada masa pertumbuhan vegetatif, merupakan salah satu upaya
untuk meningkatkan pertumbuhan dan ketahanan mereduksi tanaman terhadap
penyakit.
Di Indonesia, studi penggunaan rizobakteri penghasil enzim ACC
deaminase sebelum penelitian ini belum pernah dilaporkan. Pemanfaatannya bagi
budidaya tanaman kedelai di Indonesia merupakan salah satu alternatif teknologi
yang menjanjikan untuk mengatasi rendahnya kualitas pertumbuhan tanaman
yang dapat disebabkan oleh faktor tanah, air maupun penyakit. Selain itu,
penggunaan bakteri penghasil ACC deaminase ini dalam sistem budidaya
tanaman kedelai akan dapat mengurangi pemakaian senyawa agrokimia sintetik
yang berlebihan (pupuk dan fungisida) yang saat ini harganya semakin mahal dan
berpotensi mencemari lingkungan. Bakteri dari genus Pseudomonas penghasil
IAA yang dipilih sebagai model dalam penelitian ini dikenal kompetitif dan
paling efisien dalam memanfaatkan sumber hara di lingkungan rhizosfer
(Kloepper & Schroth 1981). Tiga jenis penyakit tular tanah yang juga digunakan
sebagai model dalam penelitian ini adalah penyakit busuk kecambah dan busuk
akar yang disebabkan oleh cendawan patogen Rhizoctonia solani dan Fusarium
oxysporum, dan penyakit hawar batang yang disebabkan oleh cendawan patogen
Sclerotium rolfsii. Ketiga jenis patogen ini termasuk penyakit penting pada
tanaman kedelai di Indonesia. Kehilangan panen kedelai yang diakibatkan oleh
penyakit ini di Indonesia cukup besar yaitu sekitar 12,5 ribu ton dari total 147,5
ribu ton kehilangan panen kedelai pada tahun 1998 (Wrather et al. 2001). Hasil
penelitian Balai Penelitian Tanaman Kacang-kacangan dan Umbi-umbian (2005)
juga memperlihatkan bahwa intensitas serangan cendawan tular tanah R. solani
3
mencapai 15,5% dari total serangan penyakit. Tantangan dalam pemanfaatan
bakteri penghasil ACC deaminase ini pada tanaman kedelai terletak pada
kemampuan menapis dan memilih bakteri penghasil ACC deaminase yang unggul,
kompetitif, dan dapat bekerja secara sinergis dengan bakteri bintil akar (rhizobia).
Tujuan Penelitian
Penelitian ini bertujuan mendapatkan isolat-isolat Pseudomonas penghasil
enzim 1-aminocyclopropane-1-carboxylate (ACC) deaminase yang mampu
meningkatkan pertumbuhan dan ketahanan tanaman kedelai terhadap penyakit
melalui serangkaian penelitian di laboratorium, ruang penumbuh (growth
chamber), dan rumah kaca. Secara rinci, tujuan penelitian ini dicapai melalui 3
tahapan utama, sebagai berikut:
1. Penapisan (screening) isolat-isolat Pseudomonas pemacu pertumbuhan
kedelai secara in planta di ruang penumbuh (growth chamber) dan
pengukuran aktivitas ACC deaminase secara in vitro di laboratorium.
2. Seleksi isolat-isolat Pseudomonas penghasil ACC deaminase yang unggul dan
tidak antagonis terhadap bakteri bintil akar melalui uji kompatibilitas.
3. Pengujian kemampuan isolat-isolat Pseudomonas penghasil ACC deaminase
dalam meningkatkan pertumbuhan dan ketahanan tanaman kedelai terhadap
penyakit yang disebabkan oleh cendawan patogen Fusarium oxysporum,
Sclerotium rolfsii, dan Rhizoctonia solani melalui percobaan di rumah kaca
pada media tanah steril dan non-steril.
Hipotesis
Diperoleh bakteri Pseudomonas penghasil ACC deaminase yang unggul,
mempunyai karakter tidak antagonis terhadap bakteri bintil akar (rhizobia), dan
mampu meningkatkan pertumbuhan dan daya tahan tanaman kedelai terhadap
serangan penyakit.
4
Manfaat Penelitian
Pemanfaatan Pseudomonas penghasil ACC deaminase sebagai agen hayati
dalam sistem budidaya tanaman kedelai di Indonesia akan mendukung upaya
peningkatan produksi yang selama ini lebih banyak bertumpu pada penggunaan
bahan kimia sintetik (pupuk dan fungisida). Pemanfaatan bakteri ini secara tepat
akan mengurangi penggunaan pupuk dan fungisida kimia sintetik yang harganya
terus semakin mahal dan pemakaiannya yang berlebihan berpotensi mencemari
lingkungan. Sifat bakteri ini yang tidak antagonis terhadap rhizobia dapat bekerja
secara sinergis dengan bakteri bintil akar penambat N yang alami (native) maupun
yang diaplikasikan secara bersamaan. Fungsi ganda karakter ACC deaminase
yang dimiliki bakteri ini selain mampu melindungi tanaman dari berbagai
cekaman biotik (serangan penyakit) juga diharapkan dapat melindungi tanaman
dari berbagai cekaman abiotik (lingkungan ekstrim). Sebagai agen hayati,
Pseudomonas penghasil ACC deaminase dapat diperbanyak dan diperbaharui,
sehingga dapat digunakan secara berkelanjutan.
Temuan Baru (Novelty)
Studi bakteri penghasil enzim ACC deaminase dan pemanfaatannya bagi
sistem budidaya tanaman kedelai di Indonesia belum pernah dilaporkan.
Ditemukannya isolat lokal (indigenous) Pseudomonas penghasil ACC deaminase
dari rizosfer tanaman kedelai yang mampu meningkatkan pertumbuhan dan daya
tahan tanaman kedelai terhadap serangan cendawan patogen akan memotivasi
kegiatan eksplorasi, isolasi, dan seleksi berbagai jenis bakteri dengan karakter dan
fungsi yang sama untuk dikembangkan sebagai pupuk dan fungisida hayati.
TINJAUAN PUSTAKA
Rizobakteri Pemacu Pertumbuhan Tanaman (PGPR)
Rizobakteri pemacu tumbuh tanaman yang populer disebut plant growth
promoting rhizobacteria (PGPR) diperkenalkan pertama kali oleh Kloepper dan
Schroth (1978). Rizobakteri merupakan kelompok bakteri rhizosfer yang memiliki
kemampuan mengkolonisasi rizosfer secara agresif dan memberi keuntungan bagi
tanaman (Kloepper & Schroth 1978; Schroth & Hancock 1982). Berbagai jenis
bakteri telah diidentifikasi sebagai PGPR. Sebagian besar berasal dari kelompok
Gram negatif dengan jumlah galur paling banyak dari genus Pseudomonas dan
Serratia (Kloepper 1993).
Aktivitas rizobakteri di lingkungan perakaran memberi keuntungan bagi
pertumbuhan tanaman dengan kemampuannya menyediakan atau memfasilitasi
penyerapan berbagai unsur hara dalam tanah serta mensintesis dan mengubah
konsentrasi berbagai zat pengatur tumbuh (fitohormon). Selain itu, bakteri ini juga
memiliki kemampuan menekan aktivitas patogen dengan cara menghasilkan
berbagai senyawa atau metabolit seperti siderophore, -1,3-glukanase, kitinase,
antibiotik, dan sianida (Kloepper 1993; Cattelan et al. 1999; Tenuta 2006) dan
enzim aminocyclopropane carboxylate (ACC) deaminase (Glick 1995).
Enzim ACC Deaminase dan Etilen
Enzim 1-aminocyclopropane-1-carboxylate deaminase (E.C.4.1.99.4),
disingkat ACC deaminase, merupakan enzim sitoplasma yang diproduksi oleh
beberapa mikroba. Honma dan Shimomura (1978) menemukan enzim ini pertama
kali pada bakteri Pseudomonas sp galur ACP. Enzim ACC deaminase berperan
mendegradasi asam amino siklopropanoid 1-aminocyclopropane-1-carboxylic
acid atau ACC menjadi α-ketobutirat dan amonia. Asam amino ACC merupakan
prekursor hormon etilen pada tanaman, sehingga ketersediaanya menjadi faktor
utama dalam biosintesis hormon etilen.
Biosistesis etilen pada tanaman dimulai dari proses S-adenosilasi metionin
menjadi S-adenosylmethionine yang selanjutnya diubah menjadi ACC (Ose et al.
2003). ACC yang terbentuk dioksidasi menjadi hormon etilen (Gambar 1).
6
Gambar 1. Biosintesis etilen pada tanaman (Diringkas dan digambar ulang dari
Ose et al. 2003)
Etilen tergolong hormon senesen yang berperan dalam pematangan buah
dan penuaan (Abeles et al. 1992; Mathews & Van Holde 1996). Etilen dalam
konsentrasi yang rendah pada masa perkecambahan mempercepat proses
perkecambahan atau memecah masa dormansi biji. Namun apabila konsentrasi
etilen terus meningkat, perkembangan akar menjadi terhambat. Berbagai hasil
penelitian membuktikan bahwa selain berperan dalam pematangan buah, etilen
juga berfungsi sebagai antagonis atau modulator bagi berbagai fitohormon lain
untuk mencegah pertumbuhan tanaman yang berlebihan (Lieberman & Kunishi
1972; Imaseki 1986; Arshad & Frankenberger 1993). Degradasi prekursor etilen
(ACC) oleh bakteri penghasil ACC deaminase melalui interaksi hubungan
bakteri-tanaman terbukti mampu mengurangi biosintesis hormon etilen, sehingga
perkembangan akar tidak terganggu.
Bakteri Penghasil ACC Deaminase sebagai Pemacu Tumbuh Tanaman
Berbagai hasil penelitian bakteri pemacu tumbuh mengindikasikan adanya
keterkaitan antar berbagai jenis hormon dalam meningkatkan pertumbuhan
tanaman. Hormon IAA (asam indol asetat) bekerja sama dengan sitokinin.
Perbandingan (rasio) konsentrasi kedua hormon ini sangat penting dalam
meningkatkan pertumbuhan tanaman (Mathews & Van Holde 1996). Hasil
7
penelitian lain memperlihatkan keterkaitan antara produksi hormon IAA dengan
hormon etilen. Okon dan Kapulnik (1986) dan Abbas dan Okon (1993)
melaporkan bahwa IAA yang dihasilkan oleh beberapa bakteri Azospirillum
brasilense dan Azotobacter paspali mampu meningkatkan jumlah bulu akar dan
akar lateral tanaman, sehingga meningkatkan penyerapan air dan unsur hara dari
tanah. Namun peningkatan pertumbuhan ini terjadi pada tanaman yang diberi IAA
dalam konsentrasi rendah (0,005 µg ml-1) dan tanaman yang diinokulasi dengan
bakteri yang kemampuan memproduksi IAA-nya rendah. Sintesis IAA yang
berlebihan justru menghambat pertumbuhan tanaman (Beyeler et al. 1997).
Konsentrasi IAA yang tinggi di lingkungan akar dapat memicu pembentukan
ACC, dan ACC yang terbentuk akan dioksidasi menjadi etilen yang dalam
konsentrasi tinggi dapat menghambat perkembangan akar (Glick et al. 1998;
Mayak et al. 1997; Shah et al. 1997).
Hasil penelitian Glick et al. (1998) membuktikan bahwa Pseudomonas
penghasil enzim ACC deaminase mampu mengurangi pengaruh penghambatan
pertumbuhan tanaman karena meningkatnya hormon etilen dengan cara
menghidrolisis ACC yang terbentuk dalam jaringan akar. Mekanisme proses
penurunan konsentrasi etilen di dalam lingkungan akar disajikan pada Gambar 2.
Pada Gambar 2 terlihat bahwa hormon IAA yang diproduksi oleh mikroba di
lingkungan rizosfer (eksogenus) sebagian masuk ke jaringan akar melalui proses
kesetimbangan. Hormon IAA ini selain memacu perkembangan sel dan
pembentukan akar muda, juga merangsang pembentukan enzim ACC sintase
untuk pembentukan ACC. Dalam proses kesetimbangan, sebagian ACC
dikeluarkan akar yang selanjutnya didegradasi oleh bakteri penghasil enzim ACC
deaminase menjadi amonia dan α-ketobutirat. Hidrolisis ACC secara terus
menerus akan mengurangi jumlah ACC dan pembentukan hormon etilen di dalam
akar, sehingga mengurangi pengaruh penghambatan etilen bagi perkembangan
akar. Hasil penelitian Wang et al. (2000) membuktikan adanya kemampuan
bakteri penghasil ACC deaminase dalam meningkatkan panjang akar pada
tanaman kanola dan memperkuat daya tahan tanaman terhadap serangan penyakit.
8
Gambar 2. Skema mekanisme penurunan konsentrasi hormon etilen dalam
jaringan tanaman oleh bakteri penghasil enzim ACC deaminase untuk
mencegah terbentuknya etilen berlebihan yang dapat menghambat
perkembangan akar (Sumber: diadaptasi dari Glick et al. 1998; 2007).
9
Bakteri Penghasil ACC Deaminase sebagai Agen Hayati Pengendali Patogen
Selain memacu pertumbuhan tanaman, bakteri penghasil ACC deaminase
juga berperan dalam meningkatkan daya tahan tanaman terhadap cekaman (stress)
yang ditimbulkan oleh berbagai faktor biotik (serangan patogen) maupun abiotik
(lingkungan). Bakteri ini mampu mengurangi tingkat cekaman tanaman dengan
mengendalikan pembentukan hormon etilen yang dipicu oleh berbagai faktor
biotik dan abiotik ekstrim. Berbagai hasil penelitian menunjukkan bahwa
peningkatan konsentrasi etilen pada tanaman, khususnya pada awal masa
pertumbuhan vegetatif, menghambat perkembangan akar dan melemahkan
ketahanan tanaman terhadap serangan penyakit (Wang et al. 2000; Glick et al.
2007).
Studi yang dilakukan Wang et al. (2000; 2006) membuktikan kemampuan
beberapa bakteri penghasil ACC deaminase dalam mengendalikan berbagai
penyakit akar tanaman yang disebabkan oleh cendawan patogen, seperti penyakit
layu rebah (damping off) pada mentimun dan busuk akar pada tomat dan kentang.
Hasil penelitiannya membuktikan kemampuan bakteri penghasil ACC deaminase
dalam menekan serangan cendawan patogen Pythium ultimum penyebab layu
rebah. Tanaman yang terinfeksi patogen sering mengalami cekaman etilen (etilen
diproduksi dalam jumlah banyak), sehingga akan memperparah serangan penyakit
(Van Loon et al. 2006). Inokulasi bakteri penghasil ACC deaminase terbukti
mampu menekan pembetukan hormon etilen dan memperkuat daya tahan tanaman
terhadap serangan patogen.
Cendawan Patogen Tular Tanah pada Kedelai
Berbagai penyakit tanaman kedelai yang disebabkan oleh cendawan di
dalam tanah yang populer dikenal sebagai patogen tular tanah (soilborne disease)
sudah banyak diidentifikasi. Beberapa diantaranya adalah cendawan patogen
Fusarium oxysporum penyebab busuk akar (root rot) dan tanaman mati mendadak
(sudden death syndrome), Sclerotium rolfsii penyebab layu (damping-off) dan
hawar batang atau busuk pangkal batang (stem rot), dan Rhizoctonia solani
penyebab busuk akar dan busuk kecambah (Colyer 1989; Hartman et al. 1999).
Ketiga jenis cendawan patogen ini masih tergolong sebagai penyakit utama
tanaman kedelai di Indonesia. Total kehilangan hasil panen kedelai yang
10
diakibatkan oleh cendawan ini di Indonesia cukup besar yaitu sekitar 12,5 ribu ton
dari total 147,5 ribu ton kehilangan panen kedelai pada tahun 1998 (Wrather et al.
2001). Hasil penelitian Balai Penelitian Tanaman Kacang-kacangan dan Umbiumbian (2005) memperlihatkan bahwa intensitas serangan cendawan patogen
tular tanah R. solani mencapai 15,5% dari total serangan penyakit.
Gejala penyakit yang ditimbulkan oleh Fusarium menurut Roy et al.
(1997) adalah daun menguning (yellowing), khlorosis dan nekrosis pada daun
muda, diskolorasi pada batang, dan busuk akar. Hasil penelitian Mueller et al.
(2003) mengindikasikan bahwa sangat sedikit galur kedelai yang tahan terhadap
serangan patogen ini. Sedangkan kerugian yang ditimbulkan oleh serangan S.
rolfsii sangat bervariasi dan biasanya terjadi pada areal yang terpencar-pencar di
sekitar tanaman yang mati (Colyer 1989).
BAHAN DAN METODE
Tempat Penelitian
Penelitian ini dilakukan di laboratorium, ruang penumbuh (growth
chamber), dan rumah kaca. Penelitian di laboratorium dan ruang penumbuh
dilaksanakan di Laboratorium Biologi dan Kesehatan Tanah, Balai Penelitian
Tanah, Bogor. Sedangkan percobaan di rumah kaca dilakukan di Instalasi Rumah
Kaca, Balai Besar Penelitian dan Pengembangan Bioteknologi dan Sumberdaya
Genetik Pertanian, Cimanggu, Bogor.
Bahan Penelitian
Penelitian ini menggunakan isolat bakteri Pseudomonas; cendawan
patogen Fusarium oxysporum, Sclerotium rolfsii, dan Rhizoctonia solani; bakteri
bintil akar Bradyrhizobium japonicum Bj11 dan Sinorhizobium fredii Rif5; benih
kedelai varietas Wilis; plastik kantong tumbuh (growth pouches); dan tanah untuk
pengujian tanaman di rumah kaca.
Bakteri Pseudomonas yang diuji adalah sebanyak 82 isolat Pseudomonas
non-patogen yang diisolasi dari rizosfer tanaman kedelai di daerah Plumbon,
Cirebon, Jawa Barat. Sebanyak 81 isolat merupakan isolat penghasil hormon asam
indol asetat (IAA) dengan kemampuan sintesis secara in vitro berkisar dari 1,13 –
20,49 µg ml-1 (Wahyudi et al. 2007). Isolat Pseudomonas tersebut adalah isolat
dengan kode Crb1 sampai Crb6, Crb8 sampai Crb37, Crb39 sampai Crb56, Crb60,
Crb74, Crb75, Crb78 sampai Crb87, Crb89, Crb92 sampai Crb95, Crb102,
Crb104, dan Crb109 sampai Crb115. Satu isolat yang bukan penghasil IAA, yaitu
Pseudomonas Crb38 yang disertakan dalam penelitian ini, digunakan sebagai
kontrol negatif. Daftar isolat dan kemampuannya menghasilkan IAA dalam media
cair yang diperkaya dengan triptofan (prekursor IAA) disajikan pada Tabel 1.
12
Tabel 1. Isolat-isolat Pseudomonas dan kemampuannya menghasilkan IAA yang
digunakan dalam penelitian ini.
No
Kode Isolat
IAA (ppm)
No
Kode Isolat
IAA (ppm)
1
Crb1
10,21
42
Crb43
5,08
2
Crb2
9,58
43
Crb44
3,73
3
Crb3
2,32
44
Crb45
9,65
4
Crb4
9,46
45
Crb46
15,80
5
Crb5
12,75
46
Crb47
10,36
6
Crb6
8,35
47
Crb48
8,98
7
Crb8
7,40
48
Crb49
16,19
8
Crb9
8,98
49
Crb50
10,01
9
Crb10
7,64
50
Crb51
10,17
10
Crb11
8,35
51
Crb52
17,53
11
Crb12
6,68
52
Crb53
16,86
12
Crb13
7,40
53
Crb54
16,90
13
Crb14
3,45
54
Crb55
8,79
14
Crb15
13,99
55
Crb56
18,47
15
Crb16
4,89
56
Crb60
8,04
16
Crb17
16,02
57
Crb74
7,72
17
Crb18
7,82
58
Crb75
7,13
18
Crb19
3,37
59
Crb78
6,40
19
Crb20
5,16
60
Crb79
19,67
20
Crb21
14,15
61
Crb80
4,45
21
Crb22
3,45
62
Crb81
18,67
22
Crb23
13,17
63
Crb82
6,63
23
Crb24
15,16
64
Crb83
5,04
24
Crb25
2,20
65
Crb84
14,63
25
Crb26
12,53
66
Crb85
19,72
26
Crb27
1,98
67
Crb86
6,31
27
Crb28
12,16
68
Crb87
6,26
28
Crb29
2,64
69
Crb89
5,45
29
Crb30
4,31
70
Crb92
1,44
30
Crb31
5,45
71
Crb93
7,60
31
Crb32
2,60
72
Crb94
1,13
32
Crb33
3,26
73
Crb95
7,24
33
Crb34
2,82
74
Crb102
6,48
34
Crb35
12,53
75
Crb104
20,49
35
Crb36
4,39
76
Crb109
9,18
36
Crb37
2,34
77
Crb110
5,85
37
Crb38
0
78
Crb111
10,93
38
Crb39
3,91
79
Crb112
6,88
39
Crb40
8,66
80
Crb113
9,30
40
Crb41
3,73
81
Crb114
9,62
41
Crb42
4,61
82
Crb115
7,75
Sumber: Data hasil penelitian Wahyudi et al. (2007)
13
Biakan murni cendawan patogen akar kedelai R. solani diperoleh dari
Laboratorium Biologi dan Kesehatan Tanah, Balai Penelitian Tanah, Bogor,
sedangkan F. oxysporum dan S. rolfsii diperoleh dari Dr. Abjad Asih Nawangsih,
Departemen Proteksi Tanaman, Fakultas Pertanian, Institut Pertanian Bogor (IPB),
Bogor. Bakteri bintil akar B. japonicum Bj11 diperoleh dari Dr. Aris Tri Wahyudi,
Laboratorium Mikrobiologi, Departemen Biologi, FMIPA, IPB Bogor; sedangkan
S. fredii Rif5 diperoleh dari Laboratorium Biologi dan Kesehatan Tanah, Balai
Penelitian Tanah, Bogor.
Benih kedelai varietas Wilis diperoleh dari Balai Besar Penelitian dan
Pengembangan Bioteknologi dan Sumberdaya Genetik Pertanian, Bogor. Tanah
untuk penelitian di rumah kaca adalah tanah Ultisol lapisan atas (0-20 cm) yang
berasal dari tanah pertanian di daerah Leuwiliang-Jasingga, Bogor.
Tahapan Penelitian
Penelitian dimulai dengan kegiatan penapisan (screening) isolat-isolat
Pseudomonas yang mampu memacu pertumbuhan tanaman kedelai pada media
steril kantong tumbuh (growth pouch) yang dilaksanakan di ruang penumbuh
(growth chamber). Isolat-isolat yang mampu meningkatkan pertumbuhan tanaman
kedelai, selanjutnya diuji aktivitas ACC deaminase dan kompatibilitasnya dengan
bakteri bintil akar B. japonicum Bj11 dan S. fredii Rif5 secara in vitro.
Isolat-isolat Pseudomonas terbaik yang diperoleh, yaitu isolat yang
mampu memacu pertumbuhan tanaman, memiliki aktivitas ACC deaminase, dan
tidak antagonis terhadap bakteri bintil akar, selanjutnya diuji pada tanaman
kedelai pada tanah pada pot di rumah kaca. Pengujian ini mencakup kemampuan
isolat Pseudomonas yang terpilih dalam meningkatkan pertumbuhan dan
ketahanan tanaman kedelai terhadap penyakit pada tanah steril dan non-steril di
rumah kaca. Secara skematis alur tahapan penelitian disajikan pada Gambar 3.
14
Gambar 3. Diagram alir tahapan penelitian
15
Penapisan in planta Pseudomonas Pemacu Tumbuh
Penapisan kemampuan isolat-isolat Pseudomonas memacu pertumbuhan
tanaman kedelai dilakukan pada media steril kantong tumbuh yang ditempatkan
pada rak-rak di ruang penumbuh (Gambar 4).
Gambar 4. Penapisan Pseudomonas pemacu tumbuh pada media steril kantong
tumbuh. Rak kantong tumbuh (A), penempatan kantong tumbuh pada
rak (B), dan penempatan kedelai pada tiap kantong tumbuh (C).
Prosedur penapisan dengan kantong tumbuh mengikuti protokol pengujian
Liftshitz et al. (1987). Kantong tumbuh terbuat dari plastik tebal tahan panas
berukuran 18 cm (lebar) x 19 cm (panjang). Di dalam tiap kantong diberi 3
potongan kertas saring, masing-masing selebar 5 cm dengan panjang seukuran
bagian dalam kantong tumbuh. Bagian atas kertas saring diberi lipatan untuk
dudukan biji kedelai yang ditumbuhkan. Kantong tumbuh sebelum digunakan
disterilisasi dengan autoklaf selama 3 hari berturut-turut (1 jam per hari).
Penapisan isolat dilakukan dalam 6 set percobaan (A sampai dengan F),
masing-masing set terdiri atas 14 sampai dengan 17 perlakuan (termasuk
perlakuan kontrol tanpa inokulasi isolat dan kontrol inokulasi dengan isolat
bukan-penghasil IAA Crb38). Isolat Pseudomonas yang digunakan pada masingmasing set percobaan disajikan pada Tabel 2.
Percobaa
DALAM MENINGKATKAN PERTUMBUHAN DAN
KETAHANAN TANAMAN KEDELAI TERHADAP PENYAKIT
EDI HUSEN
SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2012
PERNYATAAN MENGENAI DISERTASI
DAN SUMBER INFORMASI
Dengan ini saya menyatakan bahwa disertasi ”Studi Pseudomonas
Penghasil ACC Deaminase dalam Meningkatkan Pertumbuhan dan Ketahanan
Tanaman Kedelai terhadap Penyakit” adalah karya saya dengan arahan dari
komisi pembimbing dan belum diajukan dalam bentuk apapun kepada perguruan
tinggi manapun. Sumber informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang
diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks
dan dicantumkan dalam Daftar Pustaka di bagian akhir disertasi ini.
Bogor, Januari 2012
Edi Husen
NRP: G361070062
ABSTRACT
EDI HUSEN. Study on Pseudomonas Producing ACC Deaminase in Increasing
Growth and Survival of Soybean Against Disease. Under direction of ARIS TRI
WAHYUDI, ANTONIUS SUWANTO and GIYANTO.
1-aminocyclopropane-1-carboxylate (ACC) deaminase-producing bacteria
have been known to help plant growth by preventing the inhibition-effect of
increase concentration of ethylene in higher plants, which is commonly triggered
by high concentration of indole-3-acetic acid (IAA) and/or by the presence of
plant pathogens in the vicinity of the root. The enzyme degrades ACC (precursor
of ethylene) into ammonia and α-ketobutirate as bacterial sole source of nitrogen.
This study examined the potential use of Pseudomonas isolates producing ACC
deaminase in increasing soybean growth and survival against pathogenic fungi
Fusarium oxysporum, Sclerotium rolfsii and Rhizoctonia solani. Eighty one
isolates of IAA-producing Pseudomonas (1.13 to 20.49 µg IAA ml-1) were
screened in planta for their ability to promote soybean growth in growth chamber
conditions. The selected isolates were assessed in vitro for their ACC deaminase
activity and compatibility with root-nodule bacteria Bradyrhizobium japonicum
BJ11 and Sinorhizobium fredii Rif5, and tested to promote soybean growth and
reduce disease incidence caused by F. oxysporum, S. rolfsii and R. solani under
greenhouse conditions. The results showed that 13 out of 81 isolates significantly
increased soybean root length and weight, up to 50% from untreated plants. Of 13
isolates, 11 isolates were able to use ACC as their sole source of nitrogen as an
indication of their ACC deaminase activities. Two isolates that did not show ACC
deaminase activities had lower capacity to produce IAA (5.45 to 6,31 µg IAA ml1
). Three out of 11 isolates inhibited at least one strain of root-nodule bacteria,
thereby limiting their use for soybean. Eight selected isolates increased soybean
height and fresh weight although not all were significantly different from
untreated control. On the other hand, most isolates significantly increased the
survival rates of soybean in soil containing pathogenic fungi. Disease suppression
of the isolates caused by F. oxysporum, S. rolfsii and R. solani was 17.1, 36.4 and
64.5%, respectively. The higher the destructive effect of the pathogens as shown
by S. rolfsii and R. solani treatments, the better was the ability of the isolates to
reduce the disease. Further work is worth to evaluate whether or not the fertility
status of the soil or a particular pathogen influence the beneficial effects of these
bacteria on soybean.
Key words: ACC deaminase, Fusarium oxysporum, growth promotion, IAA,
Pseudomonas, Rhizoctonia solani, Sclerotium rolfsii, soybean disease.
RINGKASAN
EDI HUSEN. Studi Pseudomonas Penghasil ACC Deaminase dalam Meningkatkan Pertumbuhan dan Ketahanan Tanaman Kedelai terhadap Penyakit. Dibimbing
oleh ARIS TRI WAHYUDI, ANTONIUS SUWANTO dan GIYANTO.
Enzim 1-aminocyclopropane-1-carboxylate deaminase (ACC deaminase)
(E.C.4.1.99.4) merupakan enzim yang diproduksi oleh beberapa rizobakteri untuk
mendegradasi substrat ACC (prekursor hormon etilen) sebagai sumber nitrogen.
Degradasi ACC secara aktif oleh rizobakteri akan mengurangi biosintesis hormon
etilen. Dalam banyak kasus, biosintesis etilen yang berlebihan dalam jaringan akar
akan menghambat perkembangan akar dan melemahkan ketahanan tanaman
terhadap serangan penyakit. Beberapa faktor pemicu biosintesis etilen pada
tanaman banyak terkait dengan cekaman (stres) akibat kondisi lingkungan yang
tidak mendukung, serangan hama penyakit, dan peningkatan konsentrasi hormon
asam indol asetat (indole acetic acid, IAA). Dari berbagai hasil penelitian,
inokulasi bakteri penghasil ACC deaminase terbukti mampu meningkatkan
pertumbuhan tanaman dengan mengoptimalkan peran IAA dalam memacu
pertumbuhan tanaman dan meningkatkan daya tahan tanaman terhadap serangan
patogen.
Di Indonesia, studi penggunaan rizobakteri penghasil ACC deaminase
sebelum penelitian ini belum pernah dilaporkan. Pemanfaatannya pada tanaman
kedelai merupakan salah satu alternatif teknologi yang menjanjikan untuk
meningkatkan kualitas pertumbuhan tanaman dan mengatasi banyaknya serangan
penyakit pada pertanaman kedelai. Penggunaan bakteri ini dapat mengurangi
pemakaian senyawa agrokimia sintetik yang berlebihan (pupuk dan pestisida)
yang berpotensi mencemari lingkungan. Tantangannya adalah terletak pada
kemampuan menapis dan memilih bakteri penghasil ACC deaminase yang unggul
yang dapat bekerja secara sinergis dengan bakteri bintil akar kedelai (rhizobia).
Penelitian ini bertujuan untuk mendapatkan isolat-isolat Pseudomonas
lokal penghasil enzim ACC deaminase dan mempelajari kemampuannya
meningkatkan pertumbuhan dan ketahanan tanaman kedelai terhadap penyakit
melalui serangkaian penelitian di laboratorium dan rumah kaca. Untuk mencapai
tujuan ini dilakukan penapisan (screening) isolat secara in planta dan in vitro di
laboratorium. Isolat-isolat terbaik selanjutnya diuji keefektivannya pada tanaman
kedelai menggunakan tanah steril dan non-steril.
Mikroba yang digunakan mencakup isolat Pseudomonas asal rizosfer
tanaman kedelai, yaitu 81 isolat penghasil IAA (1,13 – 20,49 µg IAA ml-1) dan 1
isolat bukan-penghasil IAA; cendawan patogen Rhizoctonia solani, Sclerotium
rolfsii, dan Fusarium oxysporium; bakteri bintil akar Bradyrhizobium japonicum
BJ11 dan Sinorhizobium fredii Rif5. Varietas kedelai yang digunakan adalah
varietas Wilis. Tanah untuk percobaan pot menggunakan tanah pertanian yang
diperoleh dari areal pertanian di sekitar Leuwiliang-Jasinga, Bogor.
Hasil penapisan in planta menggunakan media steril kantong-tumbuh
(growth pouch) di ruang penumbuh (growth chamber) diperoleh 13 dari 81 isolat
Pseudomonas penghasil IAA yang mampu meningkatkan panjang dan bobot akar
bibit kedelai sampai 50% dibanding perlakuan kontrol. Dari 13 isolat ini, 11
diantaranya memiliki aktivitas ACC deaminase berdasarkan kemampuannya
mendegradasi substrat ACC pada media garam minimal. Hasil yang diperoleh
memperlihatkan peran fisologis bakteri penghasil ACC deaminase dalam memacu
pertumbuhan tanaman kedelai tanpa terpengaruh oleh peran isolat ini yang juga
mampu mensintesis hormon IAA. Dua isolat yang tidak memiliki aktivitas ACC
deaminase, yaitu Pseudomonas Crb31 dan Crb86, tergolong isolat yang rendah
kemampuannya menghasilkan IAA (5,45 dan 6,31 µg IAA ml-1) dibanding isolat
lain.
Hasil uji kompatibilitas isolat dengan bakteri bintil akar menunjukkan
bahwa 3 dari 11 isolat Pseudomonas penghasil ACC deaminase bersifat antagonis
terhadap bakteri bintil akar B. japonicum Bj11 dan/atau S. fredii Rif5. Sifat
antagonis ini diindikasikan oleh zona penghambatan pertumbuhan di sekeliling
koloni Pseudomonas yang ditumbuhkan bersama dengan bakteri bintil akar pada
media agar. Ketiga isolat ini tidak potensial digunakan untuk tanaman kedelai.
Delapan isolat penghasil ACC deaminase yang tidak antagonis terhadap bakteri
bintil akar, yaitu Pseudomonas Crb5, Crb12, Crb17, Crb24, Crb46, Crb47, Crb49,
dan Crb56.
Inokulasi kedelai dengan masing-masing dari delapan isolat Pseudomonas
penghasil ACC deaminase sebagian mampu meningkatkan pertumbuhan tanaman
kedelai (umur 14 hari) pada tanah steril dan non-steril di rumah kaca. Data tinggi
dan bobot tanaman yang diinokulasi dengan isolat ini lebih tinggi dibanding
tanaman yang tidak diinokulasi (kontrol). Hasil terbaik peningkatan pertumbuhan
kedelai pada tanah steril ditunjukkan oleh isolat Pseudomonas Crb5, Crb24,
Crb46, dan Crb 56, sedangkan pada tanah non-steril oleh isolat Crb12, Crb17, dan
Crb24. Berbedanya respon tanaman kedelai pada tanah steril dan non-steril diduga
terkait dengan interaksi isolat terhadap mikroba alami, baik yang bersifat positif
maupun negatif terhadap isolat yang diintroduksi. Isolat Crb5, Crb46, dan Crb56
mampu meningkatkan bobot akar pada tanah steril, namun tidak berpengaruh
pada tanah non-steril. Sedangkan isolat Crb12, Crb17, dan Crb47 justru efektif
meningkatkan pertumbuhan kedelai pada tanah non-steril atau dengan kehadiran
mikroba alami. Rendahnya tingkat kesuburan tanah yang digunakan dalam
penelitian ini diduga juga berpengaruh terhadap keefektivan isolat dalam
meningkatkan pertumbuhan tanaman kedelai.
Inokulasi kedelai dengan isolat Pseudomonas penghasil ACC deaminase
mampu meningkatkan ketahanan tanaman terhadap cendawan patogen Fusarium
oxysporum, Sclerotium rolfsii, dan Rhizoctonia solani. Tingkat penekanan
penyakit oleh isolat yang disebabkan oleh patogen F. oxysporum, S. Rolfsii, dan R.
solani berturut-turut mencapai 17,1%; 36,4%; dan 64,5%. Kemampuan isolat
meningkatkan ketahanan tanaman terhadap penyakit cenderung meningkat dengan
meningkatnya tingkat cekaman patogen. Jumlah tanaman yang mati yang
disebabkan oleh F. oxysporum, S. Rolfsii, dan R. solani berturut-turut mencapai
15%, 31%, dan 42%. Diduga induksi pembentukan ACC deaminase pada isolat
meningkat dengan semakin meningkatnya tingkat cekaman patogen. Studi
mendalam tentang sifat spesifik maupun generik peran Pseudomonas penghasil
ACC deaminase dalam meningkatkan ketahanan tanaman kedelai terhadap
penyakit sangat berharga untuk dilakukan.
© Hak cipta milik IPB, tahun 2012
Hak cipta dilindungi Undang-Undang
Dilarang mengutip sebagian atau seluruh karya tulis ini tanpa mencantumkan
atau menyebutkan sumbernya. Pengutipan hanya untuk kepentingan pendidikan,
penelitian, penulisan karya ilmiah, penyusunan laporan, penulisan kritik atau
tinjauan suatu masalah; dan pengutipan tersebut tidak merugikan kepentingan
yang wajar IPB.
Dilarang mengumumkan dan memperbanyak sebagian atau seluruh karya tulis
dalam bentuk apapun tanpa izin IPB.
STUDI PSEUDOMONAS PENGHASIL ACC DEAMINASE
DALAM MENINGKATKAN PERTUMBUHAN DAN
KETAHANAN TANAMAN KEDELAI TERHADAP PENYAKIT
EDI HUSEN
Disertasi
sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
Doktor pada
Mayor Mikrobiologi
SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2012
Penguji pada Ujian Tertutup: Dr. Ir. Suryo Wiyono, MSc.Agr
Dr. Ir. Dyah Manohara, MS
Penguji pada Ujian Terbuka: Prof. Dr. Iswandi Anas, M.Sc
Dr. Pingkan Aditiawati
Judul Disertasi
: Studi Pseudomonas Penghasil ACC Deaminase dalam
Meningkatkan Pertumbuhan dan Ketahanan Tanaman
Kedelai terhadap Penyakit
Nama
: Edi Husen
NRP
: G361070062
Disetujui
Komisi Pembimbing
Dr. Aris Tri Wahyudi, M.Si
Ketua
Dr. Ir. Giyanto, M.Si
Anggota
Prof. Dr. Ir. Antonius Suwanto, M.Sc
Anggota
Diketahui:
Koordinator Mayor Mikrobiologi
Dekan Sekolah Pascasarjana IPB
Dr. Ir. Gayuh Rahayu
Dr. Ir. Dahrul Syah, M.Sc.Agr
Tanggal ujian: 26 Oktober 2011
Tanggal lulus:
PRAKATA
Puji syukur penulis panjatkan kepada Allah SWT atas segala rahmat dan
kasih sayang-Nya, sehingga disertasi yang berjudul “Studi Pseudomonas
Penghasil ACC Deaminase dalam Meningkatkan Pertumbuhan dan Ketahanan
Tanaman Kedelai terhadap Penyakit” telah berhasil diselesaikan.
Terima kasih penulis sampaikan kepada Dr. Aris Tri Wahyudi, Prof. Dr.
Antonius Suwanto, dan Dr. Giyanto yang telah memberikan bimbingan dan
arahan selama pelaksanaan penelitian dan penulisan disertasi. Penelitian ini
terlaksana berkat dukungan dana dari proyek Kerjasama Kemitraan Penelitian
Pertanian dengan Perguruan Tinggi (KKP3T) antara Badan Litbang Pertanian dan
Institut Pertanian Bogor tahun 2007-2009 dan dari Program Insentif Peningkatan
Kapasitas Iptek Sistem Produksi RISTEK tahun 2010-2011 atas nama Dr. Aris Tri
Wahyudi. Oleh karena itu, penulis mengucapkan banyak terima kasih. Terima
kasih kepada Pimpinan dan seluruh staf Departemen Biologi, FMIPA IPB dan
Laboratorium Mikrobiologi atas segala bantuan fasilitas dan penggunaan alat.
Terima kasih penulis sampaikan kepada Dr. Sri Rochayati, kepala Balai Penelitian
Tanah (Balittanah), Dr. Achmad Rachman (d/h kepala Balittanah), Dr. Muhrizal
Sarwani, kepala Balai Besar Litbang Sumberdaya Lahan Pertanian (BBSDLP),
dan Prof. Dr. Irsal Las (d/h kepala BBSDLP) atas izin sekolah dan dukungan yang
diberikan. Ucapan terima kasih juga penulis sampaikan kepada Pimpinan dan
seluruh staf Kelompok Peneliti Biologi dan Kesehatan Tanah dan teman-teman
peneliti lingkup Balittanah yang senantiasa memberikan dukungan moril dalam
penyelesaian studi.
Terima kasih kepada Dr. Dyah Manohara (Balai Penelitian Tanaman Obat
dan Aromatik, Balittro, Bogor) dan Dr. Suryo Wiyono (Departemen Proteksi
Tanaman, Fakultas Pertanian, IPB) atas kesediannya sebagai penguji luar komisi
pada ujian tertutup dan saran perbaikan yang diberikan. Terima kasih kepada Prof.
Dr. Iswandi Anas (Departemen Ilmu Tanah dan Sumberdaya Lahan, Fakultas
Pertanian, IPB) dan Dr. Pingkan Aditiawati (Sekolah Ilmu dan Teknologi Hayati,
ITB, Bandung) atas kesediaannya sebagai penguji luar komisi pada ujian terbuka
dan saran perbaikan yang diberikan.
Ucapan terima kasih kepada istri, Dra. Asih Hendarsih, dan ananda
Mahirawan Setiadhi atas kesabaran dan dukungannya yang senantiasa diberikan.
Semoga karya ilmiah ini bermanfaat.
Bogor, Januari 2012
Edi Husen
RIWAYAT HIDUP
Penulis dilahirkan di Bukittinggi pada tanggal 10 September 1960, sebagai
anak keempat dari Bapak Nazaruddin Chatib Basa dan Ibu Masitah. Penulis
mengenal pertanian sejak menempuh pendidikan pertanian di Sekolah Pertanian
Menengah Atas (SPMA) Negeri Bogor tahun 1978-1981 dan mengenal ilmu tanah
setelah menempuh Pendidikan Kedinasan di Pusat Pelatihan Manajemen dan
Kepemimpinan Pertanian (PPMKP) (d/h IPLPP) Ciawi, Bogor pada tahun 19811982. Pendidikan Sarjana Biologi diselesaikan di Fakultas Matematika dan Ilmu
Pengetahuan Alam, Universitas Pakuan Bogor pada tahun 1987. Pendidikan
Master of Science dalam bidang Mikrobiologi Tanah diselesaikan di University of
the Philippines, Los Banos (UPLB), Philippines pada tahun 2002 dan memperoleh
penghargaan Gamma Sigma Delta dari UPLB. Selanjutnya, penulis melanjutkan
sekolah S3 Jalur Penelitian (by Research) di Program Studi Mikrobiologi, Sekolah
Pascasarjana, Institut Pertanian Bogor pada tahun 2007.
Penulis adalah staf Peneliti Mikrobiologi Tanah di Balai Penelitian Tanah,
Balai Besar Litbang Sumberdaya Lahan Pertanian, Bogor. Selama menjadi
mahasiswa S3, penulis telah mempresentasikan sebagian hasil penelitian disertasi
pada Seminar Nasional dan Internasional, Perhimpunan Mikrobiologi Indonesia,
pada tahun 2008 di Purwokerto dan pada tahun 2010 di Bogor, dengan judul
“Growth Enhancement and Disease Reduction of Soybean by ACC DeaminaseProducing Pseudomonads”. Selain melaksanakan penelitian disertasi, penulis juga
aktif dalam kerja sama penelitian dengan lembaga riset nasional dan internasional,
antara lain proyek REDD-ALERT (Reducing Emissions from Deforestation and
Degradation through Alternative Landuses in Rainforests of the Tropics),
khususnya aspek aktivitas mikroba pada gambut. Pada bulan Juli – Agustus 2011
penulis mendapat kesempatan mengikuti pelatihan soil microbiological extraction
and quantification techniques, khususnya microbial community fingerprinting
using PLFA analysis di Faculty of Bioscience Engineering, University of Gent,
Belgia. Penulis juga aktif mempublikasikan berbagai hasil penelitian di media
cetak ilmiah maupun populer. Selama masa studi S3, penulis telah
mempublikasikan hasil penelitian disertasi ini pada:
1) Microbiology Indonesia, Vol. 2 (3): 107-111, 2008, Prospective use of 1aminocyclopropane-1-carboxylate deaminase-producing bacteria for plant
growth promotion and defense against biotic and abiotic stresses in peat-soil
agriculture.
2) Indonesian Journal of Agricultural Science, Vol. 10 (1) 2009: 19-25, Soybean
seedling root growth promotion by 1-aminocyclopropane-1-carboxylate
deaminase-producing pseudomonads.
3) American Journal of Agricultural and Biological Sciences, Vol. 6 (2) 2011:
273-278, Soybean response to 1-aminocyclopropane-1-carboxylate
deaminase-producing Pseudomonas under field soil conditions.
4) American Journal of Applied Sciences, 8: 1073-1080, 2011, Growth
enhancement and disease reduction of soybean by 1-aminocyclopropane-1carboxylate deaminase-producing Pseudomonas.
DAFTAR ISI
Halaman
DAFTAR ISI ... ................................................................................................ xix
DAFTAR TABEL ... ........................................................................................ xxi
DAFTAR GAMBAR ... .................................................................................. xxiii
DAFTAR LAMPIRAN ... ................................................................................ xxv
PENDAHULUAN ............................................................................................... 1
Latar Belakang ......................................................................................... 1
Tujuan Penelitian ..................................................................................... 3
Hipotesis ................................................................................................. 3
Manfaat Penelitian.................................................................................... 4
Temuan Baru (Novelty) ............................................................................ 4
TINJAUAN PUSTAKA ...................................................................................... 5
Rizobakateri Pemacu Pertumbuhan Tanaman (PGPR) .............................. 5
Enzim ACC Diaminase dan Etilen ............................................................ 5
Bakteri Penghasil ACC Deaminase sebagai Pemacu Tumbuh
Tanaman .................................................................................................. 6
Bakteri Penghasil ACC Deaminase sebagai Agen Hayati Pengendali
Patogen .................................................................................................... 9
Cendawan Patogen Tular Tanah pada Kedelai .......................................... 9
BAHAN DAN METODE .................................................................................. 11
Tempat Penelitian .................................................................................. 11
Bahan Penelitian..................................................................................... 11
Tahapan Penelitian ................................................................................. 13
Penapisan in planta Pseudomonas Pemacu Tumbuh .............................. 15
Pengujian Aktivitas Enzim ACC Deaminase .......................................... 18
Uji Kompatibilitas Pseudomonas dengan Rhizobia ................................. 19
Uji Pemacu Tumbuh di Rumah Kaca ..................................................... 20
Uji Penekanan Penyakit ......................................................................... 21
HASIL DAN PEMBAHASAN .......................................................................... 27
Hasil Penapisan Psedomonas Pemacu Tumbuh Tanaman Kedelai .......... 27
Aktivitas ACC Deaminase ..................................................................... 31
Uji Kompatibilitas Pseudomonas dengan Rhizobia ................................. 34
Pengaruh Pseudomonas terhadap Peningkatan Pertumbuhan Kedelai ..... 36
Pengaruh Pseudomonas terhadap Penekanan Penyakit ............................ 37
SIMPULAN DAN SARAN ............................................................................... 47
Simpulan ................................................................................................ 47
Saran ..................................................................................................... 47
DAFTAR PUSTAKA ........................................................................................ 49
LAMPIRAN ...................................................................................................... 53
DAFTAR TABEL
Halaman
1
Isolat-isolat Pseudomonas dan kemampuannya menghasilkan IAA
yang digunakan dalam penelitian ini ....................................................... 12
2
Isolat-isolat Pseudomonas pada masing-masing set percobaan ............... 16
3
Aktivitas ACC-deaminase pada media garam minimal DworkinFoster (DF) ditambah amonium sulfat dan ACC sebagai sumber N ........ 32
4
Reaksi penghambatan (antagonis) isolat Pseudomonas terhadap
bakteri bintil akar Bradyrhizobium japonicum Bj11 dan
Sinorhizobium fredii Rif5 pada media cawan agar King’s B.................... 35
5
Pertumbuhan kedelai (umur 14 hari setelah tanam) yang diinokulasi
dengan isolat Pseudomonas (Crb) penghasil ACC deaminase pada
media tanah non-steril di rumah kaca ...................................................... 36
6
Penekanan penyakit dan bobot basah tanaman kedelai yang
diinokulasi dengan isolat Pseudomonas (Crb) penghasil ACC
deaminase pada tanah yang diinfestasi dengan cendawan patogen
Fusarium oxysporum (Fo) di rumah kaca ................................................ 39
7
Penekanan penyakit dan bobot basah tanaman kedelai yang
diinokulasi dengan isolat Pseudomonas (Crb) penghasil ACC
deaminase pada tanah yang diinfestasi dengan cendawan patogen
Sclerotium rolfsii (Sr) di rumah kaca....................................................... 41
8
Penekanan penyakit dan bobot basah tanaman kedelai yang
diinokulasi dengan isolat Pseudomonas (Crb) penghasil ACC
deaminase pada tanah yang diinfestasi dengan cendawan patogen
Rhizoctonia solani (Rs) di rumah kaca .................................................... 43
DAFTAR GAMBAR
Halaman
1
Biosintesis etilen pada tanaman (Diringkas dan digambar ulang dari
Ose et al. 2003) ......................................................................................... 6
2
Skema mekanisme penurunan konsentrasi hormon etilen dalam
jaringan tanaman oleh bakteri penghasil enzim ACC deaminae untuk
mencegah terbentuknya etilen berlebihan yang dapat menghambat
perkembangan akar (Sumber: diadaptasi dari Glick et al. 1998) .................. 8
3
Diagram alir tahapan penelitian ................................................................ 14
4
Penapisan Pseudomonas pemacu tumbuh pada media steril kantong
tumbuh. Rak kantong tumbuh (A), penempatan kantong tumbuh pada
rak (B), dan penempatan kecambah kedelai pada tiap kantong tumbuh
(C) ............................................................................................................ 15
5
Biji kedelai yang sudah diinokulasi dengan isolat Pseudomonas dan
dikecambahkan pada cawan Petri (A), dan penempatan kecambah
kedelai umur 2 hari pada media kantong tumbuh (B) ................................ 18
6
Skema penempatan pot secara acak dalam uji pemacu tumbuh pada
media tanah steril dan tanah non-steril di rumah kaca (K = kontrol
tanpa inokulasi; Crb17 adalah kedelai yang diinokulasi dengan isolat
Pseudomonas Crb17; angka 1 sampai 5 adalah nomor ulangan) ................ 21
7
Hambatan perkembangan dan pertumbuhan tanaman kedelai pada
media agar semi-padat yang diinfestasi dengan cendawan patogen F.
oxysporum, S. rolfsii, dan R. solani ........................................................... 22
8
Skema penempatan pot pada pengujian ketahanan tanaman kedelai
inokulasi dengan Pseudomonas penghasil ACC deaminase terhadap
cendawan patogen pada tanah steril (atas) dan non-steril (bawah) di
rumah kaca. (FS46-1 = inokulasi tanah steril dengan Fusarium
oxysporum dan Pseudomonas Crb46 pada ulangan 1; FN56-3 =
inokulasi tanah steril dengan Fusarium oxysporum dan Pseudomonas
Crb56 pada ulangan 3, dan seterusnya) ..................................................... 24
9
Pengaruh isolat Pseudomonas terhadap pertambahan panjang dan
bobot akar (%) tanaman kedelai umur 7 hari pada percobaan A. Tanda
* = berbeda nyata dibanding perlakuan kontrol ......................................... 28
10
Pengaruh isolat Pseudomonas terhadap pertambahan panjang dan
bobot akar (%) tanaman kedelai umur 7 hari pada percobaan B. Tanda
* = berbeda nyata dibanding perlakuan kontrol ......................................... 28
11
Pengaruh isolat Pseudomonas terhadap pertambahan panjang dan
bobot akar (%) tanaman kedelai umur 7 hari pada percobaan C. Tanda
* = berbeda nyata dibanding perlakuan kontrol ......................................... 29
12
Pengaruh isolat Pseudomonas terhadap pertambahan panjang dan
bobot akar (%) tanaman kedelai umur 7 hari pada percobaan D. Tanda
* = berbeda nyata dibanding perlakuan kontrol ......................................... 29
13
Pengaruh isolat Pseudomonas terhadap pertambahan atau
pengurangan panjang dan bobot akar (%) tanaman kedelai umur 7 hari
pada percobaan E. Inokulasi Pseudomonas tidak nyata meningkatkan
panjang maupun bobot akar ...................................................................... 30
14
Pengaruh isolat Pseudomonas terhadap pertambahan atau
pengurangan panjang dan bobot akar (%) tanaman kedelai umur 7 hari
pada percobaan E. Inokulasi Pseudomonas tidak nyata meningkatkan
panjang maupun bobot akar dan isolat cenderung menghambat panjan
dan bobot akar .......................................................................................... 29
15
Pertumbuhan isolat Pseudomonas pada cawan-agar media M26 (A),
DF + amonium sulfat (B), dan DF + ACC (C). .......................................... 31
16
Uji kompatibilitas Pseudomonas dengan rhizobia pada agar cawan
King's B, yaitu reaksi antagonis B. japonicum Bj11 terhadap
Pseudomonas Crb26 (A) yang ditunjukkan oleh zona penghambatan
warna terang di sekeliling koloni isolat (bulatan kertas saring) dan
reaksi tidak antagonis S. fredii Rif5 terhadap Pseudomonas Crb56 (B)...... 35
DAFTAR LAMPIRAN
Halaman
1
Hasil analisis contoh tanah komposit Ultisols dari daerah Leuwiliang,
Jasinga, Bogor untuk penelitian di rumah kaca ......................................... 53
2
Data hasil analisis varian dan rata-rata perlakuan pada tiap set
percobaan di ruang penumbuh (growth chamber) ..................................... 54
3
Daftar publikasi hasil penelitian selama masa studi yang diterbitkan
pada journal nasional dan international terakreditasi, periode 20072011 ......................................................................................................... 60
PENDAHULUAN
Latar Belakang
Berbagai jenis bakteri yang menguntungkan dari kelompok rizobakteri
pemacu tumbuh tanaman banyak diteliti dan dikembangkan, antara lain dari genus
Pseudomonas, Enterobacter, Bacillus, Serratia, Acetobacter, Azotobacter, dan
Azospirillum. Selain mampu menghasilkan senyawa pemacu tumbuh dan
mengendalikan penyakit, beberapa rizobakteri seperti Pseudomonas juga dikenal
sebagai bakteri kompetitif dan paling efisien memanfaatkan sumber hara di
lingkungan rhizosfer (Kloepper & Schroth 1981). Manfaat rizobakteri ini terhadap
pertumbuhan tanaman telah banyak dilaporkan. Beberapa galur mampu
mensintesis zat pengatur tumbuh (fitohormon), menghasilkan enzim 1aminocyclopropane-1-carboxylate (ACC) deaminase untuk mengurangi sintesis
hormon etilen yang berlebihan pada masa pertumbuhan vegetatif tanaman,
memfasilitasi penyerapan unsur hara di dalam tanah (Glick 1995; Cattelan et al.
1999; Tenuta 2006), dan menghasilkan senyawa atau metabolit seperti
siderophore, -1,3-glukanase, kitinase, antibiotik, dan sianida untuk menekan
aktivitas patogen (Kloepper 1993; Cattelan et al. 1999; Wang et al. 2000). Di
antara berbagai peran penting ini, bakteri penghasil enzim ACC deaminase mulai
banyak diteliti untuk membantu pertumbuhan tanaman.
Rizobakteri penghasil ACC deaminase mampu memacu pertumbuhan dan
meningkatkan daya tahan tanaman terhadap cekaman (stress) yang disebabkan
berbagai faktor biotik dan abiotik (lingkungan) yang ekstrim, antara lain tingginya
hormon IAA (Mayak et al. 1997), genangan (Grichko & Glick 2001), kekeringan
(Mayak et al. 2004), adanya polutan organik dan anorganik (Reed & Glick 2005;
Belimov et al. 2001), tingginya kadar garam (Saravanakumar & Samiyappan
2007), dan serangan patogen (Wang et al. 2000; Dey et al. 2004; Shaharoona et al.
2006). Enzim ini berperan mendegradasi ACC (prekursor hormon etilen) menjadi
amonia dan α-ketobutirat untuk mengurangi pembentukan hormon etilen dalam
jaringan akar yang dipicu oleh berbagai faktor biotik dan abiotik ekstrim tersebut
(Abeles et al. 1992; Glick 1995). Sebagai hormon senescence yang berperan
penting dalam pembungaan dan pematangan buah, peningkatan konsentrasi
2
hormon etilen pada awal masa pertumbuhan tanaman menghambat perkembangan
akar (Glick 1995; Mayak et al. 1997) dan pembentukan bintil akar (Ma et al.
2003), dan dalam banyak kasus melemahkan ketahanan tanaman terhadap
penyakit (Wang et al. 2000; 2006; Dey et al. 2004). Tanaman yang terinfeksi
patogen juga dilaporkan sering mengalami cekaman etilen dengan diproduksinya
hormon ini dalam jumlah yang berlebihan, sehingga memperparah serangan
penyakit (Lund et al. 1998; Van Loon et al. 2006). Dengan demikian,
pemanfaatan rizobakteri penghasil ACC deaminase untuk mengendalikan sintesis
etilen, terutama pada masa pertumbuhan vegetatif, merupakan salah satu upaya
untuk meningkatkan pertumbuhan dan ketahanan mereduksi tanaman terhadap
penyakit.
Di Indonesia, studi penggunaan rizobakteri penghasil enzim ACC
deaminase sebelum penelitian ini belum pernah dilaporkan. Pemanfaatannya bagi
budidaya tanaman kedelai di Indonesia merupakan salah satu alternatif teknologi
yang menjanjikan untuk mengatasi rendahnya kualitas pertumbuhan tanaman
yang dapat disebabkan oleh faktor tanah, air maupun penyakit. Selain itu,
penggunaan bakteri penghasil ACC deaminase ini dalam sistem budidaya
tanaman kedelai akan dapat mengurangi pemakaian senyawa agrokimia sintetik
yang berlebihan (pupuk dan fungisida) yang saat ini harganya semakin mahal dan
berpotensi mencemari lingkungan. Bakteri dari genus Pseudomonas penghasil
IAA yang dipilih sebagai model dalam penelitian ini dikenal kompetitif dan
paling efisien dalam memanfaatkan sumber hara di lingkungan rhizosfer
(Kloepper & Schroth 1981). Tiga jenis penyakit tular tanah yang juga digunakan
sebagai model dalam penelitian ini adalah penyakit busuk kecambah dan busuk
akar yang disebabkan oleh cendawan patogen Rhizoctonia solani dan Fusarium
oxysporum, dan penyakit hawar batang yang disebabkan oleh cendawan patogen
Sclerotium rolfsii. Ketiga jenis patogen ini termasuk penyakit penting pada
tanaman kedelai di Indonesia. Kehilangan panen kedelai yang diakibatkan oleh
penyakit ini di Indonesia cukup besar yaitu sekitar 12,5 ribu ton dari total 147,5
ribu ton kehilangan panen kedelai pada tahun 1998 (Wrather et al. 2001). Hasil
penelitian Balai Penelitian Tanaman Kacang-kacangan dan Umbi-umbian (2005)
juga memperlihatkan bahwa intensitas serangan cendawan tular tanah R. solani
3
mencapai 15,5% dari total serangan penyakit. Tantangan dalam pemanfaatan
bakteri penghasil ACC deaminase ini pada tanaman kedelai terletak pada
kemampuan menapis dan memilih bakteri penghasil ACC deaminase yang unggul,
kompetitif, dan dapat bekerja secara sinergis dengan bakteri bintil akar (rhizobia).
Tujuan Penelitian
Penelitian ini bertujuan mendapatkan isolat-isolat Pseudomonas penghasil
enzim 1-aminocyclopropane-1-carboxylate (ACC) deaminase yang mampu
meningkatkan pertumbuhan dan ketahanan tanaman kedelai terhadap penyakit
melalui serangkaian penelitian di laboratorium, ruang penumbuh (growth
chamber), dan rumah kaca. Secara rinci, tujuan penelitian ini dicapai melalui 3
tahapan utama, sebagai berikut:
1. Penapisan (screening) isolat-isolat Pseudomonas pemacu pertumbuhan
kedelai secara in planta di ruang penumbuh (growth chamber) dan
pengukuran aktivitas ACC deaminase secara in vitro di laboratorium.
2. Seleksi isolat-isolat Pseudomonas penghasil ACC deaminase yang unggul dan
tidak antagonis terhadap bakteri bintil akar melalui uji kompatibilitas.
3. Pengujian kemampuan isolat-isolat Pseudomonas penghasil ACC deaminase
dalam meningkatkan pertumbuhan dan ketahanan tanaman kedelai terhadap
penyakit yang disebabkan oleh cendawan patogen Fusarium oxysporum,
Sclerotium rolfsii, dan Rhizoctonia solani melalui percobaan di rumah kaca
pada media tanah steril dan non-steril.
Hipotesis
Diperoleh bakteri Pseudomonas penghasil ACC deaminase yang unggul,
mempunyai karakter tidak antagonis terhadap bakteri bintil akar (rhizobia), dan
mampu meningkatkan pertumbuhan dan daya tahan tanaman kedelai terhadap
serangan penyakit.
4
Manfaat Penelitian
Pemanfaatan Pseudomonas penghasil ACC deaminase sebagai agen hayati
dalam sistem budidaya tanaman kedelai di Indonesia akan mendukung upaya
peningkatan produksi yang selama ini lebih banyak bertumpu pada penggunaan
bahan kimia sintetik (pupuk dan fungisida). Pemanfaatan bakteri ini secara tepat
akan mengurangi penggunaan pupuk dan fungisida kimia sintetik yang harganya
terus semakin mahal dan pemakaiannya yang berlebihan berpotensi mencemari
lingkungan. Sifat bakteri ini yang tidak antagonis terhadap rhizobia dapat bekerja
secara sinergis dengan bakteri bintil akar penambat N yang alami (native) maupun
yang diaplikasikan secara bersamaan. Fungsi ganda karakter ACC deaminase
yang dimiliki bakteri ini selain mampu melindungi tanaman dari berbagai
cekaman biotik (serangan penyakit) juga diharapkan dapat melindungi tanaman
dari berbagai cekaman abiotik (lingkungan ekstrim). Sebagai agen hayati,
Pseudomonas penghasil ACC deaminase dapat diperbanyak dan diperbaharui,
sehingga dapat digunakan secara berkelanjutan.
Temuan Baru (Novelty)
Studi bakteri penghasil enzim ACC deaminase dan pemanfaatannya bagi
sistem budidaya tanaman kedelai di Indonesia belum pernah dilaporkan.
Ditemukannya isolat lokal (indigenous) Pseudomonas penghasil ACC deaminase
dari rizosfer tanaman kedelai yang mampu meningkatkan pertumbuhan dan daya
tahan tanaman kedelai terhadap serangan cendawan patogen akan memotivasi
kegiatan eksplorasi, isolasi, dan seleksi berbagai jenis bakteri dengan karakter dan
fungsi yang sama untuk dikembangkan sebagai pupuk dan fungisida hayati.
TINJAUAN PUSTAKA
Rizobakteri Pemacu Pertumbuhan Tanaman (PGPR)
Rizobakteri pemacu tumbuh tanaman yang populer disebut plant growth
promoting rhizobacteria (PGPR) diperkenalkan pertama kali oleh Kloepper dan
Schroth (1978). Rizobakteri merupakan kelompok bakteri rhizosfer yang memiliki
kemampuan mengkolonisasi rizosfer secara agresif dan memberi keuntungan bagi
tanaman (Kloepper & Schroth 1978; Schroth & Hancock 1982). Berbagai jenis
bakteri telah diidentifikasi sebagai PGPR. Sebagian besar berasal dari kelompok
Gram negatif dengan jumlah galur paling banyak dari genus Pseudomonas dan
Serratia (Kloepper 1993).
Aktivitas rizobakteri di lingkungan perakaran memberi keuntungan bagi
pertumbuhan tanaman dengan kemampuannya menyediakan atau memfasilitasi
penyerapan berbagai unsur hara dalam tanah serta mensintesis dan mengubah
konsentrasi berbagai zat pengatur tumbuh (fitohormon). Selain itu, bakteri ini juga
memiliki kemampuan menekan aktivitas patogen dengan cara menghasilkan
berbagai senyawa atau metabolit seperti siderophore, -1,3-glukanase, kitinase,
antibiotik, dan sianida (Kloepper 1993; Cattelan et al. 1999; Tenuta 2006) dan
enzim aminocyclopropane carboxylate (ACC) deaminase (Glick 1995).
Enzim ACC Deaminase dan Etilen
Enzim 1-aminocyclopropane-1-carboxylate deaminase (E.C.4.1.99.4),
disingkat ACC deaminase, merupakan enzim sitoplasma yang diproduksi oleh
beberapa mikroba. Honma dan Shimomura (1978) menemukan enzim ini pertama
kali pada bakteri Pseudomonas sp galur ACP. Enzim ACC deaminase berperan
mendegradasi asam amino siklopropanoid 1-aminocyclopropane-1-carboxylic
acid atau ACC menjadi α-ketobutirat dan amonia. Asam amino ACC merupakan
prekursor hormon etilen pada tanaman, sehingga ketersediaanya menjadi faktor
utama dalam biosintesis hormon etilen.
Biosistesis etilen pada tanaman dimulai dari proses S-adenosilasi metionin
menjadi S-adenosylmethionine yang selanjutnya diubah menjadi ACC (Ose et al.
2003). ACC yang terbentuk dioksidasi menjadi hormon etilen (Gambar 1).
6
Gambar 1. Biosintesis etilen pada tanaman (Diringkas dan digambar ulang dari
Ose et al. 2003)
Etilen tergolong hormon senesen yang berperan dalam pematangan buah
dan penuaan (Abeles et al. 1992; Mathews & Van Holde 1996). Etilen dalam
konsentrasi yang rendah pada masa perkecambahan mempercepat proses
perkecambahan atau memecah masa dormansi biji. Namun apabila konsentrasi
etilen terus meningkat, perkembangan akar menjadi terhambat. Berbagai hasil
penelitian membuktikan bahwa selain berperan dalam pematangan buah, etilen
juga berfungsi sebagai antagonis atau modulator bagi berbagai fitohormon lain
untuk mencegah pertumbuhan tanaman yang berlebihan (Lieberman & Kunishi
1972; Imaseki 1986; Arshad & Frankenberger 1993). Degradasi prekursor etilen
(ACC) oleh bakteri penghasil ACC deaminase melalui interaksi hubungan
bakteri-tanaman terbukti mampu mengurangi biosintesis hormon etilen, sehingga
perkembangan akar tidak terganggu.
Bakteri Penghasil ACC Deaminase sebagai Pemacu Tumbuh Tanaman
Berbagai hasil penelitian bakteri pemacu tumbuh mengindikasikan adanya
keterkaitan antar berbagai jenis hormon dalam meningkatkan pertumbuhan
tanaman. Hormon IAA (asam indol asetat) bekerja sama dengan sitokinin.
Perbandingan (rasio) konsentrasi kedua hormon ini sangat penting dalam
meningkatkan pertumbuhan tanaman (Mathews & Van Holde 1996). Hasil
7
penelitian lain memperlihatkan keterkaitan antara produksi hormon IAA dengan
hormon etilen. Okon dan Kapulnik (1986) dan Abbas dan Okon (1993)
melaporkan bahwa IAA yang dihasilkan oleh beberapa bakteri Azospirillum
brasilense dan Azotobacter paspali mampu meningkatkan jumlah bulu akar dan
akar lateral tanaman, sehingga meningkatkan penyerapan air dan unsur hara dari
tanah. Namun peningkatan pertumbuhan ini terjadi pada tanaman yang diberi IAA
dalam konsentrasi rendah (0,005 µg ml-1) dan tanaman yang diinokulasi dengan
bakteri yang kemampuan memproduksi IAA-nya rendah. Sintesis IAA yang
berlebihan justru menghambat pertumbuhan tanaman (Beyeler et al. 1997).
Konsentrasi IAA yang tinggi di lingkungan akar dapat memicu pembentukan
ACC, dan ACC yang terbentuk akan dioksidasi menjadi etilen yang dalam
konsentrasi tinggi dapat menghambat perkembangan akar (Glick et al. 1998;
Mayak et al. 1997; Shah et al. 1997).
Hasil penelitian Glick et al. (1998) membuktikan bahwa Pseudomonas
penghasil enzim ACC deaminase mampu mengurangi pengaruh penghambatan
pertumbuhan tanaman karena meningkatnya hormon etilen dengan cara
menghidrolisis ACC yang terbentuk dalam jaringan akar. Mekanisme proses
penurunan konsentrasi etilen di dalam lingkungan akar disajikan pada Gambar 2.
Pada Gambar 2 terlihat bahwa hormon IAA yang diproduksi oleh mikroba di
lingkungan rizosfer (eksogenus) sebagian masuk ke jaringan akar melalui proses
kesetimbangan. Hormon IAA ini selain memacu perkembangan sel dan
pembentukan akar muda, juga merangsang pembentukan enzim ACC sintase
untuk pembentukan ACC. Dalam proses kesetimbangan, sebagian ACC
dikeluarkan akar yang selanjutnya didegradasi oleh bakteri penghasil enzim ACC
deaminase menjadi amonia dan α-ketobutirat. Hidrolisis ACC secara terus
menerus akan mengurangi jumlah ACC dan pembentukan hormon etilen di dalam
akar, sehingga mengurangi pengaruh penghambatan etilen bagi perkembangan
akar. Hasil penelitian Wang et al. (2000) membuktikan adanya kemampuan
bakteri penghasil ACC deaminase dalam meningkatkan panjang akar pada
tanaman kanola dan memperkuat daya tahan tanaman terhadap serangan penyakit.
8
Gambar 2. Skema mekanisme penurunan konsentrasi hormon etilen dalam
jaringan tanaman oleh bakteri penghasil enzim ACC deaminase untuk
mencegah terbentuknya etilen berlebihan yang dapat menghambat
perkembangan akar (Sumber: diadaptasi dari Glick et al. 1998; 2007).
9
Bakteri Penghasil ACC Deaminase sebagai Agen Hayati Pengendali Patogen
Selain memacu pertumbuhan tanaman, bakteri penghasil ACC deaminase
juga berperan dalam meningkatkan daya tahan tanaman terhadap cekaman (stress)
yang ditimbulkan oleh berbagai faktor biotik (serangan patogen) maupun abiotik
(lingkungan). Bakteri ini mampu mengurangi tingkat cekaman tanaman dengan
mengendalikan pembentukan hormon etilen yang dipicu oleh berbagai faktor
biotik dan abiotik ekstrim. Berbagai hasil penelitian menunjukkan bahwa
peningkatan konsentrasi etilen pada tanaman, khususnya pada awal masa
pertumbuhan vegetatif, menghambat perkembangan akar dan melemahkan
ketahanan tanaman terhadap serangan penyakit (Wang et al. 2000; Glick et al.
2007).
Studi yang dilakukan Wang et al. (2000; 2006) membuktikan kemampuan
beberapa bakteri penghasil ACC deaminase dalam mengendalikan berbagai
penyakit akar tanaman yang disebabkan oleh cendawan patogen, seperti penyakit
layu rebah (damping off) pada mentimun dan busuk akar pada tomat dan kentang.
Hasil penelitiannya membuktikan kemampuan bakteri penghasil ACC deaminase
dalam menekan serangan cendawan patogen Pythium ultimum penyebab layu
rebah. Tanaman yang terinfeksi patogen sering mengalami cekaman etilen (etilen
diproduksi dalam jumlah banyak), sehingga akan memperparah serangan penyakit
(Van Loon et al. 2006). Inokulasi bakteri penghasil ACC deaminase terbukti
mampu menekan pembetukan hormon etilen dan memperkuat daya tahan tanaman
terhadap serangan patogen.
Cendawan Patogen Tular Tanah pada Kedelai
Berbagai penyakit tanaman kedelai yang disebabkan oleh cendawan di
dalam tanah yang populer dikenal sebagai patogen tular tanah (soilborne disease)
sudah banyak diidentifikasi. Beberapa diantaranya adalah cendawan patogen
Fusarium oxysporum penyebab busuk akar (root rot) dan tanaman mati mendadak
(sudden death syndrome), Sclerotium rolfsii penyebab layu (damping-off) dan
hawar batang atau busuk pangkal batang (stem rot), dan Rhizoctonia solani
penyebab busuk akar dan busuk kecambah (Colyer 1989; Hartman et al. 1999).
Ketiga jenis cendawan patogen ini masih tergolong sebagai penyakit utama
tanaman kedelai di Indonesia. Total kehilangan hasil panen kedelai yang
10
diakibatkan oleh cendawan ini di Indonesia cukup besar yaitu sekitar 12,5 ribu ton
dari total 147,5 ribu ton kehilangan panen kedelai pada tahun 1998 (Wrather et al.
2001). Hasil penelitian Balai Penelitian Tanaman Kacang-kacangan dan Umbiumbian (2005) memperlihatkan bahwa intensitas serangan cendawan patogen
tular tanah R. solani mencapai 15,5% dari total serangan penyakit.
Gejala penyakit yang ditimbulkan oleh Fusarium menurut Roy et al.
(1997) adalah daun menguning (yellowing), khlorosis dan nekrosis pada daun
muda, diskolorasi pada batang, dan busuk akar. Hasil penelitian Mueller et al.
(2003) mengindikasikan bahwa sangat sedikit galur kedelai yang tahan terhadap
serangan patogen ini. Sedangkan kerugian yang ditimbulkan oleh serangan S.
rolfsii sangat bervariasi dan biasanya terjadi pada areal yang terpencar-pencar di
sekitar tanaman yang mati (Colyer 1989).
BAHAN DAN METODE
Tempat Penelitian
Penelitian ini dilakukan di laboratorium, ruang penumbuh (growth
chamber), dan rumah kaca. Penelitian di laboratorium dan ruang penumbuh
dilaksanakan di Laboratorium Biologi dan Kesehatan Tanah, Balai Penelitian
Tanah, Bogor. Sedangkan percobaan di rumah kaca dilakukan di Instalasi Rumah
Kaca, Balai Besar Penelitian dan Pengembangan Bioteknologi dan Sumberdaya
Genetik Pertanian, Cimanggu, Bogor.
Bahan Penelitian
Penelitian ini menggunakan isolat bakteri Pseudomonas; cendawan
patogen Fusarium oxysporum, Sclerotium rolfsii, dan Rhizoctonia solani; bakteri
bintil akar Bradyrhizobium japonicum Bj11 dan Sinorhizobium fredii Rif5; benih
kedelai varietas Wilis; plastik kantong tumbuh (growth pouches); dan tanah untuk
pengujian tanaman di rumah kaca.
Bakteri Pseudomonas yang diuji adalah sebanyak 82 isolat Pseudomonas
non-patogen yang diisolasi dari rizosfer tanaman kedelai di daerah Plumbon,
Cirebon, Jawa Barat. Sebanyak 81 isolat merupakan isolat penghasil hormon asam
indol asetat (IAA) dengan kemampuan sintesis secara in vitro berkisar dari 1,13 –
20,49 µg ml-1 (Wahyudi et al. 2007). Isolat Pseudomonas tersebut adalah isolat
dengan kode Crb1 sampai Crb6, Crb8 sampai Crb37, Crb39 sampai Crb56, Crb60,
Crb74, Crb75, Crb78 sampai Crb87, Crb89, Crb92 sampai Crb95, Crb102,
Crb104, dan Crb109 sampai Crb115. Satu isolat yang bukan penghasil IAA, yaitu
Pseudomonas Crb38 yang disertakan dalam penelitian ini, digunakan sebagai
kontrol negatif. Daftar isolat dan kemampuannya menghasilkan IAA dalam media
cair yang diperkaya dengan triptofan (prekursor IAA) disajikan pada Tabel 1.
12
Tabel 1. Isolat-isolat Pseudomonas dan kemampuannya menghasilkan IAA yang
digunakan dalam penelitian ini.
No
Kode Isolat
IAA (ppm)
No
Kode Isolat
IAA (ppm)
1
Crb1
10,21
42
Crb43
5,08
2
Crb2
9,58
43
Crb44
3,73
3
Crb3
2,32
44
Crb45
9,65
4
Crb4
9,46
45
Crb46
15,80
5
Crb5
12,75
46
Crb47
10,36
6
Crb6
8,35
47
Crb48
8,98
7
Crb8
7,40
48
Crb49
16,19
8
Crb9
8,98
49
Crb50
10,01
9
Crb10
7,64
50
Crb51
10,17
10
Crb11
8,35
51
Crb52
17,53
11
Crb12
6,68
52
Crb53
16,86
12
Crb13
7,40
53
Crb54
16,90
13
Crb14
3,45
54
Crb55
8,79
14
Crb15
13,99
55
Crb56
18,47
15
Crb16
4,89
56
Crb60
8,04
16
Crb17
16,02
57
Crb74
7,72
17
Crb18
7,82
58
Crb75
7,13
18
Crb19
3,37
59
Crb78
6,40
19
Crb20
5,16
60
Crb79
19,67
20
Crb21
14,15
61
Crb80
4,45
21
Crb22
3,45
62
Crb81
18,67
22
Crb23
13,17
63
Crb82
6,63
23
Crb24
15,16
64
Crb83
5,04
24
Crb25
2,20
65
Crb84
14,63
25
Crb26
12,53
66
Crb85
19,72
26
Crb27
1,98
67
Crb86
6,31
27
Crb28
12,16
68
Crb87
6,26
28
Crb29
2,64
69
Crb89
5,45
29
Crb30
4,31
70
Crb92
1,44
30
Crb31
5,45
71
Crb93
7,60
31
Crb32
2,60
72
Crb94
1,13
32
Crb33
3,26
73
Crb95
7,24
33
Crb34
2,82
74
Crb102
6,48
34
Crb35
12,53
75
Crb104
20,49
35
Crb36
4,39
76
Crb109
9,18
36
Crb37
2,34
77
Crb110
5,85
37
Crb38
0
78
Crb111
10,93
38
Crb39
3,91
79
Crb112
6,88
39
Crb40
8,66
80
Crb113
9,30
40
Crb41
3,73
81
Crb114
9,62
41
Crb42
4,61
82
Crb115
7,75
Sumber: Data hasil penelitian Wahyudi et al. (2007)
13
Biakan murni cendawan patogen akar kedelai R. solani diperoleh dari
Laboratorium Biologi dan Kesehatan Tanah, Balai Penelitian Tanah, Bogor,
sedangkan F. oxysporum dan S. rolfsii diperoleh dari Dr. Abjad Asih Nawangsih,
Departemen Proteksi Tanaman, Fakultas Pertanian, Institut Pertanian Bogor (IPB),
Bogor. Bakteri bintil akar B. japonicum Bj11 diperoleh dari Dr. Aris Tri Wahyudi,
Laboratorium Mikrobiologi, Departemen Biologi, FMIPA, IPB Bogor; sedangkan
S. fredii Rif5 diperoleh dari Laboratorium Biologi dan Kesehatan Tanah, Balai
Penelitian Tanah, Bogor.
Benih kedelai varietas Wilis diperoleh dari Balai Besar Penelitian dan
Pengembangan Bioteknologi dan Sumberdaya Genetik Pertanian, Bogor. Tanah
untuk penelitian di rumah kaca adalah tanah Ultisol lapisan atas (0-20 cm) yang
berasal dari tanah pertanian di daerah Leuwiliang-Jasingga, Bogor.
Tahapan Penelitian
Penelitian dimulai dengan kegiatan penapisan (screening) isolat-isolat
Pseudomonas yang mampu memacu pertumbuhan tanaman kedelai pada media
steril kantong tumbuh (growth pouch) yang dilaksanakan di ruang penumbuh
(growth chamber). Isolat-isolat yang mampu meningkatkan pertumbuhan tanaman
kedelai, selanjutnya diuji aktivitas ACC deaminase dan kompatibilitasnya dengan
bakteri bintil akar B. japonicum Bj11 dan S. fredii Rif5 secara in vitro.
Isolat-isolat Pseudomonas terbaik yang diperoleh, yaitu isolat yang
mampu memacu pertumbuhan tanaman, memiliki aktivitas ACC deaminase, dan
tidak antagonis terhadap bakteri bintil akar, selanjutnya diuji pada tanaman
kedelai pada tanah pada pot di rumah kaca. Pengujian ini mencakup kemampuan
isolat Pseudomonas yang terpilih dalam meningkatkan pertumbuhan dan
ketahanan tanaman kedelai terhadap penyakit pada tanah steril dan non-steril di
rumah kaca. Secara skematis alur tahapan penelitian disajikan pada Gambar 3.
14
Gambar 3. Diagram alir tahapan penelitian
15
Penapisan in planta Pseudomonas Pemacu Tumbuh
Penapisan kemampuan isolat-isolat Pseudomonas memacu pertumbuhan
tanaman kedelai dilakukan pada media steril kantong tumbuh yang ditempatkan
pada rak-rak di ruang penumbuh (Gambar 4).
Gambar 4. Penapisan Pseudomonas pemacu tumbuh pada media steril kantong
tumbuh. Rak kantong tumbuh (A), penempatan kantong tumbuh pada
rak (B), dan penempatan kedelai pada tiap kantong tumbuh (C).
Prosedur penapisan dengan kantong tumbuh mengikuti protokol pengujian
Liftshitz et al. (1987). Kantong tumbuh terbuat dari plastik tebal tahan panas
berukuran 18 cm (lebar) x 19 cm (panjang). Di dalam tiap kantong diberi 3
potongan kertas saring, masing-masing selebar 5 cm dengan panjang seukuran
bagian dalam kantong tumbuh. Bagian atas kertas saring diberi lipatan untuk
dudukan biji kedelai yang ditumbuhkan. Kantong tumbuh sebelum digunakan
disterilisasi dengan autoklaf selama 3 hari berturut-turut (1 jam per hari).
Penapisan isolat dilakukan dalam 6 set percobaan (A sampai dengan F),
masing-masing set terdiri atas 14 sampai dengan 17 perlakuan (termasuk
perlakuan kontrol tanpa inokulasi isolat dan kontrol inokulasi dengan isolat
bukan-penghasil IAA Crb38). Isolat Pseudomonas yang digunakan pada masingmasing set percobaan disajikan pada Tabel 2.
Percobaa