Uji kualitatif secara Kromatografi Lapis Tipis

2. Uji kualitatif secara Kromatografi Lapis Tipis

Identifikasi kualitatif ekstrak etanol umbi binahong dilakukan dengan menggunakan Kromatografi Lapis Tipis KLT. Analisis dengan KLT mempunyai beberapa keuntungan yaitu penanganannya sederhana, selain itu cuplikan dan pelarut yang digunakan sedikit. a. Uji KLT flavonoid Fase diam yang digunakan yaitu selulosa gel dan fase gerak yang digunakan adalah butanol: asam asetat : air 4:1:5. Selulosa digunakan sebagai fase diam, karena jika digunakan silika gel, maka akan terbentuk kompleks khelat antara salah satu gugus yang terdapat pada flavonoid dengan gypsum CaSO 4 . Kompleks khelat yang terjadi tersebut terikat kuat pada fase diam jadi dapat menyebabkan tidak terjadinya elusi. Reaksinya adalah sebagai berikut: HO OH O O O gula OH OH 2 CaSO 4 o O O gula O O o o Ca Ca Gambar 4. Reaksi flavonoid dengan CaSO 4 membentuk kompleks khelat Pembanding yang digunakan adalah rutin. Penotolan bercak dan pembanding pada fase diam dilakukan dengan mikropipet 5µl. Sampel dan pembanding ditotolkan pada lempeng KLT kemudian dielusi pada batas tertentu 10 cm. Elusi dilakukan sepanjang 10 cm di dalam bejana yang sudah jenuh. Bejana yang berisi larutan pengembang harus dijenuhkan terlebih dahulu agar proses elusi dapat berlangsung dengan baik. Selain itu juga untuk menghindari terjadinya pengekoran pada bercak. Tabel III. Nilai Rf dan warna bercak pada uji KLT dengan fase diam silika gel GF 254 dan fase gerak butanol: asam asetat glacial: air 4:1:5 dan pembanding rutin 0,05 untuk analisis flavonoid. Deteksi UV 254 UV 365 Uap amoniak Bercak No Rf Warna Rf Warna Rf Warna Sample 1 0, 23 Kuning - - 0, 23 Kuning 2 0, 80 Kuning 0, 80 Ungu tua 0, 80 Kuning Pembanding 1 0, 64 Kuning 0,64 Ungu tua 0, 64 Kuning Dilihat dari hasil yang dapat dilihat dari tabel, maka dapat disimpulkan sampel mengandung flavonoid. Hal ini terbukti dengan adanya bercak dengan warna bercak yang mirip antara sampel no 2 dengan bercak pembanding. Jika dilihat dari Rf nya, kemungkinan yang terjadi adalah flavonoid yang terdapat pada sampel berbeda dengan pembanding. Flavonoid mempunyai gugus auksokrom OH yang terikat pada atom karbon 4’ pada cincin B. Selain itu flavonoid juga mempunyai gugus O yang bersifat elektrofil senang menarik elektron. Dengan adanya basa NH 3 , OH akan mudah melepaskan H yang kemudian diikat oleh NH 3 , setelah itu terjadi reaksi penyusunan kembali untuk menstabilkan struktur. Penyusunan kembali ini menyebabkan O akan memiliki pasangan elektron tambahan. Dengan adanya tambahan elektron tersebut, maka energi yang diperlukan untuk mempromosikan elektronnya semakin kecil, sehingga akan terjadi pergeseran panjang gelombang menuju panjang gelombang yang lebih besar. PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI Reaksinya sebagai berikut: O O OH O gula HO OH OH NH 3 O o O OH HO OH O gula NH 4 + Gambar 5. Reaksi antara flavonoid dengan NH 3 Warna kuning yang terjadi, dapat dengan cepat hilang karena di udara terdapat banyak uap air H-OH sehingga H dari uap air akan berikatan dengan O yang kelebihan elektron, sehingga struktur senyawa tersebut akan kembali seperti semula. Oleh karena itu warna yang terbentuk merupakan warna yang reversibel. b. Uji KLT alkaloid Fase diam yang digunakan yaitu silika gel GF 254 . Silika gel GF 254 merupakan fase diam yang bersifat polar. Silika gel merupakan adsorben yang paling banyak digunakan dalam Kromatografi Lapis Tipis KLT yang berupa silika gel yang dicampur perekat CaSO 4 dan indikator floresensi. Sedangkan fase gerak yang digunakan adalah etil asetat : metanol : air 70:20:10. Sebagai pembanding digunakan skopolamin. Skopolamin merupakan alkaloid tropan. Sampel dan pembanding ditotolkan bersama- sama pada lempeng KLT, kemudian dielusi pada batas tertentu 10 cm. Setelah itu dideteksi dibawah sinar UV 254 nm dan UV 365 nm, kemudian dideteksi dengan pereaksi semprot Dragendorf. Tabel IV. Nilai Rf dan warna bercak pada uji KLT dengan fase diam silika gel GF 254, fase gerak etil asetat : methanol : air 70:20:10dan pembanding skopolamin untuk analisis alkaloid. Deteksi UV 254 UV 365 Dragendorf Bercak No Rf Warna Rf Warna Rf Warna Sampel 1 0, 07 Ungu 0, 07 Ungu - - 2 0, 25 Meredam ungu 0, 25 Ungu - - 3 0, 53 Meredam ungu - - - - Pembanding 1 0, 52 Meredam ungu - - 0, 52 Orange Dari hasil tersebut dapat diketahui bahwa sampel tidak mengandung alkaloid. Hal ini dikarenakan baik warna dan Rf sampel tidak ada yang menyerupai warna dan Rf dari pembanding. Sampel mempunyai tiga bercak yang terlihat di bawah lampu UV 254 yaitu dengan Rf 0,07 bercak berwarna ungu, Rf 0,25 bercak berwarna ungu dan meredam flouroresensi dari silika, dan terakhir Rf 0,53 juga meredam flouroresensi berwarna ungu. Di bawah lampu UV 365 , hanya terlihat dua bercak sampel yaitu bercak Rf 0,70 yang berwarna ungu dan bercak Rf 0,25 berwarna ungu. Ketika di semprot dengan pereaksi Dragendorf, tidak terlihat bercak. Sedangkan pembanding, hanya tampak satu bercak dengan Rf 0,52 berwarna ungu dan meredam flouresensi pada UV 254, dan akan nampak warna orange ketika disemprot dengan pereaksi Dragendorf. Hal ini menggambarkan beberapa senyawa organik non nitrogen berikatan secara konjugasi dengan keton atau aldehid atau gugus lakton akan berekasi secara khusus dengan alkaloid. PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI Pada uji tabung yang sudah dilakukan, diperoleh hasil positif untuk uji alkaloid padahal setelah di uji dengan KLT, ternyata hasilnya negatif. Kemungkinan besar hal ini disebabkan karena alkaloid yang terdapat dalam ekstrak etanol umbi binahong tersebut merupakan alkaloid yang berada dalam bentuk basa. Alkaloid dalam bentuk basa akan larut pada pelarut yang non polar dan etanol kurang polar untuk dapat menyari alkaloid dengan baik. c. Uji KLT senyawa fenolik. Fase diam yang digunakan adalah silika gel GF 254 dan fase gerak yang digunakan adalah toluene: etil asetat: metanol 70:20:10. Pembanding yang digunakan yaitu eugenol 1. Sampel dan pembanding ditotolkan pada lempeng KLT, kemudian dielusi pada batas tertentu 10 cm dan dikeringkan. Tabel V. Nilai Rf dan warna bercak pada uji KLT dengan fase diam silika gel GF 254, fase gerak toluen, etil asetat, metanol 70:20:10 dan pembanding eugenol untuk analisis senyawa fenolik Deteksi UV 254 UV 365 FeCl 3 Bercak No Rf Warna Rf Warna Rf Warna Sampel 1 0, 04 Ungu muda - - - - 2 0, 73 Ungu - - 0, 73 Ungu Pembanding 1 0, 73 Ungu - - 0, 73 Ungu Dari hasil yang terlihat pada tabel tersebut, dapat disimpulkan bahwa sampel mengandung senyawa fenolik. Hal ini terbukti dengan adanya Rf sampel yang mendekati Rf pembanding yaitu 0,73. Selain itu warna dari sampel dan pembandingnya juga sama. PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI Hasil positif tersebut, dipertegas dengan terbentuknya warna ungu pada bercak yang disemprot dengan FeCl 3 . warna tersebut terjadi karena reaksi antara senyawa fenolik dengan FeCl 3 . d. Uji tanin Uji KLT tanin menggunakan fase diam silika gel GF 254 dan fase gerak etil asetat : metanol : air 100 : 13,5 : 10. Sampel dan pembanding yang berupa asam tanat 1 ditotolkan pada lempeng KLT kemudian dielusi pada batas tertentu 10 cm. Setelah itu dideteksi dengan UV 254 nm, UV 365 nm dan FeCl 3 Tabel VI. Nilai Rf dan warna bercak pada uji KLT dengan fase diam silika gel GF 254, fase gerak etil asetat : metanol : air 100 : 13,5 : 10dan pembanding asam tanat untuk analisis tanin. Deteksi UV 254 UV 365 FeCl 3 Bercak No Rf Warna Rf Warna Rf Warna Sample 1 0,48 ungu 0,48 ungu 0, 48 ungu Pembanding 1 0,50 ungu 0,50 ungu 0, 50 ungu Dari hasil yang terlihat, dapat disimpulkan sampel mengandung tanin. Hasil positif tersebut ditunjukkan dengan adanya perubahan warna bercak ketika disemprot dengan FeCl 3 . Hal ini terjadi karena adanya reaksi antara FeCl 3 dengan gugus fenolik yang terdapat pada tanin. Perbedaan nilai Rf diduga karena adanya perbedaan jenis dari tanin. e. Uji KLT saponin Fase diam yang digunakan adalah silika gel GF 254 dan fase gerak yang digunakan adalah toluen : etil asetat 93:7 yang bersifat lebih non polar dibandingkan dengan silika. Dengan perbedaan kepolaran dari fase PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI diam dan fase gerak ini, diharapkan senyawa uji dapat terelusi dengan baik. Saponin merupakan senyawa yang bersifat polar dalam bentuk glikosida, sedangkan dalam bentuk aglikonya saponin semipolar dengan demikian akan terikat dengan fase geraknya. Pembanding yang digunakan adalah Glycyrrhiza Radix 1 . Setelah proses elusi, langkah selanjutnya adalah deteksi dengan menggunakan lampu UV 254 , lampu UV 365 dan anisaldehid-asam sulfat. Hasilnya adalah sebagai berikut: Tabel VII. Nilai Rf dan warna bercak pada uji KLT dengan fase diam silika gel GF 254, fase gerak toluen : etil asetat 93:7 dan pembanding Glycyrrhiza Radix untuk analisis saponin. Deteksi UV 254 UV 365 Vanilin asam sulfat Bercak No Rf Warna Rf Warna Rf Warna Sample 1 0, 02 Meredam - - 0, 02 Ungu muda 2 0,14 Meredam 0,14 Berfloresensi ungu 0,14 Ungu Pembanding 1 0,01 Meredam 0, 01 Berfloresensi Ungu 0, 01 Orange 2 0,05 Meredam 0, 05 Berfloresensi Ungu 0, 05 Merah 3 0,13 Meredam 0,13 Berfloresensi ungu 0,13 Ungu 4 - - 0, 20 Berfloresensi kuning - - Dari hasil yang diperoleh, maka dapat disimpulkan bahwa sampel mengandung saponin. Warna dari bercak sampel sama dengan warna bercak pembanding. Namun ada sedikit perbedaan pada harga Rfsampel dan pembanding. Rf sampel 0,14 sedangkan Rf pembanding 0,13. Hal ini dimungkinkan sampel dan pembanding mengandung senyawa yang sama namun beda golongannya. Secara keseluruhan perbedaan nilai Rf disebabkan karena adanya perbedaan kepolaran dari senyawa-senyawa yang terkandung dalam sampel. Sehingga terdapat perbedaan afinitas ikatan antara fase gerak dan senyawa yang terkandung dalam sampel. E. Uji potensi antibakteri ekstrak etanol umbi binahong terhadap Staphylococcus aureus ATCC 25923 dan Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 Pengujian potensi antibakteri ekstrak etanol umbi binahong dilakukan dengan metode difusi paperdisk. Dipilih metode ini karena mempunyai keuntungan antara lain secara teknis, metode ini sederhana dan mudah dilakukan, tidak membutuhkan banyak cawan petri dan tidak membutuhkan alat khusus. Selain itu dapat diketahui luas zona hambat senyawa yang diuji terhadap bakteri. Sebelum dilakukan pengujian, bakteri uji yang digunakan yaitu Staphylococcus aureus ATCC 25923 dan Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853, dibuat suspensi yang kemudian disetarakan terlebih dahulu dengan Mc. Farland II yang mempunyai kekeruhan 6x10 8 CFUml. Penyetaraan ini PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI berfungsi untuk reprodusibilitas percobaan. Sehingga apabila dilakukan replikasi dalam percobaan, dapat diasumsikan jumlah bakteri per satuan yang digunakan selalu sama. Setelah disetarakan dengan standard Mc. Farland II, bakteri uji dibiakkan secara spread plate yaitu dengan cara bakteri disebar di permukaan media NA yang sudah memadat. Pembiakan bakteri ini disesuaikan dengan sifat Staphylococcus aureus dan Pseudomonas aeruginosa yang merupakan bakteri fakultatif aerob, dimana dalam pertumbuhannya, dibutuhkan ketersediaan oksigen yang cukup. Selain itu, disesuaikan pula dengan kondisi percobaan yang sesungguhnya, dimana infeksi pada luka biasa terjadi di permukaan kulit yang ketersediaan oksigennya cukup. Paperdisk yang digunakan mempunyai diameter 6 mm. Pada tiap paperdisk diteteskan ekstrak etanol umbi binahong dengan empat konsentrasi yang berbeda, kontrol positif, dan kontrol negatif. Konsentrasi ekstrak etanol yang digunakan yaitu 25, 50, 75, 100, sedangkan kontrol positifnya amoksisilin 0,03 gml, dan kontrol negatif yang digunakan yaitu DMSO yang merupakan pelarut ekstrak etanol. Amoksisilin merupakan suatu antibiotik golongan beta laktam derifat penisilin dengan spektrum luas. Amoksisilin mempunyai aktivitas bakterisida terhadap bakteri gram positif maupun gram negatif dengan mekanisme menghambat pembentukan atau sintesis dinding sel mikroba Surini, 2006. DMSO merupakan pelarut yang bersifat nonpolar tetapi diindikasikan tidak mempunyai daya hambat terhadap pertumbuhan bakteri. PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI Dengan menggunakan paperdisk, maka senyawa uji akan berdifusi ke dalam media dan menghambat pertumbuhan dan bahkan membunuh bakteri uji. Penghambatan pertumbuhan bakteri uji ini dapat dilihat dari zona hambat yang terbentuk setelah inkubasi selama 24 jam. Setelah diinkubasi selama 24 jam, hasil yang diperoleh untuk uji terhadap Staphylococcus aureus ATCC 25923 yaitu kontrol negatif tidak menunjukkan zona hambat, kontrol positif menunjukkan adanya zona jernih disekitar paper disk dengan rata-rata diameternya dari tiga replikasi yaitu 3,1 cm sedangkan semua variasi konsentrasi ekstrak tidak menunjukkan adanya zona hambat. Hal ini berarti tidak menunjukkan adanya penghambatan terhadap pertumbuhan bakteri uji yaitu Staphylococcus aureus ATCC 25923. Dalam penelitian ini ekstrak tersebut tidak menunjukkan potensi. Table VIII. Diameter zona hambat ekstrak etanol umbi binahong terhadap Staphylococcus aureus ATCC 25923 Diameter zona hambat cm Senyawa Replikasi I Replikasi II Replikasi III Amoxisilin 3,00 3,25 3,00 DMSO - - - Konsentrasi 100 - - - Konsentrasi 75 - - - Konsentrasi 50 - - - Konsentrasi 25 - - - Begitu pula pada uji terhadap bakteri uji Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853. kontrol negatif tidak menunjukkan zona hambat, kontrol positif menunjukkan adanya zona jernih disekitar paper disk dengan rata-rata PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI diameter pada replikasi yaitu 2,2 cm sedangkan semua variasi konsentrasi ekstrak tidak menunjukkan adanya zona hambat. Table IX. Diameter zona hambat ekstrak etanol umbi binahong terhadap Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 Diameter zona hambat cm Senyawa Replikasi I Replikasi II Replikasi III Amoxisilin 2,20 2,30 2,20 DMSO - - - Konsentrasi 100 - - - Konsentrasi 75 - - - Konsentrasi 50 - - - Konsentrasi 25 - - - Hal ini berarti ekstrak etanol umbi binahong tidak menunjukkan adanya penghambatan terhadap pertumbuhan bakteri uji yaitu Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853. Dalam penelitian ini ekstrak tersebut tidak berpotensi untuk dikembangkan menjadi antibakteri. Dari uji difusi yang dilakukan, dapat diketahui pula bahwa kedua bakteri baik Staphylococcus aureus maupun Pseudomonas aeruginosa tidak resisten terhadap amoksisilin. Menurut Anonim 1993, untuk masing-masing antibiotik dan jenis bakterinya, mempunyai diameter yang berbeda-beda, untuk dinilai sebagai antibiotik yang sensitif poten dalam terapi. Amoksisilin dinyatakan sensitif bila diameter zona hambat terhadap Staphylococcus aureus yang terbentuk yaitu lebih dari 2,9 cm sedangkan terhadap Pseudomonas aeruginosa, zona hambat yang terbentuk sebesar 1,5 cm lebih. Dalam penelitian ini diameter zona hambat terhadap Staphylococcus aureus adalah 3,1 cm sedangkan pada Pseudomonas aeruginosa sebesar 2,2 cm. Jika ditinjau ulang pada uji KLT, diketahui bahwa ekstrak etanol umbi binahong mengandung senyawa flavonoid, fenolik, tanin, dan saponin yang merupakan senyawa antibakteri. Namun ketika diuji, ternyata ekstrak etanol tersebut tidak mempunyai potensi untuk menghambat pertumbuhan bakteri uji. Ekstrak etanol umbi binahong itu sendiri berukuran yang besar. Hal ini akan menyulitkan senyawa uji untuk dapat masuk ke dalam sel bakteri tersebut, sehingga tidak mampu untuk menghambat pertumbuhan bakteri. PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

BAB V KESIMPULAN DAN SARAN