Ovine Pregnancy Associated Glycoprotein (ovPAG) as a marker of pregnancy on Garut Sheep

OVINE PREGNANCY-ASSOCIATED GLYCOPROTEIN
(ovPAG) SEBAGAI PENANDA KEBUNTINGAN PADA
DOMBA GARUT

ENNY TANTINI SETIATIN

SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2010

PERNYATAAN MENGENAI DISERTASI
DAN SUMBER INFORMASI

Dengan ini saya menyatakan bahwa disertasi Ovine PregnancyAssociated Glycoprotein (ovPAG) sebagai Penanda Kebuntingan pada Domba
Garut adalah karya saya dengan arahan dari komisi pembimbing dan belum
diajukan dalam bentuk apapun kepada perguruan tinggi manapun. Sumber
informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan maupun tidak
diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam
Daftar Pustaka di setiap akhir bab dalam disertasi ini

Bogor, Maret 2010

Enny Tantini Setiatin
NIM B061040011

ABSTRACT
ENNY TANTINI SETIATIN. Ovine Pregnancy-Associated Glycoprotein
(ovPAG) as a Marker of Pregnancy on Garut Sheep. Under direction of DONDIN
SAJUTHI, BAMBANG PURWANTARA, and CHALID TALIB.
Pregnancy-Associated Glycoprotein (PAG) structurally related to aspartic
proteinase, expressed in the outer epithelial cell layer (trophectoderm) of ungulate
placenta. Ovine PAG synthesized by mono- and binucleic trophoblast before
complete implantation at day 14-15. Of this, ovPAG could be used as a marker for
early pregnancy and foetal wellbeing. The research was started with extraction
and isolation of PAG from placenta of garut sheep collected at parturation and to
characterize their molecular weight. The procedures included extraction of protein
at neutral pH (cotyledon was thawed, minced, added PBS, blended and
centrifuged), acidic (H3PO41M, pH 4,5; centrifuged) and ammonium sulfate
(40% and 80% (NH4)SO4, centrifuged) precipitation ; gel filtration (SephadexG75), anion exchanged chromatography (DEAE- cellulose). Cotyledone’s extract
was subjected to Sephadex-G75 and DEAE cellulose, and their fractions were

measured their absorbances. Sephadex-G75 and DEAE fractions at peak
absorbances were assayed for protein concentration (Bichinconinic protein assay).
Continuously, these fractions were subjected to monogel SDS-PAGE and stained
by Commassie Brilliant Blue. Then, isolate was used to produce polyclonal
antibody ( rabbit anti-ovPAG). Polyclonal antibody production was carried out in
accordance with Animal Care and Use Committee of PT Indoanilab No: 03-IAth
ACUC-08, 15 Nopember 2008. Rabbit anti-ovPAG DN32 gave the best
immune response using Modified ELISA technique also could differenciate
ovPAG in the urine of pregnant and non pregnant ewes using Western Blot
Technique. Simultaneously, modified ELISA was developed started by producing
ovine PAG standard, carried out by developing serial dilution at concentration
0,344; 0,172; 0,0688; 0,0344 and 0,0172 ng/ml, continued with intra- and interassay validation. Validation of standard showed coefficient variation intra-assay
on QC-H and QC-L were 9,97 % and 5,87 %, respectively. Moreover, coefficient
variation inter-assay on QC-H and QC-L were 16,95 % and 13,9 %, respectively.
Using Western blot technique, protein at 31 kDa molecular weight appeared in
pregnant’s urine whereas protein around 71 kDa became a common protein.
Modified ELISA technique could differentiate the concentration of ovPAG in
between pregnant and non pregnant urine at 55,56 % of nine ewes.
Key words : Garut sheep, cotyledone, ovine pregnancy-associated glycoprotein
(ovPAG), purification, Rabbit anti-ovPAG

RINGKASAN
ENNY TANTINI SETIATIN. Ovine Pregnancy-Associated Glycoprotein
(ovPAG) sebagai Penanda Kebuntingan pada Domba Garut. Dibimbing oleh
DONDIN SAJUTHI, BAMBANG PURWANTARA, and CHALID TALIB.
Pregnancy-associated glycoprotein (PAG) merupakan famili aspartik
protease, terdapat di dalam sel trofektoderm plasenta ungulata. OvinePAG
disintesa oleh sel mono- dan binukleat trofoblas sesaat menjelang implantasi pada
hari ke 14-15. Oleh karena itu,
PAG digunakan sebagai indikator penanda
kebuntingan dini dan juga kesehatan fetus. Tujuan penelitia ini adalah ekstrasi dan
isolasi ovPAG dalam kotiledon plasenta; memproduksi antibodi poliklonal
(Rabbit anti-ovPAG); mendeterminasi ovPAG dalam urine domba bunting, dan
pembuatan standar ovPAG. Kegiatan penelitian diawali dengan melakukan
ekstraksi dan isolasi PAG dari plasenta domba garut yang dikoleksi pada saat
melahirkan dan mengkarakterisasi PAG berdasarkan berat molekulnya. Pada saat
melahirkan, kotiledon dikoleksi dari plasenta, disimpan pada -200C sampai
seluruh induk domba (n=9 ekor) melahirkan. Selanjutnya kotiledon diekstrak
dengan perlakuan presipitasi asam (H3PO41M, pH 4,5 ; sentrifus) dan garam (40%
(NH4)SO4 dilanjutkan 80% (NH4)SO4, dan disentrifus). Berikutnya dilakukan

isolasi protein melalui gel filtrasi (Sephadex G-75) dan kromatografi pertukaran
anion (DEAE-cellulose). Fraksi yang ditampung diukur absorbansinya, fraksi
yang memiliki absorbansi tinggi, diukur total proteinnya. Kemudian, dimasukkan
dalam monogel SDS-PAGE utuk diukur perkiraan berat molekulnya berdasarkan
pita protein yang muncul setelah diwarnai dengan Commassie Brilliant Blue.
Isolat yang didapat dipergunakan untuk memproduksi antibodi poliklonal (Rabbit
anti-ovPAG) dengan melakukan imunisasi pada kelinci New Zealand White
(n=12 ekor). Pembuatan antibodi poliklonal dilakukan setelah mendapat
persetujuan dari Komisi Pengawasan dan Kesejahteraan dan Penggunaan Hewan
Percobaan (KPK-PHP) PT INDOANILAB No.:03-IA-ACUC 2008, Tanggal 15
Nopember 2008.
Rabbit anti-ovPAG dideterminasi spesifitasnya terhadap
ovPAG dalam urin untuk membedakan domba bunting dan tidak bunting
menggunakan teknik Western Blot dan ELISA. ELISA termodifikasi ,
dikembangkan dengan diawali pembuatan standar ovPAG yang dibuat dengan
melakukan pengenceran pada konsentrasi 0,344; 0,172; 0,0688; 0,0344 dan
0,0172 ng/ml, dilanjutkan dengan menghitung koefisien variasi intra- dan interasai. Kelinci memberikan respon imun terbaik dari DN32 ( Rabbit anti-ovPAG
DN32). Determinasi Rabbit anti-ovPAG DN32 menggunakan teknik Western Blot
terhadap ovPAG dalam urin domba bunting dan tidak bunting. Protein pada berat
molekul 31 kDa merupakan protein spesifik dalam urin domba garut bunting

sedangkan protein pada 71 kDa merupakan protein umum yang ditemukan dalam
urin. Koefisien variasi intra-asai untuk kontrol kualitas konsentrasi tinggi dan
rendah adalah berturut-turut 9,97 % and 5,87 %, sedangkan koefisien variasi
inter asai pada kontrol kualitas konsentrasi tinggi dan rendah adalah 16,95 % dan
13,9 %. Teknik ELISA termodifikasi dapat membedakan konsentrasi ovPAG

dalam urin domba tidak bunting dan bunting sebesar 55,56 % dari sembilan ekor
domba yang diuji.
Kata kunci : Domba garut, kotiledon,
Ovine Pregnancy-Associated
Glycoprotein (ovPAG), purifikasi, Rabbit anti-ovPAG

© Hak Cipta milik IPB, tahun 2010
Hak Cipta dilindungi Undang-Undang

1. Dilarang mengutip sebagian atau seluruh karya tulis ini tanpa
mencantumkan atau menyebutkan sumber
a. Pengutipan

hanya

untuk

kepentingan

pendidikan,

penelitian,

penulisan karya ilmiah, penyusunan laporan, penulisan kritik atau
tinjauan suatu masalah
b. Pengutipan tersebut tidak merugikan kepentingan yang wajar IPB

2. Dilarang mengumumkan dan memperbanyak sebagian atau seluruh karya
tulis dalam bentuk apapun tanpa izin IPB

OVINE PREGNANCY-ASSOCIATED GLYCOPROTEIN
(ovPAG) SEBAGAI PENANDA KEBUNTINGAN PADA
DOMBA GARUT

ENNY TANTINI SETIATIN

Disertasi
Sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
Doktor pada
Program Studi Biologi Reproduksi

SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2010

Penguji Luar Komisi pada

:

Ujian Tertutup

Penguji Luar Komisi pada
Ujian Terbuka

1. Dr. drh. M. Agil, M.Sc.Agr.
2. Dr. drh. Diah Iskandriati

:

1. Ir. Polmer Situmorang, Ph.D.
2. Prof. Dr. drh. Tuty L. Yusuf, M.S.

PRAKATA

Alhamdulillaahirobbil ‘alamiin penulis panjatkan ke hadirat Alloh SWT yang
banyak memberi kenikmatan dan kemudahan lahir maupun batin. Hanya berkat rahmat,
hidayah dan izinNYA, penulis dalam menyelesaikan disertasi dengan judul “Ovine
Pregnancy-Associated Glycoprotein (ovPAG) sebagai Penanda Kebuntingan pada
Domba Garut”. Disertasi ini ditulis untuk memenuhi salah satu persyaratan dalam
memperoleh gelar Doktor pada Sekolah Pascasarjana Institut Pertanian Bogor. Penelitian

dilaksanakan di Laboratorium Lapangan Fakultas Peternakan IPB, Unit
Rehabilitasi Reproduksi dan Laboratorium Terpadu Fakultas Kedokteran Hewan

IPB, Laboratorium Mikrobiologi dan Imunologi PSSP, LPPM-IPB serta PT
Indoanilab Bogor, yang penelitiannya dilaksanakan mulai Oktober 2006 sampai
dengan Oktober 2009.
Disertasi ini memuat satu bab yang merupakan pengembangan dari naskah
artikel yang akan diterbitkan di jurnal ilmiah. Bab 3 berjudul Ekstraksi dan isolasi
ovine pregnancy associated glycoprotein (ovPAG) dari kotiledon plasenta domba
garut pada saat melahirkan sedang menunggu penerbitan di Jurnal Ilmu Ternak
dan Veteriner 14(3):208-215.
Pada kesempatan yang berbahagia ini penulis menyampaikan terimakasih
dan penghargaan yang tak terhingga kepada : Prof. drh. Dondin Sajuthi, M.ST.
Ph.D. selaku Ketua Komisi Pembimbing; Dr. drh. Bambang Purwantara, M.Sc.
dan Dr. Chalid Talib selaku Anggota Komisi Pembimbing atas kesabaran
sumbangan pemikiran; pengarahan; perhatian, dan nasihat mulai dari awal
perencanaan; pelaksanaan penelitian serta selesainya penulisan disertasi ini.
Penulis mendapatkan karunia terindah karena atas izinNYA, Allah berkenan
memberi penulis Para Pembimbing yang tidak hanya membimbing di bidang
keilmuan tetapi juga spiritual dan finansial.
Terima kasih dan penghargaan penulis sampaikan kepada Dr. drh. M.
Agil, M.Sc.Agr. dan Dr.drh. Diah Iskandriati, selaku Penguji Luar pada Ujian
Tertutup serta Ir. Polmer Situmorang, Ph.D. dan Prof.Dr.drh. Tuty L. Yusuf, M.S.

selaku Penguji Luar pada Ujian Terbuka atas segala sumbangan pemikiran;

masukan ; saran,

dan pengarahan sehingga penulisan Disertasi ini menjadi

semakin lengkap dan bermakna.
Selanjutnya terimakasih dan penghargaan penulis sampaikan kepada
Rektor Universitas Diponegoro Semarang (UNDIP); Dekan; Kajur Produksi
Ternak; Kolega di Laboratorium Pemuliaan dan Reproduksi Ternak Fakultas
Peternakan UNDIP yang telah mengizinkan; memberi semangat; mendoakan,
serta memberi bantuan dana penelitian dan penulisan disertasi sehingga penulis
dapat melanjutkan studi lanjut Strata 3. Tak lupa penulis sampaikan terimakasih
kepada Rektor Institut Pertanian Bogor (IPB); Dekan dan Staf Sekolah
Pascasarjana IPB; Dekan Fakultas Kedokteran Hewan IPB; Ketua Program Studi
Biologi Reproduksi beserta dosen;

teknisi dan petugas administrasi, atas

pelayanan yang baik selama penulis mengikuti pendidikan. Ucapan yang sama

penulis sampaikan kepada Pengelola Beasiswa Program Pascasarjana (BPPS)
Dirjen Dikti Depdiknas; Pengelola Penelitian Kerjasama Kemitraaan Penelitian
Pertanian dengan Perguruan Tinggi (KKP3T) TA 2007 dan 2009; Hibah
Penelitian Program Doktor 2009, dan Dana Bantuan Disertasi UNDIP untuk
bantuan

perkuliahan dan penulisan disertasi sehingga disertasi

ini dapat

terselesaikan.
Penghormatan yang sebesar-besarnya penulis sampaikan kepada ibu bapak
tercinta Ibunda Moertati (Almh); Ayahanda N.S. Setiakomara (Alm); Ibunda
Suryati (Almh) dan Ayahanda Adi Siswoyo (Alm); suami Drs. Mulyo Suprapto,
Akt.; anak-anak M. Luthfiadi Setiapratama dan M. Rezky Setiapraptadi, serta
saudara-saudara penulis atas segala kasih sayang; pengertian; doa bantuan
immateriil dan materiil sehingga dapat menyelesaikan pendidikan dengan baik.
Selama

melaksanakan

penelitian

penulis

juga

mendapat

banyak

kemudahan dan kebaikan sehingga penelitian dapat berjalan lancar. Pertama,
penulis menyampaikan terimakasih kepada teman-teman penemu DEEA Gesdect,
Daud Samsudewa, SPt. MS.; Eko Sugiyanto, SPt., dan Akhmad Lukman, SPt.
yang telah memberi inspirasi penulis untuk dapat mencari seri baru dari produk
alat deteksi kebuntingan dini. Penulis ingin menyampaikan terimakasih sebesarbesarnya kepada Dr. Ir. Farida Fathul, M.Sc.; Ir. Umi Adiati; Dr. drh. Amrozi;
Dr. Dra. Iis Arifiantini, M.S. ; Dr. Herdis ; Dr. Rizal ;

Dr. drh. Agus Setiadi ;

Prof. Dr. drh. Arief Boediono ; Bondan; drh. Dedi; Aep; drh. Dani; Keluarga
Bapak Anda; drh. Ajat dan rekan-rekan di “Ternak Domba Sehat” selama
pengerjaan penelitian di lapangan; Dr. drh. Ita Juwita; drh. Wahono Esthi, MS.;
Wahyu; Dr. drh. M. Agil, MSc.Agr.; Dr. drh. Hera Maheswari, MSc.; Dr.drh.
Puji Astuti, MSc.; Dr. drh. Diah Iskandriati; Uus Saefulloh, SSi. M.Biomed.; Dra.
Isti KS; Dra. Maryati, MSi.; Silmi Mariya, SSi.; Rahmita, SKH; drh. Dede; Tri;
Ririn; Iin; Dr. Ir. Nuril Hidayati, MSc.; Willy Praira, SSi., selama pengerjaan
penelitian di laboratorium. Penulis harus menyampaikan terimakasih dan mohon
maaf yang sebesar-besarnya kepada Nani, Wiwid, Ayu, Sri, Dewi, Yanti, Rima
dan Yana yang telah membantu secara administrasi.
Kepada rekan-rekan seperjuangan Dr. Ir. Thomas Mata Hine, M.S.; Ir.
Bayu Rosadi, M.S., dan Ir. Satya Gunawan, M.S. , yang selalu bersama dalam
penyelesaian studi doktor ini. Terima kasih dan maaf penulis sampaikan bagi
teman-teman di Wacana Biologi Reproduksi terutama Raden Harry Murti S.Si.;
drh. Sri, M.S.; dra. Ekayanti, M.Si.; Tatan Kastaman, S.Si.; Ir. Heri Sujoko, M.S.;
Ir. Asri, M.S, dan Ir. Gholib.

Kepada rekan-rekan dari Fakultas Peternakan

UNDIP yang telah memberikan semangat dan doa, Prof. Dr. Ir. Joelal Achmadi,
MSc.; Dr.Ir. Syaiful Anwar, MS.; Ir. Trisetyo Edi, MS. Dr. Ir. Irene Sumeidiana,
MS.; Dr.Ir. Sri Wuwuh, MS.; Dr.Ir. Yon Supri Ondho, MS.; Ir. Barep Sutiyono,
MS.; Dr.Ir. Seno Jauhari, MSc.; Dr.Ir. Edi Kurnianto, MSc.; Dr.Ir. Sutopo, MSc.;
Dr.Ir. Agung Purnomoadi, MSc.; Dr.Ir. Endang Purbowati, MS.; Dr.Ir. Eko
Pangestu, MS.; Ir. Heni Rizki, MS.; Ir. Yani; Ir. Susilo Budiyanto, MS.; Ir.
Mulyono, MS., Ir. Titik Ekowati, MSc.; Dra. Sunarsih, MSi. Rekan-rekan
Genesis, terimakasih dorongan dan doanya. Disertasi ini juga penulis dedikasikan
untuk Ir. Bambang Srigandono, M.Sc. (Alm) dan drh. Rita Miranda, M.Sc.
(Almh) yang telah mendorong penulis untuk melanjutkan studi S3.
Semoga amal kebaikan tersebut diterima dan diridhoi Allah SWT serta
mendapat

balasan dariNYA dengan kebaikan yang berlipatganda. Penulis

menyadari selama berinteraksi dengan rekan-rekan terutama saat menjalankan
penelitian banyak melakukan kesalahan dalam tindakan maupun komunikasi yang
kurang menyenangkan maka penulis mohon maaf lahir dan batin.

Semoga disertasi ini bermanfaat dan semoga Allah SWT senantiasa
memberi rahmat, hidayah dan meridhoi semua amal perbuatan kita. Amiiin.

Bogor, Maret 2010
Enny Tantini Setiatin

RIWAYAT HIDUP
Penulis dilahirkan di Semarang pada 12 September 1961 sebagai anak
keempat dari pasangan Moertati (Almh) dan N.S. Setiakomara (Alm). Menikah
dengan Drs. Mulyo Suprapto, Akt pada 1993 dan dikaruniai dua orang anak
bernama M. Luthfiadi Setiapratama dan M. Rezky Setiapraptadi.
Pendidikan sarjana ditempuh di Fakultas Kedokteran Hewan IPB
diselesaikan pada tahun 1986. Pada tahun 1993, penulis diterima pada program
S2 Animal and Forage Science, Reading University, UK dan lulus pada tahun
1994. Kesempatan untuk melanjutkan program doktor pada program studi Biologi
Reproduksi, Sekolah Pascasarjana IPB diperoleh pada tahun 2004 yang dibiayai
oleh Departemen Pendidikan Nasional melalui Program BPPS.
Sejak 1989, penulis terdaftar sebagai Staf di Laboratorium Pemuliaan dan
Reproduksi Ternak, Jurusan Produksi Ternak Fakultas Perternakan Universitas
Diponegoro sampai saat ini serta staf peneliti Pusat Penelitian Pengembangan
Teknologi, Lembaga Penelitian Universitas Diponegoro sampai tahun 2001. Mata
kuliah yang diajarkan adalah Dasar Reproduksi Ternak, Ilmu Reproduksi Ternak,
Reproduksi dan Inseminasi Buatan, Kesuburan dan Kemajiran Ternak serta
Kesehatan Hewan.
Artikel ilmiah yang berkaitan dengan penelitian disertasi serta
dipublikasikan adalah :
Setiatin ET, Sajuthi D, Purwantara B, Talib C. 2009. Ekstraksi dan isolasi ovine
pregnancy-associated glycoprotein (ovPAG) dari kotiledon plasenta domba garut
pada saat melahirkan. Jurnal Ilmu Ternak Veteriner 14(3): 208-215.

DAFTAR ISI
Halaman
DAFTAR TABEL

xviii

DAFTAR GAMBAR

xix

DAFTAR LAMPIRAN

xxi

DAFTAR SINGKATAN

xxii

PENDAHULUAN ................................................................................

1

Latar Belakang .........................................................................

1

Kerangka Pemikiran .................................................................

2

Tujuan Penelitian .....................................................................

3

Manfaat Penelitian ...................................................................

3

Hipotesis ..................................................................................

4

TINJAUAN PUSTAKA ......................................................................

5

Aktivitas Reproduksi Domba ................................................

5

Siklus Estrus.............................................................................

5

Masa Kebuntingan ................................................................

5

Fertilisasi ..................................................................................

5

Implantasi ................................................................................

6

Penanda Kebuntingan .............................................................

8

Sekresi Plasenta .......................................................................

9

Progesteron ...............................................................................

9

Estrogen ....................................................................................

10

Pregnancy-Associated Glycoprotein (PAG)..............................

11

Mekanisme
Sintesis
Protein
Pregnancy-Associated
Glycoprotein (PAG)...................................................................

12

Isolasi ovPAG ..........................................................................

18

Filtrasi Gel ........................ ........................................................

18

Kromatografi Pertukaran Anion ................................................

18

Elektroforesis Gel pada Monogel Sodium Dedocyl SulfatePolyacrylamid Gel Electroforesis (SDS-PAGE) ......................

20

xv

Halaman
Pewarnaan Commassie Brilliant Blue ......................................

21

Pengukuran Konsentrasi Protein ..............................................

21

Antibodi Poliklonal ..................................................................

22

Determinasi Rabbit anti-ovPAG menggunakan Metode
Western Blot .............................................................................

24

Enzyme Linked Immunosorbent Assay (ELISA) .....................

25

EKSTRAKSI DAN ISOLASI OVINE PREGNANCY ASSOCIATED
GLYCOPROTEIN (ovPAG) DARI KOTILEDON PLASENTA
DOMBA GARUT PADA SAAT MELAHIRKAN ..............................

29

Abstrak .....................................................................................

29

Abstract ....................................................................................

29

Pendahuluan ..............................................................................

30

Metode Penelitian ..................................................................

33

Hasil dan Pembahasan ...............................................................

38

Kesimpulan ...............................................................................

45

Daftar Pustaka ..........................................................................

45

PEMBUATAN POLIKLONAL ANTIBODI RABBIT OVINE
PREGNANCY-ASSOCIATED GLYCOPROTEIN (Rabbit anti-ov PAG)

48

Abstrak .....................................................................................

48

Abstract ....................................................................................

48

Pendahuluan ..............................................................................

49

Metode Penelitian ..................................................................

52

Hasil dan Pembahasan ...............................................................

55

Kesimpulan ...............................................................................

63

Daftar Pustaka ..........................................................................

63

xvi

Halaman
PENGUJIAN OVINE PREGNANCY-ASSOCIATED GLYCOPROTEIN
(ovPAG) MENGGUNAKAN TEKNIK ENZYME LINKED
IMMUNOSORBENT ASSAY (ELISA) TERMODIFIKASI ..............

66

Abstrak .....................................................................................

66

Abstract ....................................................................................

66

Pendahuluan ..............................................................................

67

Metode Penelitian

..................................................................

69

Hasil dan Pembahasan .............................................................

71

Kesimpulan ..............................................................................

74

Daftar Pustaka ..........................................................................

75

PEMBAHASAN UMUM .....................................................................

76

KESIMPULAN DAN SARAN UMUM ...............................................

81

DAFTAR PUSTAKA .............................................................................

82

LAMPIRAN ...........................................................................................

90

xvii

DAFTAR TABEL

Halaman
1 Jumlah Fraksi dan Konsentrasi Protein pada Kolom SephadexG75 dan DEAE-cellulose ...........................................................

41

2 Isolat ovPAG dan Konsentrassinya yang Diimunisasikan pada
Kelinci New Zealand White .......................................................

52

3 Rerata Konsentrasi ovPAG dalam Urin dan Plasma Domba
Bunting dan Tidak Bunting terhadap Uji Antibodi Positif dan
Negatif ......... ..........................................................................

73

4 Konsentrasi ovPAG dalam Urin Domba Garut Tidak Bunting
dan Bunting .................................................................................

73

xviii

DAFTAR GAMBAR

Halaman
1 Alur kerangka pemikiran penelitian ovPAG

4

2 Tahapan awal kebuntingan domba ..............................................

8

3 Pola hormon dalam plasma darah domba ....................................

11

4 Sel binukleat, kontribusinya terhadap plasenta ruminansia yang
definitif dan karakteristik endokrinnya ........................................

13

5 Konsentrasi rata-rata ovPAG dalam plasma (± SEM) selama
kebuntingan
dan postpartum pada domba (A) Churra dan
(B) Merino ....................................................................................

15

6 Diagram ekspresi ovPAG sepanjang usia kebuntingan ...............

17

7 Proses Filtrasi Gel ........................................................................

19

8 Proses Kromatografi Pertukaran Anion .......................................

19

9 Perbedaan respon primer dan sekunder antigen yang disuntikan

24

10 Prosedur Metode Western Blot ....................................................

25

11 Alur kerangka pemikiran penelitian ekstraksi dan isolasi
ovPAG............................................................................................

32

12 Tipe plasenta sinepiteliochorion pada domba .............................

34

13 Proses Pembuatan Monogel SDS-PAGE ....................................

37

14 Kemiringan persamaan linear perhitungan migrasi relatif untuk
menentukan berat molekul protein ovine pregnancy-associated
glycoprotein (ovPAG) ................................................................

39

15 Pita protein dari isolat hasil ekstraksi kotiledon yang terpapar
pada monogel SDS-PAGE dengan pewarnaan Commassie
Brilliant Blue ...............................................................................

40

16 Absorbansi protein dalam fraksi dari kolom Sephadex-G75
(NH4HCO3) dan DEAE-cellulose (Tris-HCl 0,01 M, NaCl
20,40,80,160,320 mM dan 1M) ...................................................

42

17 Pita protein fraksi hasil filtrasi gel Sephadex-G75 .......................

44

xix

Halaman
18 Pita protein fraksi hasil kromatografi pertukaran anion
DEAE-Cellulose ..........................................................................

44

19 Alur kerangka pemikiran penelitian pembuatan antibodi
poliklonal rabbit anti- ovPAG ....................................................

51

20 Respon imun poliklonal antibodi rabbit anti-ovPAG terhadap
berbagai sumber isolat ovine pregnancy-associated glycoprotein
(ovPAG) .................... ..................................................................

58

21 Perbandingan potensi DN16 dan DN32 sebagai sumber rabbit
anti-ovPAG ...............................................................................

59

22 Determinasi rabbit anti-ovPAG negatif (Ab -) maupun positif
(Ab +) terhadap berbagai sumber ovPAG (K, DN32, DN16,
DN8, DT, S) ................................................................................

60

23 Determinasi rabbit anti-ovPAG DN32 positif dan negatif
terhadap ovPAG dalam urin domba garut bunting dan tidak
bunting ........................................................................................

62

24 Alur kerangka pemikiran penelitian pengujian ovPAG
menggunakan teknik ELISA Termodifikasi ...............................

68

25 Kemiringan dan persamaan linear standar DN32 pada tiga
lempeng ELISA ..........................................................................

71

xx

DAFTAR LAMPIRAN

Halaman
1 Persetujuan Komisi ACUC .........................................................

89

2 Sodium dedocyl sulphate-polyacrylamide gel electrophoresis
(SDS-PAGE) ...............................................................................

90

3 Pewarnaan Commassie Brilliant Blue .........................................

91

4 Perhitungan berat molekul protein dalam monogel SDS-PAGE

92

5 Makalah Publikasi .......................................................................

93

6 Uji Beda t-student antara Konsentrasi ovPAG dalam Urin
Domba Tidak Bunting dan Bunting ............................................

106

xxi

DAFTAR SINGKATAN

%

:

persen

(NH4)2SO4

:

amonium sulfat

µl

:

mikroliter

0

:

derajat Celcius

1 CV

:

1 column volume

2N H2SO4

:

2 Normalitas asam sulfat

Ab

:

antibodi

Ag

:

antigen

AMP

:

Adenosin mono phosphate

APS

:

Amonium per sulphate

ATP

:

adenosin tri phosphate

BCA

:

bichinconinic acid

BICP

:

5-bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate disodium salt

BM

:

berat molekul

boPAG, bPAG

:

bovine pregnancy-associated glycoprotein

caPAG, cPAG

:

caprine pregnancy-associated glycoprotein

CBB

:

commassie brilliant blue

cDNA

:

cyclic deoxiribonucleic acid

COOH

:

karboksil

DEAE

:

diethylaminoethane

dH2O

:

deionized water

DN

:

DEAE-NaCl

DT

:

DEAE-Tris HCl

ELISA

:

enzyme linked immuno sorbent assay

FCA

:

Freud’s complete adjuvant

FICA

:

Freud’s Incomplete adjuvant

g

:

gravitasi

H2SO4

:

asam sulfat

H3PO4

:

asam fosfat

C

xxii

HCG

:

Human Chorionic Gonatotrophine

IB

:

inseminasi buatan

ICM

:

inner cell mass

Interferon-τ

:

Interferon-tau

kDa

:

kilo Dalton

KOH

:

kalium hidroksida

KPA

:

kromatografi pertukaran anion

M

:

molar

Mg2+

:

ion magnesium positif 2

ml

:

mililiter

mM

:

milimolar

mRNA

:

massenger ribonucleic acid

MRP

:

maternal recognition of pregnancy

NaCl

:

natrium chlorida

NBT

:

nitrotetrazolium blue chlorine-98%

ng

:

nanogram

NH4HCO3

:

amonium bikarbonat

NZW

:

New Zealand White

OD

:

optical density

OH

:

hidroksil

ovPAG

:

ovine pregnancy-associated glycoprotein

PAG

:

pregnancy-associated glygoprotein

PBS

:

phosphate buffer saline

PEG

:

polietilen glikol

pH

:

derajat keasaman

QC-H

:

Quality Control-Hihgh

QC-L

:

Quality Control-Low

RIA

:

radio immuno assay

S

:

Sephadex

SBN

:

sel binukleik

SDS-PAGE

:

sodium dedocyl sulfate - polyacrylamide gel electroforesis

xxiii

sel B

:

sel bursa fabricius

Sel T

:

Sel thymus

TEMED

:

Tetra methyl ethylene diamine

TMB

:

3,3’,5,5’ tetra methyl benzidine dihydrochloride

Tris- HCl

:

tris-asam chlorida

tRNA

:

transfer ribonucleic acid

USG

:

Ultrasonography

ZP

:

Zona pellucida

xxiv

PENDAHULUAN

Latar Belakang

Populasi domba di Indonesia saat ini berjumlah 7.549.316 ekor sedangkan
di Jawa Barat mencapai 4.221.806 ekor atau 55,92% populasi nasional.
Pemotongan domba yang tercatat di Jawa Barat pada tahun 2006 mencapai
3.343.365 ekor (Disnak Prov Jabar 2008). Peningkatan populasi domba menjadi
lambat karena di lapangan masih banyak ditemukan pemotongan hewan betina
dalam keadaan bunting. Hal ini terjadi oleh karena belum adanya alat deteksi
kebuntingan pada ruminansia kecil yang mudah dan cepat dilakukan di lapangan.
Belum berkembangnya metode deteksi kebuntingan dini pada ruminansia kecil
secara tidak langsung akan berakibat pada rendahnya efisiensi manajemen
reproduksi.
Metode

deteksi kebuntingan pada ruminansia kecil khususnya domba

perkembangannya belum seperti pada hewan besar. Beberapa metode deteksi
kebuntingan pada ternak lain telah diadopsi untuk domba, tetapi hasilnya belum
memuaskan. Penentuan kebuntingan dengan mengamati early pregnancy factor
yang dapat dideteksi 24 jam setelah perkawinan dengan metode rossette inhibition
sulit diterapkan di lapangan (Jainudeen & Hafez 2000). Aktivitas

ovine

trophoblast protein 1 (oTP-1) disebut juga ovine interferon tau (oIFN-

) adalah

memperpanjang

fase

luteal

dengan

produksi

yang

sangat

tinggi

(Geisert & Malayer 2000; Ezashi & Roberts 2004) hanya berlangsung beberapa
hari antara hari ke 12-21 setelah perkawinan (Roberts et al. 1992;
Demmers et al. 2001, Spencer & Bazer 2004). Interferon-

terutama berfungsi

sebagai sinyal penanda kebuntingan (Gray et al. 2006) serta mempersiapkan
endometrium untuk implantasi yang terjadi pada hari ke-18 usia kebuntingan
(Klein et al. 2006; Dunlap et al. 2005).
Progesteron dan estrogen sebagai penanda kebuntingan pernah dilaporkan
oleh Spencer et al. (2004) tetapi konsentrasi kedua hormon tersebut yang tidak
berbeda sesaat

setelah implantasi. Akibatnya

bunting dan tidak bunting (Spencer et al.

sulit dibedakan antara domba

2004;

Johnson & Everitt 2000;

2

Senger 1999). Transrectal ultrasonography (USG), merupakan metode yang
aplikatif

di

lapangan

(Pierson

Wodzicka-Tomaszewka et al. 1991;

&

Ginther

1988;

Strmśnik et al. 2002), tetapi diperlukan

peralatan dan keahlian khusus serta dilakukan secara invasive yang dapat
menyebabkan terjadinya stres

(Karen et al 2003a). Selain itu, sekitar 35%

kematian embrio dapat terjadi di awal kebuntingan sehingga pemanfaatan USG
untuk deteksi kebuntingan dini akan sulit (Szafranska et al. 2006). Oleh karena
itu perlu dikembangkan metode deteksi kebuntingan dini yang aplikatif di
lapangan; akurat; non-invasive (Monfort et al. 1997;

Karen et al 2003b;

Chelini et al. 2005); cepat, dan aman (Verbeckmoes et al. 2004).
Pregnancy-associated glygoprotein (PAG) merupakan famili aspartik
protease yang disekresikan oleh sel binukleat trofoblastik sesaat menjelang
implantasi (Wooding 1992; Sousa et al. 2006). Substansi ini telah berhasil
dipurifikasi dari plasenta domba; kambing; sapi; babi; kerbau; zebu, dan dengan
berat molekul berkisar antara 35 – 75,8 kDa bison (El Amiri et al. 2004;
Xie et al. 1996; Garbayo et al. 1998; Zoli et al. 1991; Szafranska et al. 2003;
Barbato et al. 2008; Sousa et al. 2002; Kiewisz et al. 2008). Konsentrasi PAG
dapat terdeteksi dalam darah induk pada awal kebuntingan dengan akurasi 76,6 –
100% (Szafranska et al. 2006). Konsentrasi PAG meningkat sejalan dengan
berkembangnya plasenta yang mengindikasikan bahwa perkembangan embrio
berjalan dengan baik. Oleh sebab itu, PAG memiliki fungsi ganda yaitu sebagai
indikator kebuntingan maupun kesehatan feto-plasental (Karen et al. 2003b;
Boscos et al. 2003; Jonker 2004).

Kerangka Pemikiran
.
Metode

deteksi kebuntingan pada ruminansia kecil khususnya domba

belum berkembang dibandingkan dengan ruminansia besar.

Pregnancy-

Associated Glycoprotein (PAG) merupakan protein yang disekresikan oleh sel
binukleid tropoblas dari ternak diawal masa kebuntingan, dan konsentrasinya
terus meningkat hingga mencapai 300-400 ng/ml pada saat sel chorion
berproliferasi dan implantasi. OvinePAG merupakan substansi yang sangat

3

potensial sebagai penanda kebuntingan. Substansi ini dapat diisolasi dari plasenta
pada

saat

melahirkan

sehingga

tidak

ada

hewan

yang

dikorbankan.

Konsentrasinya akan mencapai basal sekitar dua minggu setelah melahirkan,
dengan demikian tidak akan bias dengan PAG bunting dan

dapat dideteksi

sebelum siklus berikutnya
Selama ini, pengukuran konsentrasi ovPAG masih memanfaatkan teknik
RIA, akan tetapi teknik ini menggunakan bahan radioaktif yang saat ini sudah
mulai ditinggalkan.

Oleh karena itu perlu dikembangkan suatu teknik untuk

mendeteksi ovPAG yang aplikatif, aman, sederhana, fleksibel, mudah dengan
volume sampel yang kecil tetapi mempunyai tingkat akurasi yang tinggi seperti
teknik ELISA.
Berdasarkan kondisi di atas maka dilakukan serangkaian penenlitian yang
dimulai dengan ekstraksi dan isolasi ovPAG dar kotiledon plasenta; dilanjutkan
dengan memproduksi antibodi poliklonal pada kelinci (rabbit anti-ovPAG), serta
mengembangkan teknik ELISA Termodifikasi agar dapat mengukur konsentrasi
ovPAG dalam urin dan plasma (Gambar 1).

Tujuan Penelitian

Penelitian ini bertujuan untuk

: (1) purifikasi ovPAG dalam kotiledon

plasenta (2) memproduksi anti bodi poliklonal (Rabbit anti-ovPAG) (3)
mendeterminasi ovPAG dalam urin domba bunting (4) menentukan konsentrasi
ovPAG terendah dalam urin domba bunting.

Manfaat Penelitian

Hasil penelitian ini diharapkan (1) dapat memurnikan ovPAG yang ada di
dalam kotiledon plasenta domba garut berdasarkan berat molekulnya (2) dapat
dikembangkan menjadi penanda deteksi kebuntingan (3) mendapatkan metode
pengukuran ovPAG yang sederhana.

4

Sel Binukleik Trofoblas

Implantasi

ovPAG

Ekstraksi Kotiledon

Isolasi ovPAG

Pembuatan Antibodi Poliklonal

Deteksi ovPAG dalam urin dan plasma

Gambar 1 Alur kerangka pemikiran penelitian purifikasi ovPAG

Hipotesis

Ovine Pregnancy-associated glycoprotein (ovPAG) ditemukan pada domba
bunting dan dapat diisolasi dari kotiledon plasenta. OvinePAG, berdasarkan berat
molekulnya berbeda pada setiap spesies.

TINJAUAN PUSTAKA
Aktivitas Reproduksi Domba
Siklus Estrus

Siklus estrus domba berkisar antara 14-19 hari (Jainudeen et al. 2000).
Domba garut yang dipelihara secara intensif mempunyai siklus estrus antara
17-20 hari sedangkan yang dipelihara secara tradisional adalah 14-30 hari
(Hastono & Masbulan 2001).
Siklus estrus terdiri dari dua fase yaitu fase folikuler dan luteal. Fase
folikuler terbagi menjadi proestrus dan estrus sedangkan fase luteal terbagi
menjadi metesrus dan diestrus. Fase folikeluler paling dominan ditandai dengan
produksi hormon estrogen oleh folikel sedangkan fase luteal didominasi oleh
pertumbuhan korpus luteum yang ditandai dengan diproduksinya progesteron
(Senger 1999).
Masa Kebuntingan
Kebuntingan adalah serangkaian proses fisiologis yang dimulai dari
terjadinya fertilisasi dan diakhiri dengan kelahiran (Jainudeen & Hafez 2000).
Lama kebuntingan pada domba bervariasi bergantung pada bangsanya yaitu
berkisar antara 144 – 153 hari (Johnson & Everitt 2000; Senger 1999) dengan
rata-rata 148 hari.

Fertilisasi

Pembentukan suatu individu baru dimulai dari penggabungan antara
spermatozoa dan ovum yang dikenal dengan fertilisasi yang terjadi di dalam
oviduk. Fertilisasi diakhiri dengan terbentuknya satu sel kompleks yang disebut
embrio. Embrio akan mengalami pembelahan sel sampai terbentuk suatu jaringan
yang berbeda disebut dengan blastosis. Blastosis memiliki dua populasi sel yang
berbeda,

yaitu inner cell mass (ICM)

dan selapis sel trofektoderm yang

6

mengelilingi ICM. Embrio akan tumbuh dari perkembangan ICM sedangkan
plasenta dan membran ekstraembrionik tumbuh dari trofektoderm.

Interaksi

antara blastosis dan epitel endometrium induk merupakan awal terjadinya
implantasi (Senger 1999: Dey et al. 2004).
Konseptus memasuki uterus pada hari ke-4, blastosit terbentuk pada hari
ke-6 dan menetas dari zona pelusida pada hari ke 8-9 (Gambar 1). Blastosit
berkembang dari bentuk sperikal menjadi tubuler pada hari ke-11 kemudian
mengalami elongasi

berbentuk filamen antara hari ke-12 dan 16. Elongasi dari

blastosit menandakan terjadinya implantasi yang melibatkan proses aposisi dan
penempelan (hari 12-15) serta mengalami adesi secara ketat pada hari ke-16
(Spencer et al. 2004).
Pembentukan trofektoderm yang diikuti dengan perkembangan lebih lanjut
menjadi trofoblas merupakan tahapan yang penting untuk dimulainya implantasi
dan terjadinya kebuntingan. Sebelum embrio menempel pada dinding uterus,
embrio akan mengalami tiga tahapan penting yaitu : perkembangan awal embrio,
preimplantasi yang meliputi perkembangan embrio lebih lanjut serta terjadinya
membran ekstraembrionik, dan terbentuknya fetus (telah mempunyai bentuk yang
definitif spesies tertentu) serta plasenta (Senger 1999).
Implantasi
Implantasi pada ruminansia (sapi, domba, kambing) terjadi pada tahap
blastosis. Waktu terjadinya implantasi berbeda-beda pada setiap spesies yaitu
pada babi hari ke-13, sapi hari ke-20, domba hari ke-16 dan kambing hari ke-19
(Dey et al. 2004; Spencer & Bazer 2004). Implantasi merupakan proses yang
sangat rumit dan melibatkan interaksi yang sangat dekat antara blastosit dan
penerimaan uterus terhadap embrio. Tempat terjadinya implantasi terletak pada
area karunkular (Johnson & Everitt 2000; Dey et al. 2004; Lee & DeMayo 2004).
Blastosis berkembang dari embrio tahap awal, morula, sebagai hasil dari
penyatuan dan mengisi blastocoele yang dikelilingi oleh selapis sel embrio atau
trofektoderm (Gambar 2). Trofektoderm terlibat dalam adhesi dengan epitel
endometrium sehingga terjadi implantasi. Penerimaan uterus yang terjadi pada
periode yang terbatas didefinisikan sebagai waktu dimana lingkungan uterus

7

sangat kondusif untuk menerima blastosis dan implantasi. Interaksi dua arah
antara blastosis dan epitel endometrium induk memicu terjadinya implantasi,
suatu proses dimana pembuluh darah embrio berkomunikasi dengan sirkulasi
darah induk untuk meneguhkan fungsi plasenta dan kebuntingan. Sirkulasi induk
mempunyai

barier khusus yang dapat menyeleksi dengan jalan menembus

plasenta untuk melindungi dan memberi makan embrio (Dey et al.

2004;

Wodzicka-Tomaszewka et al. 1991).
Plasentasi pada ruminansia seperti sapi dan domba adalah superfisial, yang
dikenal sebagai kotiledon sinepiteliokhorial (Wooding 1992). Sinepiteliokhorial
adalah sinsisium feto-maternal yang merupakan fusi sel binukleat trofoblas dan
sel epitel uterus.

Sedang kotiledon merupakan struktur kasar dari plasenta dan

vili trofoblas yang membentuk kripta karunkel induk. Fusi seluruhnya atau
sebagian kotiledon fetus dengan karunkel induk disebut plasentom yang
merupakan tempat utama terjadinya pertukaran nutrien dan gas dalam plasenta
(Green et al. 1998; Xie et al. 1996).
Domba dengan tipe plasenta sinepiteliochorial akan mengalami preimplantasi pada hari ke 8-15 diikuti dengan pemanjangan periode aposisi dan
penempelan. Menurut Spencer et al. (2004), pada domba implantasi dan plasentasi
dimulai pada hari ke 15-16 tetapi prosesnya akan terus berlanjut sampai hari ke
50-60 usia kebuntingan. Keberhasilan implantasi dapat dideteksi paling lambat 14
hari setelah ovulasi atau sekitar hari ke 5-15

(Wilcox et al. 1999;

Johnson & Everitt 2000; Aplin & Kimber 2004).
Sejak terjadinya fertilisasi sampai implantasi, aktivitas ini juga
dipengaruhi oleh aktivitas hormonal terutama progesteron dan estrogen
(Gambar 1). Estradiol mencapai konsentrasi 10 pg/ml pada saat puncak estrus
yang merupakan saat yang paling baik untuk perkawinan, yang konsentrasinya
berfluktuasi sampai terjadi implantasi. Sementara konsentrasi progesteron sejak
terjadinya fertilisasi sampai terbentuk blastosis pada hari ke-8 mengalai
peningkatan konsentrasi sampai mencapai 10 ng/ml. Konsentrasi ini tetap
bertahan sampai terjadinya implantasi. Keberhasilan implantasi dan kebuntingan
didukung oleh adanya interaksi antara progesteron dan estrogen yang disekresikan
oleh ovarium (Spencer et al. 2004; Wen-ge Ma et al. 2003).

8

C
Terlepas dari ZP

Pemanjangan

Aposisi

Adhesi

A

Lumen uteri
Uterotubal
Kornua uteri

Pertumguhan dan
Perkembangan
blastosis

Oviduk

B

Progesteron

Hari Sesudah
Perkawinan
Gambar 2 Tahapan awal kebuntingan
domba
(Spencer et al. 2004).
Keterangan :
Gambar 2 A.
Tahapan
awalterjadi
kebuntingan
domba.
di dalam
tuba
Fertilisasi
di dalam
tubaFertilisasi
Fallopii terjadi
dan tahap
morula
Fallopii
dan
tahap
morula
memasuki
uterus
pada
hari
ke-4.
memasuki uterus pada hari ke-4.
Blastosis
dibentuk
pada
harihari
ke-6ke-6
dandan
ditetaskan
daridari
ZP pada
hari
B.
Blastosis
dibentuk
pada
ditetaskan
ZP pada
ke hari
8-9. ke
Berkembang
dari
bentuk
spherical
menjadi
tubular
pada
8-9. Berkembang dari bentuk spherical menjadi tubular
haripada
ke-11,
perpanjangan
ke filamenus
pada
12-15.
hari ke-11,
perpanjangan
ke filamenus
padahari
hari ke
ke 12-15.
Perpanjangan
blastosis
menandakan
dimulainya
implantasi
yang
C. Perpanjangan blastosis menandakan dimulainya implantasi
melibatkan
aposisi
dan
penempelan
secara
cepat
pada
hari
ke
12-15
yang melibatkan aposisi dan penempelan secara cepat pada hari
danke
pelekatan
secara
kuat pada
hari
ke-16
et al. 2004).
12-15 dan
pelekatan
secara
kuat
pada(Spencer
hari ke-16

Penanda Kebuntingan
Saat yang paling kritis dalam siklus reproduksi ternak ditentukan oleh
kemampuan induk untuk menerima sinyal yang dikirimkan oleh konseptus untuk
menghalangi terjadinya luteolisis dan mempertahankan kebuntingan yang disebut
dengan maternal recognition of pregnancy atau MRP (Senger 1999;
Geisert & Malayer 2000) . Pada ruminansia sinyal penanda kebuntingan yang
utama adalah interferon tau (Johnson & Everitt 2000; Spencer & Bazer 2004).

Progesteron
(ng/ml)

Posisi Uterus

Masuk ke
uterus

9

Penanda kebuntingan berbeda-beda sesuai dengan bangsanya akan tetapi
mempunyai fungsi yang sama yaitu mencegah terjadinya luteolisis agar tidak
terjadi abortus. Pada primata (CG); manusia (HCG) maupun kuda (PMSG)
sekresinya berupa choriogonadotrophin. Domba maupun sapi disekresikan
interferon-tau maupun early pregnancy factor yang berfungsi untuk menekan
peningkatan reseptor oksitosin, sedangkan pada babi disekresikan estrogen untuk
menekan sekresi prostaglandin. Substansi penand akebuntingan ini akan menurun
konsentrasinya atau bahkan menghilang pada saat implantasi telah terjadi
bersamaan dengan mulai terbentuknya plasenta.
Pada saat implantasi sempurna, akan diikuti dengan plasentasi yaitu proses
terbentuknya plasenta (chorion, alantois dan amnion). Plasenta berfungsi sebagai
pelindung konseptus dengan jalan mensekresikan cairan plasenta. Sekresi
plasenta

berupa

steroid

(progesteron

dan

estrogen),

laktogen

plasenta

(Devlin 2002) serta PAG (Green et al. 1998, Xie et al. 1996). Substansi yang
disekresikan oleh plasenta akan bertahan sampai kebuntingan berakhir.

Sekresi Plasenta
Progesteron
Progesteron merupakan hormon penjaga kebuntingan.

Keberadaan

progesteron di dalam uterus akan menstimulir dan menjaga fungsi uterus sehingga
dapat dipergunakan untuk tempat perkembangan embrio dini, implantasi,
plasentasi serta keberhasilan perkembangan fetus dan plasenta sampai akhir masa
kebuntingan (Spencer et al. 2004).
Pada ternak domba, sudah dapat dinyatakan bunting jika

konsentrasi

progesteron dalam darah minimal 2,5 ng/ml (Boscos et al. 2003) sedangkan
peneliti lainnya menyatakan bahwa konsentrasi tertinggi progesteron pada fase
luteal pada 2-4 ng/ml dibandingkan dengan saat estrus pada 1,5-0,8 ng/ml
(Ranilla et al. 1994). Peningkatan yang drastis dari 2-4 ng/ml menjadi 12-20
ng/ml terjadi pada kebuntingan hari ke 60-125 (Edqvist & Stabenfeldt 1980),
karena plasenta dan atau konseptus sudah memproduksi progesteron. Hal yang

10

sama terlihat level progesteron meningkat dengan konsentrasi tertinggi 16 ng/ml
(Johnson & Everitt 2000).
Korpus luteum domba memproduksi progesteron dalam jumlah yang
relatif rendah pada 50 hari pertama kebuntingan, tetapi setelah melewati masa ini
plasenta merespon terhadap lueteinizing hormon maupun prolaktin, untuk
mempersiapkan diri sebagai sumber utama progesteron sampai kebuntingan
berakhir. Hal ini menunjukkan bahwa konsentrasi progesteron baru terukur
setelah hari ke-60 (Schoenecker et al. 2004).
Apabila plasenta telah berfungsi dengan

sempurna maka meskipun

dilakukan ovariektomi produksi hormon yang menjaga kebuntingan tetap
disekresikan karena fungsinya telah digantikan oleh plasenta (Gambar 3). Domba
apabila dilakukan ovariektomi setelah hari ke-50 tidak akan menyebabkan
terjadinya abortus (Senger 1999; Johnson & Everitt 2000).

Estrogen
Aktivitas utama estrogen adalah menunjukkan tanda berahi saat estrus,
meningkatkan ukuran uterus, aliran darah uterus, meningkatkan ekspresi reseptor
progesteron

terhadap

oksitosin,

mendorong

perkembangan

organ

fetus,

menstimulir produksi protein hepar induk serta meningkatkan massa jaringan
mammae dan adipose (Hirako et al. 2003; Senger 1999; Johnson & Everitt 2000).
Estrogen merupakan hormon yang selain diproduksi oleh ovarium juga
diproduksi oleh kotiledon fetus bersama-sama dengan karunkula induk
(Teng et al. 2002). Salah satu produk deteksi kebuntingan (DEEA Gestdect®)
dengan memanfaatkan ikatan fenol yang terikat pada gugus estrogen dalam urin,
mempunyai mempunyai akurasi pada domba dan sapi berturut-turut 60-70 % dan
90 % (Samsudewa et al. 2005). Hal ini menunjukan bahwa estrogen terukur
dalam urin domba bunting maupun tidak bunting.

11

0

50

100

150

200

Usia kebuntingan (hari)
Gambar 3 Pola hormon dalam plasma darah domba saat bunting. Garis panah
menunjukkan saat dimana ovariektomi (Johnson & Everitt 2000).

Pregnancy-Associated Glycoprotein (PAG)

Pregnancy-Associated Glycoprotein (PAG) merupakan glikoprotein asam
(pI 4.4-5.4), sebagai anggota famili aspartik proteinase yang memperlihatkan
sekuen yang paling dekat dengan pepsin (Green et al. 2000). Pregnancyassociated glycoprotein disintesa oleh sel mono- dan binukleat trofoblas (Gambar
3). Sel binukleik (SBN) fetus merupakan sel unik pada ruminansia, sumber utama
protein plasenta

seperti laktogen plasenta dan hormon steroid yang

bertanggungjawab terhadap keberhasilan kebuntingan (Atkinson et al. 1993).
Selanjutnya SBN

migrasi melalui apical tight junction epitelium chorion,

melintasi microvillar junction fetomaternal, kemudian fusi ke dalam sinsisium
uterus. Sinsisium berhubungan erat dengan sirkulasi darah induk, pada fusi lebih
lanjut granula SBN dilepas oleh proses eksositosis ke dalam sinsisium. Adanya
perpindahan produk plasenta sepanjang kebuntingan kemungkinan erat kaitannya

12

dengan keberhasilan proses metabolisme dan atau imunologi antara induk dan
fetus (Wooding 1992). Perubahan pada sistem ini akan menurunkan kapasitas
konseptus dalam memproduksi sinyal biologis yang berkaitan dengan kebuntingan
yang

diperlukan

untuk

perkembangan

dan

pertumbuhan

fetus

(Regnault et al. 1999).
Pada domba, sel-sel ini berdiferensiasi dari sel mononukleik trofektoderm
sesaat sebelum kontak antara epitel uterus dengan plasenta yang umumnya terjadi
pada hari ke-13 (Green et al. 2000) atau ke 14-15

kebuntingan

(Dunlap et al. 2005).

Mekanisme Sintesis Protein Ovine Pregnancy-Associated Glycoprotein (ovPAG)

Asam amino bereaksi dengan ATP membentuk kompleks AMP dan
pirofosfat. Reaksi ini dikatalisis oleh enzim aminoacyl-tRNA synthetase dengan
adanya Mg2+. Enzim yang dipergunakan berbeda untuk setiap asam amino . Pada
pemisahan fosfat grup dari ATP akan melepas banyak energi yang tersimpan
dalam kompleks asam amino AMP. Kompleks asam amino AMP-enzim disebut
asam amino teraktivasi sementara pirofosfat dihidrolisis menjadi dua organik
fosfat ( Zubay 1993; Champe et al. 2008).
Kompleks asam amino AMP-enzim berikatan dengan tempat pengikatan
asam amino ( AA binding site) dari spesifik tRNAnya sementara COOH berikatan
dengan OH.

Katalisator dari reaksi ini adalah enzim yang sama yaitu yang

menghasilkan tRNA-amino acid complex disebut sebagai charged tRNA.
Sementara AMP dan enzim dilepaskan yang dapat dipergunakan untuk
mengaktivasi dan mengikat molekul tRNA lainnya. Selanjutnya kompleks asam
amino-tRNA bergerak menuju ribosom sebagai tempat sintesa protein. Aktivasi
ribosom oleh mRNA memerlukan Mg2+ pada konsentrasi yang sesuai.
Sel trofoblas menyimpan protein ini dalam granula

(Gambar 4) dan

melepaskannya ke dalam organisme induk setelah terjadinya fusi dengan sel epitel
endometrium induk (Dunlap et al. 2006). Molekul mRNA terletak pada sel monomaupun binukleat trofoblas. Dengan memanfaatkan antibodi monoklonal
terdeteksi bahwa sel binukleat trofoblas mempunyai epitop terhadap karbohidrat

13

(Garbayo et al. 2008), selanjutnya melalui

proses glikolisasi terbentuk PAG

(Klisch et al. 2008). Pregnancy-Associated Glycoprotein dilepaskan dari sel
trofoblas dan terikat pada reseptor sel permukaan spesifik pada sel target induk.
Embrio memulai transkripsi gen spesifik di dalam massa sel bagian dalam
blastosis, mRNA yang mengatur sintesis PAG di dalam trofoblas. Selanjutnya
PAG akan mendorong respon induk melalui reseptor pada endometrium
(Lambert et al. 2005). Variasi derajat glikosilasi pada PAG berbeda-beda
tergantung dari kadar karbohidrat yang berkaitan dengan usia kebuntingan, yang
merupakan faktor penting pada saat menentukan waktu paruhnya dalam plasma
induk (Klisch et al. 2005; Sousa et al. 2006).

Gambar 4 Sel binukleat, kontribusi