Kinetika Aktivitas Reduksi Nitrat Bakteri Nitrat Amonifikasi Disimilatif dari Muara Sungai pada Konsentrasi Oksigen (O2) yang Berbeda

KINETIKA AKTIVITAS REDUKSI NITRAT BAKTERI
NITRAT AMONIFIKASI DISIMILATIF DARI MUARA
SUNGAI PADA KONSENTRASI OKSIGEN (O2) YANG
BERBEDA

TETI MARDIATI

SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2009

PERNYATAAN MENGENAI TESIS DAN
SUMBER INFORMASI
Dengan ini saya menyatakan bahwa tesis Kinetika Aktivitas Reduksi Nitrat
Bakteri Nitrat Amonifikasi Disimilatif dari Muara Sungai pada Konsentrasi
Oksigen (O2) yang Berbeda adalah benar hasil karya saya sendiri dengan arahan
komisi pembimbing dan belum diajukan dalam bentuk apapun kepada perguruan
tinggi mana pun. Sumber informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang
diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari penulisan lain telah disebutkan dalam
teks dan dicantumkan dalam Daftar Pustaka di bagian akhir tesis ini

Bogor, Juni 2009

Teti Mardiati
NRP G351070201

ABSTRACT
TETI MARDIATI, Nitrate Reduction Activity Kinetics of Dissimilative Nitrate
Ammonification Bacteria Isolated from Estuary under Different Concentration of
Oxygen. Under direction of IMAN RUSMANA and TRI WIDIYANTO.
Dissimilative Nitrate ammonification bacteria have ability to remove
nitrate in aquatic environments. These groups are consist of fermentative bacteria
which reduce nitrate to ammonium with nitrous oxide (N2O) as by product. Four
selected isolates from tropical estuary were tested the growth and nitrate
reduction activities under different concentration of oxygen (O2). The results
showed that Cell density was increased by increasing of oxygen concentration. In
contrast, the activities of nitrate reduction was decreased by increasing of oxygen
concentration. HF7 and LF6 isolates had the highest nitrate reducing activity. The
maximum specific growth of HF7 isolate with asetate as carbon source, and 49.41
mM nitrate after 96 h incubation under air saturated of 1%, 10%, 100% was 0.034

CFUh-1, 0.040 CFUh-1, and 0.070 CFUh-1 respectively. While LF6 isolate was
0.035 CFU h-1, 0.045 CFU h-1, and 0.057 CFU h-1.
Nitrate removal rate of HF7 isolate with asetate as carbon source, and 49.41
mM nitrate after 96 h incubation under air saturated of 1%, 10%, 100% was 6.3 x
10 -10 mMh-1, 5.1 x 10 -10 mMh-1, and 3.3 x 10-10 mMh-1 respectively. While LF6
isolate was 2.0 x 10-10 mMh-1, 2,1 x 10-10 mMh-1 and 1,0 x 10-10 mMh-1
respectively.
Keywords: nitrate reduction, dissimilative nitrate ammonification
oxygen concentration.

bacteria,

RINGKASAN
TETI MARDIATI. Kinetika Aktivitas Reduksi Nitrat Bakteri Nitrat Amonifikasi
Disimilatif dari Muara Sungai pada Konsentrasi Oksigen yang Berbeda.
Dibimbing oleh IMAN RUSMANA dan TRI WIDIYANTO.
Bakteri nitrat amonifikasi disimilatif atau Dissimilatory Nitrate Reduction to
Ammonium (DNRA) termasuk kedalam kelompok bakteri pereduksi nitrat.
Bakteri DNRA bersifat fermentatif, dapat mendegradasi senyawa organik dalam
lingkungan oksigen terbatas atau anaerob. Penggunaan nitrat sebagai akseptor

elektron oleh kelompok bakteri ini, dapat mengurangi kadar nitrat di perairan.
Pada sisi lain bakteri DNRA menghasilkan produk samping N2O (nitrous oksida),
gas yang berpotensi meningkatkan pemanasan global.
Meskipun bakteri DNRA umumnya mereduksi nitrat menjadi amonium pada
kondisi anoksik, tetapi pada beberapa bakteri ditemukan reduksi nitrat
berlangsung secara aerob. Sensitivitas sistem reduktase bakteri DNRA daerah
tropik terhadap oksigen belum banyak diketahui. Bertolak dari hal tersebut perlu
dilakukan penelitian pengaruh oksigen terhadap kinetika aktivitas reduksi nitrat
bakteri DNRA yang berasal dari muara sungai di daerah tropik.
Empat isolat terseleksi dari muara sungai daerah tropik, telah diuji
pertumbuhan dan aktivitas reduksi nitratnya pada konsentrasi oksigen yang
berbeda. Keempat isolat tersebut adalah isolat HF7, LF6 (berasal dari muara
Sungai Cisadane) dan isolat FR1, FR2 (berasal dari muara Sungai Cimandiri).
Tingkat pencemaran muara Sungai Cisadane lebih tinggi dari pada muara Sungai
Cimandiri.
Metoda penelitian dilakukan melalui 3 tahap, yaitu konfirmasi kemurnian
isolat dan peremajaan, seleksi aktivitas konsentrasi oksigen berbeda, dan kinetika
aktivitas reduksi nitrat isolat terpilih pada konsentrasi oksigen berbeda.
Pengkondisian konsentrasi oksigen dilakukan dengan mengatur volume saturasi
udara pada head space botol sampel dengan penggunaan gas nitrogen murni.

Aktivitas reduksi nitrat dan senyawa-senyawa yang dihasilkan diukur dengan
analisis nitrat metoda Greenberg, analisis nitrit metode Sulfanilamid dan analisis
amonium metoda Phenate.
Hasil penelitian tahap seleksi menunjukkan kerapatan sel cenderung
meningkat sejalan dengan penambahan konsentrasi oksigen. Aktivitas reduksi
nitrat cenderung menurun sejalan dengan penambahan konsentrasi oksigen. Isolat
HF7 dan LF6 memiliki kemampuan mereduksi nitrat paling tinggi, dengan
perkiraan gas N2O yang dihasilkan lebih sedikit dibandingkan isolat FR1 dan
FR2. Kedua isolat dijadikan isolat terpilih untuk diamati laju pertumbuhan dan
kinetika aktivitas reduksi nitratnya.
Hasil pengamatan laju pertumbuhan isolat HF7 dan LF6 menunjukkan
konsentrasi oksigen mempengaruhi laju pertumbuhan kedua isolat. Laju
pertumbuhan spesifik maksimum (µ maks) dari isolat HF7 pada konsentrasi
saturasi udara 1%, 10% dan 100% dengan sumber karbon asetat dan nitrat media
49,41mM secara berurut adalah 0,034 CFU/jam, 0,040 CFU/jam, dan 0,070
CFU/jam. Laju pertumbuhan spesifik dari isolat LF6 pada kondisi yang sama
secara berurut adalah 0,035 CFU /jam, 0,045 CFU /jam, dan 0,057 CFU /jam.

Kecepatan rata-rata mengurangi nitrat medium oleh setiap sel isolat HF7
dengan sumber karbon asetat, nitrat medium 49,41 mM, masa inkubasi 96 jam

pada konsentrasi udara saturasi 1%, 10%, 100% secara berurut adalah 6,3 x 10-10
mMJ-1, 5,1 x 10-10 mMJ-1, dan 3,3 x 10-10 mMJ-1. Sedangkan rata-rata kecepatan
reduksi setiap sel isolat LF6 pada kondisi yang sama secara berurut adalah 2,0 x
10 -10 mMJ-1, 2,1 x 10-10 mMJ-1 dan 1,0 x 10-10 mMJ-1.
Dari hasil penelitian keseluruhan menunjukkan bahwa oksigen berpengaruh
terhadap kinetika aktivitas reduksi nitrat bakteri DNRA yang berasal dari muara
sungai daerah tropik. Besarnya pengaruh oksigen terhadap kinetika aktivitas
reduksi nitrat tergantung pada sensitivitas sistem nitrat reduktase yang dimiliki
oleh isolat bakteri. Konsentrasi oksigen berbeda lebih besar pengaruhnya pada
isolat HF7 dibandingkan terhadap isolat LF6. Perkiraan konsentrasi gas N2O
tertinggi yang dihasilkan pada isolat HF7 dengan nitrat medium 49,41 mM dan
sumber karbon asetat terdapat pada konsentrasi saturasi udara 100%. Sedangkan
pada isolat LF6 diperkirakan menghasilkan gas N2O terbesar pada konsentrasi
saturasi udara 10%.
Kata kunci : Reduksi nitrat, bakteri nitrat amonifikasi disimilatif, konsentrasi
oksigen.

© Hak Cipta milik IPB, tahun 2009
Hak Cipta dilindungi Undang-Undang
Dilarang mengutip sebagian atau seluruh karya tulis ini tanpa mencantumkan

atau menyebutkan sumber. Pengutipan hanya untuk kepentingan pendidikan,
penelitian, penulisan karya ilmiah, penyusunan laporan, penulisan kritik atau
tinjauan suatu masalah; dan pengutipan tersebut tidak merugikan kepentingan
yang wajar IPB.
Dilarang mengumumkan dan memperbanyak sebagian atau seluruh karya tulis
dalam bentuk apa pun tanpa izin IPB.

KINETIKA AKTIVITAS REDUKSI NITRAT BAKTERI
NITRAT AMONIFIKASI DISIMILATIF DARI MUARA
SUNGAI PADA KONSENTRASI OKSIGEN (O2)
YANG BERBEDA

TETI MARDIATI

Tesis
Sebagai salah satu syarat untukmemperoleh gelar
Magister Sains pada Mayor Mikrobiologi

SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR

BOGOR
2009

Judul Tesis

Nama
NRP

: Kinetika Aktivitas Reduksi Nitrat Bakteri Nitrat Amonifikasi
Disimilatif dari Muara Sungai pada Konsentrasi Oksigen (O2)
yang Berbeda
: Teti Mardiati
: G351070201

Disetujui
Komisi Pembimbing

Dr. Ir. Iman Rusmana, M. Si.
Ketua

Dr. Tri Widiyanto, M. Si
Anggota
Diketahui

Ketua Mayor Mikrobiologi

Dr. Ir. Gayuh Rahayu

Tanggal Ujian: 18 Juni 2009

Dekan Sekolah Pascasarjana

Prof. Dr. Ir. Khairil Anwar Notodiputro, M.S.

Tanggal Lulus:

Penguji Luar Komisi pada Ujian Tesis: Dr. Ir. Munti Yuhana, M.Si.

PRAKATA

Puji dan syukur penulis panjatkan kepada Allah SWT atas limpahan rahmat,
karunia dan ridho-Nyalah tesis yang berjudul ”Kinetika Aktivitas Reduksi Nitrat
Bakteri Nitrat Amonifikasi Disimilatif dari Muara Sungai pada Konsentrasi
Oksigen (O2) yang Berbeda” dapat diselesaikan.
Pelaksanaan penelitian dan penulisan tesis ini tidak terlepas dari bantuan dan
bimbingan berbagai pihak. Pada kesempatan ini penulis menyampaikan terima
kasih yang sebesar-besarnya kepada:
1. Bapak Dr. Ir. Iman Rusmana, M.Si dan Bapak Dr. Tri Widiyanto, M.Si selaku
komisi pembimbing atas bantuan, bimbingan dan pengarahan yang telah
diberikan selama penelitian dan penulisan tesis ini sehingga penulis dapat
menyelesaikan dengan baik.
2. Departemen Agama RI yang telah memberikan beasiswa pendidikan.
3. Ketua Program Studi Biologi, Ketua Mayor Mikrobiologi, Ketua dan Staf
Laboratorium Mikrobiologi Departemen Biologi, Fakultas Ilmu Pengetahuan
Alam, Institut Pertanian Bogor yang telah membantu dalam menyediakan
fasilitas hingga terlaksananya penelitian ini.
4. Suami, Ibunda, dan anak-anak tercinta, seluruh keluarga serta rekan-rekan di
MAN Batumandi yang telah banyak memberikan dukungan, hingga penulis
mampu menyelesaikan studi ini dengan baik.
5. Rekan-rekan angkatan 2007 Program studi Biologi, rekan-rekan lab

mikrobiologi, Mbak Ratna, Irul dan Ria

atas segala bantuan dan

kerjasamanya.
Akhirnya semoga tesis ini bermanfaat bagi semuanya. Amin.

Bogor, juni 2009

Teti Mardiati

RIWAYAT HIDUP
Penulis dilahirkan di Bandung pada tanggal 19 Agustus 1967 dari ayah
Ahmad Hidayat dan ibu Siti Rokilah. Penulis merupakan anak pertama dari enam
bersaudara.
Penulis menyelesaikan program sarjana (SI) Jurusan Biologi Fakultas
Pendidikan Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam IKIP Bandung pada tahun
1990.

Penulis bertugas sebagai staf Pengajar Biologi pada Madrasah Aliyah

Negeri (MAN) Batumandi Kabupaten Agam Sumatera Barat sejak tahun 1992
sampai sekarang. Pada bulan Juli 2007 penulis melanjutkan kuliah ke Sekolah
Pascasarjana Institut Pertanian Bogor Program Studi Biologi Mayor Mikrobiologi
melalui beasiswa pendidikan Departemen Agama RI.

Bogor, juni 2009

Penulis

DAFTAR ISI

Halaman.
DAFTAR TABEL .......................................................................................... xiii
DAFTAR GAMBAR...................................................................................... xiv
DAFTAR LAMPIRAN................................................................................... xv
PENDAHULUAN ..........................................................................................

1

Latar Belakang ......................................................................................

1

Tujuan...................................................................................................

3

TINJAUAN PUSTAKA.................................................................................

4

Muara sungai.........................................................................................

4

Muara Sungai Cimandiri dan Cisadane..................................................

6

Bakteri Pereduksi Nitrat ........................................................................

7

Enzim-Enzim yang Berperan Dalam Reduksi Nitrat ..............................

8

Bakteri Nitrat Amonifikasi Disimilatif (DNRA) ...................................

9

METODE PENELITIAN............................................................................ .... 13
Waktu dan Tempat penelitian ................................................................ 13
Bahan Penelitian .................................................................................. 13
Konfirmasi dan Peremajaan Isolat. ....................................................... 13
Seleksi Aktivitas Reduksi Nitrat pada Konsentrasi Oksigen (O2)
yang Berbeda ....................................................................................... 14
Analisis nitrit. .............................................................................. 15
Analisis nitrat .............................................................................. 15
Analisis amonium ........................................................................ 16
Perhitungan Pembentukan Gas. ........................................................... 16
Kinetika Aktivitas Reduksi Nitrat Isolat Terpilih ................................. 17
HASIL ............................................................................................................ 19
Karakteristik, Morfologi dan Fisiologi Bakteri Amonifikasi
Disimilatif ............................................................................................ 19
Densitas Sel isolat Bakteri DNRA Pada Konsentrasi O2

yang Berbeda ....................................................................................... 21
Aktivitas Reduksi Nitrat Bakteri DNRA pada Konsentrasi
Oksigen yang Berbeda......................................................................... 22
Pertumbuhan Isolat Terpilih ................................................................ 25
Kinetika Aktivitas Reduksi Nitrat ........................................................ 26
PEMBAHASAN............................................................................................. 32
SIMPULAN DAN SARAN ............................................................................ 41
Simpulan............................................................................................... 41
Saran..................................................................................................... 41
DAFTAR PUSTAKA ..................................................................................... 42
LAMPIRAN ................................................................................................... 46

DAFTAR TABEL
Halaman
1. Karakterisasi morfologi dan fisiologi isolat LF6, HF7, FR2,dan FR1 ............. 20
2. Aktivitas reduksi nitrat dan senyawa yang dihasilkan isolat HF7 pada
konsentrasi saturasi udara 1%, 10% dan 100% setelah inkubasi 96
jam suhu ruang (29-31)oC ........................................................................... 31
3. Aktivitas reduksi nitrat dan senyawa yang dihasilkan isolat LF6
pada konsentrasi saturasi udara 1%, 10% dan 100%, setelah inkubasi
96 jam suhu ruang (29-31)oC.......................................................................... 31

DAFTAR GAMBAR
Halaman
1. Daur biogeokimia nitrogen di perairan ........................................................... 5
2. Lintasan reduksi nitrat oleh aktivitas bakteri (1) Denitrifikasi,
(2).Reduksi nitrat amonifikasi disimilatif (3) Oksidasi amonia
secara anaerob................................................................................................ .8
3. Bagan pembentukan N2O pada reduksi nitrat oleh bakteri DNRA ................ 10
4. Enzim pereduksi nitrat bakteri nitrat amonifikasi disimilatif ....................... 11
5. Morfologi koloni dari isolat LF6, HF7, FR2 dan FR1 pada
medium denitrifikasi ..................................................................................... 19
6. Hasil uji fermentatif pada isolat FR1, FR2, HF7 dan LF6, setelah
inkubasi 48 jam ............................................................................................ 21
7. Densitas sel Isolat LF6, HF7, FR2, dan FR1 pada konsentrasi
saturasi udara yang berbeda, setelah diinkubasi selama 96 jam
pada suhu ruang (29-31)0C. ......................................................................... 22
8. Jumlah nitrat tereduksi oleh isolat LF6, HF7, FR2, dan FR1 pada
konsentrasi saturasi udara yang berbeda, setelah diinkubasi selama 96
jam pada suhu ruang ( 29-31)0 C .................................................................. 22
9. Jumlah nitrit terakumulasi dari isolat LF6, HF7, FR2, dan FR1
pada konsentrasi saturasi udara yang berbeda, setelah diinkubasi
selama 96 jam pada suhu ruang (29-31)0 C ................................................... 23
10.Jumlah amonium yang dihasilkan dari isolat LF6, HF7, FR2, dan
FR1 pada konsentrasi saturasi udara yang berbeda, setelah diinkubasi
selama 96 jam pada suhu ruang ( 29-31)0C.................................................... 24
11.Pola pertumbuhan isolat HF7 dan LF6 pada konsentrasi saturasi udara
Berbeda......................................................................................................... 25
12.Laju pertumbuhan maksimum isolat HF7 dan LF6 pada konsentrasi
saturasi udara berbeda .................................................................................. 26
13. Aktivitas reduksi nitrat, pembentukan nitrit dan amonium dari isolat
HF7 dan LF6 pada konsentrasi saturasi udara 1%, 10% dan 100%. .............. 27
14. Perbandingan pertumbuhan sel isolat HF7 dan LF6 dengan penurunan
konsentrasi nitrat pada konsentrasi saturasi udara 1%, 10% dan 100% ...... 29

DAFTAR LAMPIRAN
Halaman
1. Pembentukan warna pada uji kadar nitrat (A), nitrit (B) dan
amonium (C)................................................................................................ 47
2. Kurva standar konsentrasi amonium (A) dan kurva standar
konsentrasi nitrit (B) ............................................................................... .48
3. Jumlah CFU Isolat HF7 dan LF6 pada pengenceran 10-8 ............................ 49
4. Kurva standar pertumbuhan isolat HF7 dan LF6 pada kondisi
nitrat medium 49,41 mM............................................................................. 50
5. Presentase nitrat tereduksi dan senyawa yang dihasilkan isolat
LF6,HF7 dan FR2 pada kadar saturasi udara berbeda dengan
inkubasi selama 4 hari suhu ruang (29-31)oC................................................. 51
6. Presentase nitrat tereduksi dan senyawa yang dihasilkan isolat
FR1 pada kadar saturasi udara berbeda dengan inkubasi selama
4 hari suhu ruang (29-31)oC ........................................................................... 52
7. Perbandingan konsentrasi nitrat tereduksi, nitrit, nitrat, amonium
dan estimasi gas yang dihasilkan isolat LF6 dan HF7 ................................... 53
8. Perbandingan konsentrasi nitrat tereduksi, nitrit, nitrat, amonium
dan estimasi gas yang dihasilkan isolat FR1 dan FR2 ................................... 54

PENDAHULUAN
Latar Belakang
Bakteri nitrat amonifikasi disimilatif atau Dissimilatory Nitrate Reduction to
Ammonium (DNRA) termasuk ke dalam kelompok bakteri pereduksi nitrat.
Kelompok bakteri pereduksi nitrat menggunakan nitrat sebagai akseptor elektron
dalam

respirasi anaerob (Purwoko 2007). Di alam bakteri pereduksi nitrat

berperan dalam degradasi senyawa organik pada lingkungan oksigen terbatas atau
anaerob. Bakteri pereduksi nitrat juga merupakan bagian dari mikroorganisma
yang terlibat dalam siklus biogeokimia nitrogen global. Kelompok bakteri ini
dapat mengurangi

kadar nitrogen tanah pertanian (kelompok denitrifikasi),

bermanfaat dalam pengolahan air limbah, perbaikan kualitas perairan seperti
tambak (Madigan et al. 2006; Maier et al. 2000; Widiyanto 2006).
Pada sisi lain kelompok bakteri ini dapat menghasilkan produk samping atau
produk antara gas nitrous oksida (N2O). Gas N2O merupakan salah satu gas
rumah kaca yang dapat meningkatkan pemanasan global seperti gas CO2 dan CH4.
Penambahan gas N2O setiap tahunnya 0,2-0,3% (Conrad 1995) dengan kalor
jenis N2O lebih besar dan waktu tinggal (residence time) di atmosfer lebih lama,
maka jumlah kalor yang diserap oleh N2O tinggi. Gas N2O memiliki potensi
penyerapan panas 150 kali lebih besar dari pada gas CO2. Pada stratosfer N2O
dapat terfotolisis menjadi NO atau N2 yang menyebabkan terjadinya pengkisan
lapisan ozon (Rusmana 2003c). Proses Fotolisis N2O menjadi NO atau N2 dapat
mengubah senyawa ozon (O3) menjadi gas oksigen (O2). Hal tersebut
memperbesar radiasi cahaya matahari terhadap bumi.
N2O diperkirakan sebanyak 90% berasal dari proses biotik (Rusmana
2003c). Penambahan pupuk nitrogen, limbah senyawa nitrogen dari industri, dan
pembakaran bahan bakar fosil memperbesar emisi senyawa N2O. Terdapat
hubungan linier antara penambahan pupuk nitrogen pada areal pertanian dengan
peningkatan emisi N2O (Li 2004). Pencemaran nitrogen dari daratan terakumulasi
di muara sungai. Mikroorganisma pereduksi nitrat menjadi dominan pada muara
sungai yang tercemar senyawa nitrogen termasuk bakteri DNRA yang bersifat
fermentatif (Rusmana dan Nedwell 2004).

Proses pembentukan N2O pada bakteri DNRA bukan

sebagai senyawa

antara seperti yang dihasilkan oleh bakteri denitrifikasi, tetapi merupakan produk
samping melalui reaksi kimia dalam menghasilkan amonium (Rusmana 2003a).
Kelompok bakteri ini memanfatkan senyawa nitrat sebagai penerima elektron
alternatif untuk mendapatkan energi dibawah kondisi oksigen terbatas (Ricardson
et al. 2001). Purwoko (2007) menyatakan bahwa fermentasi sebenarnya
merupakan proses yang tidak memerlukan oksigen tetapi organisma fermentatif
terkadang memerlukan oksigen untuk proses metabolisma lainnya maupun
pertumbuhannya.
Walaupun nitrat amonifikasi disimilatif dan denitrifikasi termasuk proses
anoksik tetapi reduksi nitrat dapat terjadi pada kondisi aerob. Jenis bakteri yang
dapat melakukan reduksi nitrat pada kondisi aerob diantaranya Escherichia coli,
Thiosphaera pantotropha, dan Pseudomonas aeroginosa (Carter et al. 1995).
Kemampuan bakteri tersebut mereduksi nitrat pada kondisi aerob dan anaerob
berkaitan dengan enzim yang dimilikinya. Enzim nitrat reduktase pada membran
sel (Nar) aktivitasnya dapat dipengaruhi oleh konsentrasi oksigen, dimana oksigen
menghambat sistem transpor nitrat ke membran. Enzim Nap yang mereduksi nitrat
dalam periplasma tidak sensitif terhadap oksigen. Ekspresi gen nar dipengaruhi
oleh ketersediaan oksigen dan nitrit sedangkan gen nap tidak (Moreno - Vivian
et al. 1999).
Menurut Holt et al. (1994) sebagian besar bakteri fermentatif memiliki dua
jalur metabolisma, yaitu respirasi dan fermentatif. Secara umum bakteri
fermentatif

pereduksi

nitrat

bersifat

desulfuricans adalah salah satu bakteri

anaerob

fakultatif,

Desulfovibrio

yang dapat memanfaatkan nitrat atau

sulfat sebagai akseptor elektron yang bersifat anaerob obligat. Keberadaan
oksigen berpengaruh pada aktivitas reduksi nitrat bakteri fermentatif. Terdapat
hubungan antara ketersediaan oksigen dengan pembentukan amonium hasil
aktivitas bakteri fermentatif. Hasil penelitian pada sedimen perairan estuari Colne
di Inggris menunjukkan konsentrasi amonium bertambah dengan bertambahnya
kedalaman (Rusmana 2003a).
Hasil penelitian yang dilakukan Bonin et al. (1989) menunjukkan bahwa
pembentukan nitrat, nitrit dan N2O oleh Pseudomonas nautica pada konsentrasi

oksigen lebih besar dari 4,05 mg/l; 2,15 mg/l; 0,25 mg/l sepenuhnya dihambat.
Demikian juga pada percobaan Kester et al. (1997) menunjukkan bahwa pada
kultur Alcaligenes eutropus, Nitrosomonas europia dan Pseudomonas stutzeri
dengan aerasi berbeda didapatkan jumlah produk yang berbeda. Pada udara
saturasi 80 % produksi NO dan N2O adalah 0,87% dan 0,17%, sedangkan pada
udara saturasi 1% berubah menjadi 2,32% dan 0,78%. Kemampuan mereduksi
nitrat Pseudomonas stutzeri pada udara saturasi 90% setelah diinkubasi 92 jam,
dengan sumber karbon suksinat adalah 99,24%. Sementara itu pada Thiosphaera
pantotropha ATCC 35512 pada kondisi udara saturasi, suhu dan sumber karbon
yang sama adalah 27,29% (Su et.al 2000).
Berdasarkan beberapa penelitian tersebut yang banyak dilakukan pada
kelompok bakteri denitrifikasi dan bakteri yang berasal dari daerah beriklim
sedang, maka perlu dilakukan pengujian pengaruh konsentrasi oksigen terhadap
kinetika aktivitas bakteri DNRA muara sungai di daerah tropik. Pengaruh oksigen
sebagai sesama akseptor elektron terhadap efektivitas reduksi nitrat menjadi
amonium perlu diamati, termasuk prediksi senyawa N2O yang dihasilkan.
Hasil penelitian ini diharapkan dapat melengkapi pengetahuan fisiologi
respirasi bakteri pereduksi nitrat.

Langkah selanjutnya adalah kemungkinan

kelompok bakteri ini dapat dimanfaatkan dalam strategi penanggulangan masalah
lingkungan seperti pengolahan limbah dan perairan tercemar, konservasi
kesuburan tanah dan menjaga kualitas perairan seperti tambak, danau

tanpa

menimbulkan emisi Nitrous Oksida (N2O).

Tujuan
Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui pengaruh konsentrasi oksigen
terhadap kinetika aktivitas reduksi nitrat oleh bakteri nitrat amonifikasi disimilatif
yang berasal dari muara Sungai Cimandiri Sukabumi Jawa Barat dan muara
Sungai Cisadane Tanggerang Banten.

TINJAUAN PUSTAKA
Muara sungai
Muara sungai termasuk ke dalam ekosistem estuari, dimana air tawar dan air
laut bercampur. Bahan-bahan organik dan anorganik yang terdapat di muara
sungai sebagian diendapkan, terlarut dan terbawa oleh arus ke laut. Salah satu
proses yang mempengaruhi konsentrasi bahan-bahan organik dan anorganik pada
muara sungai adalah proses biologi (Chester 1990).
Menurut Dahuri et al. (1996) kualitas air suatu perairan pesisir seperti
muara dicirikan oleh karakteristik kimianya yang mudah dipengaruhi oleh
masukan air yang berasal dari daratan (melalui sungai) dan lautan sekitarnya.
Proses pembuangan limbah dari daratan melalui aliran sungai atau dari lautan
yang berlangsung secara terus menerus akan mengakibatkan turunnya kualitas air
muara sungai. Pencemaran muara sungai oleh senyawa nitrogen lebih dominan
berasal dari daratan.
Pada muara sungai terjadi daur biogeokimia nitrogen, yaitu terjadinya
perubahan-perubahan senyawa atau unsur nitrogen dalam medium dan peristiwa
yang berbeda. Beberapa

proses transformasi senyawa nitrogen melibatkan

berbagai jenis bakteri yaitu bakteri yang berperan dalam amonifikasi, asimilasi,
fiksasi, nitrifikasi dan reduksi nitrat disimilatif.
Amonifikasi adalah proses pembentukan amonia dari materi organik
dilakukan oleh bakteri dan cendawan safrofit. Asimilasi adalah proses
pemanfaatan senyawa nitrogen anorganik untuk pembentukan asam amino dalam
protoplasma. Fiksasi nitrogen yaitu peristiwa pengikatan gas nitrogen (N2)
umumnya terjadi di daratan, simbiosis alga di perairan dan percampuran nitrogen
dari atmosfer. Nitrifikasi merupakan reaksi oksidasi pembentukan nitrat yang
berasal dari amonia. Reduksi nitrat disimilatif merupakan reaksi reduksi terhadap
nitrat dimana nitrat direduksi melalui tahap-tahap tertentu dengan hasil akhir
amonium atau gas nitrogen. Reduksi nitrat disimilatif yang dominan terjadi di
atas sedimen muara sungai adalah denitrifikasi (Dong et al. 2002). Denitrifikasi
yaitu reaksi reduksi yang mengubah nitrat menjadi nitrit, nitrit oksida, nitrous
oksida dan terakhir gas nitrogen. Reduksi nitrat disimilatif yang dominan pada

bagian sedimen muara sungai adalah nitrat amonifikasi disimilatif (Rusmana
2003a).
Madigan et al. (2006) menyatakan proses penghilangan senyawa nitrogen
di tanah dan perairan melalui proses denitrifikasi dan anaerob ammonia oxidation
(anammox). Kedua proses tersebut menghasilkan gas nitrogen dan nitrous oksida
(denitrifikasi) sebagai produk akhir. Proses ini jika terjadi di areal pertanian dapat
menurunkan produktivitas hasil pertanian.
Senyawa-senyawa nitrogen yang terdapat di muara sungai secara umum
terlibat dalam daur biogeokimia seperti yang dijelaskan oleh Kennish (1994)
seperti terlihat pada Gambar 1.

Gambar 1 Daur biogeokimia nitrogen di perairan

Muara Sungai Cimandiri dan Cisadane
Muara Sungai Cimandiri kabupaten Sukabumi Jawa Barat, merupakan
muara sungai yang telah tercemar. Berbagai sampah rumah tangga / pemukiman,
limbah areal pertanian (sawah, perkebunan) dan bahan-bahan lain sepanjang
Daerah Aliran Sungai (DAS) Sungai Cimandiri terakumulasi di muara. Kualitas
air pada muara sungai Cimandiri sudah mengalami penurunan (Marnis 2008).
Selain limbah yang masuk ke perairan sungai, aktivitas penambangan pasir
sepanjang DAS menyebabkan warna perairan di sekitar muara menjadi coklat
sampai jarak yang cukup jauh dari pantai (Marnis 2008). Pada kondisi kimia dan
fisik perairan seperti itu

akan memicu

pertumbuhan mikroorganisma-

mikroorganisma aerob fakultatif dan anaerob disamping bakteri aerob, termasuk
mikroorganisme yang memanfaatkan senyawa nitrogen baik organik (protein,
asam amino) atau senyawa anorganik (nitrat, nitrit, dan amonium).
Muara

Sungai

Cisadane

merupakan

muara

sungai

yang

tingkat

pencemarannya lebih tinggi dari muara Sungai Cimandiri. Sungai Cisadane selain
sebagai sumber air yang dimanfaatkan penduduk untuk keperluan sehari-hari,
juga merupakan sumber perairan pertanian. Disamping itu berfungsi sebagai
tempat penampungan limbah yang berasal dari limbah rumah tangga, industri,
pertanian dan perternakan (Brahmana & Suriati 2001).
Beberapa parameter kualitas air yang menunjukkan muara Sungai Cisadane
tercemar adalah rendahnya kandungan oksigen terlarut, tingginya konsentrasi
nitrit dan amonia serta suhu perairan yang tinggi. Kandungan oksigen terlarut
berkisar antara 0,39-2,33 mg/l, dan suhu 32,0-32,60C. Kandungan senyawa nitrit
0,03-0,14 mg/l dan amonia 0,09-1,19 mg/l (Syahputra 2007). Tingkat pencemaran
muara Sungai Cisadane pada musim hujan akan lebih rendah karena faktor
pengenceran oleh air hujan, termasuk air hujan dari hulu melalui aliran sungai.
Muara sungai yang banyak mengandung limbah organik dan anorganik yang
mengandung senyawa nitrogen diduga menghasilkan emisi Nitrous Oksida (N2O)
yang lebih besar. Emisi N2O dari perairan dan muara kurang lebih 66%, produksi
gas ini berkorelasi positif dengan konsentrasi nitrat atau nitrit perairan (Seitzinger
& Kroezen 1998; Rusmana 2003c).

Pada kedua muara sungai diatas senyawa nitrogen umumnya berasal dari
limbah organik rumah tangga sepanjang daerah aliran sungai yang mengalami
dekomposisi, limbah pupuk nitrogen anorganik areal pertanian dan senyawa
nitrogen anorganik tanah yang mengalami erosi tepi sungai. Sumber senyawa
nitrogen lain berasal dari proses nitrifikasi, proses dekomposisi mikroorganisma
dan eksresi organisma di habitat muara sungai serta gas oksida nitrogen dari udara
yang terlarut melalui air hujan. Limbah industri merupakan faktor utama
pencemaran yang meningkatkan senyawa nitrogen pada muara Sungai Cisadane
disamping faktor-faktor di atas.

Bakteri Pereduksi Nitrat
Kelompok bakteri pereduksi nitrat merupakan mikroorganisma yang terlibat
dalam daur nitrogen di alam. Kelompok bakteri ini berperanan dalam pengubahan
senyawa nitrat menjadi produk akhir gas nitrogen atau senyawa amonium.
Rusmana (2003b) menyatakan bahwa terdapat tiga proses reduksi nitrat
disimilatif pada bakteri yaitu denitrifikasi, reduksi nitrat menjadi amonium
disimilatif dan oksidasi amonium disimilatif (anaerob ammonia oxidation,
anammox). Denitrifikasi adalah proses reduksi nitrat menjadi N2O atau N2. Pada
proses ini bakteri menggunakan nitrat sebagai penerima elektron terakhir untuk
memperoleh energi pada kondisi O2 terbatas atau anaerob (Zumft 1997; Ricardson
2000; Ricardson et al. 2001). Reduksi nitrat menjadi amonium disimilatif adalah
proses untuk menghilangkan kelebihan tenaga pereduksi dan menunjang
pertumbuhan bakteri pada kondisi anaerob (Cole 1996). Anamoks adalah oksidasi
amonia secara anaerobik dimana terjadi pengubahan amonium dan nitrat atau
nitrit menjadi gas nitrogen. Pada metabolisma ini membentuk senyawa antara
hidroksil amin dan hidrazin (Jetten et al. 2001).
Tiga lintasan proses reduksi nitrat oleh aktivitas bakteri dapat digambarkan
sebagai berikut (Rusmana 2003b).

NO

N 2O

N2

NO

N 2O

N2

(1)
(1)

N2 O

(3)

N2 O
NO3

-

NO3

-

NO2

-

NH4

NO2

-

NH4

NH2OH
NH2OH

(2)
(2)

N 2H2

N2

(3)

N 2H2

N2

(3)

NH3
NH3

Gambar 2 Lintasan reduksi nitrat oleh aktivitas bakteri (1) Denitrifikasi,
(2).Reduksi nitrat amonifikasi disimilatif (3) Oksidasi amonia secara
anaerob.
Enzim-Enzim yang Berperan pada Reduksi Nitrat
Kelompok bakteri pereduksi nitrat baik denitrifikasi, bakteri DNRA maupun
anamoks

memiliki enzim-enzim tertentu untuk mengkatalisasi reaksi-reaksi

reduksi nitrat. Enzim pada bakteri denitrifikasi adalah nitrat reduktase (Nar dan
Nap), Nitrit reduktase (Nir), Nitrit oksid reduktase (Nor), Nitrous oksid reduktase
(Nos) (Moreno - Vivian et al. 1999; Zumft 1997; Ricardson et al. 2001).
Bakteri DNRA memiliki enzim nitrat reduktase (Nap dan Nar) yang
mereduksi nitrat menjadi nitrit dan dua enzim yang mereduksi nitrat menjadi
amonium yaitu Nir B (Harbone et al. 1992) dan enzim formate dependent nitrite
reduction to amonium atau Nrf (Cole 1996).

Pada spesies tertentu

seperti

Wollinella succinogens dan Campylobacter fetus memiliki enzim nitrous oksida
reduktase (Nos). Enzim ini mereduksi gas N2O menjadi gas Nitrogen (Zumft
1997).
Enzim yang terdapat pada bakteri anamoks adalah nitrit reducing enzyme
(NR) yaitu enzim yang mereduksi nitrit menjadi hidroksil amin (NH2OH).
Hidrazin Hidrolase (HH) enzim yang mereduksi hidroksilamin menjadi hidrazin
(N2H4) dan Hydrazine – oxidising enzyme (HZO), enzim yang mengoksidasi
hidrazin menjadi gas nitrogen (Jetten et al. 2001).

Bakteri Nitrat Amonifikasi Disimilatif (DNRA)
Pada kondisi yang sesuai beberapa genus dapat mereduksi nitrit menjadi
amonia melalui proses reduksi nitrat disimilasif. Prosesnya berlangsung pada saat
kandungan senyawa nitrit tinggi (Kelso et al. 1997). Kelompok bakteri ini bersifat
fermentatif (Rusmana & Nedwell 2004), dapat memanfaatkan senyawa organik
untuk pembentukan energi melalui transfer elektron di sitoplasma (Purwoko
2007).
Purwoko (2007) mengemukakan bahwa sebagian besar prokariota
fermentatif menghasilkan semua ATP melalui fosforilasi tingkat subtrat,
kemudian ATP dihidrolisis oleh ATP sintetase, sehingga dapat menghasilkan
perbedaan potensial yang digunakan untuk aktivitas membran. Organisma
fermentatif memerlukan akseptor elektron untuk menerima elektron dari NADH.
Kelompok bakteri pereduksi nitrat dapat memanfaatkan senyawa nitrat sebagai
penerima elektron alternatif untuk mendapatkan energi dibawah kondisi oksigen
terbatas (Ricardson et al. 2001).
Kelompok bakteri DNRA mereduksi senyawa nitrat sejalan dengan
penambahan senyawa nitrit, ketika konsentrasi nitrat rendah terjadi penambahan
senyawa amonium (Kelso et al. 1997). Pada beberapa pengamatan di lapangan
menunjukkan bahwa proses nitrat amonifikasi disimilatif banyak terjadi pada suhu
tinggi (Herbert & Nedwell 1990). Bakteri DNRA lebih dominan pada lingkungan
yang rasio C/N nya tinggi (Nedwell 1982). Bakteri DNRA lebih kompetitif dari
pada bakteri denitrifikasi pada konsentrasi bahan organik tinggi.
Bakteri-bakteri nitrat amonifikasi disimilatif diantaranya adalah Bacillus
pyocyanes, Clostridium pasteurianum, Desulfovibrio desulfuricans (Moat et al.
2002).

Bacillus licheniformis, Wollinella succinogenes, Citrobacter freundii,

Klebsiella oxytoca, K. Pneumonia, Escherichia coli (Rusmana 2003a).
Rusmana (2003a) telah mengisolasi dan mengkarakterisasi Klebsiella
pneumonia yang mereduksi nitrat menjadi amonium dan menghasilkan N2O
sebagai produk sampingnya. Syahputra (2007) telah mengisolasi dan menyeleksi
bakteri nitrat amonifikasi disimilatif dari muara sungai Cisadane. Isolat terpilih
dikarakterisasi mempunyai kemiripan dengan Escherichia sp 21 CR dengan

tingkat kemiripan 97%. Sebagian besar famili Enterobacteriaceae mereduksi
nitrat dan bersifat fermentatif (Holt et al. 1994).
Proses pembentukan N2O pada

kelompok bakteri nitrat amonifikasi

disimilatif bukan sebagai senyawa antara seperti pada kelompok bakteri
denitrifikasi, tetapi merupakan produk samping

melalui reaksi kimia

dalam

menghasilkan amonium (Rusmana 2003a). Bagan proses reaksi kimia reduksi
nitrat ke amonium dapat ditunjukkan pada Gambar 3.
N 2O

NO3

-

NO2-

NO

N2 O2H2

NOH

NH4

NH2OH

+

Gambar 3 Bagan pembentukan N2O pada reduksi nitrat oleh bakteri DNRA
(Darjamurni 2003)
Pada kelompok bakteri DNRA terjadi dua tahap reaksi enzimatik yaitu tahap
pertama oleh enzim Nap dan Nar seperti pada bakteri dinitrifikasi. Patereu et al.
(1994) menyatakan bahwa ada dua tipe enzim yang mereduksi nitrat menjadi nitrit
yaitu nitrat reduktase yang terdapat pada membran (Nar) dan nitrat reduktase yang
terdapat pada periplasmik (Nap). Enzim Nar aktivitasnya berhubungan langsung
dengan proses respirasi pembentukan ATP yang dapat dipengaruhi oleh
konsentrasi oksigen dimana oksigen menghambat sistem transpor nitrat. Enzim
Nap yang mereduksi nitrat dalam periplasma tidak sensitif terhadap oksigen.
Enzim Nar yang terdapat di membran plasma mempunyai transmembran proton
motive force (PMF) tempat terjadinya sintesis ATP (Moreno- Vivian et.al 1999).
Demikian pula menurut Carter et al. (1995) reduksi nitrat dalam periplasma
tidak sensitif terhadap hambatan oksigen. Oleh karena itu, nitrat reduktase
periplasmik berhubungan dengan kemampuan untuk respirasi nitrat dalam
ketersediaan oksigen pada spesies laboratorium. Oksidasi quinol oleh nitrat
reduktase periplasmik tidak terpusat untuk menghasilkan gradien proton
elektrokimia,

tetapi

cukup

bertindak

keseimbangan regulasi reaksi redoks
respirasi aerobik.

sebagai

katup

untuk

membantu

dan mempertahankan jalannya rantai

Enzim Nap merupakan komplek dari dua sub unit protein. Sub unit Nap A
mengikat kofaktor Molibdenum (Mo) sebagai sisi aktif dari enzim. Sub unit Nap
B mempunyai dua situs ikatan heme C yang memiliki perbedaan potensial. Nap C
merupakan sitokrom tipe tetraheme C, berperan dalam transfer elektron antara
Quinol dan Nap AB (Richardson 2000).
Reaksi enzimatik tahap kedua yaitu perubahan nitrit menjadi amonium oleh
enzim Nir B yang aktivitasnya bergantung pada NADH sitoplasma sebagai donor
elektron (Harbone et al. 1992) dan enzim Nrf yang aktivitasnya bergantung pada
format sebagai donor elektron (Cole 1996). Dalam Richardson (2000) kinerja
enzim pereduksi nitrat menjadi amonium disimilatif digambarkan sebagai berikut
(Gambar 4).

NO2-

NH4+
NrfA

NapA
NapB

Periplasma
NO3-

NO2-

NO3NO2-

NrfB

NrfB

NrfC
NrfC

NapC

Membran plasma

NarI

NrfD

NarH
NO3-

NO2NarG

NirD

Sitoplasma

NirB
NO3-

NO2-

NO -

NH +

2
4
Gambar 4 Enzim pereduksi nitrat bakteri nitrat amonifikasi
disimilatif
Ketersediaan oksigen di lingkungan pada bakteri nitrat amonifikasi

disimilatif diantaranya berkaitan erat dengan sistem sensor regulator sebagai
mikroorganisme

anaerob

fakultatif. Kelompok bakteri DNRA memiliki

kemampuan adaptasi dari aerob ke anaerob atau sebaliknya. Oksigen merepresi
sintesis reduktase anaerob, sebaliknya pada kondisi oksigen terbatas akan
merepresi sintesis

ketoglutarat dehidrogenase. Hal ini mengakibatkan perubahan

kondisi jalur asam sitrat dari siklus TCA oksidatif menjadi non siklus/ reduktif
(White 1995).
Pada White (1995) dijelaskan bahwa pergantian
reduktif Escherichia coli

respirasi oksidatif dan

sebagai salah satu bakteri DNRA diatur oleh tiga

sistem, yaitu sistem Arc (Aerobic respiration control), sistem Nar (Nitrat
anaerobic respiration) dan sistem Fnr. Sistem Arc merupakan sistem dua
komponen. Sistem ini merepresi gen-gen aerob berupa enzim-enzim siklus asam
sitrat, piruvat dehidrogenase, asam lemak oksidase, dan sitokrom oksidase. Selain
itu sistem Arc menginduksi gen-gen mikroaerob (sitokrom d oksidase dan sintesis
kobal alamin).
Sistem Nar terdiri dari 3 protein yaitu Nar X, Nar L dan Nar Q. Sistem ini
juga merupakan sistem dua komponen, Nar X berperan sebagai histidin kinase,
sedangkan Nar L sebagai protein regulator respons.

Sistem ini menginduksi

sintesis transkripsi gen nitrat reduktase dan menghambat gen fumarat reduktase
serta gen aerobik lainnya. Penelitian selanjutnya diketahui bahwa Nar Q juga
berperan sebagai penerima sensor (White 1995 ; Purwoko 2007).
Sistem Fnr merupakan sistem tunggal yang berperanan pada kondisi
anaerob. Protein Fnr berperan sebagai regulator positif untuk transkripsi gen-gen
dalam pertumbuhan anaerob dan regulator negatif untuk transkripsi gen-gen
pertumbuhan aerob (White 1995 ; Purwoko 2007).

METODE PENELITIAN
Waktu dan Tempat penelitian
Penelitian ini dilaksanakan pada bulan Oktober 2008 sampai Maret 2009.
Tempat penelitian di Laboratorium Mikrobiologi Departemen Biologi Fakultas
Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Institut Pertanian Bogor.
Bahan Penelitian
Isolat yang digunakan dalam penelitian ini adalah bakteri nitrat amonifikasi
disimilatif (DNRA)

koleksi Laboratorium Mikrobiologi Departemen Biologi,

FMIPA IPB Bogor. Isolat merupakan bakteri terpilih dari penelitian sebelumnya
hasil isolasi dari muara Sungai Cimandiri Pelabuhan Ratu Sukabumi Jawa Barat

dan muara Sungai Cisadane Tangerang Banten. Kode isolat dari muara Sungai
Cimandiri adalah FR1 dan FR2 (Marnis 2008). Kode isolat dari muara Sungai
Cisadane HF7 dan LF6 (Syahputra 2007).

Konfirmasi dan Peremajaan Isolat.
Peremajaan isolat murni dimulai dengan konfirmasi kemurnian isolat
menggunakan media padat, dilanjutkan dengan peremajaan isolat murni pada
media cair.

Komposisi media cair adalah: 10 g Natrium asetat, 4,2 g NaNO3,

3,0 g yeast ekstrak, 0,5 g (NH4)2SO4, 0,9 g K2HPO4.3 H2O, 0,5 g MgSO4.7H2O,
0,2 g KH2PO4, 0,1 g CaCl2.2H2O dengan salinitas 2% dan pH 7 (Rodina 1972).
Media padat dibuat sama dengan media cair ditambah agar bacto 20 g per liter.
Media disterilisasi pada suhu 1210 C tekanan udara 1 atmosfer selama 15 menit.
Konfirmasi kemurnian isolat dilakukan dengan cara diinokulasikan masingmasing isolat murni bakteri nitrat amonifikasi disimilatif dengan metoda cawan
gores pada medium agar, kemudian diinkubasikan selama 7 hari. Karakterisasi
dan morfologi sel tiap isolat dilakukan dengan teknik pewarnaan gram
(Hadioetomo 1993).
Konfirmasi kemurnian isolat secara fisiologi dilakukan dengan uji
fermentatif. Keempat isolat ditumbuhkan pada medium glukosa dengan indikator
brom cressol purple. Isolat diletakkan pada tabung bertutup untuk membatasi
masukan oksigen. Uji ini dilakukan untuk melihat kemampuan fermentasi dari
tiap isolat. Perubahan warna ungu menjadi kuning menunjukkan isolat tersebut
melakukan fermentasi, jika tidak terjadi perubahan warna bukan

kelompok

bakteri fermentatif. Peremajaan bakteri pada medium cair dilakukan dengan cara
diinokulasikan 1 lup tiap isolat pada medium cair masing-masing sebanyak 20
ml kedalam botol yang berukuran 100 ml. Inkubasi dilakukan selama 24 jam
Tahap selanjutnya masing-masing isolat diambil 1 ml dimasukkan ke medium 50
ml untuk perbanyakan inokulan dan diinkubasikan selama 24 jam.

Seleksi Aktivitas Reduksi Nitrat pada Konsentrasi
Oksigen (O2) yang Berbeda
Pengukuran aktivitas reduksi nitrat pada konsentrasi oksigen berbeda
dilakukan pada

botol serum steril 75 ml yang ditutup dengan butyl rubber

septum. Pengkondisian konsentrasi oksigen dengan pengaturan volume saturasi
udara pada head space botol serum.
Botol serum steril volume 75 ml diisi dengan 23 ml medium cair. Botol
dibuat kondisi an aerobik dengan cara menghilangkan oksigen yang terdapat di
dalam botol. Gas nitrogen bebas oksigen dialirkan ke dalam botol reaksi dengan
menggunakan jarum/syringe steril selama 15 menit. Sebelum gas dimasukkan,
gas terlebih dahulu disaring dengan filter steril diameter 47 mm dengan ukuran
0,45 mikro meter.
Langkah berikutnya, saturasi udara pada masing-masing botol dikondisikan
menjadi 0%, 1%, 10%, 30%, 50%, 80%, dan 100%. Saturasi udara dimasukkan
pada masing-masing botol serum yang telah diberi perlakuan pembebasan oksigen
sebanyak 0,5 ml, 5 ml, 15 ml, 25 ml, dan 40 ml. Pada waktu proses pemasukan
saturasi udara, gas nitrogen akan terdorong keluar melalui jarum yang dipasang
pada tutup botol disamping syringe, sehingga volume saturasi udara pada masingmasing botol menjadi 1%, 10%, 30%, 50%, 80%. Pengkondisian saturasi udara
100% dilakukan dengan tanpa memasukkan gas nitrogen murni pada botol serum.
Kondisi saturasi udara 0% dengan pengisian gas nitrogen murni tanpa
memasukkan saturasi udara.
Seluruh botol serum yang telah dikondisikan saturasi udaranya dikocok
untuk melarutkan gas perlakuan. Masing-masing botol serum diinokulasi dengan
1 ml isolat. Isolat diletakan pada inkubator berpenggoyang pada kecepatan 80 rpm
suhu ruang (28-31)oC selama 96 jam (Su et al. 2001).
Setelah diinkubasi pada kadar oksigen yang berbeda, dilakukan pengukuran
densitas sel dengan spektrofotometer pada panjang gelombang 620 nm. Kultur
biakan bakteri diambil sebanyak 1ml pada tabung efendorf dan disentrifugasi
dengan kecepatan 4000 rpm selama 15 menit untuk mendapatkan supernatan.
Supernatan dari kultur biakan dianalisis kandungan nitrit, nitrat dan amonium.

Analisis nitrit.
Analisis Nitrit menggunakan metode Sulfanilamide (Cleseri et al 1989).
Nitrit dengan amina aromatik pada sulfalinamide akan membentuk diazonium.
Senyawa tersebut dengan NED (N-I-Naphtyl Ethylene Diamine Dyhidrochloride)
membentuk gugus kromofor yang berwarna merah muda (Lampiran 1) dan dapat
diukur dengan spektrofotometer pada panjang gelombang 540 nm. Kadar nitrit
ditentukan dengan cara memasukkan 5 ml sampel yang telah diencerkan kedalam
tabung reaksi, ditambahkan 0,1 sulfanilamid (C6H8N2O2S) dan 0,1 NED.
Kemudian diukur absorbansinya dengan spektrofotometer pada panjang
gelombang 540 nm. Kurva standar natrium nitrit (NaNO2) dengan konsentrasi
sebesar : 0 ;

0,2; 0,4; 0,6; 0,8 , dan 1,0 mg/l kemudian dikonversi ke mM

digunakan untuk menentukan kadar nitrit pada sampel (Lampiran 2).
Analisis nitrat
Analisis senyawa nitrat dengan menggunakan metode Greenberg et al
(1992). Kadar nitrat ditentukan dengan cara memasukkan 20 ml sampel yang
telah diencerkan ke dalam kolom reduksi yang berisi cadmium. Pada saat sampel
melewati kolom reduksi, cadmium akan mereduksi nitrat menjadi nitrit. Sampel
sebanyak 5 ml direaksikan dengan reagen pada analisis nitrit.

Sampel akan

menunjukkan perubahan warna merah muda (Lampiran 1), diukur pada panjang
gelombang 540 nm. Kurva standar natrium nitrit (NaNO2) dengan konsentrasi
sebesar : 0 ;

0,2; 0,4; 0,6; 0,8; dan 1,0 mg/l, kemudian dikonversi ke mM

digunakan untuk menentukan kadar nitrit pada sampel. Nilai konsentrasi nitrat
adalah hasil pengurangan antara konsentrasi nitrit yang dilewatkan pada kolom
reduksi dengan konsentrasi nitrit yang tidak dilewatkan.
Analisis amonium
Pengukuran konsentrasi amonium menggunakan metode phenate (Cleseri et
al. 1989). Kadar amonium ditentukan dengan cara 5 ml sampel yang diencerkan ,
dimasukkan kedalam tabung reaksi, ditambahkan 0,2 ml larutan fenol alkohol
(C6H5OH) lalu dihomogenkan, diamkan selama 1 menit lalu tambahkan 0,2 ml
Na-Dihidro Nitroprusid (Na2[Fe(CN)NO]2.H2O), kemudian ditambahkan 0,5 ml
larutan oksidan yang terdiri dari Natrium Sitrat (C6H5Na3O7.2H2O) dan Natrium

hipoklorit (NaOCl2) dan dibiarkan selama satu jam pada suhu ruang (28-31)o C.
Sampel yang telah diberi larutan indikator menunjukkan perubahan warna hijau
sampai biru (Lampiran 1), diukur dengan spektrofotometer pada panjang
gelombang 640 nm. Kurva standar amonium klorida (NH4Cl) sebesar: 0 ; 0,2;
0,4; 0,6; 0,8 ; 1,0; 2,0; 4,0; dan 8,0 mg/l kemudian dikonversi ke mM digunakan
untuk menghitung konsentrasi amonia pada sampel (Lampiran 2).
Perhitungan Pembentukan Gas.
nitrit (NO2 -), dan amonium (NH4+)

nitrat (NO3-),

Setelah konsentrasi

diketahui dari masing-masing sampel, dihitung jumlah nitrat yang tereduksi
dengan rumus :
= [NO3-] kontrol – [NO3-]inokulasi

[NO3-] tereduksi
%

[NO3-]

=

tereduksi

[NO3-] red

x

100

-

[NO3 ] kontrol
Jumlah senyawa nitrit yang terbentuk dihitung dengan rumus sebagai berikut:
[NO2-] terbentuk
%[NO2

[NO2-] perlakuan – [NO2-] kontrol

=

] terbentuk = [NO2-] perlakuan – [NO2-] kontrol

-

x 100

-

[NO3 ]tereduksi
Jumlah senyawa amonium yang terbentuk dihitung dengan rumus sebagai berikut:
=

[NH4+] perlakuan – [NH4+] kontrol

% [NH4+] terbentuk =

[NH4+] perlakuan – [NH4+] kontrol

[NH4+] terbentuk

x

100

[NO3-]tereduksi
Estimasi produk akhir gas yang terbentuk dihitung dengan rumus
[Gas ]

=

[NO3-]reduksi – [NO2-] terbentuk – [NH4 +] terbentuk

%[

=

[Gas] X 100%

Gas]

[NO3-] tereduksi

Keterangan : Konsentrasi nitrat kontrol didapatkan dari sediaan medium steril
tanpa bakteri .

Kinetika Aktivitas Reduksi Nitrat Isolat Terpilih
Dua isolat terbaik dalam mereduksi nitrat dan responsif terhadap oksigen
dipilih untuk diamati kinetikanya. Botol serum steril volume 125 ml diisi dengan
50 ml medium cair. Sebanyak 1 ml isolat diinokulasikan pada tiap botol yang
telah dikondisikan saturasi udaranya secara berurutan masing-masing 1 %, 10%,
100%. Kultur biakan diinkubasikan pada suhu ruang (28-31)oC selama 96 jam
(Su et al 2001).

Kultur biakan diamati pola pertumbuhannya dan dianalisis

konsentrasi nitrat, nitrat, dan amonium dengan metoda yang telah diuraikan
sebelumnya. Analisis dilakukan setiap selang waktu 12 jam selama 96 jam (4
hari).
Hasil pertumbuhan digambarkan pada suatu grafik pertumbuhan pada
kondisi oksigen berbeda. Korelasi antara konsentrasi sel dengan kerapatan optis
(OD) isolat, dilakukan metoda hitungan cawan (Lampiran 3) pada konsentrasi
pengenceran 10 -6, 10-7, 10 -8, dan 10-9. Kultur biakan yang sama diencerkan dan
OD dari beberapa pengenceran diukur. Kurva standar pertumbuhan dibuat dari
nilai-nilai OD pengenceran dan konsentrasi sel sehingga didapatkan nilai regresi
dan persamaan garis (Lampiran 4) untuk menentukan jumlah sel. Laju
pertumbuhan spesifik maksimum didapatkan dengan mencari nilai regresi dan
persamaan garis dari korelasi waktu inkubasi dengan nilai ln jumlah sel. Laju
pertumbuhan maksimum merupakan koefisien variabel x pada persamaan garis
Y= ax + c (Maier et al. 2000).
Hasil uji kimia digambarkan dalam suatu grafik yang menunjukkan
hubungan lama inkubasi dengan nitrat tereduksi, nitrit, dan amonium serta
estimasi gas N2O yang terbentuk pada setiap konsentrasi oksigen yang berbeda.
Kecepatan reduksi setiap sel masing-masing isolat dihitung pada kondisi saturasi
udara 1 %, 10% dan 100%.

HASIL
Karakteristik, Morfologi dan Fisiologi
Bakteri Nitrat Amonifikasi Disimilatif
Hasil konfirmasi kemurnian dari keempat isolat dengan metoda cawan
gores, morfologi koloninya berbentuk bulat, elevasi tombol dan cembung