4.5 Kromatografi Penukar ion
Penelitian ini menggunakan matriks DEAE Sephadex A 50. Matriks ini termasuk dalam golongan fungsional diethylaminoethyl, terbuat dari dextran,
sejenis polysakarida. Dextran termasuk dalam golongan penukar ion yang lemah. Kode A-50 adalah penukar ion jenis anionik dengan kapasitas 50, artinya jumlah
50 muatan dan potensi muatannya per unit berat atau miliequivalen grup ion per miligram berat kering matrik Boyer 1993. Hasil kromatografi pertukaran ion
disajikan pada Gambar 16.
-0,1 0,1
0,2 0,3
0,4 0,5
0,6 0,7
10 20
30 40
50 60
70 Nomer fraksi
Aktivitas kola g
enase Uni tm
l; Absor b
an 280 n
0,1 0,2
0,3 0,4
0,5 0,6
0,7 0,8
Konsentrasi NaCl M
Gambar 16 Hasil kromatografi penukar ion. ◊ absorban pada 280 nm,
■ aktivitas kolagenase Terdapat tiga puncak aktivitas kolagenase. Aktivitas kolagenase tertinggi
terdapat pada fraksi yang ke-11 sebesar 0,658 Umenit dengan absorban 0,352 pada panjang gelombang 280 nm. Fraksi yang ke-11 ini selanjutnya dimurnikan
lagi menggunakan gel filtrasi.
4.6 Kromatogafi Gel Filtrasi
Purifikasi kolagenase
selanjutnya adalah kromatografi gel filtrasi.
Penelitian ini kromatografi menggunakan matriks Sephadex G-100. Kode G-100 artinya adalah matriks untuk gel filtrasi dengan perkiraan berat molekul yang akan
dipisahkan sebesar 4.000-150.000 Dalton. Selanjutnya fraksi-fraksi yang dihasilkan, diuji aktivitas kolagenase dan proteinnya. Hasil kromatografi gel
filtrasi disajikan pada Gambar 17.
0,02 0,04
0,06 0,08
0,1 0,12
0,14
1 10
19 28
37 46
55 Nomer Fraksi
A k
tiv ita
s k o
la g
en as
e U
n it
m
0,02 0,04
0,06 0,08
0,1 0,12
0,14
Ab so
rb a
n 280
n m
Gambar 17 Hasil kromatografi gel filtrasi. ◊ aktivitas kolagenase, ■
absorban pada 280 nm. Aktivitas kolagenase tertinggi terdapat pada fraksi yang ke-7 sebesar 0,133
Uml dengan absorban 0,126 pada panjang gelombang 280 nm. Gel Sephadex G- 100 dapat digunakan untuk memisahkan kolagenase dengan pengotor lainnya.
Tahapan proses pemurnian telah berjalan dengan baik hal ini dapat dilihat dengan peningkatan kelipatan pemurniannya Kelipatan tingkat pemurnian kolagenase
disajikan pada Tabel 8. Purifikasi kolagenase dari organ dalam ikan bandeng, menghasilkan tingkat kemurnian akhir sebesar 114,371 kali dan yield sebesar
1,26. Tabel 8 Hasil pemurnian kolagenase.
Tahapan Volume
ml Aktvitas
enzim Unitml
Aktivitas U
Konsentrasi protein
mgml Protein
mg Aktivitas
spesifik Umg Derajat
kemurnian Yield
Ekstraksi 450 0,141 63 0,785 353,25 0,178 1,00 100,00
Hasil pengendapan
70 ZA 45 0,496
2,32 1,185
53,325 0,419 2,347 35,42
Dialisis 20 0,451 9,020
1,020 23,260 0,388 2,484
14,32 DEAE
Sephadex A-50 5 0,657
1,314 0,095
0,190 6,916 38,778
2,08 Sephadex G-
100 5 0,133
0,798 0,0065
0,039 20,462 114,731
1,26
4.4 Karakterisasi