Autentikasi Kencur Menggunakan Kombinasi Sidik Jari Kckt Dan Kemometrika
AUTENTIKASI KENCUR MENGGUNAKAN KOMBINASI
SIDIK JARI KCKT DAN KEMOMETRIKA
CAHYA SEPTYANTI
SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2015
PERNYATAAN MENGENAI TESIS DAN
SUMBER INFORMASI SERTA PELIMPAHAN HAK CIPTA*
Dengan ini saya menyatakan bahwa tesis berjudul Autentikasi Kencur
Menggunakan Kombinasi Sidik Jari KCKT dan Kemometrika adalah benar karya
saya dengan arahan dari komisi pembimbing dan belum diajukan dalam bentuk
apa pun kepada perguruan tinggi mana pun. Sumber informasi yang berasal atau
dikutip dari karya yang diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari penulis lain telah
disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam Daftar Pustaka di bagian akhir
tesis ini.
Dengan ini saya melimpahkan hak cipta dari karya tulis saya kepada Institut
Pertanian Bogor.
Bogor, November 2015
Cahya Septyanti
NIM G451124031
RINGKASAN
CAHYA SEPTYANTI. Autentikasi Kencur Menggunakan Kombinasi Sidik Jari
KCKT dan Kemometrika. Dibimbing oleh IRMANIDA BATUBARA dan
MOHAMAD RAFI.
Kaempferia galanga yang di Indonesia dikenal sebagai kencur umumnya
digunakan dalam obat tradisional untuk mengobati berbagai penyakit. Produk
kencur telah dijual komersial sebagai herbal kombinasi (jamu). Selain itu, kencur
juga digunakan sebagai herbal tunggal (serbuk kencur) yang dikemas dalam
bentuk kapsul atau sachet.
K. rotunda (kunci pepet) dan K. pandurata (temu kunci) merupakan spesies
yang berkerabat dekat dengan kencur yang tersedia di pasar tradisional Indonesia.
Keduanya dimungkinkan sebagai bahan pemalsu bagi kencur. Harga kencur
kering di pasar umumnya lebih tinggi dari kunci pepet kering dan temu kunci
kering. Ketiganya memiliki warna rimpang yang sama namun berbeda ukuran dan
bau. Identifikasi dan autentikasi kencur menjadi sangat sulit jika sudah dalam
bentuk serbuk. Jika bahan baku kencur telah terpalsukan maka kualitas, efikasi,
dan keamanan produk akhir kencur akan berubah. Oleh karena itu, diperlukan
suatu langkah untuk menentukan atau mengonfirmasi identitas dan keaslian
kencur yang dikenal dengan istilah autentikasi. Autentikasi dilakukan dengan
adanya suatu metode analitik yang tepat untuk menguji kualitas bahan baku
kencur untuk mencegah adanya pemalsuan dari spesies yang berkerabat dekat
dengannya seperti kunci pepet dan temu kunci.
Pemalsuan kencur dilakukan dengan mencampurkan serbuk kencur dengan
kunci pepet atau temu kunci. Sistem KCKT terdiri dari kolom C18, program elusi
gradien 20-80% metanol dan asam asetat 1% selama 0-60 menit dengan laju alir 1
mL/menit, dan diamati pada 254 nm. Analisis komponen utama (AKU) dan
analisis diskriminan (AD) digunakan untuk membangun model identifikasi dan
autentikasi sampel.
Identifikasi dan autentikasi kencur dari kunci pepet dan temu kunci telah
diperoleh dengan analisis sidik jari KCKT. Pada plot AKU, ketiganya dapat
terklasifikasi dengan baik namun jika kencur dicampur dengan kunci pepet atau
temu kunci tidak terklasifikasi dengan baik. AD dapat membedakan ketiga spesies
dengan baik juga ketika dicampur sebagai kencur-kunci pepet dan kencur-temu
kunci pada seluruh konsentrasi yang digunakan. Kencur-kunci pepet 5% memiliki
sedikit perbedaan dengan 100% kencur. Validasi model AD menggunakan teknik
validasi silang leave-one-out (LOOCV). Model memberikan hasil prediksi
klasifikasi yang sangat memuaskan (100% terklasifikasi).
Identifikasi dan autentikasi kencur dari kunci pepet dan temu kunci telah
berhasil dengan metode sidik jari yang dikombinasikan dengan AD. Metode yang
dikembangkan ini menghasilkan metode yang dapat dipercaya dan efisien untuk
identifikasi dan autentikasi kencur dari kunci pepet dan temu kunci.
Kata kunci: autentikasi, kemometrika, analisis sidik jari KCKT, Kaempferia
galanga
SUMMARY
CAHYA SEPTYANTI. Authentication of Kaempferia galanga Using HPLC
Fingerprint Combined with Chemometrics. Supervised by IRMANIDA
BATUBARA and MOHAMAD RAFI.
Kaempferia galanga is known as kencur in Indonesia and widely used in
folk medicine to treat some diseases. In Indonesia, commercial product of kencur
was sold as jamu (Indonesia traditional medicines) along with other medicinal
plants. Besides sold as jamu, sometimes kencur also used as a single herb product
(kencur powder) which is packaged in capsule or sachet.
Some related species of kencur such as K. rotunda (kunci pepet) and K.
pandurata (temu kunci) are available in Indonesia local markets and these two
plants could be a potential counterfeit of kencur. The price of kencur dry powder
in local market generally is more expensive than kunci pepet and temu kunci.
These three medicinal plants have similar color in their rhizomes but differ in size
and odor. Identification and authentication of kencur will be very difficult if
present in powdered form. Adulteration of kencur with some related plants will
change the quality, efficacy, and safety of kencur finished products. To overcome
this problem, the confirmation of the identity and authenticity of kencur is needed.
This purpose will need an appropriate analytical method for evaluating quality of
kencur raw material in order to prevent an adulteration with some related plants.
Adulteration detection was carried out by mixing kencur powder with kunci
pepet or temu kunci. The HPLC system C18 column, methanol and 1% acetic acid
with gradient elution program of 20–80% in 0–60 min as mobile phase with a
flow rate of 1 mL/min and monitored at 254 nm. Principal component analysis
(PCA) and discriminant analysis (DA) were used to construct a model for
identification and authentication of the samples.
Identification, discrimination, and authentication of some closely-related
species could be carrying out by chromatographic fingerprint analysis combined
with chemometrics. Based on the result obtained, identification and authentication
of kencur from kunci pepet and temu kunci was achieved using HPLC fingerprint
analysis. From PCA plot, kencur, kunci pepet, and temu kunci could be classified
into their own groups. Unfortunately, the authentication of kencur when it mixed
with kunci pepet or temu kunci was couldn’t distinguish well by PCA. DA was
able to distinguish the three species as well as all mixed sample of kencur-kunci
pepet and kencur-temu kunci in all concentration used. However, kencur-kunci
pepet 5% has a small difference with 100% of kencur. Validation of the DA
model used a leave-one-out cross-validation technique (LOOCV). The model
gave a very satisfactory classification prediction for the test sample (100%
classified).
Identification and authentication of kencur from kunci pepet and temu kunci
was successfully achieved by our HPLC fingerprint method combined with DA.
So the developed method was proved to be an efficient and reliable method for
identification and authentication of kencur from kunci pepet and temu kunci.
Keywords: authentication, chemometrics, HPLC fingerprint analysis, Kaempferia
galanga
© Hak Cipta Milik IPB, Tahun 2015
Hak Cipta Dilindungi Undang-Undang
Dilarang mengutip sebagian atau seluruh karya tulis ini tanpa mencantumkan
atau menyebutkan sumbernya. Pengutipan hanya untuk kepentingan pendidikan,
penelitian, penulisan karya ilmiah, penyusunan laporan, penulisan kritik, atau
tinjauan suatu masalah; dan pengutipan tersebut tidak merugikan kepentingan
IPB
Dilarang mengumumkan dan memperbanyak sebagian atau seluruh karya tulis ini
dalam bentuk apa pun tanpa izin IPB
AUTENTIKASI KENCUR MENGGUNAKAN KOMBINASI
SIDIK JARI KCKT DAN KEMOMETRIKA
CAHYA SEPTYANTI
Tesis
sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
Magister Sains
pada
Program Studi Kimia
SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2015
Penguji pada Ujian Tertutup: Dr. dr. Irma Herawati Suparto, MS
Judul Tesis : Autentikasi Kencur Menggunakan Kombinasi Sidik Jari KCKT dan
Kemometrika
Nama
: Cahya Septyanti
NIM
: G451124031
Disetujui oleh
Komisi Pembimbing
Dr Irmanida Batubara, MSi
Ketua
Dr Mohamad Rafi, MSi
Anggota
Diketahui oleh
Ketua Program Studi
Kimia
a.n. Dekan Sekolah Pascasarjana IPB
Sekretaris Program Magister
Prof Dr Dyah Iswantini,
MSc Agr
Prof Dr Ir Nahrowi, MSc
Tanggal Ujian:
Tanggal Lulus:
30 November 2015
PRAKATA
Puji dan syukur penulis panjatkan kepada Allah subhanahu wa ta’ala atas
segala karunia-Nya sehingga karya ilmiah ini berhasil diselesaikan. Tema yang
dipilih dalam penelitian ini ialah autentikasi, dengan judul Autentikasi Kencur
Menggunakan Kombinasi Sidik Jari KCKT dan Kemometrika. Penelitian
dilaksanakan sejak bulan April 2014 sampai Februari 2015 bertempat di
Laboratorium Pusat Studi Biofarmaka Institut Pertanian Bogor (PSB IPB).
Penulis mengucapkan terima kasih kepada Dr Irmanida Batubara, MSi
selaku ketua komisi pembimbing dan Dr Mohamad Rafi, MSi sebagai anggota
komisi pembimbing yang selalu memberikan motivasi, kritik, dan saran untuk
kelancaran penelitian dan penulisan. Terima kasih kepada Laboratorium Pusat
Studi Biofarmaka Institut Pertanian Bogor (PSB IPB) yang telah memberikan
kesempatan kepada penulis untuk melaksanakan penelitiannya. Penulis juga
mengucapkan terima kasih kepada Endi Suhendi yang telah membantu dalam
menyediakan alat dan bahan selama penelitian dan Laela Wulansari, SSi yang
telah membantu selama pengumpulan data sidik jari KCKT. Ungkapan terima
kasih juga dihaturkan untuk kedua orang tua, suami, dan adik penulis yang selalu
memberikan dukungan dan kasih sayangnya. Ucapan terima kasih kepada
Nurmaida dan Dewi Anggraini S yang senantiasa menyemangati dan berjuang
bersama dalam penelitian. Semoga tulisan ini dapat memberikan manfaat dalam
perkembangan ilmu pengetahuan.
Bogor, November 2015
Cahya Septyanti
DAFTAR ISI
DAFTAR TABEL
vi
DAFTAR GAMBAR
vi
DAFTAR LAMPIRAN
vi
1 PENDAHULUAN
1
2 METODE
Bahan
Alat
Prosedur Analisis Data
2
2
2
2
3 HASIL DAN PEMBAHASAN
Pengoptimuman Kondisi dan Validasi Metode KCKT
Analisis Sidik Jari KCKT untuk Identifikasi dan Autentikasi Kencur
Identifikasi dan Autentikasi Kencur dari Kunci Pepet dan Temu Kunci
Menggunakan Kombinasi Sidik Jari KCKT dan Kemometrika
4
4
6
8
4 SIMPULAN DAN SARAN
Simpulan
Saran
11
11
11
DAFTAR PUSTAKA
11
LAMPIRAN
13
RIWAYAT HIDUP
16
DAFTAR TABEL
1 Sumber sampel
2 Komposisi campuran yang digunakan pada percobaan
3
3
DAFTAR GAMBAR
Kromatogram KCKT kencur Wonogiri
Kromatogram kencur, temu kunci, dan kunci pepet
Kromatogram sidik jari KCKT dari kencur, temu kunci, dan kunci pepet
Kromatogram kencur 100%, kencur-temu kunci, dan kencur-kunci
pepet
5 Plot AKU dan AD kencur, temu kunci, dan kunci pepet 100% serta
campuran sampel
1
2
3
4
5
6
7
8
10
DAFTAR LAMPIRAN
1 Hasil identifikasi/determinasi tumbuhan
2 Kisaran waktu retensi relatif dan luas puncak relatif dari sampel
3 Pohon filogenik genus Kaempferia berdasarkan kloroplas sekuens DNA
13
14
15
1
1 PENDAHULUAN
Kaempferia galanga yang di Indonesia dikenal sebagai kencur umumnya
digunakan dalam obat tradisional untuk mengobati penyakit rematik, batuk,
disentri, diare, dan sakit perut. Tanaman ini yang telah dilaporkan memiliki
beberapa aktivitas biologis seperti antimikrob (Lakshmanan et al. 2011),
antioksidan (Mekseepralard et al. 2010), pengusir nyamuk dan larva (Sutthanont
et al. 2010), analgesik (Ridtitid et al. 2008), dan antialergi (Tewtrakul &
Subhadhirasakul 2007). Produk kencur telah dijual komersial sebagai herbal
kombinasi (jamu) diantaranya untuk jamu perawatan kesehatan wanita, jamu
penyegar, jamu pelancar peredaran darah, dan jamu yang berkhasiat menguatkan
tubuh (Roemantyo dan Soekarman 1996). Selain itu, kencur juga digunakan
sebagai herbal tunggal (serbuk kencur) yang dikemas dalam bentuk kapsul atau
sachet. Etil-p-metoksi sinamat dan etil sinamat dari ekstrak kencur berperan
penting dalam bioaktivitas tersebut (Umar et al. 2012).
K. rotunda (kunci pepet) dan K. pandurata (temu kunci) merupakan spesies
yang berkerabat dekat dengan kencur yang tersedia di pasar tradisional Indonesia.
Keduanya dimungkinkan sebagai bahan pemalsu (adulterant) bagi kencur karena
adanya kemiripan dalam hal warna rimpang yang putih kekuningan. Membedakan
ketiganya jika masih dalam bentuk rimpang tidaklah sulit karena ukuran dan bau
rimpang masing-masing sangat berbeda, akan tetapi akan menjadi sangat sulit jika
sudah dalam bentuk serbuk. Harga kencur kering di pasar umumnya lebih tinggi
dari kunci pepet kering, dan temu kunci kering. Hal ini berarti kunci pepet dan
temu kunci dimungkinkan untuk digunakan sebagai pemalsu untuk kencur. Jika
bahan baku kencur telah terpalsukan (teradulterasi) maka kualitas, efikasi, dan
keamanan produk akhir kencur akan berubah. Oleh karena itu, diperlukan suatu
langkah untuk menentukan atau mengonfirmasi identitas dan keaslian kencur yang
dikenal dengan istilah autentikasi. Autentikasi dilakukan dengan adanya suatu
metode analitik yang tepat untuk menguji kualitas bahan baku kencur untuk
mencegah adanya pemalsuan dari spesies yang berkerabat dekat dengannya
seperti kunci pepet dan temu kunci.
Identifikasi, autentikasi, dan diskriminasi spesies tumbuhan dalam 1 genus
yang merupakan bagian dari kontrol kualitas obat herbal dapat dilakukan dengan
metode sidik jari senyawa kimia. Beberapa teknik analisis seperti kromatografi
(KLT, KG, KCKT/UPLC) dan spektrometri (UV-tampak, inframerah, RMI, SM)
atau gabungan kromatografi-spektrometri (KG-SM dan KC-SM) dapat digunakan
untuk analisis sidik jari (Liang et al. 2004). KCKT dengan detektor diode array
(KCKT-DAD) merupakan pilihan yang lebih baik untuk pengembangan analisis
sidik jari kimia karena teknik ini memiliki efisiensi pemisahan dan sensitivitas
deteksi yang tinggi (Zou et al. 2006; Li et al. 2010).
Analisis sidik jari kimia mampu menyajikan profil karakteristik kimia
sampel dengan rinci akan tetapi akan mengandung data yang besar. Kemometrika,
dalam hal ini analisis multivariat diperlukan untuk mengolah data tersebut dengan
tujuan identifikasi, autentikasi, atau diskriminasi suatu sampel. Kombinasi sidik
jari kromatografi dan analisis multivariat telah digunakan secara luas untuk
identifikasi, autentikasi, dan diskriminasi dari berbagai tanaman obat termasuk
beberapa genus Aconitum (Zhao et al. 2009), Epimedium (Wang et al. 2012), dan
2
Panax (Yang et al. 2013), Zingiber (Rafi et al. 2013), dan Curcuma (Rafi et al.
2015). Hingga saat ini belum ditemukan adanya publikasi yang terkait dengan
penggunaan sidik jari KCKT yang dikombinasikan dengan kemometrika untuk
genus Kaempferia yang bertujuan untuk identifikasi, diskriminasi, dan autentikasi.
Oleh karena itu, penelitian ini mengembangkan metode analisis sidik jari KCKT
yang dikombinasikan dengan kemometrika untuk identifikasi, diskriminasi, dan
autentikasi kencur dari spesies yang berkerabat dekat (kunci pepet dan temu
kunci). Metode ini diharapkan dapat menjadi metode yang dapat dipercaya,
efisien, dan praktis untuk identifikasi dan autentikasi bahan baku kencur.
2 METODE
Bahan
Dua puluh satu sampel yang digunakan terdiri atas kencur dari 9 daerah,
dari 6 daerah, kunci pepet dan temu kunci dari 6 daerah di pulau Jawa, Indonesia
(Tabel 1). Semua sampel telah diidentifikasi di Herbarium Bogoriense, Pusat
Penelitian Biologi, Lembaga Ilmu Pengetahuan Indonesia, Indonesia (Lampiran 1)
dan voucher spesimen disimpan di Pusat Studi Biofarmaka, Institut Pertanian
Bogor, Indonesia. Bahan kimia yang digunakan ialah metanol, asetonitril, dan
asam asetat dengan HPLC grade (Merck, Darmstadt, Jerman) serta air
(Ikapharmindo Putramas, Jakarta, Indonesia). Filter membran Ekicrodisc 25 R
(ukuran pori 0.45μm) diperoleh dari Gelman Science Japan Co. (Tokyo, Jepang).
Alat
Alat-alat yang digunakan antara lain neraca analitik, dan sistem KCKT LC20A (Shimadzu, Tokyo, Jepang) dengan detector UV diode array dan kolom
Shim-pack VP-ODS C18 (150 nm × 4.6 mm i.d) (Shimadzu, Tokyo, Jepang) serta
peranti lunak statistika XLSTAT 2012.2.02 (Addinsoft, New York, USA).
Prosedur Analisis Data
Preparasi Sampel
Rimpang segar dicuci dengan air bersih, ditiriskan, dipotong kecil-kecil, dan
dikeringkan dalam oven 50oC. Setelah itu, rimpang kering digiling dan diayak
menggunakan pengayak 40 mesh agar diperoleh bentuk serbuk.
Preparasi Sampel untuk Pembuatan Sidik Jari KCKT
Ditimbang sebanyak 250 mg sampel serbuk (kencur, kunci pepet, dan temu
kunci) kemudian diekstraksi menggunakan ultrasonikasi dengan 5 mL metanol
selama 30 menit. Ekstrak sampel disaring dengan filter membran 0.45 μm
sebelum diinjeksikan dalam sistem KCKT.
Deteksi adulterasi dilakukan dengan mencampurkan serbuk kencur dengan
kunci pepet atau temu kunci. Sumber sampel kencur dikelompokkan dalam 3
3
kategori yaitu konsentrasi komponen mayor tinggi (T), komponen mayor sedang
(S), dan komponen mayor rendah (R). Kombinasi sampel kencur dengan kunci
pepet atau temu kunci dilakukan sesuai komposisi pada Tabel 2.
Tabel 1 Sumber sampel
Spesies
Kaempferia galanga
Kaempferia pandurata
Kaempferia rotunda
Kode sampel
Sumber (Daerah)
KG-1
KG-2
KG-3
KG-4
KG-5
KG-6
KG-7
KG-8
KG-9
KP-1
KP-2
KP-3
KP-4
KP-5
KP-6
KR-1
KR-2
Bogor, Jawa Barat
Sumedang, Jawa Barat
Karang anyar, Jawa Tengah
Solo, Jawa Tengah
Purworejo, Jawa Tengah
KR-3
KR-4
KR-5
KR-6
Bekasi, Jawa Barat
Solo, Jawa Tengah
Solo, Jawa Tengah
Karang anyar, Jawa Tengah
Wonogiri, Jawa Tengah
Wonogiri, Jawa Tengah
Pacitan, Jawa Timur
Pacitan, Jawa Timur
Bogor, Jawa Barat
Bekasi, Jawa Barat
Sumedang, Jawa Barat
Wonogiri, Jawa Tengah
Pacitan, Jawa Timur
Ponorogo, Jawa Timur
Bogor, Jawa Barat
Bekasi, Jawa Barat
Tabel 2 Komposisi campuran yang digunakan pada percobaan
Kencur
S-95
S-75
S-50
R-95
R-75
R-50
Komposisi (%)
Kunci pepet
Kencur
5
T-95
25
T-75
50
T-50
5
S-95
25
S-75
50
S-50
Temu kunci
5
25
50
5
25
50
Keterangan: T = konsentrasi komponen mayor tinggi, S = sedang, R = rendah
Peralatan dan Kondisi Kromatografi
Sistem KCKT terdiri dari pengumpan mikro dengan syringe gas tight, klep
mikroinjeksi sebagai injektor, kolom C18, dan detektor DAD. Suhu kolom sesuai
suhu kamar dan laju alir fase gerak 1.0 ml/menit. Pengoptimuman sidik jari
4
KCKT diperoleh dengan mengombinasikan eluen asam asetat (CH3COOH) 1%
dimodifikasi dengan pelarut organik yaitu asetonitril (ACN) atau metanol
(MeOH) dengan sistem elusi gradien dan deteksi pada panjang gelombang
200−400 nm.
Sebanyak 20 μL ekstrak kencur yang telah dipreparasi diinjeksikan ke
dalam setiap kondisi yang telah disebutkan. Waktu analisis total, jumlah puncak,
dan resolusi masing-masing puncak digunakan sebagai variabel untuk
menentukan kondisi optimum analisis. Selanjutnya, sampel kunci pepet dan temu
kunci (Tabel 1) dan campuran sampel dengan komposisi lainnya (Tabel 2)
diinjeksikan dengan sistem KCKT pada kondisi optimum analisis. Validasi
metode analitik dilakukan dengan parameter kedapatulangan dan stabilitas
terhadap waktu retensi relatif dan luas puncak relatif.
Kedapatulangan metode ditentukan dengan injeksi 5 larutan sampel yang
disiapkan. Stabilitas metode diuji berdasarkan analisis larutan sampel pada 0, 4, 8,
dan 12 jam. Simpangan baku relatif dari waktu retensi relatif dan luas puncak
relatif puncak mayor ditentukan untuk kedua parameter tersebut.
Autentikasi Kencur
Data yang diperoleh dari profil kromatografi sampel kencur, kunci pepet,
temu kunci, serta campuran sampel dievaluasi menggunakan analisis kemometrika
multivariat. Waktu retensi relatif kencur setiap puncak khas dihitung dengan
membandingan waktu retensi setiap puncak terhadap waktu retensi puncak
tertinggi. Dihitung juga luas puncak relatif setiap puncak khas terhadap luas
puncak tertinggi. Autentikasi dilakukan dengan mengelompokkan luas puncak
relatif puncak mayor kromatogram. Model divalidasi dengan LOOCV (leave-oneout cross-validation) dengan piranti lunak XLSTAT 2012.2.02 (Addinsoft, New
York, USA).
3 HASIL DAN PEMBAHASAN
Pengoptimuman Kondisi dan Validasi Metode KCKT
Kondisi optimum pembuatan sidik jari KCKT kencur diawali dengan
preparasi sampelnya. Kencur yang digunakan ialah kencur yang berasal dari
daerah Wonogiri, Jawa Tengah. Daerah ini dipilih karena memberikan intensitas
sinyal setiap puncak mayor yang tertinggi dari daerah lainnya. Kencur diekstraksi
dengan ultrasonikasi supaya seluruh komponen kimia (senyawa mayor dan minor)
akan terdeteksi pada sidik jari kromatografi dengan waktu ekstraksi yang tidak
terlalu lama. Pemilihan nisbah serbuk:pelarut 250 mg dalam 5 mL metanol dan
waktu ekstraksi selama 30 menit berdasarkan percobaan jumlah serbuk dan waktu
ekstraksi yang memberikan intensitas puncak mayor yang optimum terbaca pada
kromatogram.
Pengoptimuman kondisi KCKT sangat penting dilakukan dalam analisis
sidik jari kromatografi. Hal ini bertujuan agar diperoleh pemisahan analat dengan
resolusi dan baseline yang baik. Menurut Dejaegher et al. (2010), pemisahan
yang baik untuk analisis kualitatif ialah yang memberikan jumlah puncak (n)
5
maksimum dan pemisahan antar puncak yang jelas (resolusi > 1.5). Pada
penelitian ini, pemisahan analat optimum diperoleh dengan elusi gradien 20-80%
metanol dan asam asetat 1% dalam air. Kondisi tersebut memberikan nilai resolusi
7 puncak mayor lebih besar dari 1.5 dan waktu analisis selama 1 jam (Gambar 1).
Pemilihan sistem elusi gradien karena ekstrak sampel mengandung komponen
kimia yang kompleks. Sistem elusi isokratik umumnya tidak dapat memberikan
pemisahan yang baik dan jumlah puncak mayor lebih sedikit sehingga tidak
memberikan informasi yang cukup dalam analisis sidik jari kromatografi. Panjang
gelombang yang dipilih ialah 254 nm karena pada panjang gelombang ini seluruh
puncak mayor dapat terbedakan dengan baik dan memberikan baseline yang lurus
sehingga sensitivitasnya lebih tinggi dari panjang gelombang lain.
Gambar 1 Kromatogram KCKT kencur wonogiri. Kolom yang digunakan: Shimpack VP-ODS C18 (150 nm × 4.6 mm i.d) (Shimadzu, Tokyo, Jepang).
Fase gerak terdiri dari methanol dan asam asetat 1% dalam air
menggunakan program elusi gradien 20−80% (A) selama 0-60 menit
dengan laju alir 1 mL/menit dan panjang gelombang deteksi 254 nm
Sistem kromatografi optimum yang telah diperoleh kemudian divalidasi
terlebih dahulu sebelum digunakan untuk identifikasi dan autentikasi kencur dari
kunci pepet dan temu kunci. Parameter kedapatulangan dan stabilitas cukup
mewakili validasi metode untuk analisis kualitatif. Kedapatulangan dilakukan
untuk melihat kedapatulangan metode uji. Pada penelitian ini diperoleh
simpangan baku relatif dari waktu retensi relatif untuk semua puncak mayor dari
uji kedapatulangan dengan kisaran 0–0.18% sedangkan untuk luas puncak relatif
sebesar 0–5.95%. Uji stabilitas dilakukan untuk melihat stabilitas dari sampel uji.
Simpangan baku relatif dari waktu retensi relatif dan luas puncak relatif dari uji
stabilitas yang diperoleh kurang dari 1.33% dan 1.94%. Perbedaan waktu retensi
menunjukkan ketidakpastian dalam perhitungan waktu retensi di antara
kromatogram. Suatu metode analitik dikatakan valid jika nilai simpangan baku
relatif kurang dari 5% (Taverniers et al. 2004). Meskipun ada satu puncak mayor
yang memberikan simpangan baku relatif dari luas puncak relatif lebih besar dari
6
5%, puncak mayor lain sesuai dengan standar validasi metode yang berlaku. Oleh
karena itu, hasil uji kinerja analitik menunjukkan bahwa pengembangan metode
sidik jari KCKT secara kualitatif ini dapat dipercaya dan valid.
Analisis Sidik Jari KCKT untuk Identifikasi dan Autentikasi Kencur
Metode sidik jari KCKT yang telah dikembangkan kemudian diaplikasikan
pada 21 sampel tunggal yang terdiri dari 9 sampel kencur, 6 sampel kunci pepet,
dan 6 sampel temu kunci. Kromatogram sampel kencur, kunci pepet, dan temu
kunci tunggal ditunjukkan pada Gambar 2.
Gambar 2 Kromatogram kencur (a), temu kunci (b), dan kunci pepet (c). Lokasi:
kencur Bogor (a1), Sumedang (a2), Karang anyar (a3), Solo (a4),
Purworejo (a5), Wonogiri 1 (a6), Wonogiri 2 (a7), Pacitan 1 (a8),
Pacitan 2 (a9); temu kunci Bogor (b1), Bekasi (b2), Sumedang (b3),
Wonogiri (b4), Pacitan (b5), Ponorogo (b6); kunci pepet Bogor (c1),
Bekasi 1 (c2), Bekasi 2 (c3), Solo 1 (c4), Solo 2 (c5), Karang anyar
(c6)
Puncak yang ada dalam semua sampel dan memberikan sinyal cukup besar dalam
setiap kromatogram sampel digunakan sebagai puncak mayor. Pendekatan sidik
jari yang khas digunakan dengan normalisasi waktu retensi dan luas puncak untuk
7
menghitung waktu retensi relatif dan luas puncak relatif setiap puncak mayor
terhadap puncak pembanding. Puncak pembanding yang dipilih adalah puncak 4
(Gambar 3) karena memberikan luas puncak tertinggi dalam kromatogram sidik
jari kencur. Nilai waktu retensi relatif setiap puncak mayor relatif konsisten
(Lampiran 2), artinya waktu retensi relatif merupakan variabel yang cocok
digunakan dalam identifikasi sampel. Sebaliknya, nilai luas puncak relatif
bervariasi (Lampiran 2) di antara sampel yang menunjukkan perbedaan
konsentrasi senyawa kimia setiap sampel. Hal ini dikarenakan kondisi lingkungan
tanaman yang berbeda antar daerah sampel.
c
b
a
Waktu (menit)
Gambar 3 Kromatogram sidik jari KCKT dari kencur (a), temu kunci (b), dan
kunci pepet (c)
Identifikasi, diskriminasi, dan autentikasi dari beberapa spesies yang
berkerabat dekat dapat dilakukan dengan analisis sidik jari kromatografi.
Perbandingan kromatogram sidik jari untuk semua sampel yang diuji
menunjukkan bahwa hampir semua puncak mayor yang diperoleh dari ketiga
spesies tidak bertumpang tindih. Puncak mayor (1, 3, 5, 13, 14, dan 15) dari
kencur tidak muncul dalam temu kunci dan kunci pepet. Begitu juga puncak
mayor temu kunci (2, 8, 9, 10, 11, 12, dan 19) dan kunci pepet (6, 7, 16, 17, dan
18) tidak muncul dalam sampel lainnya sehingga seluruh puncak mayor dari
setiap spesies tersebut merupakan puncak yang khas. Meskipun puncak no. 4 ada
pada kencur dan temu kunci, puncak ini umumnya menunjukkan tinggi puncak
yang dominan pada kencur. Oleh karena itu, puncak no. 4 pun dapat digunakan
sebagai puncak karakteristik dari kencur. Hal yang sama juga terjadi pada puncak
no. 15 kencur terhadap puncak no.16 pada kunci pepet. Semua puncak khas dalam
kromatogram sidik jari dari setiap sampel ini dapat digunakan untuk identifikasi,
diskriminasi, autentikasi kencur dari kunci pepet dan temu kunci (Gambar 3).
Adanya puncak karakteristik dari setiap spesies sangat membantu dalam
pendeteksian jika terjadi adulterasi kencur oleh kunci pepet dan temu kunci. Jika
kencur teradulterasi oleh kunci pepet dan temu kunci dengan konsentrasi 5, 25,
dan 50%, kromatogram sidik jari dapat membedakan kencur tunggal dari kencur
yang tercampur dengan kunci pepet dan temu kunci. Adanya puncak karakteristik
dari kunci pepet dan temu kunci memberikan perbedaan pada kromatogram sidik
jari yang diperoleh (Gambar 4). Konsentrasi adulteran (kunci pepet dan temu
8
kunci) menyebabkan perubahan yang signifikan pada kromatogram kencur
(Gambar 4a). Intensitas puncak mayor dari kencur menurun secara linear
sedangkan intensitas puncak mayor dan kunci pepet meningkat linear dengan
meningkatnya konsentrasi adulteran (Gambar 4b & 4c). Berdasarkan hasil yang
diperoleh, identifikasi dan autentikasi kencur dari kunci pepet dan temu kunci
telah diperoleh menggunakan analisis sidik jari KCKT.
a
b
c
Waktu (menit)
Gambar 4 Kromatogram kencur 100%, kencur-temu kunci, dan kencur-kunci
pepet (a), campuran kencur-temu kunci (b), dan campuran kencurkunci pepet (c). Sampel: kencur 100% (a1, b1, & c1), kencur-temu
kunci 5% (a2 & b2), 25% (a3 & b3), 50% (a4 & b4), temu kunci
100% (a5 & b5), kencur-kunci pepet 5% (a6 & c2), 25% (a7 & c3),
50% (a8 & c4), dan kunci pepet 100% (a9 & c5)
Identifikasi dan Autentikasi Kencur dari Kunci Pepet dan Temu Kunci
Menggunakan Kombinasi Sidik Jari KCKT dan Kemometrika
Kombinasi sidik jari KCKT dan kemometrika dalam hal ini analisis
multivariat digunakan untuk mengonfirmasi hasil yang diperoleh untuk
identifikasi dan autentikasi kencur dari kunci pepet dan temu kunci dari
pengamatan kromatogram sidik jari yang khas. Kombinasi ini merupakan metode
yang paling sering digunakan untuk identifikasi, autentikasi, dan autentikasi
spesies tanaman obat. Teknik analisis multivariat yang digunakan dalam
9
penelitian ini adalah analisis komponen utama (AKU) dan analisis diskriminan
(AD).
Pada analisis multivariat, AKU merupakan contoh pengenalan pola tidak
terawasi dan merupakan metode yang paling sering digunakan untuk mereduksi
data. AKU dapat mereduksi jumlah variabel dan akan memberikan informasi baru
setelah reduksi dari set data. Hasil dari analisis AKU ialah variabel baru yang
disebut komponen utama (KU) dari transformasi data aslinya. Umumnya, dua
KU sering digunakan untuk membuat plot AKU karena KU tersebut memberikan
variasi data paling besar. Kemiripan obyek dan kecenderungan pengelompokan
ditunjukkan dalam plot AKU.
Pada penelitian ini, AKU digunakan untuk identifikasi dan autentikasi
seluruh sampel berdasarkan luas puncak dari 19 puncak mayor. AKU dilakukan
pada 33 obyek × 19 matriks data. Gambar 5b menunjukkan plot AKU dengan 2
KU pertama, keragaman total dari campuran sampel yang dihasilkan sebesar
64.80% (KU1 = 30.06% dan KU2 = 34.74%). Berdasarkan plot AKU, sampel
kencur, temu kunci, dan kunci pepet dapat dikelompokkan menjadi 3 kelompok
berbeda (Gambar 5a & 5b). Hal yang sama untuk autentikasi kencur jika
teradulterasi dengan temu kunci, semua campuran sampel dapat dibedakan dengan
baik (Gambar 5b). Namun, pada campuran kencur-temu kunci 5% terlihat bahwa
jarak antara campuran tersebut dengan kencur 100% sangat dekat. Metode AKU
juga tidak dapat membedakan campuran kencur dan kunci pepet dengan baik. Hal
ini karena luas puncak mayor kunci pepet tunggal sangat kecil dibandingkan luas
puncak mayor kencur (Gambar 3a dan 3c). Oleh karena itu, AKU dapat
mendiskriminasikan ketiga spesies namun tidak berhasil dalam autentikasi kencur
khususnya jika kencur teradulterasi oleh kunci pepet.
AD merupakan teknik pengenalan pola lainnya yang sangat baik dan umum
digunakan untuk diskriminasi tumbuhan yang berkerabat dekat. Metode ini akan
membentuk suatu fungsi diskriminan (FD) untuk setiap kelompok dengan mencari
kombinasi linear dari data yang akan memberikan pemisahan dari dua atau lebih
kelompok observasi. Pada penelitian ini, model prediksi AD digunakan untuk
memperoleh diskriminasi yang jelas antara ketiga sampel dan autentikasi kencur
dari kunci pepet dan temu kunci. Model ini juga menggunakan 19 puncak mayor
sebagai variabel. Keragaman total yang diperoleh sebesar 98.91% (F1 = 94.59%
dan F2 = 3.32%). Gambar 5c dan 5d menunjukkan bahwa AD telah dapat
mengelompokkan ketiga spesies tunggal serta campuran kencur-temu kunci dan
kencur-kunci pepet pada semua konsentrasi yang digunakan pada penelitian ini.
Namun, kencur-kunci pepet 5% memiliki perbedaan yang kecil dengan kencur
100%. Hal ini karena luas puncak mayor kunci pepet tunggal sangat kecil
(Gambar 3a dan 3c). Luas puncak kunci pepet yang sangat kecil ini membuat
perubahan komposisi kunci pepet 5% tidak memberikan perbedaan signifikan
pada komposisi senyawa adulteran dalam campuran (Gambar 4c1 & 4c2).
10
Gambar 5 Plot AKU kencur, temu kunci, dan kunci pepet 100% (a), plot AKU
100% sampel dan campuran sampel (b); plot AD sampel 100% (c) dan
plot AD100% sampel dan campuran sampel
Berdasarkan analisis sidik jari kromatogram dan pola pengelompokkan
analisis multivariat ketiga sampel, dapat teramati bahwa pola sampel kencur lebih
dekat dengan kunci pepet daripada temu kunci. Hal ini sesuai dengan pohon
filogenik genus Kaempferia yang telah dibuat oleh Techaprasan et al. (2010)
berdasarkan kloroplas sekuens DNA (Lampiran 3).
Validasi model AD dengan jumlah sampel sedikit umumnya dilakukan
dengan teknik validasi silang. Kemampuan prediksi model telah diuji dengan
menggunakan validasi leave-one-out cross (LOOCV). LOOCV merupakan
pendekatan yang paling umum dengan mengeluarkan satu sampel pada suatu
waktu. Prosedur ini diulang sampai semua objek telah dikeluarkan secara bergilir.
LOOCV terklasifikasi sangat baik pada 100% sampel yang digunakan dalam
penelitian ini. Hasil ini menunjukkan bahwa model memberikan prediksi
klasifikasi yang sangat memuaskan untuk sampel uji.
11
4 SIMPULAN DAN SARAN
Simpulan
Identifikasi dan autentikasi kencur dari kunci pepet dan temu kunci telah
dilakukan dengan metode sidik jari KCKT. Autentikasi kencur dari kunci pepet
dan temu kunci dilakukan dengan pengamatan puncak karakteristik dari
kromatogram sidik jari pada setiap sampel yang digunakan serta kombinasi
dengan kemometrika (AD). Metode yang dikembangkan ini menghasilkan metode
yang dapat dipercaya dan efisien untuk identifikasi dan autentikasi kencur dari
kunci pepet dan temu kunci.
Saran
Identifikasi puncak karakteristik dari kencur, kunci pepet, dan temu kunci
dengan KC-SM diperlukan. Hal ini bertujuan memberi tambahan informasi
senyawa penciri pada setiap sampel dan lebih memudahkan dalam autentikasi
kencur terhadap spesies yang berkerabat dekat.
DAFTAR PUSTAKA
Dejaegher B, Alaerts G, Matthijs N. 2010. Methodology to Develop Liquid
Chromatographic Fingerprints for the Quality Control of Herbal Medicines.
Acta Chromatogr. 22(2):237–258.doi:10.1556/AChrom.22.2010.2.7.
Lakshmanan D, Werngren J, Jose L, Suja KP, Nair MS, Varma RL, Mundayoor S,
Hoffner S, Kumar RA. 2011. Ethyl p-methoxycinnamate isolated from a
traditional anti-tuberculosis medicinal herb inhibits drug resistant strains of
Mycobacterium
tuberculosis
in
vitro.
Fitoterapia
82:757–
761.doi:10.1016/j.fitote.2011.03.006.
Li Y, Wu T, Zhu ZH, Wan LL, Yu Q, Li XX, Cheng ZH, Guo C. 2010.
Combinative method using HPLC fingerprint and quantitative analyses
forquality consistency evaluation of an herbal medicinal preparation produced
by different manufacturers. J Pharm Bio Med Anal. 52:597602.doi:10.1016/j.jpba.2010.01.018.
Liang ZY, Xie P, Chan K. 2004. Quality control of herbal medicines. J J Chromb.
812:53-70.doi:10.1016/j.jchromb.2004.08.041.
Mekseepralard C, Kamkaen N, Wilkinson JM. 2010. Antimicrobial and
antioxidant activities of traditional Thai herbal remedies for aphthous ulcers.
Phytother Res. 24:1514–1519.doi:10.1002/ptr.3158.
Rafi M, Wulansari L, Heryanto R, Darusman LK, Lim LW, Takeuchi T. 2015.
Curcuminoid’s Content and Fingerprint Analysis for Authentication and
Discrimination of Curcuma xanthorrhiza from Curcuma longa by HighPerformance Liquid Chromatography-Diode Array Detector. Food Anal
Methods 8(9):2185-2193.doi:10.1007/s12161-015-0110-1.
12
Rafi M, Lim LW, Takeuchi T, Darusman LK. 2013. Capillary liquid
chromatographic fingerprint used for discrimination of Zingiber montanum
from related species. Anal Bioanal Chem. 405:6599-5503.doi: 10.1007/s00216013-7083-y.
Ridtitid W, Sae-Wong C, Reanmongkol W, Wongnawa M. 2008. Antinociceptive
activity of the methanolic extract of Kaempferia galanga Linn. in experimental
animals. J Ethnopharmacol.118:225–230.doi:10.1016/j.jep.2008.04.002.
Roemantyo HS, Soekarman. 1996. Sekilas pemanfaatan kencur pada jamu
kemasan (jamu products containing Kaempferia galanga L.). Warta Tumbuhan
Obat Indonesia [internet].[diunduh 2013 Okt 26];3(2): 15-16. Tersedia pada:
http//ejournal.litbang.depkes.go.id/index.php/wtoi/article/view/2780.
Sutthanont N, Choochote W, Tuetun B, Junkum A, Jitpakdi A, Chaithong U,
Riyong D, Pitasawat B. 2010. Chemical composition and larvicidal activity of
edible plant-derived essential oils against the pyrethroid-susceptible and resistant strains of Aedes aegypti (Diptera: Culicidae). J Vector Ecol. 35:106–
115.doi:10.1111/j/1948-7134.2010.00036.x.
Taverniers I, De Loose M, Van Bockstaele E. 2004. Trends in quality in the
analytical laboratory. II. Analytical method validation and quality assurance.
Trends Anal Chem. 23 (8):535-552.doi:10.1016/j.trac.2004.04.001.
Techaprasan J, Klinbunga S, Ngamriabsakul C, Jenjittikul T. 2010. Genetic
variation of Kaempferia (Zingiberaceae) in Thailand based on chloroplast
DNA (psbA-trnH and petA-psbJ) sequences. Genet Mol Res. 9(4):19571973.doi:10.4238/vol9-4gmr873
Tewtrakul S, Subhadhirasakul S. 2007. Anti-Allergic activity of some selected
plants in the Zingiberaceae family. J. Ethnopharmacol. 109:535–
538.doi:10.1016/j.jep.2006.08.010.
Umar MI, Asmawi MZ, Sadikun A, Atangwho IJ, Yam MF, Altaf R, Ahmed A.
2012. Bioactivity-guided isolation of ethyl-p-methoxycinnamate, an antiinflammatory constituent, from Kaempferia galanga L. extracts. Molecules 17:
8720-8734.doi:10.3390/molecules17078720.
Wang L, Wang X, Kong L. 2012. Automatic authentication and distinction of
Epimedium koreanum and Epimedium wushanense with HPLC fingerprint
analysis assisted by pattern recognition techniques. Biochem. Sys. Eco. 40:138145.doi:10.1016/j.bse.2011.10.014.
Yang DY, Lee SW, Kim YO, Sohn S, Kim YC, Hyun DY, Hong YP, Shin YS.
2013. HPLC-based metabolic profilling and quality control of leaves of
different
Panax
species.
J
Gingseng
Res.
37:248253.doi:10.5142/jgr.2013.37.248.
Zhao Y, Zhang Y, Lin R, Sun W. 2009. An expeditious HPLC method to
distinguish Aconitum kusnezoffi from related species. Fitoterapia 80:333338.doi:10.1016/j.fitote.2009.04.005.
Zou HB, Yag GS, Du AQ, Yuan JR, Qin ZR, Xia YY, Aboul-Enein HY. 2006.
Combinational numeral fingerprint spectra of Glycyrrhiza and analysis of
common peak ratio invariableness in HPLC. Biomed Chromatogr. 20:642655.doi:10.1002/bmc.639.
13
Lampiran 1 Hasil identifikasi/determinasi tumbuhan
Keterangan: sampel no. 9 & 10 tidak digunakan
14
Lampiran 2 Kisaran waktu retensi relatif (RRT) dan luas puncak relatif (RPA) dari sampel
15
Lampiran 3 Pohon filogenik genus Kaempferia berdasarkan kloroplas sekuens
DNA (Techaprasan et al. 2010)
K. galanga
K. rotunda
K. pandurata
16
RIWAYAT HIDUP
Penulis dilahirkan di Jakarta pada tanggal 8 September 1990 sebagai anak
sulung dari pasangan Muji Waluyo dan Rachmawati. Pendidikan Sarjana
ditempuh di Program Studi Kimia, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan
Alam IPB, lulus pada tahun 2012. Kesempatan untuk melanjutkan ke program
magister di Program Studi Kimia pada Program Pascasarjana IPB diperoleh pada
tahun 2012. Beasiswa pendidikan pascasarjana diperoleh pada tahun 2013 dari
program Fresh graduate Direktorat Jenderal Pendidikan Tinggi Republik
Indonesia.
Penulis bekerja paruh waktu sebagai pengajar bidang studi kimia SMA di
bimbingan belajar Nurul Fikri di Bogor sejak tahun 2012. Penulis juga aktif
menjadi asisten praktikum di laboratorium kimia IPB saat pendidikan sarjana serta
pernah menjadi penanggung jawab praktikum di laboratorium kimia IPB saat
pendidikan magister.
Saat mengikuti program sarjana, penulis pernah menjadi pemakalah poster
pada seminar nasional tanaman obat “POKJANAS TOI XLII” di Universitas
Jenderal Achmad Yani (UNJANI), Cimahi, Bandung pada tahun 2012. Selama
mengikuti program S-2, penulis berperan aktif dalam seminar internasional
temulawak (IST3) yang diselenggarakan oleh Pusat Studi Biofarmaka IPB tahun
2015 sebagai penyaji poster. Artikel yang berjudul “HPLC Fingerprint Analysis
Combined with Chemometrics for Authentication of Kaempferia galanga from
Related Species” sedang dalam proses review pada jurnal Indonesian Journal of
Chemistry. Karya ilmiah tersebut merupakan bagian dari program S-2 penulis.
SIDIK JARI KCKT DAN KEMOMETRIKA
CAHYA SEPTYANTI
SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2015
PERNYATAAN MENGENAI TESIS DAN
SUMBER INFORMASI SERTA PELIMPAHAN HAK CIPTA*
Dengan ini saya menyatakan bahwa tesis berjudul Autentikasi Kencur
Menggunakan Kombinasi Sidik Jari KCKT dan Kemometrika adalah benar karya
saya dengan arahan dari komisi pembimbing dan belum diajukan dalam bentuk
apa pun kepada perguruan tinggi mana pun. Sumber informasi yang berasal atau
dikutip dari karya yang diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari penulis lain telah
disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam Daftar Pustaka di bagian akhir
tesis ini.
Dengan ini saya melimpahkan hak cipta dari karya tulis saya kepada Institut
Pertanian Bogor.
Bogor, November 2015
Cahya Septyanti
NIM G451124031
RINGKASAN
CAHYA SEPTYANTI. Autentikasi Kencur Menggunakan Kombinasi Sidik Jari
KCKT dan Kemometrika. Dibimbing oleh IRMANIDA BATUBARA dan
MOHAMAD RAFI.
Kaempferia galanga yang di Indonesia dikenal sebagai kencur umumnya
digunakan dalam obat tradisional untuk mengobati berbagai penyakit. Produk
kencur telah dijual komersial sebagai herbal kombinasi (jamu). Selain itu, kencur
juga digunakan sebagai herbal tunggal (serbuk kencur) yang dikemas dalam
bentuk kapsul atau sachet.
K. rotunda (kunci pepet) dan K. pandurata (temu kunci) merupakan spesies
yang berkerabat dekat dengan kencur yang tersedia di pasar tradisional Indonesia.
Keduanya dimungkinkan sebagai bahan pemalsu bagi kencur. Harga kencur
kering di pasar umumnya lebih tinggi dari kunci pepet kering dan temu kunci
kering. Ketiganya memiliki warna rimpang yang sama namun berbeda ukuran dan
bau. Identifikasi dan autentikasi kencur menjadi sangat sulit jika sudah dalam
bentuk serbuk. Jika bahan baku kencur telah terpalsukan maka kualitas, efikasi,
dan keamanan produk akhir kencur akan berubah. Oleh karena itu, diperlukan
suatu langkah untuk menentukan atau mengonfirmasi identitas dan keaslian
kencur yang dikenal dengan istilah autentikasi. Autentikasi dilakukan dengan
adanya suatu metode analitik yang tepat untuk menguji kualitas bahan baku
kencur untuk mencegah adanya pemalsuan dari spesies yang berkerabat dekat
dengannya seperti kunci pepet dan temu kunci.
Pemalsuan kencur dilakukan dengan mencampurkan serbuk kencur dengan
kunci pepet atau temu kunci. Sistem KCKT terdiri dari kolom C18, program elusi
gradien 20-80% metanol dan asam asetat 1% selama 0-60 menit dengan laju alir 1
mL/menit, dan diamati pada 254 nm. Analisis komponen utama (AKU) dan
analisis diskriminan (AD) digunakan untuk membangun model identifikasi dan
autentikasi sampel.
Identifikasi dan autentikasi kencur dari kunci pepet dan temu kunci telah
diperoleh dengan analisis sidik jari KCKT. Pada plot AKU, ketiganya dapat
terklasifikasi dengan baik namun jika kencur dicampur dengan kunci pepet atau
temu kunci tidak terklasifikasi dengan baik. AD dapat membedakan ketiga spesies
dengan baik juga ketika dicampur sebagai kencur-kunci pepet dan kencur-temu
kunci pada seluruh konsentrasi yang digunakan. Kencur-kunci pepet 5% memiliki
sedikit perbedaan dengan 100% kencur. Validasi model AD menggunakan teknik
validasi silang leave-one-out (LOOCV). Model memberikan hasil prediksi
klasifikasi yang sangat memuaskan (100% terklasifikasi).
Identifikasi dan autentikasi kencur dari kunci pepet dan temu kunci telah
berhasil dengan metode sidik jari yang dikombinasikan dengan AD. Metode yang
dikembangkan ini menghasilkan metode yang dapat dipercaya dan efisien untuk
identifikasi dan autentikasi kencur dari kunci pepet dan temu kunci.
Kata kunci: autentikasi, kemometrika, analisis sidik jari KCKT, Kaempferia
galanga
SUMMARY
CAHYA SEPTYANTI. Authentication of Kaempferia galanga Using HPLC
Fingerprint Combined with Chemometrics. Supervised by IRMANIDA
BATUBARA and MOHAMAD RAFI.
Kaempferia galanga is known as kencur in Indonesia and widely used in
folk medicine to treat some diseases. In Indonesia, commercial product of kencur
was sold as jamu (Indonesia traditional medicines) along with other medicinal
plants. Besides sold as jamu, sometimes kencur also used as a single herb product
(kencur powder) which is packaged in capsule or sachet.
Some related species of kencur such as K. rotunda (kunci pepet) and K.
pandurata (temu kunci) are available in Indonesia local markets and these two
plants could be a potential counterfeit of kencur. The price of kencur dry powder
in local market generally is more expensive than kunci pepet and temu kunci.
These three medicinal plants have similar color in their rhizomes but differ in size
and odor. Identification and authentication of kencur will be very difficult if
present in powdered form. Adulteration of kencur with some related plants will
change the quality, efficacy, and safety of kencur finished products. To overcome
this problem, the confirmation of the identity and authenticity of kencur is needed.
This purpose will need an appropriate analytical method for evaluating quality of
kencur raw material in order to prevent an adulteration with some related plants.
Adulteration detection was carried out by mixing kencur powder with kunci
pepet or temu kunci. The HPLC system C18 column, methanol and 1% acetic acid
with gradient elution program of 20–80% in 0–60 min as mobile phase with a
flow rate of 1 mL/min and monitored at 254 nm. Principal component analysis
(PCA) and discriminant analysis (DA) were used to construct a model for
identification and authentication of the samples.
Identification, discrimination, and authentication of some closely-related
species could be carrying out by chromatographic fingerprint analysis combined
with chemometrics. Based on the result obtained, identification and authentication
of kencur from kunci pepet and temu kunci was achieved using HPLC fingerprint
analysis. From PCA plot, kencur, kunci pepet, and temu kunci could be classified
into their own groups. Unfortunately, the authentication of kencur when it mixed
with kunci pepet or temu kunci was couldn’t distinguish well by PCA. DA was
able to distinguish the three species as well as all mixed sample of kencur-kunci
pepet and kencur-temu kunci in all concentration used. However, kencur-kunci
pepet 5% has a small difference with 100% of kencur. Validation of the DA
model used a leave-one-out cross-validation technique (LOOCV). The model
gave a very satisfactory classification prediction for the test sample (100%
classified).
Identification and authentication of kencur from kunci pepet and temu kunci
was successfully achieved by our HPLC fingerprint method combined with DA.
So the developed method was proved to be an efficient and reliable method for
identification and authentication of kencur from kunci pepet and temu kunci.
Keywords: authentication, chemometrics, HPLC fingerprint analysis, Kaempferia
galanga
© Hak Cipta Milik IPB, Tahun 2015
Hak Cipta Dilindungi Undang-Undang
Dilarang mengutip sebagian atau seluruh karya tulis ini tanpa mencantumkan
atau menyebutkan sumbernya. Pengutipan hanya untuk kepentingan pendidikan,
penelitian, penulisan karya ilmiah, penyusunan laporan, penulisan kritik, atau
tinjauan suatu masalah; dan pengutipan tersebut tidak merugikan kepentingan
IPB
Dilarang mengumumkan dan memperbanyak sebagian atau seluruh karya tulis ini
dalam bentuk apa pun tanpa izin IPB
AUTENTIKASI KENCUR MENGGUNAKAN KOMBINASI
SIDIK JARI KCKT DAN KEMOMETRIKA
CAHYA SEPTYANTI
Tesis
sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
Magister Sains
pada
Program Studi Kimia
SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2015
Penguji pada Ujian Tertutup: Dr. dr. Irma Herawati Suparto, MS
Judul Tesis : Autentikasi Kencur Menggunakan Kombinasi Sidik Jari KCKT dan
Kemometrika
Nama
: Cahya Septyanti
NIM
: G451124031
Disetujui oleh
Komisi Pembimbing
Dr Irmanida Batubara, MSi
Ketua
Dr Mohamad Rafi, MSi
Anggota
Diketahui oleh
Ketua Program Studi
Kimia
a.n. Dekan Sekolah Pascasarjana IPB
Sekretaris Program Magister
Prof Dr Dyah Iswantini,
MSc Agr
Prof Dr Ir Nahrowi, MSc
Tanggal Ujian:
Tanggal Lulus:
30 November 2015
PRAKATA
Puji dan syukur penulis panjatkan kepada Allah subhanahu wa ta’ala atas
segala karunia-Nya sehingga karya ilmiah ini berhasil diselesaikan. Tema yang
dipilih dalam penelitian ini ialah autentikasi, dengan judul Autentikasi Kencur
Menggunakan Kombinasi Sidik Jari KCKT dan Kemometrika. Penelitian
dilaksanakan sejak bulan April 2014 sampai Februari 2015 bertempat di
Laboratorium Pusat Studi Biofarmaka Institut Pertanian Bogor (PSB IPB).
Penulis mengucapkan terima kasih kepada Dr Irmanida Batubara, MSi
selaku ketua komisi pembimbing dan Dr Mohamad Rafi, MSi sebagai anggota
komisi pembimbing yang selalu memberikan motivasi, kritik, dan saran untuk
kelancaran penelitian dan penulisan. Terima kasih kepada Laboratorium Pusat
Studi Biofarmaka Institut Pertanian Bogor (PSB IPB) yang telah memberikan
kesempatan kepada penulis untuk melaksanakan penelitiannya. Penulis juga
mengucapkan terima kasih kepada Endi Suhendi yang telah membantu dalam
menyediakan alat dan bahan selama penelitian dan Laela Wulansari, SSi yang
telah membantu selama pengumpulan data sidik jari KCKT. Ungkapan terima
kasih juga dihaturkan untuk kedua orang tua, suami, dan adik penulis yang selalu
memberikan dukungan dan kasih sayangnya. Ucapan terima kasih kepada
Nurmaida dan Dewi Anggraini S yang senantiasa menyemangati dan berjuang
bersama dalam penelitian. Semoga tulisan ini dapat memberikan manfaat dalam
perkembangan ilmu pengetahuan.
Bogor, November 2015
Cahya Septyanti
DAFTAR ISI
DAFTAR TABEL
vi
DAFTAR GAMBAR
vi
DAFTAR LAMPIRAN
vi
1 PENDAHULUAN
1
2 METODE
Bahan
Alat
Prosedur Analisis Data
2
2
2
2
3 HASIL DAN PEMBAHASAN
Pengoptimuman Kondisi dan Validasi Metode KCKT
Analisis Sidik Jari KCKT untuk Identifikasi dan Autentikasi Kencur
Identifikasi dan Autentikasi Kencur dari Kunci Pepet dan Temu Kunci
Menggunakan Kombinasi Sidik Jari KCKT dan Kemometrika
4
4
6
8
4 SIMPULAN DAN SARAN
Simpulan
Saran
11
11
11
DAFTAR PUSTAKA
11
LAMPIRAN
13
RIWAYAT HIDUP
16
DAFTAR TABEL
1 Sumber sampel
2 Komposisi campuran yang digunakan pada percobaan
3
3
DAFTAR GAMBAR
Kromatogram KCKT kencur Wonogiri
Kromatogram kencur, temu kunci, dan kunci pepet
Kromatogram sidik jari KCKT dari kencur, temu kunci, dan kunci pepet
Kromatogram kencur 100%, kencur-temu kunci, dan kencur-kunci
pepet
5 Plot AKU dan AD kencur, temu kunci, dan kunci pepet 100% serta
campuran sampel
1
2
3
4
5
6
7
8
10
DAFTAR LAMPIRAN
1 Hasil identifikasi/determinasi tumbuhan
2 Kisaran waktu retensi relatif dan luas puncak relatif dari sampel
3 Pohon filogenik genus Kaempferia berdasarkan kloroplas sekuens DNA
13
14
15
1
1 PENDAHULUAN
Kaempferia galanga yang di Indonesia dikenal sebagai kencur umumnya
digunakan dalam obat tradisional untuk mengobati penyakit rematik, batuk,
disentri, diare, dan sakit perut. Tanaman ini yang telah dilaporkan memiliki
beberapa aktivitas biologis seperti antimikrob (Lakshmanan et al. 2011),
antioksidan (Mekseepralard et al. 2010), pengusir nyamuk dan larva (Sutthanont
et al. 2010), analgesik (Ridtitid et al. 2008), dan antialergi (Tewtrakul &
Subhadhirasakul 2007). Produk kencur telah dijual komersial sebagai herbal
kombinasi (jamu) diantaranya untuk jamu perawatan kesehatan wanita, jamu
penyegar, jamu pelancar peredaran darah, dan jamu yang berkhasiat menguatkan
tubuh (Roemantyo dan Soekarman 1996). Selain itu, kencur juga digunakan
sebagai herbal tunggal (serbuk kencur) yang dikemas dalam bentuk kapsul atau
sachet. Etil-p-metoksi sinamat dan etil sinamat dari ekstrak kencur berperan
penting dalam bioaktivitas tersebut (Umar et al. 2012).
K. rotunda (kunci pepet) dan K. pandurata (temu kunci) merupakan spesies
yang berkerabat dekat dengan kencur yang tersedia di pasar tradisional Indonesia.
Keduanya dimungkinkan sebagai bahan pemalsu (adulterant) bagi kencur karena
adanya kemiripan dalam hal warna rimpang yang putih kekuningan. Membedakan
ketiganya jika masih dalam bentuk rimpang tidaklah sulit karena ukuran dan bau
rimpang masing-masing sangat berbeda, akan tetapi akan menjadi sangat sulit jika
sudah dalam bentuk serbuk. Harga kencur kering di pasar umumnya lebih tinggi
dari kunci pepet kering, dan temu kunci kering. Hal ini berarti kunci pepet dan
temu kunci dimungkinkan untuk digunakan sebagai pemalsu untuk kencur. Jika
bahan baku kencur telah terpalsukan (teradulterasi) maka kualitas, efikasi, dan
keamanan produk akhir kencur akan berubah. Oleh karena itu, diperlukan suatu
langkah untuk menentukan atau mengonfirmasi identitas dan keaslian kencur yang
dikenal dengan istilah autentikasi. Autentikasi dilakukan dengan adanya suatu
metode analitik yang tepat untuk menguji kualitas bahan baku kencur untuk
mencegah adanya pemalsuan dari spesies yang berkerabat dekat dengannya
seperti kunci pepet dan temu kunci.
Identifikasi, autentikasi, dan diskriminasi spesies tumbuhan dalam 1 genus
yang merupakan bagian dari kontrol kualitas obat herbal dapat dilakukan dengan
metode sidik jari senyawa kimia. Beberapa teknik analisis seperti kromatografi
(KLT, KG, KCKT/UPLC) dan spektrometri (UV-tampak, inframerah, RMI, SM)
atau gabungan kromatografi-spektrometri (KG-SM dan KC-SM) dapat digunakan
untuk analisis sidik jari (Liang et al. 2004). KCKT dengan detektor diode array
(KCKT-DAD) merupakan pilihan yang lebih baik untuk pengembangan analisis
sidik jari kimia karena teknik ini memiliki efisiensi pemisahan dan sensitivitas
deteksi yang tinggi (Zou et al. 2006; Li et al. 2010).
Analisis sidik jari kimia mampu menyajikan profil karakteristik kimia
sampel dengan rinci akan tetapi akan mengandung data yang besar. Kemometrika,
dalam hal ini analisis multivariat diperlukan untuk mengolah data tersebut dengan
tujuan identifikasi, autentikasi, atau diskriminasi suatu sampel. Kombinasi sidik
jari kromatografi dan analisis multivariat telah digunakan secara luas untuk
identifikasi, autentikasi, dan diskriminasi dari berbagai tanaman obat termasuk
beberapa genus Aconitum (Zhao et al. 2009), Epimedium (Wang et al. 2012), dan
2
Panax (Yang et al. 2013), Zingiber (Rafi et al. 2013), dan Curcuma (Rafi et al.
2015). Hingga saat ini belum ditemukan adanya publikasi yang terkait dengan
penggunaan sidik jari KCKT yang dikombinasikan dengan kemometrika untuk
genus Kaempferia yang bertujuan untuk identifikasi, diskriminasi, dan autentikasi.
Oleh karena itu, penelitian ini mengembangkan metode analisis sidik jari KCKT
yang dikombinasikan dengan kemometrika untuk identifikasi, diskriminasi, dan
autentikasi kencur dari spesies yang berkerabat dekat (kunci pepet dan temu
kunci). Metode ini diharapkan dapat menjadi metode yang dapat dipercaya,
efisien, dan praktis untuk identifikasi dan autentikasi bahan baku kencur.
2 METODE
Bahan
Dua puluh satu sampel yang digunakan terdiri atas kencur dari 9 daerah,
dari 6 daerah, kunci pepet dan temu kunci dari 6 daerah di pulau Jawa, Indonesia
(Tabel 1). Semua sampel telah diidentifikasi di Herbarium Bogoriense, Pusat
Penelitian Biologi, Lembaga Ilmu Pengetahuan Indonesia, Indonesia (Lampiran 1)
dan voucher spesimen disimpan di Pusat Studi Biofarmaka, Institut Pertanian
Bogor, Indonesia. Bahan kimia yang digunakan ialah metanol, asetonitril, dan
asam asetat dengan HPLC grade (Merck, Darmstadt, Jerman) serta air
(Ikapharmindo Putramas, Jakarta, Indonesia). Filter membran Ekicrodisc 25 R
(ukuran pori 0.45μm) diperoleh dari Gelman Science Japan Co. (Tokyo, Jepang).
Alat
Alat-alat yang digunakan antara lain neraca analitik, dan sistem KCKT LC20A (Shimadzu, Tokyo, Jepang) dengan detector UV diode array dan kolom
Shim-pack VP-ODS C18 (150 nm × 4.6 mm i.d) (Shimadzu, Tokyo, Jepang) serta
peranti lunak statistika XLSTAT 2012.2.02 (Addinsoft, New York, USA).
Prosedur Analisis Data
Preparasi Sampel
Rimpang segar dicuci dengan air bersih, ditiriskan, dipotong kecil-kecil, dan
dikeringkan dalam oven 50oC. Setelah itu, rimpang kering digiling dan diayak
menggunakan pengayak 40 mesh agar diperoleh bentuk serbuk.
Preparasi Sampel untuk Pembuatan Sidik Jari KCKT
Ditimbang sebanyak 250 mg sampel serbuk (kencur, kunci pepet, dan temu
kunci) kemudian diekstraksi menggunakan ultrasonikasi dengan 5 mL metanol
selama 30 menit. Ekstrak sampel disaring dengan filter membran 0.45 μm
sebelum diinjeksikan dalam sistem KCKT.
Deteksi adulterasi dilakukan dengan mencampurkan serbuk kencur dengan
kunci pepet atau temu kunci. Sumber sampel kencur dikelompokkan dalam 3
3
kategori yaitu konsentrasi komponen mayor tinggi (T), komponen mayor sedang
(S), dan komponen mayor rendah (R). Kombinasi sampel kencur dengan kunci
pepet atau temu kunci dilakukan sesuai komposisi pada Tabel 2.
Tabel 1 Sumber sampel
Spesies
Kaempferia galanga
Kaempferia pandurata
Kaempferia rotunda
Kode sampel
Sumber (Daerah)
KG-1
KG-2
KG-3
KG-4
KG-5
KG-6
KG-7
KG-8
KG-9
KP-1
KP-2
KP-3
KP-4
KP-5
KP-6
KR-1
KR-2
Bogor, Jawa Barat
Sumedang, Jawa Barat
Karang anyar, Jawa Tengah
Solo, Jawa Tengah
Purworejo, Jawa Tengah
KR-3
KR-4
KR-5
KR-6
Bekasi, Jawa Barat
Solo, Jawa Tengah
Solo, Jawa Tengah
Karang anyar, Jawa Tengah
Wonogiri, Jawa Tengah
Wonogiri, Jawa Tengah
Pacitan, Jawa Timur
Pacitan, Jawa Timur
Bogor, Jawa Barat
Bekasi, Jawa Barat
Sumedang, Jawa Barat
Wonogiri, Jawa Tengah
Pacitan, Jawa Timur
Ponorogo, Jawa Timur
Bogor, Jawa Barat
Bekasi, Jawa Barat
Tabel 2 Komposisi campuran yang digunakan pada percobaan
Kencur
S-95
S-75
S-50
R-95
R-75
R-50
Komposisi (%)
Kunci pepet
Kencur
5
T-95
25
T-75
50
T-50
5
S-95
25
S-75
50
S-50
Temu kunci
5
25
50
5
25
50
Keterangan: T = konsentrasi komponen mayor tinggi, S = sedang, R = rendah
Peralatan dan Kondisi Kromatografi
Sistem KCKT terdiri dari pengumpan mikro dengan syringe gas tight, klep
mikroinjeksi sebagai injektor, kolom C18, dan detektor DAD. Suhu kolom sesuai
suhu kamar dan laju alir fase gerak 1.0 ml/menit. Pengoptimuman sidik jari
4
KCKT diperoleh dengan mengombinasikan eluen asam asetat (CH3COOH) 1%
dimodifikasi dengan pelarut organik yaitu asetonitril (ACN) atau metanol
(MeOH) dengan sistem elusi gradien dan deteksi pada panjang gelombang
200−400 nm.
Sebanyak 20 μL ekstrak kencur yang telah dipreparasi diinjeksikan ke
dalam setiap kondisi yang telah disebutkan. Waktu analisis total, jumlah puncak,
dan resolusi masing-masing puncak digunakan sebagai variabel untuk
menentukan kondisi optimum analisis. Selanjutnya, sampel kunci pepet dan temu
kunci (Tabel 1) dan campuran sampel dengan komposisi lainnya (Tabel 2)
diinjeksikan dengan sistem KCKT pada kondisi optimum analisis. Validasi
metode analitik dilakukan dengan parameter kedapatulangan dan stabilitas
terhadap waktu retensi relatif dan luas puncak relatif.
Kedapatulangan metode ditentukan dengan injeksi 5 larutan sampel yang
disiapkan. Stabilitas metode diuji berdasarkan analisis larutan sampel pada 0, 4, 8,
dan 12 jam. Simpangan baku relatif dari waktu retensi relatif dan luas puncak
relatif puncak mayor ditentukan untuk kedua parameter tersebut.
Autentikasi Kencur
Data yang diperoleh dari profil kromatografi sampel kencur, kunci pepet,
temu kunci, serta campuran sampel dievaluasi menggunakan analisis kemometrika
multivariat. Waktu retensi relatif kencur setiap puncak khas dihitung dengan
membandingan waktu retensi setiap puncak terhadap waktu retensi puncak
tertinggi. Dihitung juga luas puncak relatif setiap puncak khas terhadap luas
puncak tertinggi. Autentikasi dilakukan dengan mengelompokkan luas puncak
relatif puncak mayor kromatogram. Model divalidasi dengan LOOCV (leave-oneout cross-validation) dengan piranti lunak XLSTAT 2012.2.02 (Addinsoft, New
York, USA).
3 HASIL DAN PEMBAHASAN
Pengoptimuman Kondisi dan Validasi Metode KCKT
Kondisi optimum pembuatan sidik jari KCKT kencur diawali dengan
preparasi sampelnya. Kencur yang digunakan ialah kencur yang berasal dari
daerah Wonogiri, Jawa Tengah. Daerah ini dipilih karena memberikan intensitas
sinyal setiap puncak mayor yang tertinggi dari daerah lainnya. Kencur diekstraksi
dengan ultrasonikasi supaya seluruh komponen kimia (senyawa mayor dan minor)
akan terdeteksi pada sidik jari kromatografi dengan waktu ekstraksi yang tidak
terlalu lama. Pemilihan nisbah serbuk:pelarut 250 mg dalam 5 mL metanol dan
waktu ekstraksi selama 30 menit berdasarkan percobaan jumlah serbuk dan waktu
ekstraksi yang memberikan intensitas puncak mayor yang optimum terbaca pada
kromatogram.
Pengoptimuman kondisi KCKT sangat penting dilakukan dalam analisis
sidik jari kromatografi. Hal ini bertujuan agar diperoleh pemisahan analat dengan
resolusi dan baseline yang baik. Menurut Dejaegher et al. (2010), pemisahan
yang baik untuk analisis kualitatif ialah yang memberikan jumlah puncak (n)
5
maksimum dan pemisahan antar puncak yang jelas (resolusi > 1.5). Pada
penelitian ini, pemisahan analat optimum diperoleh dengan elusi gradien 20-80%
metanol dan asam asetat 1% dalam air. Kondisi tersebut memberikan nilai resolusi
7 puncak mayor lebih besar dari 1.5 dan waktu analisis selama 1 jam (Gambar 1).
Pemilihan sistem elusi gradien karena ekstrak sampel mengandung komponen
kimia yang kompleks. Sistem elusi isokratik umumnya tidak dapat memberikan
pemisahan yang baik dan jumlah puncak mayor lebih sedikit sehingga tidak
memberikan informasi yang cukup dalam analisis sidik jari kromatografi. Panjang
gelombang yang dipilih ialah 254 nm karena pada panjang gelombang ini seluruh
puncak mayor dapat terbedakan dengan baik dan memberikan baseline yang lurus
sehingga sensitivitasnya lebih tinggi dari panjang gelombang lain.
Gambar 1 Kromatogram KCKT kencur wonogiri. Kolom yang digunakan: Shimpack VP-ODS C18 (150 nm × 4.6 mm i.d) (Shimadzu, Tokyo, Jepang).
Fase gerak terdiri dari methanol dan asam asetat 1% dalam air
menggunakan program elusi gradien 20−80% (A) selama 0-60 menit
dengan laju alir 1 mL/menit dan panjang gelombang deteksi 254 nm
Sistem kromatografi optimum yang telah diperoleh kemudian divalidasi
terlebih dahulu sebelum digunakan untuk identifikasi dan autentikasi kencur dari
kunci pepet dan temu kunci. Parameter kedapatulangan dan stabilitas cukup
mewakili validasi metode untuk analisis kualitatif. Kedapatulangan dilakukan
untuk melihat kedapatulangan metode uji. Pada penelitian ini diperoleh
simpangan baku relatif dari waktu retensi relatif untuk semua puncak mayor dari
uji kedapatulangan dengan kisaran 0–0.18% sedangkan untuk luas puncak relatif
sebesar 0–5.95%. Uji stabilitas dilakukan untuk melihat stabilitas dari sampel uji.
Simpangan baku relatif dari waktu retensi relatif dan luas puncak relatif dari uji
stabilitas yang diperoleh kurang dari 1.33% dan 1.94%. Perbedaan waktu retensi
menunjukkan ketidakpastian dalam perhitungan waktu retensi di antara
kromatogram. Suatu metode analitik dikatakan valid jika nilai simpangan baku
relatif kurang dari 5% (Taverniers et al. 2004). Meskipun ada satu puncak mayor
yang memberikan simpangan baku relatif dari luas puncak relatif lebih besar dari
6
5%, puncak mayor lain sesuai dengan standar validasi metode yang berlaku. Oleh
karena itu, hasil uji kinerja analitik menunjukkan bahwa pengembangan metode
sidik jari KCKT secara kualitatif ini dapat dipercaya dan valid.
Analisis Sidik Jari KCKT untuk Identifikasi dan Autentikasi Kencur
Metode sidik jari KCKT yang telah dikembangkan kemudian diaplikasikan
pada 21 sampel tunggal yang terdiri dari 9 sampel kencur, 6 sampel kunci pepet,
dan 6 sampel temu kunci. Kromatogram sampel kencur, kunci pepet, dan temu
kunci tunggal ditunjukkan pada Gambar 2.
Gambar 2 Kromatogram kencur (a), temu kunci (b), dan kunci pepet (c). Lokasi:
kencur Bogor (a1), Sumedang (a2), Karang anyar (a3), Solo (a4),
Purworejo (a5), Wonogiri 1 (a6), Wonogiri 2 (a7), Pacitan 1 (a8),
Pacitan 2 (a9); temu kunci Bogor (b1), Bekasi (b2), Sumedang (b3),
Wonogiri (b4), Pacitan (b5), Ponorogo (b6); kunci pepet Bogor (c1),
Bekasi 1 (c2), Bekasi 2 (c3), Solo 1 (c4), Solo 2 (c5), Karang anyar
(c6)
Puncak yang ada dalam semua sampel dan memberikan sinyal cukup besar dalam
setiap kromatogram sampel digunakan sebagai puncak mayor. Pendekatan sidik
jari yang khas digunakan dengan normalisasi waktu retensi dan luas puncak untuk
7
menghitung waktu retensi relatif dan luas puncak relatif setiap puncak mayor
terhadap puncak pembanding. Puncak pembanding yang dipilih adalah puncak 4
(Gambar 3) karena memberikan luas puncak tertinggi dalam kromatogram sidik
jari kencur. Nilai waktu retensi relatif setiap puncak mayor relatif konsisten
(Lampiran 2), artinya waktu retensi relatif merupakan variabel yang cocok
digunakan dalam identifikasi sampel. Sebaliknya, nilai luas puncak relatif
bervariasi (Lampiran 2) di antara sampel yang menunjukkan perbedaan
konsentrasi senyawa kimia setiap sampel. Hal ini dikarenakan kondisi lingkungan
tanaman yang berbeda antar daerah sampel.
c
b
a
Waktu (menit)
Gambar 3 Kromatogram sidik jari KCKT dari kencur (a), temu kunci (b), dan
kunci pepet (c)
Identifikasi, diskriminasi, dan autentikasi dari beberapa spesies yang
berkerabat dekat dapat dilakukan dengan analisis sidik jari kromatografi.
Perbandingan kromatogram sidik jari untuk semua sampel yang diuji
menunjukkan bahwa hampir semua puncak mayor yang diperoleh dari ketiga
spesies tidak bertumpang tindih. Puncak mayor (1, 3, 5, 13, 14, dan 15) dari
kencur tidak muncul dalam temu kunci dan kunci pepet. Begitu juga puncak
mayor temu kunci (2, 8, 9, 10, 11, 12, dan 19) dan kunci pepet (6, 7, 16, 17, dan
18) tidak muncul dalam sampel lainnya sehingga seluruh puncak mayor dari
setiap spesies tersebut merupakan puncak yang khas. Meskipun puncak no. 4 ada
pada kencur dan temu kunci, puncak ini umumnya menunjukkan tinggi puncak
yang dominan pada kencur. Oleh karena itu, puncak no. 4 pun dapat digunakan
sebagai puncak karakteristik dari kencur. Hal yang sama juga terjadi pada puncak
no. 15 kencur terhadap puncak no.16 pada kunci pepet. Semua puncak khas dalam
kromatogram sidik jari dari setiap sampel ini dapat digunakan untuk identifikasi,
diskriminasi, autentikasi kencur dari kunci pepet dan temu kunci (Gambar 3).
Adanya puncak karakteristik dari setiap spesies sangat membantu dalam
pendeteksian jika terjadi adulterasi kencur oleh kunci pepet dan temu kunci. Jika
kencur teradulterasi oleh kunci pepet dan temu kunci dengan konsentrasi 5, 25,
dan 50%, kromatogram sidik jari dapat membedakan kencur tunggal dari kencur
yang tercampur dengan kunci pepet dan temu kunci. Adanya puncak karakteristik
dari kunci pepet dan temu kunci memberikan perbedaan pada kromatogram sidik
jari yang diperoleh (Gambar 4). Konsentrasi adulteran (kunci pepet dan temu
8
kunci) menyebabkan perubahan yang signifikan pada kromatogram kencur
(Gambar 4a). Intensitas puncak mayor dari kencur menurun secara linear
sedangkan intensitas puncak mayor dan kunci pepet meningkat linear dengan
meningkatnya konsentrasi adulteran (Gambar 4b & 4c). Berdasarkan hasil yang
diperoleh, identifikasi dan autentikasi kencur dari kunci pepet dan temu kunci
telah diperoleh menggunakan analisis sidik jari KCKT.
a
b
c
Waktu (menit)
Gambar 4 Kromatogram kencur 100%, kencur-temu kunci, dan kencur-kunci
pepet (a), campuran kencur-temu kunci (b), dan campuran kencurkunci pepet (c). Sampel: kencur 100% (a1, b1, & c1), kencur-temu
kunci 5% (a2 & b2), 25% (a3 & b3), 50% (a4 & b4), temu kunci
100% (a5 & b5), kencur-kunci pepet 5% (a6 & c2), 25% (a7 & c3),
50% (a8 & c4), dan kunci pepet 100% (a9 & c5)
Identifikasi dan Autentikasi Kencur dari Kunci Pepet dan Temu Kunci
Menggunakan Kombinasi Sidik Jari KCKT dan Kemometrika
Kombinasi sidik jari KCKT dan kemometrika dalam hal ini analisis
multivariat digunakan untuk mengonfirmasi hasil yang diperoleh untuk
identifikasi dan autentikasi kencur dari kunci pepet dan temu kunci dari
pengamatan kromatogram sidik jari yang khas. Kombinasi ini merupakan metode
yang paling sering digunakan untuk identifikasi, autentikasi, dan autentikasi
spesies tanaman obat. Teknik analisis multivariat yang digunakan dalam
9
penelitian ini adalah analisis komponen utama (AKU) dan analisis diskriminan
(AD).
Pada analisis multivariat, AKU merupakan contoh pengenalan pola tidak
terawasi dan merupakan metode yang paling sering digunakan untuk mereduksi
data. AKU dapat mereduksi jumlah variabel dan akan memberikan informasi baru
setelah reduksi dari set data. Hasil dari analisis AKU ialah variabel baru yang
disebut komponen utama (KU) dari transformasi data aslinya. Umumnya, dua
KU sering digunakan untuk membuat plot AKU karena KU tersebut memberikan
variasi data paling besar. Kemiripan obyek dan kecenderungan pengelompokan
ditunjukkan dalam plot AKU.
Pada penelitian ini, AKU digunakan untuk identifikasi dan autentikasi
seluruh sampel berdasarkan luas puncak dari 19 puncak mayor. AKU dilakukan
pada 33 obyek × 19 matriks data. Gambar 5b menunjukkan plot AKU dengan 2
KU pertama, keragaman total dari campuran sampel yang dihasilkan sebesar
64.80% (KU1 = 30.06% dan KU2 = 34.74%). Berdasarkan plot AKU, sampel
kencur, temu kunci, dan kunci pepet dapat dikelompokkan menjadi 3 kelompok
berbeda (Gambar 5a & 5b). Hal yang sama untuk autentikasi kencur jika
teradulterasi dengan temu kunci, semua campuran sampel dapat dibedakan dengan
baik (Gambar 5b). Namun, pada campuran kencur-temu kunci 5% terlihat bahwa
jarak antara campuran tersebut dengan kencur 100% sangat dekat. Metode AKU
juga tidak dapat membedakan campuran kencur dan kunci pepet dengan baik. Hal
ini karena luas puncak mayor kunci pepet tunggal sangat kecil dibandingkan luas
puncak mayor kencur (Gambar 3a dan 3c). Oleh karena itu, AKU dapat
mendiskriminasikan ketiga spesies namun tidak berhasil dalam autentikasi kencur
khususnya jika kencur teradulterasi oleh kunci pepet.
AD merupakan teknik pengenalan pola lainnya yang sangat baik dan umum
digunakan untuk diskriminasi tumbuhan yang berkerabat dekat. Metode ini akan
membentuk suatu fungsi diskriminan (FD) untuk setiap kelompok dengan mencari
kombinasi linear dari data yang akan memberikan pemisahan dari dua atau lebih
kelompok observasi. Pada penelitian ini, model prediksi AD digunakan untuk
memperoleh diskriminasi yang jelas antara ketiga sampel dan autentikasi kencur
dari kunci pepet dan temu kunci. Model ini juga menggunakan 19 puncak mayor
sebagai variabel. Keragaman total yang diperoleh sebesar 98.91% (F1 = 94.59%
dan F2 = 3.32%). Gambar 5c dan 5d menunjukkan bahwa AD telah dapat
mengelompokkan ketiga spesies tunggal serta campuran kencur-temu kunci dan
kencur-kunci pepet pada semua konsentrasi yang digunakan pada penelitian ini.
Namun, kencur-kunci pepet 5% memiliki perbedaan yang kecil dengan kencur
100%. Hal ini karena luas puncak mayor kunci pepet tunggal sangat kecil
(Gambar 3a dan 3c). Luas puncak kunci pepet yang sangat kecil ini membuat
perubahan komposisi kunci pepet 5% tidak memberikan perbedaan signifikan
pada komposisi senyawa adulteran dalam campuran (Gambar 4c1 & 4c2).
10
Gambar 5 Plot AKU kencur, temu kunci, dan kunci pepet 100% (a), plot AKU
100% sampel dan campuran sampel (b); plot AD sampel 100% (c) dan
plot AD100% sampel dan campuran sampel
Berdasarkan analisis sidik jari kromatogram dan pola pengelompokkan
analisis multivariat ketiga sampel, dapat teramati bahwa pola sampel kencur lebih
dekat dengan kunci pepet daripada temu kunci. Hal ini sesuai dengan pohon
filogenik genus Kaempferia yang telah dibuat oleh Techaprasan et al. (2010)
berdasarkan kloroplas sekuens DNA (Lampiran 3).
Validasi model AD dengan jumlah sampel sedikit umumnya dilakukan
dengan teknik validasi silang. Kemampuan prediksi model telah diuji dengan
menggunakan validasi leave-one-out cross (LOOCV). LOOCV merupakan
pendekatan yang paling umum dengan mengeluarkan satu sampel pada suatu
waktu. Prosedur ini diulang sampai semua objek telah dikeluarkan secara bergilir.
LOOCV terklasifikasi sangat baik pada 100% sampel yang digunakan dalam
penelitian ini. Hasil ini menunjukkan bahwa model memberikan prediksi
klasifikasi yang sangat memuaskan untuk sampel uji.
11
4 SIMPULAN DAN SARAN
Simpulan
Identifikasi dan autentikasi kencur dari kunci pepet dan temu kunci telah
dilakukan dengan metode sidik jari KCKT. Autentikasi kencur dari kunci pepet
dan temu kunci dilakukan dengan pengamatan puncak karakteristik dari
kromatogram sidik jari pada setiap sampel yang digunakan serta kombinasi
dengan kemometrika (AD). Metode yang dikembangkan ini menghasilkan metode
yang dapat dipercaya dan efisien untuk identifikasi dan autentikasi kencur dari
kunci pepet dan temu kunci.
Saran
Identifikasi puncak karakteristik dari kencur, kunci pepet, dan temu kunci
dengan KC-SM diperlukan. Hal ini bertujuan memberi tambahan informasi
senyawa penciri pada setiap sampel dan lebih memudahkan dalam autentikasi
kencur terhadap spesies yang berkerabat dekat.
DAFTAR PUSTAKA
Dejaegher B, Alaerts G, Matthijs N. 2010. Methodology to Develop Liquid
Chromatographic Fingerprints for the Quality Control of Herbal Medicines.
Acta Chromatogr. 22(2):237–258.doi:10.1556/AChrom.22.2010.2.7.
Lakshmanan D, Werngren J, Jose L, Suja KP, Nair MS, Varma RL, Mundayoor S,
Hoffner S, Kumar RA. 2011. Ethyl p-methoxycinnamate isolated from a
traditional anti-tuberculosis medicinal herb inhibits drug resistant strains of
Mycobacterium
tuberculosis
in
vitro.
Fitoterapia
82:757–
761.doi:10.1016/j.fitote.2011.03.006.
Li Y, Wu T, Zhu ZH, Wan LL, Yu Q, Li XX, Cheng ZH, Guo C. 2010.
Combinative method using HPLC fingerprint and quantitative analyses
forquality consistency evaluation of an herbal medicinal preparation produced
by different manufacturers. J Pharm Bio Med Anal. 52:597602.doi:10.1016/j.jpba.2010.01.018.
Liang ZY, Xie P, Chan K. 2004. Quality control of herbal medicines. J J Chromb.
812:53-70.doi:10.1016/j.jchromb.2004.08.041.
Mekseepralard C, Kamkaen N, Wilkinson JM. 2010. Antimicrobial and
antioxidant activities of traditional Thai herbal remedies for aphthous ulcers.
Phytother Res. 24:1514–1519.doi:10.1002/ptr.3158.
Rafi M, Wulansari L, Heryanto R, Darusman LK, Lim LW, Takeuchi T. 2015.
Curcuminoid’s Content and Fingerprint Analysis for Authentication and
Discrimination of Curcuma xanthorrhiza from Curcuma longa by HighPerformance Liquid Chromatography-Diode Array Detector. Food Anal
Methods 8(9):2185-2193.doi:10.1007/s12161-015-0110-1.
12
Rafi M, Lim LW, Takeuchi T, Darusman LK. 2013. Capillary liquid
chromatographic fingerprint used for discrimination of Zingiber montanum
from related species. Anal Bioanal Chem. 405:6599-5503.doi: 10.1007/s00216013-7083-y.
Ridtitid W, Sae-Wong C, Reanmongkol W, Wongnawa M. 2008. Antinociceptive
activity of the methanolic extract of Kaempferia galanga Linn. in experimental
animals. J Ethnopharmacol.118:225–230.doi:10.1016/j.jep.2008.04.002.
Roemantyo HS, Soekarman. 1996. Sekilas pemanfaatan kencur pada jamu
kemasan (jamu products containing Kaempferia galanga L.). Warta Tumbuhan
Obat Indonesia [internet].[diunduh 2013 Okt 26];3(2): 15-16. Tersedia pada:
http//ejournal.litbang.depkes.go.id/index.php/wtoi/article/view/2780.
Sutthanont N, Choochote W, Tuetun B, Junkum A, Jitpakdi A, Chaithong U,
Riyong D, Pitasawat B. 2010. Chemical composition and larvicidal activity of
edible plant-derived essential oils against the pyrethroid-susceptible and resistant strains of Aedes aegypti (Diptera: Culicidae). J Vector Ecol. 35:106–
115.doi:10.1111/j/1948-7134.2010.00036.x.
Taverniers I, De Loose M, Van Bockstaele E. 2004. Trends in quality in the
analytical laboratory. II. Analytical method validation and quality assurance.
Trends Anal Chem. 23 (8):535-552.doi:10.1016/j.trac.2004.04.001.
Techaprasan J, Klinbunga S, Ngamriabsakul C, Jenjittikul T. 2010. Genetic
variation of Kaempferia (Zingiberaceae) in Thailand based on chloroplast
DNA (psbA-trnH and petA-psbJ) sequences. Genet Mol Res. 9(4):19571973.doi:10.4238/vol9-4gmr873
Tewtrakul S, Subhadhirasakul S. 2007. Anti-Allergic activity of some selected
plants in the Zingiberaceae family. J. Ethnopharmacol. 109:535–
538.doi:10.1016/j.jep.2006.08.010.
Umar MI, Asmawi MZ, Sadikun A, Atangwho IJ, Yam MF, Altaf R, Ahmed A.
2012. Bioactivity-guided isolation of ethyl-p-methoxycinnamate, an antiinflammatory constituent, from Kaempferia galanga L. extracts. Molecules 17:
8720-8734.doi:10.3390/molecules17078720.
Wang L, Wang X, Kong L. 2012. Automatic authentication and distinction of
Epimedium koreanum and Epimedium wushanense with HPLC fingerprint
analysis assisted by pattern recognition techniques. Biochem. Sys. Eco. 40:138145.doi:10.1016/j.bse.2011.10.014.
Yang DY, Lee SW, Kim YO, Sohn S, Kim YC, Hyun DY, Hong YP, Shin YS.
2013. HPLC-based metabolic profilling and quality control of leaves of
different
Panax
species.
J
Gingseng
Res.
37:248253.doi:10.5142/jgr.2013.37.248.
Zhao Y, Zhang Y, Lin R, Sun W. 2009. An expeditious HPLC method to
distinguish Aconitum kusnezoffi from related species. Fitoterapia 80:333338.doi:10.1016/j.fitote.2009.04.005.
Zou HB, Yag GS, Du AQ, Yuan JR, Qin ZR, Xia YY, Aboul-Enein HY. 2006.
Combinational numeral fingerprint spectra of Glycyrrhiza and analysis of
common peak ratio invariableness in HPLC. Biomed Chromatogr. 20:642655.doi:10.1002/bmc.639.
13
Lampiran 1 Hasil identifikasi/determinasi tumbuhan
Keterangan: sampel no. 9 & 10 tidak digunakan
14
Lampiran 2 Kisaran waktu retensi relatif (RRT) dan luas puncak relatif (RPA) dari sampel
15
Lampiran 3 Pohon filogenik genus Kaempferia berdasarkan kloroplas sekuens
DNA (Techaprasan et al. 2010)
K. galanga
K. rotunda
K. pandurata
16
RIWAYAT HIDUP
Penulis dilahirkan di Jakarta pada tanggal 8 September 1990 sebagai anak
sulung dari pasangan Muji Waluyo dan Rachmawati. Pendidikan Sarjana
ditempuh di Program Studi Kimia, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan
Alam IPB, lulus pada tahun 2012. Kesempatan untuk melanjutkan ke program
magister di Program Studi Kimia pada Program Pascasarjana IPB diperoleh pada
tahun 2012. Beasiswa pendidikan pascasarjana diperoleh pada tahun 2013 dari
program Fresh graduate Direktorat Jenderal Pendidikan Tinggi Republik
Indonesia.
Penulis bekerja paruh waktu sebagai pengajar bidang studi kimia SMA di
bimbingan belajar Nurul Fikri di Bogor sejak tahun 2012. Penulis juga aktif
menjadi asisten praktikum di laboratorium kimia IPB saat pendidikan sarjana serta
pernah menjadi penanggung jawab praktikum di laboratorium kimia IPB saat
pendidikan magister.
Saat mengikuti program sarjana, penulis pernah menjadi pemakalah poster
pada seminar nasional tanaman obat “POKJANAS TOI XLII” di Universitas
Jenderal Achmad Yani (UNJANI), Cimahi, Bandung pada tahun 2012. Selama
mengikuti program S-2, penulis berperan aktif dalam seminar internasional
temulawak (IST3) yang diselenggarakan oleh Pusat Studi Biofarmaka IPB tahun
2015 sebagai penyaji poster. Artikel yang berjudul “HPLC Fingerprint Analysis
Combined with Chemometrics for Authentication of Kaempferia galanga from
Related Species” sedang dalam proses review pada jurnal Indonesian Journal of
Chemistry. Karya ilmiah tersebut merupakan bagian dari program S-2 penulis.