Isolasi Dan Karakterisasi Bakteri Endofit Potensial Lengkuas Merah (Alpinia Purpuruta) Dan Analisis Senyawa Antibakterinya

ISOLASI DAN KARAKTERISASI BAKTERI ENDOFIT POTENSIAL
LENGKUAS MERAH (Alpinia purpuruta) DAN ANALISIS
SENYAWA ANTIBAKTERINYA

ELFIRA JUMRAH

SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2016

PERNYATAAN MENGENAI TESIS DAN
SUMBER INFORMASI SERTA PELIMPAHAN HAK CIPTA*
Dengan ini saya menyatakan bahwa tesis berjudul Isolasi dan Karakterisasi
Bakteri Endofit Potensial Lengkuas Merah (Alpinia purpuruta) dan Analisis
Senyawa Antibakterinya adalah benar karya saya dengan arahan dari komisi
pembimbing dan belum diajukan dalam bentuk apa pun kepada perguruan tinggi
manapun. Sumber informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan
maupun tidak diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan
dicantumkan dalam Daftar Pustaka di bagian akhir tesis ini.
Dengan ini saya melimpahkan hak cipta dari karya tulis saya kepada Institut

Pertanian Bogor (IPB).

Bogor, April 2016

Elfira Jumrah
G851140071

RINGKASAN
ELFIRA JUMRAH. Isolasi dan Karakterisasi Bakteri Endofit Potensial Lengkuas
Merah (Alpinia purpuruta) dan Analisis Senyawa Antibakterinya. Dibimbing oleh
MARIA BINTANG dan FACHRIYAN HASMI PASARIBU.

Lengkuas merah (Alpinia purpuruta) merupakan tanaman yang banyak
digunakan sebagai obat tradisional dan mengandung senyawa antibakteri. Bakteri
endofit adalah mikroorganisme yang bersimbiosis mutualisme dengan tanaman
inangnya dan dapat menghasilkan senyawa aktif, salah satunya yaitu senyawa
antibakteri.
Penelitian ini bertujuan untuk mengisolasi bakteri endofit lengkuas merah,
menguji aktivitas antibakteri terhadap bakteri patogen, mengkarakterisasi isolat
bakteri endofit potensial secara konvensional dan molekuler, mengekstrak

senyawa antibakteri yang dihasilkan serta menganalisis senyawa antibakterinya
menggunakan GC-MS. Tahap awal penelitian yaitu isolasi bakteri endofit dari
lengkuas merah, menguji setiap isolat bakteri endofit terhadap bakteri patogen
menggunakan inokulasi titik, isolat potensial dikarakterisasi dan diekstraksi
senyawa aktif dengan cara fermentasi 36 jam dalam nutrient broth. Hasil ekstrak
diuji aktivitasnya dengan metode difusi sumur dan diperoleh ekstrak etil asetat
sebagai fraksi potensial yang selanjutnya dianalisis menggunakan GC-MS yang
bertujuan untuk mengetahui komponen senyawa aktif yang memiliki aktivitas
antibakteri.
Hasil penelitian diperoleh sebanyak 16 isolat bakteri endofit, isolat
potensial yang dapat menghambat bakteri patogen Gram positif (Staphylococcus
aureus dan Streptococcus mutans) dan Gram negatif (Salmonella sp. dan
Escherichia coli) yaitu isolat RL4, BL3 dan DL4. Berdasarkan karakterisasi
morfologi, biokimia dan molekuler menggunakan analisis sekuen 16S rRNA
diperoleh bahwa isolat RL4 memiliki kemiripan 99% dengan Burkholderia
cenocepacia J231, isolat BL3 memiliki kemiripan 99% dengan Burkholderia
gladioli BSR3 strain BSR3 sedangkan isolat DL4 memiliki kemiripan 99% dengan
Bacillus amyloliquefaciens DSM7. Fraksi aktif hasil ekstraksi yaitu isolat RL4
ekstrak etil asetat. Hasil GC-MS menunjukkan senyawa dalam ekstrak etil asetat
yaitu dokosan, eikosan, tetrakosan, heneikosan, heksadekanamida, pentakosan,

oktadekan, asam heksanedioat dan pentadekan.
Kata kunci : bakteri endofit, GC-MS, lengkuas merah, 16S rRNA

SUMMARY
ELFIRA JUMRAH. Isolation and Characterization of Bacteria Endophytic
Potential Red galangal (Alpinia purpurata) and Analysis of Antibacterial
Compounds. Supervised by MARIA BINTANG and FACHRIYAN HASMI
PASARIBU.
Red galangal (Alpinia purpurata) is a plant widely used as traditional
medicine and contains antibacterial compounds. Endophytic bacteria are
microorganisms that are symbiotic mutualism with the host plant and can produce
active compounds, one of them is antibacterial compound.
This study aims to isolate the endophytic bacteria red galangal, test
antibacterial activity against pathogenic bacteria, characterize endophytic bacterial
potential of conventional and molecular, extracted antibacterial compounds which
produced and analysis antibacterial compounds using GC-MS. This research
started of with isolation of endophytic from red galangal, tested each isolate
endophytic bacteria against pathogens using inoculation point, potential isolates
were characterized and extracted active compound by fermentation of 36 hours in
a nutrient broth. The extract tested their activity with the well diffusion method

and ethyl acetate extract obtained as a fraction potential to be further analyzed
using GC-MS which aims to identified components of the active compound had
antibacterial activity.
The results obtained showed that they were 16 isolates of endophytic
bacteria, isolate potential to inhibit pathogenic Gram-positive bacteria
(Staphylococcus aureus and Streptococcus mutans) and Gram negative
(Salmonella sp. and Escherichia coli) that isolates RL4, BL3 and DL4. Based on
morphological, biochemical characterization and molecular sequences of 16S
rRNA analysis showed that isolates RL4 has a 99% similarity with Burkholderia
cenocepacia J231, isolates BL3 has 99% similarity with Burkholderia gladioli
BSR3 strain BSR3, while isolates DL4 has 99% similarity with Bacillus
amyloliquefaciens DSM7. The active fraction extraction results that isolates RL4
ethyl acetate extract. The results of GC-MS showed the compounds in the ethyl
acetate extract are docosane, eicosane, tetracosane, heneicosane, hexadecanamide,
pentacosane, octadecane, hexanedioic acid and pentadecane
Keywords : endophytic bacteria, GC-MS, red galangal, 16S rRNA

© Hak Cipta Milik IPB, Tahun 2016
Hak Cipta Dilindungi Undang-Undang
Dilarang mengutip sebagian atau seluruh karya tulis ini tanpa mencantumkan

atau menyebutkan sumbernya. Pengutipan hanya untuk kepentingan pendidikan,
penelitian, penulisan karya ilmiah, penyusunan laporan, penulisan kritik, atau
tinjauan suatu masalah; dan pengutipan tersebut tidak merugikan kepentingan
IPB.
Dilarang mengumumkan dan memperbanyak sebagian atau seluruh karya tulis ini
dalam bentuk apa pun tanpa izin IPB.

ISOLASI DAN KARAKTERISASI BAKTERI ENDOFIT POTENSIAL
LENGKUAS MERAH (Alpinia purpuruta) DAN ANALISIS
SENYAWA ANTIBAKTERINYA

ELFIRA JUMRAH

Tesis
sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
Magister Sains
pada
Program Studi Biokimia

SEKOLAH PASCASARJANA

INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2016

Penguji Luar Komisi pada Ujian Tesis: Dr Ir I Made Artika, M.App.Sc

PRAKATA
Puji dan syukur penulis panjatkan kepada Allah subhanahu wa ta’ala atas
segala rahmat dan hidayah sehingga penulis dapat menyelesaikan tesis yang
berjudul “Isolasi dan Karakterisasi Bakteri Endofit Potensial Lengkuas Merah
(Alpinia purpuruta) dan Analisis Senyawa Antibakterinya” dapat diselesaikan
dengan baik. Penelitian ini berlangsung selama 5 bulan dari Oktober 2015 sampai
Maret 2016 di Laboratorium Bakteriologi Divisi Mikrobiologi Medik Departemen
Ilmu Penyakit Hewan dan Kesehatan Masyarakat Veteriner Fakultas Kedokteran
Hewan dan Laboratorium Penelitian Departemen Biokimia Fakultas Matematika
dan Ilmu Pengetahuan Alam Institut Pertanian Bogor (IPB).
Penulis mengucapkan terima kasih kepada semua pihak yang telah
membantu dalam menyelesaikan tesis ini, terutama kepada:
1. Prof Dr Drh Maria Bintang MS dan Prof Dr Drh Fachriyan Hasmi Pasaribu
selaku pembimbing yang telah banyak memberikan arahan dan bimbingan,

nasehat, waktu konsultasi serta solusi dari setiap permasalahan yang dihadapi
penulis selama menyelesaikan tesis ini.
2. Bapak Agus Somantri dan staf Laboratorium Bakteriologi Divisi Mikrobiologi
Medik yang banyak membantu selama penelitian penulis.
3. Kedua orang tua, bapak Jumasing dan ibu Rahmatiyah yang selalu mendoakan,
mendukung dan memotivasi penulis untuk menyelesaikan tesis ini.
4. Keluarga besar Puang H. Colleng dan Puang H. Baido
5. Keluarga besar mahasiswa pascasarjana program studi Biokimia, sahabat dan
semua pihak yang tidak bisa disebutkan satu persatu.
Akhir kata, Semoga karya ilmiah ini bermanfaat bagi semua pihak untuk
kemajuan ilmu pengetahuan dibidang ilmu biokimia dan biomedis.

Bogor, April 2016
Elfira Jumrah

DAFTAR ISI
DAFTAR TABEL
DAFTAR GAMBAR
DAFTAR LAMPIRAN
1 PENDAHULUAN

Latar Belakang
Perumusan Masalah
Tujuan Penelitian
Manfaat Penelitian
Hipotesis

1
1
2
3
3
3

2 METODE PENELITIAN
Waktu dan Tempat Penelitian
Alat dan Bahan
Prosedur Penelitian

4
4

4
4

3 HASIL
Isolat Bakteri Endofit Lengkuas Merah
Seleksi Isolat Bakteri Endofit Potensial Antibakteri
Karakterisasi Biokimia dan Morfologi Sel Isolat Potensial
Karakterisasi Molekuler 16S rRNA Isolat Potensial
Aktivitas Antibakteri Senyawa Aktif Isolat Potensial
Analisis GC-MS Senyawa Aktif Fraksi Etil Asetat Isolat RL4

8
8
9
10
12
12
13

4 PEMBAHASAN

Isolat Bakteri Endofit Lengkuas Merah
Seleksi Aktivitas Antibakteri Isolat Bakteri Endofit
Karakterisasi Morfologi Sel dan Biokimia Isolat Potensial
Karakterisasi Molekuler 16S rRNA Isolat Potensial
Aktivitas Antibakteri Senyawa Aktif Isolat Potensial
Analisis GC-MS Senyawa Aktif Fraksi Etil Asetat Isolat RL4

15
15
16
16
18
20
21

5 KESIMPULAN DAN SARAN
Kesimpulan
Saran

24

24
24

DAFTAR PUSTAKA

25

LAMPIRAN
RIWAYAT HIDUP

32
41

DAFTAR TABEL
1
2
3
4
5

Morfologi koloni isolat bakteri endofit lengkuas merah
Hasil pengujian isolat bakteri endofit terhadap bakteri patogen
Karakterisasi morfologi sel dan biokimia
Aktivitas antibakteri fraksi isolat bakteri endofit potensial
Aktivitas antibakteri fraksi etil asetat isolat bakteri endofit RL4

9
10
11
12
13

DAFTAR GAMBAR
1
2
3
4
5

Tanaman lengkuas merah
Koloni bakteri endofit lengkuas merah
Isolat bakteri endofit rimpang (A), batang (B) dan daun (C)
Pewarnaan Gram sel bakteri isolat BL3 (A), RL4 (B) dan DL4 (C)
Kromatogram hasil analisis GC-MS fraksi etil asetat isolat RL4

8
8
9
11
13

DAFTAR LAMPIRAN
1
2
3
4
5

Bagan alir penelitian
Hasil BLAST isolat RL4, BL3 dan DL4
Rekonstruksi pohon filogenik isolat RL4, BL3 dan DL4
Kurva pertumbuhan isolat RL4
Pola fragmentasi senyawa hasil GC-MS

32
33
34
35
36

1 PENDAHULUAN
Latar Belakang
Resistensi bakteri patogen terhadap antibiotik merupakan tantangan
terbesar pada pengobatan penyakit infeksi (Wright 2010), beberapa bakteri
patogen seperti Salmonella resisten terhadap antibiotik komersial streptomycin,
Escherichia coli resisten terhadap streptomycin, rifampicin, norfloxacin,
fosfomycin dan bakteri Staphylococcus aureus, resisten terhadap antibiotik
vancomycin, methicilin, mupiricin, rifampicin dan fusidic acid (Andersson &
Hughes 2010). Pemanfaatan mikroorganisme untuk menghasilkan antibiotik telah
lama dikembangkan seperti pada penelitian Yulinah (1987) yang berhasil
mengisolasi Streptomyces indonesiensis ATCC 45859 yang memiliki aktivitas
kuat sebagai antijamur, hasil ini telah dipatenkan di Amerika Serikat.
Pemanfaatan mikroorganisme yang bersimbiosis dengan tanaman inangnya yang
dikenal dengan sebutan mikroba endofit dapat juga dijadikan sebagai salah satu
sumber senyawa antibiotik. Penelitian mikroba endofit yang menghasilkan
senyawa antibiotik berspektrum luas munumbicin yaitu dari endofit Streptomyces
spp. strain NRRL 30562 yang merupakan endofit yang diisolasi dari tanaman
Kennedia nigriscans (Castillo et al. 2002) dan antibiotik kakadumycin yang telah
diisolasi dari endofit tanaman Grevillea pteridifolia (Castillo et al. 2003). Salah
satu, tanaman inang yang berpotensi sebagai sumber bakteri endofit yaitu
lengkuas merah, masyarakat umum banyak memanfaatkan lengkuas merah
sebagai obat tradisional.
Tanaman lengkuas termasuk dalam genus Alpinia. Alpinia adalah genus
terbesar, paling luas dan taksonomi paling kompleks pada famili Zingiberaceae
dengan 230 spesies yang terdapat di seluruh daerah tropis dan subtropis Asia
(Kress et al. 2005). Berdasarkan penelitian etnobotani, spesies Alpinia telah
banyak dimanfaatkan sebagai bahan obat-obatan di negara Asia (Phang et al.
2013) dan menurut Ghosh dan Rangan (2012), genus Alpinia memiliki potensi
biomedis yang dapat digunakan dimasa yang akan datang. Di Indonesia lengkuas
banyak dimanfaatkan sebagai bumbu dapur, pengawet makanan dan digunakan
sebagai obat gosok untuk mengobati penyakit kulit seperti panu (Handajani &
Purwoko 2008). Tanaman lengkuas ada beberapa jenis antara lain lengkuas putih
(Alpinia galangal) yang banyak digunakan sebagai bumbu dapur dan lengkuas
merah (Alpinia purpuruta) digunakan sebagai obat oleh masyarakat umum
(Bermawie et al. 2012). Berbagai manfaat lengkuas yang dipercaya masyarakat
yaitu menghilangkan panu, menghilangkan bau mulut, mengobati sakit gigi,
melancarkan peredaran darah dan mengobati asam urat. Itokawa dan Takeya
(1993) menjelaskan bahwa tanaman lengkuas mengandung golongan senyawa
flavonoid, fenol dan terpenoid yang dapat digunakan sebagai bahan dasar obatobatan modern.
Secara farmakologis, ekstrak lengkuas mempunyai aktivitas sebagai
antijamur (Khattak et al. 2005), antikanker (Rusmarilin 2003), antioksidan yang
cukup tinggi (Juntachote & Berghofer 2005), sebagai immunomodulator (Weidner
et al. 2007), penurun tekanan darah tinggi, obat gatal (Morikawa et al. 2005) serta
peningkat kesuburan dengan meningkatkan jumlah dan motilitas sperma
(Chudiwal et al. 2010). Zat aktif acetoxychavicol acetate (ACA) yang terkandung

2

dalam lengkuas dapat menghambat perkembangan virus HIV (Ying & Baoan
2006), sebagai antitumor dan antimikroba (Vankar et al. 2006; Voravuthikunchai
et al. 2006). Menurut Oonmetta-aree (2006), ekstrak lengkuas memiliki aktivitas
daya hambat yang tinggi terhadap Staphylococcus aureus dibandingkan kunyit,
jahe dan krachai. Penelitian bunga lengkuas merah (Santos et al. 2012)
menghasilkan 42 minyak esensial, komponen utama minyak esensial yang
dihasilkan yaitu α-pinene, β-pinene dan β-caryophyllene yang dianalisis
menggunakan GC-MS. Minyak esensial yang diperoleh diujikan pada larva
nyamuk Aedes aegypti dan larva nyamuk demam berdarah yang memberikan hasil
positif, serta pengujiannya pada bakteri Gram negatif dan bakteri Gram positif
yang hasilnya dapat dihambat secara signifikan. Dan menurut Victorio et al.
(2009), Rimpang lengkuas merah mengandung senyawa flavonoid, kaempferol-3rutinoside dan kaempferol-3-oliucronide.
Berbagai manfaat tanaman lengkuas merah ini dapat menjadi acuan untuk
memperoleh senyawa aktif yang terdapat dalam tanaman lengkuas yang nantinya
dapat dikembangkan sebagai senyawa antibakteri. Namun, pengambilan senyawa
bioaktif dari tanaman membutuhkan banyak biomassa. Cara efisien untuk
memperoleh senyawa bioaktif tersebut adalah menggunakan mikroba endofit.
Endofit diketahui mampu menghasilkan sejumlah senyawa bioaktif, sehingga
tidak harus mengekstrak senyawa bioaktif tersebut dari tanaman inangnya.
Beragam metabolit telah diisolasi dari endofit seperti alkaloid, peptida, steroid,
terpenoid, fenol, kuinon dan flavonoid (Sun et al. 2010). Bakteri endofit memiliki
potensi yang besar untuk dimanfaatkan sebagai penghasil senyawa aktif seperti
yang terkandung dalam tanaman inangnya.
Pemanfaatan mikroorganisme jenis bakteri endofit telah banyak menarik
perhatian karena kemampuannya menghasilkan senyawa aktif, senyawa aktif ini
digunakannya untuk mempertahankan diri dari serangan hama maupun
lingkungan. Bakteri endofit dan inangnya memiliki jalur sintesis senyawa aktif
yang sama karena transfer gen, sehingga senyawa aktif yang dihasilkan oleh
inangnya juga dapat diproduksi oleh bakteri endofit, bahkan dipercaya bahwa
bakteri endofit dapat menghasilkan senyawa aktif jauh melampaui inangnya
(Wang & Dai 2011).
Berdasarkan hal diatas, tanaman lengkuas merah dapat dimanfaatkan
sebagai sumber bakteri endofit yang dapat menghasilkan senyawa aktif yang
aktivitas dan manfaat serupa dengan tanaman inangnya, seperti senyawa
antibakteri. Senyawa antibakteri yang dihasilkan dapat berperan penting dalam
dunia medis. Sampai saat ini, belum ada publikasi tentang isolasi dan pengujian
terhadap senyawa aktif yang diproduksi oleh bakteri endofit tanaman lengkuas
merah.
Perumusan Masalah
Tanaman lengkuas merah (Alpinia purpuruta) banyak digunakan sebagai
obat tradisional dan beberapa penelitian telah membuktikan bahwa lengkuas
merah memiliki aktivitas antibakteri, namun penelitian bakteri endofit potensial
pada tanaman lengkuas merah sejauh ini belum ada publikasi.

3
Tujuan Penelitian
Penelitian ini bertujuan mengisolasi dan mengkaraterisasi bakteri endofit
yang menghasilkan senyawa antibakteri yang diperoleh dari tanaman lengkuas
merah (Alpinia purpuruta) dan menganalisis senyawa aktif potensial antibakteri.
Manfaat Penelitian
Hasil penelitian ini diharapkan dapat menambah informasi tentang cara
mengisolasi dan mengkaraterisasi bakteri endofit yang menghasilkan senyawa
antibakteri yang diperoleh dari tanaman lengkuas merah (Alpinia purpuruta) dan
menganalisis senyawa aktif potensial antibakteri.
Hipotesis
Bakteri endofit tanaman lengkuas merah (Alpinia purpuruta)
menghasilkan senyawa yang memiliki aktivitas antibakteri terhadap bakteri
patogen Gram positif (Staphylococcus aureus dan Streptococcus mutans), dan
Gram negatif (Salmonella sp. dan Escherichia coli) dengan menggunakan alat
GC-MS senyawa aktifnya dapat dianalisis sedangkan untuk isolat bakteri endofit
potensial dapat dikarakterisasi menggunakan sekuen 16S rRNA.

2 METODE
Waktu dan Tempat Penelitian
Penelitian ini dilaksanakan pada bulan Oktober 2015 hingga Maret 2016 di
Laboratorium Bakteriologi, Divisi Mikrobiologi Medik Fakultas Kedokteran
Hewan IPB dan Laboratorium Penelitian Departemen Biokimia FMIPA IPB.
Alat dan Bahan
Alat yang akan digunakan sebagai berikut : Pipet mikro, tabung reaksi,
gelas kimia, jangka sorong, cawang Petri, Ose, bunsen, autoklaf, mesin
sentrifugasi, corong pisah, vakum evaporator, inkubator (Orbital Shaking
Incubator), spektrofotometri UV-VIS, mikroskop, mesin Polymerase Chain
Reaction (PCR), Applied Biosystems model 3730XL automated DNA sequencing
system (Applied BioSystems, USA) dan alat GC-MS (Agilent Technologies,
USA). Bahan yang akan digunakan sebagai berikut : Rimpang (RL), batang (BL)
dan daun (DL) tanaman lengkuas merah segar yang diperoleh dari Pusat Studi
Biofarmaka IPB, kultur Staphylococcus aureus, Streptococcus mutans,
Salmonella sp. dan Escherichia coli (koleksi dari Laboratorium Bakteriologi
Fakultas Kedokteran Hewan, Institut Pertanian Bogor), Nutrient Agar (Oxoid)
dan Nutrient Broth (Difco), Na-hipoklorit 5%, alkohol 75%, etil asetat, n-heksan,
kloroform, larutan garam steril, kloramfenikol, aquades, nistanin, katalase,
oksidase, urease, sitrat, TSA, MacConkey, manitol, maltosa, glukosa, laktosa,
sukrosa, kristal violet, safranin, kertas tetrametil, primer (27F, 1492R, 785F dan
907R), InstaGene Matrix (Bio-Rad, USA), Montage PCR Clean up kit (Milipore)
dan Big Dye terminator cycle sequencing kit (Applied BioSystems, USA).
Prosedur Penelitian
Isolasi Bakteri Endofit dari Lengkuas Merah
Rimpang (RL), batang (BL) dan daun (DL) lengkuas merah segar yang
digunakan, terlebih dahulu dibersihkan secara menyeluruh dibawah air mengalir
hingga bersih. Sampel disterilisasi permukaannya dengan dicelupkan ke dalam
sodium hipoklorit 5% selama 5 menit, kemudian dibilas empat kali dengan air
steril. Lalu direndam selama 1 menit dalam alkohol 75% dan dibilas dengan air
steril. Sampel yang steril dipotong-potong kecil melalui proses yang steril.
Selanjutnya, sampel ditanam di media NA (Nutrient Agar) yang telah
ditambahkan nistatin (60 µL/60 mL) dan diinkubasi di ruang gelap pada suhu
30°C selama 48 jam dan diamati hingga terdapat koloni yang tumbuh selama.
Bakteri endofit yang tumbuh secara bertahap dimurnikan satu per satu dan
dipisahkan berdasarkan koloninya.

5
Seleksi Isolat Bakteri Endofit yang Potensial sebagai Antibakteri (Simarmata
et al. 2007)
Kultur bakteri uji (Staphylococcus aureus, Streptococcus mutans,
Salmonella sp. dan Escherichia coli) ditumbuhkan di media cair (Nutrient Broth)
dan diinkubasi selama 24 jam pada suhu 37°C, dan diambil sebanyak 0.4 mL
kemudian ditambahkan ke dalam 80 mL media NA yang bersuhu ±40°C dan
dikocok. Media NA yang berisi bakteri uji dituang kedalam cawan Petri steril
sebanyak 20 mL dan didiamkan hingga memadat. Isolat bakteri endofit yang telah
diregenerasi, diinokulasi ke media yang berisi bakteri uji menggunakan Ose dan
diinkubasi disuhu 37°C selama 24-48 jam secara aseptik. Zona hambat yang
terbentuk diamati dan diukur menggunakan jangka sorong, dengan adanya zona
hambat di sekeliling isolat bakteri endofit menunjukkan adanya aktivitas senyawa
antibakteri yang dihasilkan oleh bakteri endofit. Isolat endofit potensial sebagai
antibakteri dianalisis lebih lanjut.
Karakterisasi Morfologi Sel dan Biokimia Isolat Bakteri Endofit Potensial
(Cowan 1974)
Isolat bakteri endofit potensial dikarakterisasi dengan metode
konvensional yaitu uji morfologi dan biokimia, meliputi: pewarnaan Gram, uji
katalase, uji oksidase, urease, pertumbuhan (MacConkey, TSA dan sitrat),
fermentasi karbohidrat (manitol, maltosa, glukosa, sukrosa dan laktosa). Isolat
bakteri endofit potensial diregenerasi pada media NA dan diinkubasi selama 24
jam. Isolat bakteri endofit potensial yang telah siap selanjutnya dilakukan
pewarnaan Gram dengan cara, menggoreskan isolat bakteri endofit pada keseluruh
plat kaca menggunakan kawat Ose dan ditambahkan sedikit larutan garam steril.
Selanjutnya dikeringkan, setelah kering ditetesi larutan kristal violet hingga
menutupi seluruh plat kaca dan didiamkan selama 1 menit. Ditetesi lagi larutan
lugol iodin dan didiamkan 1 menit. Kemudian dibilas dengan aquades dan alkohol
selama 15 detik setelah itu, dibilas lagi dengan aquades. Terakhir ditetesi safranin
selama 1 menit dan dibilas dengan aquades. Plat kaca dikeringkan dan kemudian
diamati dengan menggunakan mikroskop.
Isolat bakteri endofit yang telah diregenerasi di media NA ditumbuhkan
lagi pada media pertumbuhan MacConkey, TSA dan sitrat dengan cara digoreskan
menggunakan kawat Ose, dan diinkubasi selama 24 jam pada suhu 30°C.
Pengujian selanjutnya yaitu untuk melihat kemampuan fermentasi karbohidrat
isolat bakteri endofit, dengan menggunakan kawat Ose isolat bakteri endofit
masing-masing dimasukkan dalam larutan manitol, maltosa, glukosa, sukrosa dan
laktosa dan diinkubasi pada suhu 30°C dan diamati perubahannya setelah 24 jam.
Karakterisasi Molekuler Isolat Bakteri Endofit Potensial dengan Analisis
Sekuen 16S rRNA (Macrogen)
Isolasi DNA isolat bakteri endofit Potensial. Koloni isolat disuspensikan
ke dalam 0.5 mL garam steril pada tabung sentrifugasi menggunakan tusuk gigi
steril. Selanjutnya disentrifugasi dengan kecepatan 10000 rpm selama 10 menit.
Pelet yang dihasilkan, diresuspensi dengan menambahkan 0.5 mL InstaGene
Matrix (Bio-Rad, USA). Kemudian diinkubasi pada suhu 56°C selama 30 menit

6
dan dipanaskan 10 menit pada suhu 100°C. Supernatan yang diperoleh setelah
pemanasan selanjutnya dapat digunakan untuk proses PCR.
Amplifikasi DNA dan pengurutan basa (sequencing) gen 16S rRNA.
Proses amplifikasi ini menggunakan PCR (Polymerase Chain Reaction).
Sebanyak 1 μL DNA dimasukkan kedalam 20 μL larutan reaksi PCR yang berisi
primer 27F dan 1492R. Pengulangan dilakukan sebanyak 35 siklus dengan
beberapa tahapan: tahap denaturasi (suhu 94°C selama 45 detik), penempelan
(55°C selama 60 detik) dan perpanjangan (72°C selama 60 detik). Hasil yang
diperoleh dipurifikasi dengan menggunakan alat Montage PCR Clean up kit
(Millipore). Dengan menggunakan primer 785F dan 907R, hasil PCR di
sequencing dengan menggunakan Big Dye terminator cycle sequencing kit
(Applied BioSystems, USA), dan dianalisis menggunakan Applied Biosystems
model 3730XL automated DNA sequencing system (Applied BioSystems, USA).
Analisis hasil sequencing. Urutan basa DNA hasil sequencing selanjutnya
disejajarkan dengan menggunakan program BioEdit Sequence Alignment Editor
ver. 7.2.0. Hasil pensejajaran kemudian dianalisis menggunakan program BLAST
pada situs www.ncbi.nlm.nih.gov yang bertujuan untuk mengetahui spesies isolat
bakteri endofit yang potensial dan rekonstruksi pohon filogenik metode Neighbor
Joining .
Fermentasi dan Ekstraksi Senyawa Antibakteri dari Isolat Bakteri Endofit
Potensial (Melliawati et al. 2006 modifikasi)
Satu Ose isolat bakteri endofit BL3, RL4 dan DL4 dikultivasi dalam media
nutrient broth 50 mL dan diinkubasi dalam penggoyang berputar (Orbital Shaking
Incubator) pada suhu 30°C selama 36 jam dengan kecepatan 150 rpm. Kemudian
hasil fermentasi disetrifugasi yang bertujuan memisahkan pelet dan supernatan,
selama 15 menit dengan kecepatan 3600 rpm. Supernatan ditambahkan pelarut nheksan, etil asetat, klorofrom (1:1 v/v), kemudian diinkubasi dalam penggoyang
berputar (Orbital Shaking Incubator) pada suhu 30°C selama 2 jam dengan
kecepatan 150 rpm, selanjutnya supernatan dan ekstrak n-heksan, etil asetat dan
kloroform dipisahkan menggunakan corong pisah, ekstrak yang diperoleh diuji
masing-masing aktivitas antibakteri terhadap Staphylococcus aureus,
Streptococcus mutans, Salmonella sp. dan Escherichia coli dengan menggunakan
metode difusi sumur dan masing-masing pelarut sebagai kontrol negatif,
selanjutnya ekstrak potensial sebagai antibakteri dievaporasi pada suhu 50°C.
Ekstrak kental yang potensial dengan berbagai konsentrasi (100 ppm, 250 ppm,
500 ppm, 750 ppm, 1000 ppm) diujikan menggunakan metode difusi sumur
terhadap bakteri Staphylococcus aureus, Streptococcus mutans, Salmonella sp.
dan Escherichia coli, pelarut sebagai kontrol negatif dan kloramfenikol 100
µg/mL kontrol positif.
Identifikasi Senyawa Antibakteri Ekstrak Etil Asetat dengan GC-MS
Ekstrak etil asetat isolat RL4 diinjeksikan 1 µL ke kolom GC-MS. Proses
GC-MS menggunakan kolom kapiler tipe Agilent J & W GC diameter 0.25 mm,
panjang 60 m, gas pembawa helium, temperatur max detektor 325°C, split ratio
1:1, dan suhu kolom 100°C. Suhu dinaikkan 15°C permenit hingga mencapai
suhu 290°C yang stabil pada menit ke-30. Hasil GC-MS yang diperoleh

7
dibandingkan dengan database (Willey9N11.L). Hasil analisis ini berupa bobot
molekul dan pola fragmentasi.

8
3 HASIL
Isolat Bakteri Endofit Lengkuas Merah (Alpinia purpuruta)
Bakteri endofit berhasil diisolasi dari lengkuas merah. Lengkuas merah
merupakan tanaman yang tumbuh tegak, batangnya terdiri dari susunan pelepah
daun. Daunnya bulat panjang yang bagian bawah terdiri atas pelepah-pelepah.
Rimpang umbinya berwarna kemerahan, berserat kasar dan beraroma khas
(Gambar 1). Lengkuas merah ini diperoleh dari kebun Biofarmaka IPB. Lengkuas
merah yang digunakan adalah lengkuas merah segar. Sampel lengkuas merah
disterilisasi permukaan menggunakan sodium hipoklorit dan alkohol tujuannya
untuk menghilangkan mikroorganisme epifit, sebelum diinokulasi pada media
nutrien agar. Selanjutnya, diinkubasi di ruang gelap dan suhu 30°C selama 48
jam. Koloni yang tumbuh selanjutnya dipisahkan berdasarkan morfologi
koloninya (Gambar 2). Bakteri endofit diisolasi sebanyak 16 isolat, masingmasing 4 isolat dari daun (RL) dan rimpang (DL), sedangkan pada batang (BL)
sebanyak 8 isolat (Gambar 3). Karakterisasi morfologi bakteri endofit dapat
dilakukan dengan melihat keragaman bakteri endofit dari lengkuas merah,
meliputi warna, elevasi, bentuk dan tekstur permukaan (Tabel 1).

Gambar 1 Tanaman lengkuas merah (Dokumentasi pribadi 2015)

A

B

C

Gambar 2 Koloni bakteri endofit lengkuas merah rimpang (A), batang (B) dan
daun (C)

9

1

1

2

2
3

2

1

8
4
3

4

7

4

3

5

6

A
B
C
Gambar 3 Isolat bakteri endofit rimpang (A), batang (B) dan daun (C)
Tabel 1 Morfologi koloni isolat bakteri endofit lengkuas merah
Isolat
Bakteri

Morfologi
Warna

Elevasi

RL1

Kuning

Timbul

RL2
RL3
RL4
BL1
BL2

Putih
Kuning
Kuning
Kuning
Putih

Cembung
Cembung
Cembung
Datar
Cembung

BL3

Kekuningan

Cembung

BL4

Kuning

Cembung

BL5

Kekuningan

Timbul

BL6

Kuning

Datar

BL7
BL8

Kekuningan
Kuning

Cembung
Timbul

DL1

Putih

Datar

DL2

Putih

Timbul

DL3

Putih

Cembung

DL4

Putih

Datar

Bentuk

Tekstur
Permukaan

Tidak
beraturan
Bundar
Bundar
Bundar
Bundar
Bundar
Tidak
beraturan
Bundar
Tidak
beraturan
Tidak
beraturan
Bundar
Bundar
Tidak
beraturan
Tidak
beraturan
Tidak
beraturan
Tidak
beraturan

Halus
Halus
Halus
Halus
Halus
Halus
Halus
Halus
Halus
Halus
Halus
Halus
Kering
Kering
Kering
Kering

Seleksi Isolat Bakteri Endofit Potensial Antibakteri
Isolat bakteri endofit diujikan terhadap bakteri patogen yang bertujuan
untuk menseleksi isolat bakteri endofit yang berpotensi sebagai penghasil
senyawa antibakteri. Metode seleksi isolat bakteri endofit yang memiliki aktivitas

10

antibakteri yaitu dengan inokulasi titik terhadap bakteri patogen. Bakteri patogen
yang digunakan yaitu bakteri Gram positif (Staphylococcus aureus dan
Streptococcus mutans) dan bakteri Gram negatif (Salmonella sp. dan Escherichia
coli). Isolat bakteri endofit ini memiliki aktivitas yang berbeda-beda dalam
menghambat bakteri patogen. Tabel 2 menunjukkan aktivitas antibakteri setiap
isolat bakteri endofit. Isolat bakteri endofit yang memiliki aktivitas kuat dalam
menghambat bakteri patogen merupakan bakteri potensial yang selanjutnya
dikarakterisasi untuk mengetahui jenis spesies bakterinya.
Tabel 2 Hasil pengujian isolat bakteri endofit terhadap bakteri patogen
Isolat
Bakteri
RL1
RL2
RL3
RL4
BL1
BL2
BL3
BL4
BL5
BL6
BL7
BL8
DL1
DL2
DL3
DL4

Staphylococcus
aureus
v
v
v
4
v
4
3
v
3

Diameter Zona Bening (mm)
Streptococcus
Escherichia
mutans
coli
1
1
2
1
v
1
5
1
v
2
4
1,5
1
2
4
v
1
v
3
1
2
1,5
2

Salmonella sp.
1
1
1
4
1
3
1
3
1
2
2
2

Keterangan : (v) terdapat zona hambat tetapi sangat kecil dan sulit terukur

Isolat bakteri endofit pada batang (BL3, BL5, dan BL7) memiliki daya
hambat yang kuat dibanding isolat bakteri endofit batang lainnya yang ditandai
dengan luasnya zona bening yang terbentuk. Sedangkan, isolat bakteri endofit
rimpang kode (RL4) dan isolat bakteri endofit daun kode (DL4) mampu
menghambat bakteri Gram positif dan Gram negatif namun, aktivitasnya jauh
lebih kecil dibanding isolat pada batang. Isolat bakteri endofit RL4, BL3 dan DL4
adalah bakteri potensial karena mampu menghambat keempat bakteri patogen dan
aktivitas hambatanya jauh lebih besar dibanding isolat bakteri endofit lainnya
ditandai dengan luas zona bening yang terukur.
Karakterisasi Morfologi Sel dan Biokimia Isolat Bakteri Endofit Potensial
Karakterisasi morfologi sel isolat bakteri endofit potensial dilakukan
dengan pewarnaan Gram. Pewarnaan Gram merupakan pewarnaan diferensial
yang paling sering digunakan untuk mengidentifikasi bakteri. Bakteri yang dapat

11

mempertahankan warna kristal violet termasuk bakteri Gram positif sedangkan
bakteri yang berubah warna menjadi kemerahan setelah penambahan safranin
menunjukkan bakteri Gram negatif. Pengamatan pewarnaan sel isolat BL3, RL4
dan DL4 (Gambar 4), menunjukkan bahwa isolat BL3 dan RL4 termasuk bakteri
Gram negatif, berbentuk batang dan isolat DL4 Gram positif, berbentuk batang.
Pengujian selanjutnya adalah metabolisme bakteri endofit secara biokimia.
Isolat bakteri endofit diuji kemampuannya memfermentasikan karbohidrat,
hidrolisis sitrat, katalase dan oksidase. Hasil karakterisasi morfologi dan biokimia
isolat BL3, RL4 dan DL4 dibandingkan dengan ciri-ciri jenis bakteri yang
didefenisikan Cowan (1974), menunjukkan isolat BL3 dan RL4 memiliki
kemiripan dengan bakteri Burkhorderia, sedangkan isolat DL4 memiliki
kemiripan dengan bakteri Bacillus. Tabel 4 menunjukkan hasil karakterisasi
morfologi sel dan biokimia isolat RL4 dan DL4.

A
B
C
Gambar 4 Pewarnaan Gram sel bakteri isolat RL4 (A), BL3 (B) dan DL4 (C)
Tabel 3 Karakterisasi morfologi sel dan biokimia
Parameter Uji
Pewarnaan
Pertumbuhan
420C
MacConkey
Sitrat
TSA
Urea
Uji karbohidrat
Maltosa
Glukosa
Laktosa
Sukrosa
Malnitol
Katalase
Oksidase

RL4
Gram
negatif/Batang

BL3
Gram
negatif/Batang

DL4
Gram
positif/Batang

-

-

+
-

+
+
+
+
+
+
+

+
+
+
+
+
+
+

+
+
+
+
+
+
+

Keterangan : (+) uji positif, (-) uji negative

12

Karakterisasi Molekuler 16S rRNA Isolat Bakteri Endofit Potensial
Isolat BL3, RL4 dan DL4 dikarakterisasi menggunakan analisis 16S
rRNA, hasil sekuensing berdasarkan warna puncak kromatogram yang
menggambarkan letak nukleotida amplifikasi hulu dan hilir. Urutan basa hasil
analisis 16S rRNA ini, dibandingkan dengan urutan basa pada NCBI-GenBank
database. Hasil pensejajaran sekuen 16S rRNA, menunjukkan bahwa panjang
pasangan basa isolat BL3 1483 bp, RL4 1467 bp dan DL4 1494 bp.
Urutan basa hasil sekuensing dianalisis menggunakan program BLAST.
Hasil BLAST menunjukkan persentase kemiripan isolat BL3 dengan
Burkholderia gladioli BSR3 strain BSR3 sebesar 99%, nilai bit score 2717 dan Evalue 0, isolat RL4 memiliki kemiripan 99%, nilai bit score 2699, E-value 0
dengan Burkholderia cenocepacia J2315, sedangkan isolat DL4 memiliki
kemiripan 99% dengan Bacillus amyloliquefaciens DSM7, bit score 2736 dan Evalue 0. Perbandingan tingkat kemiripan sekuen isolat BL3, RL4 dan DL4 dengan
sekuen 16S rRNA yang terdapat pada GenBank NCBI dengan progam BLAST
dapat dilihat pada (Lampiran 2). Hasil BLAST diperkuat dengan rekonstruksi
pohon filogenik metode Neighbor Joining (Lampiran 3).
Aktivitas Antibakteri Senyawa Aktif Isolat Potensial
Senyawa aktif yang memiliki aktivitas antibakteri dari bakteri endofit
isolat BL3, RL4 dan DL4 diisolasi dengan proses fermentasi dan ekstraksi. Isolat
BL3, RL4 dan DL4 dikultivasi selama 36 jam berdasarkan kurva pertumbuhan
yang telah dibuat (Lampiran 4). Ekstraksi senyawa antibakteri isolat BL3, RL4
dan DL4 menggunakan pelarut n-heksan, etil asetat dan kloroform. Ekstrak
masing-masing pelarut diujikan terhadap bakteri patogen. Hasil uji aktivitas fraksi
setiap pelarut isolat BL3, RL4 dan DL4 terhadap bakteri patogen ditunjukkan
pada Tabel 4.
Tabel 4 Aktivitas antibakteri fraksi isolat bakteri endofit potensial
Jenis
Sal.sp (mm) S. aureus (mm) S. mutans (mm)
E. coli (mm)
Pelarut BL3 RL4 DL4 BL3 RL4 DL4 BL3 RL4 DL4 BL3 RL4 DL4
Kloroform
v
v
v
v
1
Etil asetat
2
v
v
v
1
v
n-heksan
Keterangan : (v) terdapat zona hambat tetapi sangat kecil dan sulit terukur

Fraksi etil asetat RL4 memiliki aktivitas antibakteri yang lebih besar
dibanding fraksi lainnya. Fraksi etil asetat RL4 ini diuapkan pelarutnya pada suhu
500C dengan menggunakan evaporator hingga diperoleh ekstrak kental. Ekstrak
kental yang diperoleh sebanyak 14,80 mg. Ekstrak kental fraksi etil asetat RL4
dilarutkan kembali dengan pelarut etil asetat dengan konsentrasi bertingkat (100
ppm, 250 ppm, 500 ppm, 750 ppm dan 1000 ppm). Masing-masing konsentrasi
fraksi etil asetat isolat RL4 diujikan kembali terhadap bakteri Staphylococcus
aureus, Salmonella sp. dan Escherichia coli. Kloramfenikol digunakan sebagai
kontrol positif dan pelarut etil asetat sebagai kontrol negatif. Hasil pengukuran

13
luas zona hambat masing-masing konsentrasi fraksi etil asetat isolat RL4
ditunjukkan pada Tabel 5.
Tabel 5 Aktivitas antibakteri fraksi etil asetat isolat bakteri endofit RL4
Bakteri
Patogen
(mm)

Kontrol (-)
Etil asetat

Sal.sp
S. aureus
E.coli

-

Zona bening
Kontrol (+)
Kloramfenikol
100 µg/mL
(mm)
18
20
24

Zona bening (mm)
100
ppm

250
ppm

500
ppm

750
ppm

1000
ppm

3
3
5

5
3
6

5
3
8

6
7
12

7
9
13

Analisis GC-MS Senyawa Aktif Antibakteri Fraksi Etil Asetat Isolat RL4
Hasil analisis GC-MS fraksi etil asetat isolat RL4 teridentifikasi 112
senyawa berdasarkan database (Willey9 N11.L ), dengan kromatogram seperti
pada Gambar 5.
A b u n d a n c e

T IC : R IM P A N G L E N G K U A S
1 3 . 7 21 26 . 01 57 9. 8 3 4

F

E T O A C

U L .D \ d a ta .m s

8 5 0 0 0 0 0
8 0 0 0 0 0 0
7 5 0 0 0 0 0
7 0 0 0 0 0 0
6 5 0 0 0 0 0
6 0 0 0 0 0 0
5 5 0 0 0 0 0
5 0 0 0 0 0 0
4 5 0 0 0 0 0
4 0 0 0 0 0 0

1 6 . 7 16 82 . 7 6 7
1 5 .9 3 1

3 5 0 0 0 0 0
3 0 0 0 0 0 0
2 5 0 0 0 0 0
2 0 0 0 0 0 0

8 .5 1 7
8 .2 0 8

1 ..545.41
1 27
6 8
11 44
1 7 .7 0 4
2 0 .0 2 0
2 1 .5 1 8

3 2 .0 4
8 7
6
3 1
1 .. 9
9 3
6 1
6
3

1 0 .4 8 5
1 1 .1 7 0

1 5 0 0 0 0 0
1 0 0 0 0 0 0
5 0 0 0 0 0
1 0 .0 0

1 5 .0 0

2 0 .0 0

2 5 .0 0

3 0 .0 0

3 5 .0 0

4 0 .0 0

T im e -->

Gambar 5 Kromatogram hasil analisis GC-MS fraksi etil asetat isolat RL4
Senyawa dokosan teridentifikasi dengan kecocokan mencapai 99% dengan
senyawa yang terkandung dalam fraksi etil asetat RL4 dengan waktu retensi
15.953 menit, senyawa eikosan dengan tingkat kecocokan 98%, waktu retensi
16.764 menit dan 23.346 menit dan tetrakosan 98% pada waktu retensi 17.704
menit. Senyawa lainnya yang terdeteksi dalam ekstrak etil asetat yang memiliki
kecocokan tinggi dengan senyawa aktif yaitu heneikosan (97%),
heksadekanamida (97%), pentakosan (97%), oktadekan (96%), asam heksanedioat

14
(95%) dan pentadekan (95%), setiap senyawa memiliki pola fragmentasi yang
berbeda-beda (Lampiran 5).

4 PEMBAHASAN
Isolat Bakteri Endofit Lengkuas Merah (Alpinia purpuruta)
Bakteri endofit dapat diisolasi dari jaringan tanaman lengkuas merah baik
dari daun, batang maupun rimpang. Menurut Yu et al. (2010), bakteri endofit
dapat ditemukan di seluruh spesies tanaman di dunia dan memberikan keuntungan
terhadap inangnya. Bakteri endofit adalah mikroorganisme yang seluruh atau
sebagian hidupnya berada dalam jaringan tumbuhan (akar, batang, cabang atau
ranting tumbuhan), yang mana diantara keduanya terjalin hubungan yang saling
menguntungkan. Mikroba ini hidup diantara sel tumbuhan dan bersimbiosis
mutualisme dengan tanaman inangnya (Kumala & Siswanto. 2007). Kebanyakan
tanaman inang memiliki satu atau lebih jenis bakteri endofit yang dimilikinya
(Castilo et al. 2003). Bakteri endofit memberikan keuntungan untuk tanaman
inang dengan memproduksi senyawa pengatur pertumbuhan tanaman yang dapat
memberikan ketahanan terhadap penyakit dan juga membantu dalam fitoremediasi
(Lodewyckx et al. 2002). Selain itu, bakteri endofit juga mampu menghasilkan
senyawa aktif, yang sama dengan inangnya. Bakteri endofit telah berhasil diisolasi
dari tanaman padi (Sang et al. 2014), akar jagung (Szilagyi-Zecchin et al. 2014 ),
bawang putih yang menghasilkan endofit jenis Trichoderma brevicompactum
yang memiliki aktivitas penghambat Rhizoctonia solani, Botrytis cinerea, dan
Colletotrichum lindemuthianum (Shentu et al. 2014) dan Bakteri endofit jenis
Lysinibacillus sp. telah berhasil diidentifikasi dari tanaman bakau (Avicennia
marina) yang memiliki kemampuan menghasilkan adenosine deaminase
(Kathiresan et al. 2014). Menurut (Retnowati et al. 2012), kemampuan bakteri
endofit menghasilkan senyawa metabolit sekunder akan berbeda-beda bergantung
pada asal isolat bakteri endofit, jenis bakterinya dan kondisi perakaran tanaman
inangnya.
Bakteri endofit diisolasi dari jaringan lengkuas merah melalui proses
sterilisasi permukaan, menggunakan sodium hipoklorit 5% yang berfungsi sebagai
disinfektan mikroorganisme epifit dari permukaan sampel. Menurut Valera et al.
(2009), sodium hipoklorit bekerja mengoksidasi enzim-enzim penting dalam
proses metabolisme sel mikroorganisme. Selain itu klorin juga bekerja dengan
berikatan dengan komponen sitoplasma sel mikroorganisme, menghasilkan
senyawa n-kloro yang bersifat toksik dan merusak sel mikroorganisme. Estrela et
al. (2002) mengungkapkan bahwa senyawa klorin dapat bereaksi dengan asam
amino menghasilkan kloramin. Kloramin tersebut bersifat oksidatif dan dapat
bersifat toksik sehingga menyebabkan kematian pada sel. Berdasarkan hal-hal
tersebut, penggunaan sodium hipoklorit dimaksudkan untuk menghilangkan
mikroorganisme epifit sehingga koloni yang tumbuh pada permukaan medium
agar disekitar potongan jaringan sampel, benar merupakan koloni bakteri endofit,
selain itu pada media pertumbuhan ditambahkan nistatin yang berfungsi sebagai
antifungi (Silva et al. 2008). Sampel lengkuas merah diinokulasi dimedia nutrien
agar yang telah ditambahkan nistatin dan diinkubasi pada ruang gelap dan suhu
30°C tujuannya untuk memaksimalkan pertumbuhan setiap koloni bakteri endofit
yang dihasilkan. Setiap koloni dipisahkan berdasarkan bentuk morfologinya
(Gambar 2).

16

Hasil isolasi bakteri endofit pada lengkuas merah diperoleh 16 isolat
(Gambar 3), isolat terbanyak terdapat di batang yaitu 8 isolat, sedangkan pada
daun dan rimpang masing-masing 4 isolat. Menurut Lodewyckx et al. (2002),
bakteri endofit dapat diisolasi dari akar, daun, batang, bunga, buah dan biji
tanaman. Keragaman morfologi koloni bakteri endofit ditunjukkan pada Tabel 1.
Keragaman bakteri endofit bergantung pada kondisi tanaman inang, misal umur
tanaman, jenis tanaman, tempat tumbuh, waktu pengambilan sampel, dan sebaran
geografis (Seo et al. 2010; Mano et al. 2007).
Seleksi Aktivitas Antibakteri Isolat Bakteri Endofit
Isolat bakteri endofit yang diperoleh diuji aktivitas antibakterinya terhadap
bakteri patogen Gram positif (Staphylococcus aureus dan Streptococcus mutans)
dan bakteri Gram negatif (Salmonella sp. dan Escherichia coli) melalui metode
inokulasi titik. Uji positif isolat bakteri endofit menghambat bakteri patogen Gram
positif dan Gram negatif ditandai dengan terbentuknya zona bening di sekitar titik
isolat. Menurut Kusumawati (2014), zona bening yang terbentuk adalah bentuk
hambatan dari senyawa metabolit yang dihasilkan bakteri endofit.
Hasil uji aktivitas antibakteri isolat bakteri endofit lengkuas merah
menunjukkan spektrum yang luas karena dapat menghambat bakteri patogen
Gram positif dan Gram negatif, isolat bakteri endofit yang mampu menghambat
bakteri Gram positif dan Gram negatif adalah RL4, BL1, BL3, BL4, BL5, BL7,
DL3 dan DL4 (Tabel 2). Isolat bakteri endofit potensial terpilih yaitu RL4, BL3
dan DL4, isolat ini memiliki aktivitas hambatan terhadap bakteri patogen Gram
positif maupun Gram negatif lebih kuat dibandingkan isolat lainnya disetiap
bagian jaringannya sehingga dilanjutkan untuk karakterisasi. Setiap isolat bakteri
endofit memiliki aktivitas antibakteri berbeda-beda dan beberapa isolat tidak
memiliki aktivitas antibakteri, namun bisa jadi menghasilkan senyawa lain seperti
senyawa anti insektisida, antifungi atau hormon pertumbuhan Indole-3 Acetic
Acid (IAA) seperti yang dihasilkan bakteri endofit dari Oryza sativa L. organik
(Duangpaeng et al. 2012).
Isolat bakteri endofit yang memiliki aktivitas antibakteri menunjukkan jika
terdapat senyawa antibakteri yang dihasilkannya. Penelitian Parwata dan Dewi
(2008) menggunakan ekstrak rimpang lengkuas yang mengandung minyak atsiri
mampu menghambat bakteri Staphylococcus aureus. Hal ini menandakan, bakteri
endofit mampu mensintesis senyawa antibakteri yang sama dengan inangnya.
Berdasarkan penelitian, isolat potensial yang memiliki kemampuan
menghambat keempat bakteri patogen, masing-masing disetiap jaringan lengkuas
merah yaitu BL3 di jaringan batang, DL4 di jaringan daun dan RL4 di jaringan
rimpang. Selanjutnya isolat potensial dikarakterisasi dengan metode konvensional
dan analisis 16S rRNA.
Karakterisasi Morfologi dan Biokimia Isolat Bakteri Endofit Potensial
Isolat bakteri endofit BL3, DL4 dan RL4 dikarakterisasi morfologi sel dan
metabolisme biokimia dengan metode pewarnaan Gram, uji karbohidrat, uji
katalase, uji oksidase dan media pertumbuhan. Pengujian ini dilakukan karena

17
pengamatan morfologi koloni tidak cukup untuk mengidentifikasi jenis bakteri
endofit. Hasil pengujian ini dapat mendukung hasil karakterisasi molekuler dalam
mengidentifikasi spesies bakteri setiap isolat.
Pewarnaan Gram merupakan pewarnaan diferensial yang paling sering
digunakan dalam pengidentifikasian bakteri. Metode ini menggunakan beberapa
larutan pewarna yaitu kristal violet, lugol iodin, alkohol dan safranin. Pada bakteri
Gram negatif, pemberian larutan kristal violet akan mengubah warna dinding sel
menjadi warna ungu. Penambahan lugol iodin akan menempelkan warna ungu
hingga ke dalam sel dan membentuk kompleks ungu kristal yodium. Pembilasan
dengan alkohol akan melunturkan warna ungu tadi karena bakteri Gram negatif
mengandung lipid dalam persentase yang lebih tinggi daripada yang terkandung
dalam bakteri Gram positif dan dinding sel bakteri Gram negatif juga lebih tipis
daripada dinding sel bakteri Gram positif. Oleh karena itulah pembilasan dengan
alkohol menyebabkan terekstraksinya lipid sehingga memperbesar daya rembes
atau permeabilitas dinding sel. Jadi kompleks ungu kristal yodium yang telah
memasuki dinding sel dapat diekstraksi dan menyebabkan kehilangan zat warna
ungu. Penambahan larutan safranin adalah untuk memberikan warna merah pada
sel bakteri. Sel bakteri Gram negatif akan menyerap zat pewarna ini. Perbedaan
antara bakteri Gram positif dan Gram negatif disebabkan oleh perbedaan dinding
sel. Dinding sel bakteri Gram positif sebagian besar terdiri atas beberapa lapisan
peptidoglikan yang membentuk suatu struktur yang tebal dan kaku. Peptidoglikan
pada dinding sel bakteri ini membuat bakteri Gram positif resisten terhadap lisis
osmotik. Sehingga, bakteri Gram positif mempertahankan warna violet,
sedangkan bakteri Gram negatif berwarna merah. Berdasarkan pewarnaan Gram,
isolat BL3 dan RL4 termasuk Gram negatif berbentuk batang, sedangkan isolat
DL4 Gram positif berbentuk batang (Gambar 4).
Uji karbohidrat dilakukan untuk mengetahui apakah bakteri dapat
memfermentasi gula-gula seperti maltosa, laktosa, glukosa dan sukrosa. Uji positif
bakteri memfermentasi karbohidrat yaitu dapat mengubah warna larutan merah
menjadi kuning, Pada proses fermentasi, karbohidrat akan diubah oleh bakteri
menjadi asam organik, seperti asam laktat, asam format, atau asam asetat. Suasana
asam pada medium akan mengubah warna indikator fenol merah menjadi kuning
tua. Pada beberapa bakteri, proses fermentasi ini juga menghasilkan asam dan gas
(CO2). Gas yang dihasilkan akan terperangkap dalam tabung Durham, sehingga
akan tampak gelembung dalam tabung tersebut (Sulistiyaningsih 2008). Isolat
RL4, BL3 dan DL4 mampu memfermentasi karbohidrat.
Uji sitrat digunakan untuk mengetahui apakah bakteri menggunakan sitrat
sebagai sumber karbonnya, apabila media sitrat berubah warna dari hijau menjadi
biru menunjukkan hasil positif. Jika tidak terjadi perubahan warna, maka bakteri
tersebut tidak mempunyai enzim sitrat permease yaitu enzim spesifik yang
membawa sitrat ke dalam sel sehingga tidak menggunakan sitrat sebagai salah
satu atau satu-satunya sumber karbon. Uji katalase merupakan suatu pengujian
terhadap bakteri tertentu untuk mengetahui apakah bakteri tersebut merupakan
bakteri aerob, anaerob fakultatif atau anaerob obligat dan digunakan untuk
mengetahui kemampuan mikroorganisme untuk menguraikan hidrogen peroksida
dengan menghasilkan enzim katalase. Bakteri yang memerlukan oksigen
manghasilkan hidrogen peroksida (H2O2) yang sebenarnya beracun bagi bakteri
sendiri. Namun mereka dapat tetap hidup dengan adanya anti metabolit tersebut

18
karena mereka menghasilkan enzim katalase yang dapat mengubah hidrogen
peroksida menjadi air dan oksigen. Uji oksidase menunjukkan hasil positif dengan
memberikan perubahan warna pada kertas tetrametil dari putih menjadi ungu
(Huda et al. 2012). Berdasarkan pengujian morfologi dan biokimia isolat RL4,
BL3 dan DL4 mampu memfermentasi karbohidrat, dapat menghasilkan enzim
oksidase dan positif pengujian katalase sehingga dapat dikatakan bahwa ketiga
isolat bakteri endofit tersebut adalah bateri aerob.
Karakterisasi Molekuler 16S rRNA Isolat Bakteri Endofit Potensial
Karakterisasi morfologi dan biokimia tidak cukup untuk mengidentifikasi
spesies masing-masing isolat bakteri endofit sehingga diperlukan karakterisasi
secara molekuler sehingga data morfologi dan biokimia ini dapat dijadikan data
pendukung untuk menentukan spesies isolat bakteri endofit RL4, BL3 dan DL4.
Isolat Bakteri endofit dikarakterisasi menggunakan analisis 16S rRNA.
16S rRNA merupakan penyusun subunit 30S yang penting untuk translasi dan
terdiri dari 1550 pasangan basa (Clarridge 2004). Gen 16S rRNA sebagai penanda
molekuler yang banyak digunakan dalam studi filogenetik, evolusi dan taksonomi
prokariota (Rajendhran & Gunasekaran 2011). Gen 16S rRNA telah terbukti
sebagai penanda molekuler yang stabil dan spesifik untuk mengidentifikasi
bakteri. Selain itu, jumlah salinan gen 16S rRNA dapat berfluktuasi dari 1 sampai
15 diantara genom bakteri yang berbeda (Singh et al. 2012). Pada prokariota
terdapat tiga jenis RNA ribosomal yaitu 5S, 16S dan 23S rRNA. Diantara
ketiganya, 16S rRNA yang paling sering digunakan. Molekul 5S rRNA memiliki
urutan basa terlalu pendek, sehingga tidak ideal dari segi analisis statistika,
sementara molekul 23S rRNA memiliki struktur sekunder dan tersier yang cukup
panjang sehingga menyulitkan analisis (Clarridge 2004). Penelitian Aarti &
Khusro (2015) berhasil mengidentifikasi Bacillus tequilensis yang menghasilkan
enzim poligalakturonase menggunakan analisis 16S rRNA.
Berdasarkan hasil BLAST bakteri endofit isolat RL4 menunjukkan
kemiripan 99% dengan Burkholderia cenocepacia J2315, sedangkan isolat BL3
yaitu Burkholderia gladioli BSR3 strain BSR3 dan isolat DL4 99% mirip dengan
Bacillus amyloliquefaciens DSM7.
Genus Burkholderia tersebar luas diberbagai ekologi, namun paling
banyak ditemukan dalam tanah dan menunjukkan interaksi non-patogenic
terhadap tanaman. Burkholderia juga mampu melarutkan mineral dalam tanah
dengan menghasilkan asam organik, serta meningkatkan ketersediaan nutrisi
untuk tanaman sehingga sangat menjanjikan untuk dimanfaatkan dalam bidang
bioteknologi (Rambola et al. 2014).
Bakteri Burkholderia cenocepacia J2315 adalah bagian dari bakteri
Burkholderia cepacia complex (Bcc) yang merupakan bakteri patogen Gram
negatif yang menyebabkan penyakit cystic fibrosis (CF) (Bazzini et al. 2011),
namun berperan besar dalam bidang bioteknologi dan industri pertanian yaitu
sebagai biokontrol, bioremediasi dan promotor tanaman. Schmerk et al. (2011)
mengisolasi hopanoid dari Burkholderia cenocepacia yang merupakan senyawa
triterpenoid yang berperan penting dalam fisiologi bakteri Burkholderia
cenocepacia. Wartono (2012) melaporkan Burkholderia cepacia isolat E76
mampu menekan pertumbuhan cendawan R. solani secara in vitro dengan

19
konsentrasi formulasi 3%. Lipooligosakarida diisolasi dari Burkholderia
cenocepacia dan dikembangkan sebagai antimikroba dan terapi inflamasi (Silipo
et al. 2007).
Bakteri Burkholderia gladioli BSR3 strain BSR3 merupakan bakteri
negatif yang ditemukan diberbagai habitat