Capability of Endophytic Actinomycetes in Fixing Nitrogen and Their Role in Promoting Rice Seedlings Growth
KEMAMPUAN AKTINOMISET ENDOFIT SEBAGAI PENAMBAT
NITROGEN DAN PERANNYA DALAM MENINGKATKAN
PERTUMBUHAN TANAMAN PADI
ANNISA PARAMITA PRATYASTO
SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2012
PERNYATAAN MENGENAI TESIS DAN SUMBER INFORMASI
Dengan ini saya menyatakan bahwa tesis Kemampuan Aktinomiset Endofit
sebagai Penambat Nitrogen dan Perannya dalam Meningkatkan Pertumbuhan
Tanaman Padi adalah karya saya dengan arahan dari komisi pembimbing dan
belum diajukan dalam bentuk apapun kepada perguruan tinggi mana pun. Sumber
informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan maupun tidak
diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam
Daftar Pustaka di bagian akhir tesis ini.
Bogor, Oktober 2012
Annisa Paramita Pratyasto
G351100161
ABSTRACT
ANNISA PARAMITA PRATYASTO. Capability of Endophytic Actinomycetes
in Fixing Nitrogen and Their Role in Promoting Rice Seedlings Growth. Under
direction of YULIN LESTARI and NISA RACHMANIA MUBARIK.
Nitrogen is the nutrient that most frequently limits on paddy productivity.
Excessive chemical nitrogen fertilizer applied on conventional farming may have
negative impact to the degradation of environment. An alternative solution for this
problem is by using biological nitrogen fixation (BNF) to enhance crop growth
which can be done by applying nitrogen fixing endophytic actinomycetes. The
objective of this research was to obtain endophytic actinomycetes isolates which
have the capability in fixing N2 based on in-vitro and in-planta assay. Based on invitro assay, SSW-02 was considered as the most promising N2 fixing bacteria
based on its ability to reduce 2.1750 nmol acetylene/hour and produced ammonia
2.144 ppm for 15 days in free nitrogen medium. In-planta assessment was
conducted in a greenhouse using IR-64 rice variety on sterile and non sterile soil
with two-factors completely randomized factorial design. The factors were
endophytic actinomycetes treatments which consisted of SSW-02, AB131-2,
control and urea dosage which consisted of 0%, 50%, 100% dosage from 200
Kg/Ha. Each treatment had been done in three replications. Based on in-planta
assay, SSW-02 application with 100% urea dosage increased total plant dry
weight and leaf color. Although not significantly different, SSW-02 application
with 50% urea dosage also had the highest number of tillering and ability to
increase plant height and root length. Nitrogen content also increased by SSW-02
application with 100% urea dosage in sterile soil. Microscopic observation of
SSW-02 and AB131-2 of rice treatment using reducing tetrazolium method
showed that both of isolates were able to penetrate and colonize the root of rice,
confirming them as endophytes. The results indicated that SSW-02 had promising
role as a N2 fixing bacteria on rice plant.
Keywords : Collonization, Endophytic Actinomycetes, N2 Fixation, Rice
RINGKASAN
ANNISA PARAMITA PRATYASTO. Kemampuan Aktinomiset Endofit sebagai
Penambat Nitrogen dan Perannya dalam Meningkatkan Pertumbuhan Tanaman
Padi . Dibimbing oleh YULIN LESTARI dan NISA RACHMANIA MUBARIK.
Pertambahan populasi penduduk di dunia berdampak langsung terhadap
peningkatan kebutuhan akan produktivitas padi sebagai bahan pangan pokok di
dunia, terutama di Indonesia. Produktivitas padi dibatasi salah satunya oleh
kebutuhan akan nitrogen. Pengembangan keragaman pupuk yang responsif dan
ditambah dengan kesadaran petani tentang pentingnya kebutuhan nitrogen, telah
menyebabkan tingginya tingkat penggunaan pupuk nitrogen anorganik pada padi
yang dapat membahayakan lingkungan. Salah satu solusi dari permasalahan di
atas ialah memanfaatkan mikrob penambat N2 yaitu aktinomiset endofit yang
dapat menjadi pelaku penambatan N2 di samping keistimewaannya dalam
menghasilkan senyawa bioaktif dengan beragam fungsi seperti fitohormon,
antimikrob dan enzim. Penelitian ini bertujuan untuk mengkaji kemampuan
aktinomiset endofit terpilih dalam menambat N2 secara in-vitro dan in-planta serta
mengetahui kemampuannya dalam meningkatkan pertumbuhan tanaman padi.
Mikrob yang digunakan dalam penelitian ialah 10 isolat aktinomiset endofit
yang merupakan kelompok Streptomyces yaitu AB131-2, PS4-16, Impara 6A,
AB131-1, AB131-3, A Fat, Membramo A, LSW-05, LBR-02, dan SSW-02
koleksi Laboratorium Mikrobiologi IPB. Peremajaan isolat aktinomiset endofit
dilakukan dengan menggoreskan koloni isolat aktinomiset endofit pada media
Yeast Extract Starch Agar (YSA). Tahapan dalam penelitian ini dibagi menjadi
dua tahapan yaitu uji kemampuan aktinomiset endofit dalam penambatan nitrogen
secara in-vitro dan aktinomiset endofit terpilih diujikan secara in-planta. Secara
in-vitro, pada aktinomiset endofit dilakukan pengamatan kemampuan tumbuh
pada media bebas nitrogen, uji penambatan nitrogen dengan metode reduksi
asetilen dan uji produksi amonia dengan metode Nessler.
Aplikasi isolat aktinomiset endofit terpilih secara in-planta dilakukan pada
padi varietas IR-64 di rumah kaca dengan kombinasi metode seed dressing dan
dipping dengan inokulan aktinomiset endofit terpilih. Desain penelitian dilakukan
dengan Rancangan Acak Lengkap (RAL) faktorial dengan dua faktor yaitu faktor
isolat aktinomiset endofit terpilih terdiri atas tiga taraf yaitu tanpa inokulasi (K),
penambahan isolat aktinomiset endofit terpilih 1 (SSW-02) (S), dan penambahan
isolat aktinomiset endofit terpilih 2 (AB131-2) (A); faktor dosis urea terdiri tiga
taraf yaitu penggunaan dosis pupuk NPK sesuai standar (1) sebesar 200 Kg
Urea/Ha: 100 Kg SP-36/Ha : 100 Kg KCl/Ha, setengah dosis standar pupuk Urea
(0.5) dan tanpa pupuk Urea (0). Pengulangan dilakukan sebanyak tiga kali.
Pengamatan mikrob endofit dalam jaringan akar padi dilakukan dengan
pewarnaan tetrazolium dan pengamatan pertumbuhan vegetatif padi dilakukan
setelah padi berumur 6 MST.
Sepuluh isolat aktinomiset endofit dapat tumbuh baik dengan morfologi
koloni yang beragam pada media YSA. AB131-1, SSW-02, A Fat, Membramo A
memiliki miselia berwarna coklat tua, AB131-2 dengan miselia berwarna hijau
tua, Impara 6A memiliki miselia berwarna putih serta lainnya memiliki warna
miselia coklat muda. Perbedaan dalam pembentukan miselia aerial serta
munculnya penataan rantai spora menunjukkan karakter Streptomyces spp.
Penataan rantai spora pada aktinomiset endofit pun beragam seperti A Fat, LBR02, PS4-16 dan LSW 05 memiliki tipe rantai spora Spirales, Impara 6 A dan
AB131-3 memiliki tipe rantai spora Rectiflexibiles dan lainnya memiliki tipe
rantai spora Retinaculiaperti.
Secara in-vitro, isolat aktinomiset endofit SSW-02 merupakan isolat terbaik
yang mampu menambat nitrogen berdasarkan kemampuannya mereduksi asetilen
sebesar 2.1750 nmol etilen/jam atau dengan reduksi asetilen spesifik sebesar 1.55
nmol etilen/jam per mg sel serta berdasarkan kemampuan produksi amonia yang
dihasilkan sebesar 2.144 ppm dalam waktu optimum pertumbuhan 15 hari.
Berdasarkan kemampuan reduksi asetilen dan produksi amonia, maka isolat
aktinomiset endofit yang terpilih untuk diamati kemampuan penambatan N2
secara in-planta adalah isolat SSW-02 sebagai isolat dengan kemampuan
penambatan N2 terbaik dan isolat AB131-2 sebagai isolat dengan kemampuan
penambatan N2 rendah, namun memiliki kemampuan produksi IAA tertinggi.
Isolat SSW-02 dan AB131-2 juga mampu melakukan penetrasi di jaringan
interseluler akar padi berdasarkan uji tetrazolium dengan akar padi setelah 6
minggu masa pertumbuhan vegetatif padi. Isolat SSW-02 memasuki bagian
jaringan interselular akar, sedangkan, AB131-2 sebagian besar berada di daerah
eksodermis dari arah irisan melintang akar. Kedua isolat juga berada di bagian
pertengahan internal akar atau sekitar area korteks dan endodermis akar dari arah
irisan membujur akar. Pada pengamatan hasil pertumbuhan vegetatif padi,
aplikasi isolat SSW-02 mampu meningkatkan nilai warna hijau daun tertinggi
sebesar 3.08 dan 3.00 pada tanah steril dan tidak steril juga peningkatan terhadap
bobot kering total tanaman sebesar 17.44% dibandingkan kontrol pada tanah steril
dengan penggunaan pupuk urea sebesar 100% (≈200 Kg Urea/Ha). Aplikasi
SSW-02 dengan penggunaan pupuk urea 50% (≈100 Kg Urea/Ha) juga mampu
menunjukkan peningkatan terhadap tinggi tanaman padi sebesar 4.05%,
peningkatan panjang akar sebesar 10% dan peningkatan jumlah anakan sebesar
9% dibandingkan dengan kontrol di tanah steril. SSW-02 dengan dosis urea 100%
juga menunjukkan peningkatan serapan nitrogen total tanaman padi tertinggi pada
tanah steril sebesar 1.5005 g, namun di tanah tidak steril aplikasi AB131-2
memberikan hasil tertinggi sebesar 1.9426 g. Hal ini menunjukkan potensi
aplikasi SSW-02 sebagai penambat N2 pada tanaman padi khususnya di tanah
steril. Hal ini menunjukkan potensi aplikasi SSW-02 sebagai penambat N2 pada
tanaman padi.
Kata kunci: Aktinomiset Endofit, Kolonisasi, Padi, Penambatan N2
© Hak Cipta milik IPB, tahun 2012
Hak Cipta dilindungi Undang-Undang
1. Dilarang mengutip sebagian atau seluruh karya tulis ini tanpa
mencantumkan atau menyebutkan sumber.
a. Pengutipan hanya untuk kepentingan pendidikan, penelitian,
penulisan karya ilmiah, penyusunan laporan, penulisan kritik,
atau tinjauan suatu masalah.
b. Pengutipan tidak merugikan kepentingan yang wajar IPB
2. Dilarang mengumumkan dan memperbanyak sebagian atau seluruh Karya
tulis dalam bentuk apa pun tanpa izin IPB
KEMAMPUAN AKTINOMISET ENDOFIT SEBAGAI PENAMBAT
NITROGEN DAN PERANNYA DALAM MENINGKATKAN
PERTUMBUHAN TANAMAN PADI
ANNISA PARAMITA PRATYASTO
Tesis
sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
Magister Sains pada
Program Studi Mikrobiologi
SEKOLAH PASCA SARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2012
Penguji Luar Komisi pada Ujian Tesis: Dr. Ir. Sugiyanta M.Si.
Judul Tesis
Nama Mahasiswa
NRP
: Kemampuan Aktinomiset Endofit sebagai Penambat
Nitrogen dan Perannya dalam Meningkatkan Pertumbuhan
Tanaman Padi
: Annisa Paramita Pratyasto
: G351100161
Disetujui
Komisi Pembimbing
Dr. Ir. Yulin Lestari
Ketua
Dr. Nisa Rachmania Mubarik M.Si.
Anggota
Diketahui
Ketua Program Studi Mikrobiologi
Dekan Sekolah Pascasarjana
Prof. Dr. Anja Meryandini, M.S.
Dr. Ir. Dahrul Syah, M.Sc.Agr.
Tanggal Ujian: 8 Oktober 2012
Tanggal Lulus:
PRAKATA
Puji syukur penulis panjatkan kepada Allah SWT atas segala karunia-Nya
sehingga tesis ini berhasil diselesaikan. Judul yang dipilih dalam penelitian ini
yaitu Kemampuan Aktinomiset Endofit sebagai Penambat Nitrogen dan Perannya
dalam Meningkatkan Pertumbuhan Tanaman Padi
Terima kasih penulis ucapkan kepada Dr. Ir. Yulin Lestari dan Dr. Nisa
Rachmania Mubarik M.Si selaku pembimbing yang telah banyak memberikan
arahan dan sarannya selama penulisan karya ilmiah ini. Terima kasih juga
disampaikan kepada Dr. Ir. Sugiyanta M.Si.selaku penguji luar komisi dan Prof.
Dr. Anja Meryandini, M.S. selaku Ketua Program Mayor Mikrobiologi IPB.
Kepada I-MHERE B2c. IPB 2010/2012 terima kasih atas kepercayaannya untuk
memberikan beasiswa kuliah selama menempuh pendidikan pascasarjana di IPB
dan terimakasih atas hibah penelitian I-MHERE B2c. IPB a.n Dr. Ir. Yulin Lestari
sehingga, penelitian yang saya lakukan dapat terlaksana dengan baik.
Penulis menyampaikan terima kasih kepada staf laboratorium Mikrobiologi,
yaitu Mbak Heni dan Bapak Jaka, serta seluruh staf laboratorium Balai Penelitian
Tanah, Litbang Pertanian Bogor khususnya Bapak Jatmo, Bu Ratih, dan Pak Yadi
yang bersedia membantu penelitian saya. Ungkapan terima kasih juga penulis
sampaikan kepada Gesti, Aya, Eka, Nia, Putri, Mbak Yessy, Mbak Diah, Sari, Pak
Puji atas bantuan dan motivasinya selama penelitian. Ungkapan terima kasih
disampaikan kepada ayah, ibu, Nadira Puspita Pratyasto, Citta Faradisa Pratyasto,
serta Yudhi Hidayat atas doa, dukungan dan semangat yang diberikan. Kepada
teman-teman Pascasarjana Mikrobiologi IPB 2010 terima kasih atas kebersamaan
yang singkat dan sangat indah. Semoga penelitian ini dapat bermanfaat bagi
kemajuan ilmu pengetahuan selanjutnya.
Bogor, Oktober 2012
Annisa Paramita Pratyasto
RIWAYAT HIDUP
Penulis dilahirkan di Denpasar pada tanggal 2 Oktober 1987 dari ayah Ir.
Lintjah Pratyasto dan ibu Ir. Ida Agustini Saidi, MP. Penulis merupakan putri
pertama dari tiga bersaudara. Penulis lulus Sekolah Menengah Umum Negeri 16
Surabaya tahun 2005. Pada tahun yang sama penulis diterima masuk Universitas
Gadjah Mada (UGM) sebagai mahasiswa Jurusan Teknologi Pangan dan Hasil
Pertanian, Fakultas Teknologi Pertanian dan dinyatakan lulus S1 tahun 2009.
Penulis sempat bekerja sebagai New Product Development Staff di PT. Synergy
Beverage Indonesia pada periode Oktober 2010-Agustus 2011
Penulis
melanjutkan
pendidikan
program
Magister
pada
Sekolah
Pascasarjana-Institut Pertanian Bogor (IPB) dengan memilih Program Mayor
Mikrobiologi (MIK) dengan beasiswa program I-MHERE B2c. IPB pada tahun
2010. Saat menempuh pendidikan penulis pernah bekerja sebagai freelance
reporter pada PT. Media Pangan Indonesia periode Juni 2011 hingga sekarang.
Sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Magister Sains, penulis
melakukan penelitian dengan judul “Kemampuan Aktinomiset Endofit sebagai
Penambat Nitrogen dan Perannya dalam Meningkatkan Pertumbuhan Tanaman
Padi”. Penelitian yang dilakukan dibimbing oleh Dr. Ir. Yulin Lestari dan Dr. Nisa
Rachmania Mubarik, M.Si. Sebagian hasil penelitian ini juga pernah
dipresentasikan secara lisan oleh penulis dalam “The 7th International Student
Conference at Ibaraki University” (ISCIU7), 3-4 Desember 2011 di Ibaraki,
Jepang dan “International Seminar Agriculture Adaptation in The Tropics:
Research and Innovation toward Environment Resilience and Food Security”, 5-6
September 2012 di Bogor, Indonesia.
DAFTAR ISI
Halaman
DAFTAR TABEL ........................................................................................
xvi
DAFTAR GAMBAR ...................................................................................
xvii
DAFTAR LAMPIRAN .................................................................................
xviii
PENDAHULUAN
Latar Belakang ......................................................................................
Perumusan Masalah ..............................................................................
Hipotesis ................................................................................................
Tujuan Penelitian ..................................................................................
Manfaat Penelitian .................................................................................
Ruang Lingkup Penelitian ....................................................................
1
4
4
5
5
5
TINJAUAN PUSTAKA
Aktinomiset Endofit .............................................................................
Penambatan Nitrogen ...........................................................................
Padi .......................................................................................................
7
10
12
BAHAN DAN METODE
Kerangka Penelitian ..............................................................................
Rancangan Percobaan ...........................................................................
Bahan ....................................................................................................
Peremajaan dan Pengamatan Mikroskopis Aktinomiset Endofit .........
Pengukuran Bobot Kering Sel Aktinomiset .........................................
Uji Kemampuan Aktinomiset Endofit dalam Penambatan N2
secara In-Vitro .......................................................................................
Uji Kemampuan Aktinomiset Endofit dalam Penambatan N2
secara In-Planta .....................................................................................
HASIL
Pertumbuhan dan Morfologi Koloni Aktinomiset Endofit ..................
Kemampuan Tumbuh Aktinomiset Endofit di Media Bebas
Nitrogen ...............................................................................................
Aktivitas Penambatan Nitrogen Aktinomiset Endofit Berdasarkan
Metode Reduksi Asetilen .....................................................................
Produksi Amonia oleh Aktinomiset Endofit ......................................
Kolonisasi Aktinomiset Endofit pada Jaringan Akar Padi...................
Kemampuan Aktinomiset Endofit Penambat Nitrogen dalam
Peningkatan Pertumbuhan Vegetatif Tanaman Padi ............................
Kemampuan Aktinomiset Endofit Penambat Nitrogen dalam
Peningkatan Serapan Nitrogen Tanaman Padi .....................................
PEMBAHASAN
Pertumbuhan dan Morfologi Koloni Aktinomiset Endofit ..................
15
16
16
18
18
18
19
23
24
25
25
28
29
37
43
Kemampuan Aktinomiset Endofit dalam Penambatan N2 secara
In-Vitro .................................................................................................
Kolonisasi Aktinomiset Endofit pada Jaringan Akar Padi ...................
Kemampuan Aktinomiset Endofit Penambat Nitrogen dalam
Peningkatan Pertumbuhan Vegetatif Tanaman Padi ............................
Kemampuan Aktinomiset Endofit Penambat Nitrogen dalam
Peningkatan Serapan Nitrogen Tanaman Padi .....................................
44
46
47
51
SIMPULAN DAN SARAN ..........................................................................
55
Simpulan ...............................................................................................
Saran .....................................................................................................
55
55
DAFTAR PUSTAKA ...................................................................................
57
LAMPIRAN .................................................................................................
65
DAFTAR TABEL
Halaman
1
Diazotrof endofit dan area kolonisasinya pada tanaman padi ............
2
2
Kemampuan aktinomiset endofit dalam mereduksi asetilen .............. 25
3
Hasil uji kuantitatif produksi amonia aktinomiset endofit umur 15
hari ...................................................................................................... 26
4
Pola produksi amonia pada isolat aktinomiset endofit terpilih .......... 27
5
Pengaruh dosis urea dan aktinomiset terhadap tinggi tanaman padi
umur 6 MST pada tanah steril ............................................................ 30
6
Pengaruh dosis urea dan aktinomiset terhadap tinggi tanaman padi
umur 6 MST pada tanah tidak steril ................................................... 30
7
Pengaruh dosis urea dan aktinomiset terhadap panjang akar
tanaman padi umur 6 MST pada tanah steril ...................................... 31
8
Pengaruh dosis urea dan aktinomiset terhadap jumlah anakan
tanaman padi umur 6 MST pada tanah steril ...................................... 32
9
Pengaruh dosis urea dan aktinomiset terhadap jumlah anakan
tanaman padi umur 6 MST pada tanah tidak steril ............................. 33
10 Pengaruh dosis urea dan aktinomiset terhadap nilai warna daun
tanaman padi umur 6 MST pada tanah steril ...................................... 33
11 Pengaruh dosis urea dan aktinomiset terhadap nilai warna daun
tanaman padi umur 6 MST pada tanah tidak steril ............................. 34
12 Pengaruh dosis urea dan aktinomiset terhadap bobot kering akar
tanaman padi umur 6 MST pada tanah steril ...................................... 34
13 Pengaruh dosis urea dan aktinomiset terhadap bobot kering akar
tanaman padi umur 6 MST pada tanah tidak steril ............................. 35
14 Pengaruh dosis urea dan aktinomiset terhadap bobot kering tajuk
tanaman padi umur 6 MST pada tanah tidak steril ............................. 36
15 Pengaruh dosis urea dan aktinomiset terhadap bobot kering total
tanaman padi umur 6 MST pada tanah steril ...................................... 37
16 Pengaruh dosis urea dan aktinomiset terhadap serapan nitrogen
akar tanaman padi umur 6 MST pada tanah steril .............................. 38
DAFTAR GAMBAR
Halaman
1
Proses penambatan N2 ....................................................................... 10
2
Diagram alur penelitian ..................................................................... 15
3
Pertumbuhan koloni isolat aktinomiset endofit di media YSA
umur 15 hari ....................................................................................... 23
4
Tipe penataan rantai spora aktinomiset ............................................. 24
5
Pertumbuhan koloni isolat aktinomiset endofit di media bebas
nitrogen umur 15 hari ........................................................................ 24
6
Hasil uji kualitatif produksi amonia dengan metode Nessler ............. 26
7
Pola produksi amonia dengan metode Nessler ................................... 27
8
Kolonisasi aktinomiset endofit pada jaringan akar padi 6 MST ........ 28
9
Pertumbuhan vegetatif tanaman padi pada tanah steril ..................... 29
10 Pertumbuhan vegetatif tanaman padi pada tanah tidak steril ............. 29
11 Pengaruh dosis urea dan perlakuan aktinomiset terhadap panjang
akar tanaman padi umur 6 MST pada tanah tidak steril .................... 31
12 Pengaruh dosis urea dan perlakuan aktinomiset terhadap bobot
kering tajuk tanaman padi umur 6 MST pada tanah tidak steril ........ 35
13 Pengaruh dosis urea dan perlakuan aktinomiset terhadap bobot
kering total tanaman padi umur 6 MST pada tanah tidak steril ......... 37
14 Pengaruh dosis urea dan perlakuan aktinomiset terhadap serapan
nitrogen akar tanaman padi umur 6 MST pada tanah tidak steril ...... 38
15 Pengaruh dosis urea dan perlakuan aktinomiset terhadap serapan
nitrogen tajuk tanaman padi umur 6 MST pada tanah steril (a) dan
tidak steril (b)...................................................................................... 39
16 Pengaruh dosis urea dan perlakuan aktinomiset terhadap serapan
nitrogen total tanaman padi umur 6 MST pada tanah steril (a) dan
tidak steril (b)...................................................................................... 40
DAFTAR LAMPIRAN
Halaman
1
Hasil analisis sidik ragam dan hasil uji lanjut Duncan nilai reduksi
asetilen dengan selang kepercayaan 95% ...................................................... 67
2
Hasil analisis sidik ragam dan hasil uji lanjut Duncan nilai produksi
amonia dengan selang kepercayaan 95% ...................................................... 68
3
Hasil produksi amonia oleh aktinomiset endofit pada hari ke-15 ................. 69
4
Hasil produksi amonia isolat SSW-02 dan AB131-2 pada hari ke-5 ............ 70
5
Hasil produksi amonia isolat SSW-02 dan AB131-2 pada hari ke-10 .......... 70
6
Hasil produksi amonia isolat SSW-02 dan AB131-2 pada hari ke-15 .......... 71
7
Perhitungan kebutuhan pupuk N, P, dan K dalam skala pot 5 Kg tanah ....... 71
8
Data analisis sifat kimia tanah ultisol Cimanggu sebelum tanam ................. 72
9
Kriteria penilaian sifat kimia tanah ............................................................... 72
10 Hasil analisis sidik ragam dan hasil uji lanjut Duncan tinggi padi pada
tanah steril dengan selang kepercayaan 95% ................................................ 73
11 Hasil analisis sidik ragam dan hasil uji lanjut Duncan tinggi padi pada
tanah tidak steril dengan selang kepercayaan 95% ....................................... 74
12 Hasil analisis sidik ragam dan hasil uji lanjut Duncan panjang akar pada
tanah steril dengan selang kepercayaan 95% ................................................ 75
13 Hasil analisis sidik ragam dan hasil uji lanjut Duncan panjang akar pada
tanah tidak steril dengan selang kepercayaan 95% ....................................... 76
14 Hasil analisis sidik ragam dan hasil uji lanjut Duncan jumlah anakan
pada tanah steril dengan selang kepercayaan 95% ........................................ 77
15 Hasil analisis sidik ragam dan hasil uji lanjut Duncan jumlah anakan
pada tanah tidak steril dengan selang kepercayaan 95% ............................... 78
16 Hasil analisis sidik ragam dan hasil uji lanjut Duncan nilai warna daun
pada tanah steril dengan selang kepercayaan 95% ........................................ 79
17 Hasil analisis sidik ragam dan hasil uji lanjut Duncan nilai warna daun
pada tanah tidak steril dengan selang kepercayaan 95% ............................... 80
18 Hasil analisis sidik ragam dan hasil uji lanjut Duncan bobot kering akar
pada tanah steril dengan selang kepercayaan 95% ........................................ 81
19 Hasil analisis sidik ragam dan hasil uji lanjut Duncan bobot kering akar
pada tanah tidak steril dengan selang kepercayaan 95% ............................... 82
20 Hasil analisis sidik ragam dan hasil uji lanjut Duncan bobot kering
tajuk pada tanah steril dengan selang kepercayaan 95% ............................. 83
21 Hasil analisis sidik ragam dan hasil uji lanjut Duncan bobot kering
tajuk pada tanah tidak steril dengan selang kepercayaan 95% ..................... 84
22 Hasil analisis sidik ragam dan hasil uji lanjut Duncan bobot kering total
tanaman pada tanah steril dengan selang kepercayaan 95% ......................... 85
23 Hasil analisis sidik ragam dan hasil uji lanjut Duncan bobot kering total
tanaman pada tanah tidak steril dengan selang kepercayaan 95% ................ 86
24 Hasil analisis sidik ragam dan hasil uji lanjut Duncan serapan nitrogen
akar pada tanah steril dengan selang kepercayaan 95% ............................... 87
25 Hasil analisis sidik ragam dan hasil uji lanjut Duncan serapan nitrogen
akar pada tanah tidak steril dengan selang kepercayaan 95% ...................... 88
26 Hasil analisis sidik ragam dan hasil uji lanjut Duncan serapan nitrogen
tajuk pada tanah steril dengan selang kepercayaan 95% .............................. 89
27 Hasil analisis sidik ragam dan hasil uji lanjut Duncan serapan nitrogen
tajuk pada tanah tidak steril dengan selang kepercayaan 95% ..................... 90
28 Hasil analisis sidik ragam dan hasil uji lanjut Duncan serapan nitrogen
total pada tanah steril dengan selang kepercayaan 95% ............................... 91
29 Hasil analisis sidik ragam dan hasil uji lanjut Duncan serapan nitrogen
total pada tanah tidak steril dengan selang kepercayaan 95% ...................... 92
PENDAHULUAN
Latar Belakang
Seiring dengan peningkatan penduduk di dunia, kebutuhan padi sebagai
bahan baku utama produk pangan juga semakin meningkat. Produktivitas padi
dibatasi salah satunya oleh kebutuhan akan nitrogen (Dawe 2000, Shenoy et al.
2001). Padi membutuhkan 1 Kg nitrogen untuk memproduksi 15-20 kg biji padi.
Padi dataran rendah di tropik dapat menggunakan cukup N yang tersedia secara
alami untuk memproduksi 2-3 Ton ha-1. Untuk hasil perolehan yang lebih tinggi,
tambahan nitrogen harus diaplikasikan (Ladha & Reddy 2000). Pengembangan
keragaman pupuk yang responsif dan ditambah dengan kesadaran petani tentang
pentingnya kebutuhan nitrogen, telah menyebabkan tingginya tingkat penggunaan
pupuk nitrogen anorganik pada padi. Penggunaan sejumlah besar pupuk anorganik
dalam jangka waktu yang lama dapat menimbulkan pencemaran lingkungan,
meningkatkan kebutuhan gas akan sumber daya alam yang tak dapat diperbarui,
serta sisa produksi berupa gas CO2 dan NO2 yang berpotensi menimbulkan efek
rumah kaca.
Salah satu solusi dari permasalahan di atas ialah memanfaatkan mikrob
penambat N2 yang dapat mengurangi dampak lingkungan akibat penggunaan pupuk
nitrogen sintetis. Jika sistem penambatan N2 secara biologis berbasis mikrob endofit
dapat diterapkan pada tanaman padi, maka suplai nitrogen bagi tanaman akan
meningkat sehingga pertumbuhan dan produktivitas padi juga meningkat. Jika
sistem penambatan N2 secara biologi dapat dilakukan pada tanaman padi, maka hal
ini dapat meningkatkan suplai nitrogen yang tersedia bagi tanaman hingga sebesar
50 Kg N/Ha lahan (Ladha & Reddy 2000, Cockrell 2004).
Beberapa penelitian telah dilakukan terkait dengan diazotrof endofit dan area
kolonisasinya pada tanaman padi (Tabel 1). Potensi nitrogen yang telah ditambat
oleh bakteri endofit tidak ada yang hilang dan dilepas ke atmosfer (Cockrell 2004).
Di samping itu, beberapa bakteri endofit tersebut selain mampu menambat N2 juga
mampu mensekresikan
asam indol-3-asetat
yang penting untuk
hormon
pertumbuhan padi (Ladha et al. 1997). Selain itu keuntungan dari asosiasi endofit
ialah diazotrof terlindung dari kompetisi, sehingga lebih banyak pertukaran
2
metabolit yang terdapat pada inang, proteksi terhadap kadar konsentrasi oksigen
yang tinggi dan dapat mentransportasi nitrogen yang tertambat langsung kepada
inang (Shenoy et al. 2001).
Tabel 1 Diazotrof endofit dan area kolonisasinya pada tanaman padi
Spesies
Area kolonisasi
Referensi
Acetobacter
diazotrophicus
PA15
Akar padi
Sevilla & Kennedy
(2000)
Azoarcus sp.BH72
Interselular pada akar
Hurek & ReinholdHurek (2003)
Azospirillum
brasilense
Rambut akar atau
zona elongasi
Bacilio-Jimenez et al.
(2001)
Burkholderia sp.
M209
Epidermis dan bagian
akar lateral
Baldani et al. (1997)
Enterobacter sp.
USML2
Akar dan daun padi
Tharek et al. (2011)
Herbaspirillum
seropedicae Z67
Akar padi
Barraquio et al. (1997)
Pseudomonas
stutzeri A15
Korteks dan
epidermis akar padi
You et al. (1991)
Rhizobium
leguminosarum
bv. trifolii Ell, E12
Akar lateral
Yanni et al. (1997)
Rhizobium spp.
Akar dan daun padi
Chi et al. (2005)
Serratia
marcesens
Ruang interseluler
dan parenkim akar,
batang, dan daun
Gyaneshwar et al.
(2001)
Berbagai macam bakteri penambat N2 juga telah diteliti pada ekosistem padi
dengan sawah tergenang dan dinyatakan telah berkontribusi pada pertambahan
kadar nitrogen di tanah (Shrestha & Maskey 2005). Kemampuan penambatan N2
secara biologi pada bakteri heterotrof berkisar antara 11-16 kg N ha-1 atau sekitar
16-21% dari kebutuhan nitrogen pada padi (Shrestha & Maskey 2005). Beberapa
bakteri diazotrof endofit yang telah diteliti peranannya sebagai penambat N2 pada
padi diantaranya Klebsiella oxytoca pada padi varietas C5444 berhasil
3
meningkatkan tambatan nitrogen sebesar 11-19% total nitrogen, E. cloaceae pada
padi varietas T65 berhasil meningkatkan 0-18% total nitrogen, dan Alcaligenes
faecalis pada padi varietas Japonica dan Indica yang berhasil meningkatkan 2030% total nitrogen (Shrestha & Maskey 2005). Bakteri endofit yang berperan pula
sebagai diazotrof tersebut tersebar di berbagai area kolonisasi dari akar hingga duan
padi (Tabel 1).
Aktinomiset endofit dapat menjadi pelaku penambat N2 di samping
keistimewaannya dalam menghasilkan senyawa bioaktif dengan beragam fungsi
seperti fitohormon, antimikrob, peningkat pertumbuhan tanaman dan produsen
enzim yang sangat menguntungkan dalam bidang pertanian (Hasegawa et al. 2006,
Mano & Morisaki 2008, Joseph et al. 2012). Hal ini dilaporkan Yuan dan Crawford
(1995) yang telah meneliti beberapa spesies aktinomiset yang mampu menghasilkan
zat pemacu pertumbuhan pada tanaman serta antibiotik selain sebagai penambat N2.
Isolat aktinomiset endofit (Streptomyces sp.) yang diisolasi dari sweet pea juga
telah diaplikasikan pada tanaman kedelai (Thapanapongworakul 2003, diacu dalam
Soe et al. 2010). Isolat tersebut menunjukkan kemampuan anti cendawan patogen
dan mampu meningkatkan pasokan nitrogen pada kedelai mencapai 83% serta
kompatibel dengan penambahan Bradyrhizobium. Soe et al. (2010) juga
menunjukkan kompatibilitas antara Streptomyces dengan Bradyrhizobium dan
kemampuannya dalam peningkatan penambatan N2 pada tanaman kedelai.
Mahendra dan Alvarez-Cohen (2005) juga telah berhasil meneliti Pseudonocardia
dioxanivorans yang merupakan spesies aktinomiset baru dan memiliki kapabilitas
penambatan N2.
Berdasarkan hasil penelitian sebelumnya, penggunaan aktinomiset endofit
isolat AB131-2, PS4-16, Impara 6A, AB131-1, AB131-3, A Fat, Membramo A,
LSW-05, LBR-02, dan SSW-02 terbukti memiliki kemampuan yang beragam dalam
peningkatan pertumbuhan tanaman padi. Kemampuan yang dimiliki oleh
aktinomiset endofit tersebut diantaranya produksi IAA, siderofor, HCN, kitinase,
kemampuan pelarutan fosfat, dan kemampuan untuk menghambat cendawan dan
mikrob patogen khususnya Xanthomonas oryzae pv. oryzae (Xoo) yang merupakan
penyebab penyakit hawar daun bakteri pada padi (Yusepi 2011; Hastuti 2012).
Jelita (2011) juga melaporkan adanya dinamika populasi aktinomiset endofit pada
4
padi khususnya IR-64 yang meningkat sesuai dengan periode pertumbuhan tanaman
dan populasi tertinggi terjadi saat 4 minggu setelah tanam. Hal ini menunjukkan
peran aktinomiset endofit pada tanaman padi khususnya saat masa vegetatif
pertumbuhan padi.
Penelitian mengenai proses penambatan N2 secara biologi pada padi pada
umumnya didominasi oleh bakteri diazotrof endofit non-aktinomiset, sedangkan
aktinomiset endofit pada padi masih sangat jarang diteliti terutama pada
kemampuannya dalam menambat N2 (Tian et al. 2004). Oleh sebab itu, penelitian
terhadap aktinomiset endofit penambat N2 perlu dilakukan untuk melihat efektivitas
aktinomiset dalam penambatan N2. Kajian kemampuan aktinomiset endofit dalam
menambat N2 dapat dikaji baik secara in-vitro dengan metode reduksi asetilen,
kemampuan tumbuh pada media bebas nitrogen, pengukuran produksi amonia,
teknik
15
N-isotop maupun secara in-planta dengan mengkombinasi inokulasi
aktinomiset endofit dengan beberapa dosis pupuk anorganik. Dari hasil penelitian
ini diharapkan mampu menjawab permasalahan terhadap kebutuhan nitrogen pada
padi yang terbatas dan mampu meningkatkan pertumbuhan pada tanaman padi.
Perumusan Masalah
1. Nitrogen merupakan salah satu nutrisi pembatas pertumbuhan pada padi yang
berkontribusi langsung terhadap produktivitas hasil panen.
2. Penggunaan pupuk nitrogen anorganik yang berlebihan dan terus-menerus
mengakibatkan dampak negatif pada lingkungan.
3. Bakteri aktinomiset endofit dapat menjadi pelaku penambat N2 di samping
keistimewaannya dalam menghasilkan senyawa bioaktif seperti fitohormon,
antimikrob dan produsen enzim.
4. Penelitian tentang aktinomiset endofit pada padi masih jarang dilakukan dalam
kapasitasnya sebagai penambat N2.
Hipotesis
Isolat aktinomiset endofit terpilih baik secara seleksi in-vitro dan dilanjutkan
dengan seleksi in-planta mampu menambat nitrogen dan meningkatkan
pertumbuhan tanaman padi.
5
Tujuan Penelitian
Penelitian ini bertujuan untuk mengkaji kemampuan aktinomiset endofit
terpilih dalam menambat N2 secara in-vitro dan in-planta serta mengetahui
kemampuannya dalam meningkatkan pertumbuhan tanaman padi.
Manfaat Penelitian
Seleksi terhadap isolat aktinomiset endofit diharapkan mampu memilih satu
isolat penambat nitrogen pada tanaman padi dengan kapasitas penambatan nitrogen
paling optimal dan dapat meningkatkan pertumbuhan tanaman padi. Dari hasil yang
telah diperoleh tersebut, diharapkan dapat dikembangkan produk hayati berbasis
aktinomiset endofit yang mampu mensubstitusi kebutuhan nitrogen pada padi
sekaligus meningkatkan pertumbuhannya serta merupakan alternatif yang tepat
terhadap pemenuhan kebutuhan tanaman padi akan nitrogen yang ramah
lingkungan.
Ruang Lingkup Penelitian
Penelitian yang dilakukan meliputi penapisan isolat aktinomiset endofit
berdasarkan kapasitas penambatan N2 secara in-vitro dan in-planta. Penambatan N2
secara in-vitro dilakukan dengan melihat potensi kemampuan tumbuh di media
bebas nitrogen, kemampuan reduksi asetilen dan produksi amonia. Penambatan N2
secara in-planta dilakukan dengan kombinasi antara aplikasi aktinomiset endofit
pada tanaman padi dengan variasi level penggunaan pupuk urea selama masa
vegetatif.
6
7
TINJAUAN PUSTAKA
Aktinomiset Endofit
Aktinomiset adalah kelompok bakteri Gram positif dengan kandungan GC
yang tinggi (diatas 55 mol% G+C) (Otoguro et al. 2009, Sharma et al. 2012).
Mayoritas aktinomiset biasanya dapat hidup baik dalam lingkungan netral hingga
sedikit basa khususnya pada tanah, lingkungan rhizosfer dan mendegradasi bahan
organik (Widyastuti & Ando 2009, Sharma et al. 2012). Aktinomiset juga
menghasilkan struktur bertahan berupa spora yang dapat bertahan dalam kondisi
tidak menguntungkan, seperti rendahnya kadar air dan suhu tinggi serta dapat
bertahan dalam waktu yang lama. Tidak seperti bakteri penghasil spora lainnya,
aktinomiset memproduksi spora sebagai cara utama bakteri ini dalam melakukan
pemencaran atau dispersal (Schaad et al. 2000). Aktinomiset dikenal sebagai
bakteri yang bersifat saprofit dan sangat umum dijumpai di rhizosfer hingga lapisan
tanah dalam. Aktinomiset memiliki miselium aerial karena miselium dapat tumbuh
pada lapisan udara. Ukuran miselium umumnya memiliki diameter 0,5-1,0
m,
dengan panjang yang tidak tentu, dan tidak memiliki sekat pada fase vegetatif
(Madigan & Martinko 2006).
Pada umumnya aktinomiset dibagi menjadi dua kelompok yaitu Streptomyces
dan non-Streptomyces atau rare actinomycetes. Genus Streptomyces dibentuk oleh
Waksman & Henrici (1943) dan termasuk kelompok mikrob aerobik dengan
kandungan G+C yang tinggi (69–78 mol%) dengan bentuk asal spora batang dari
miselium substrat serta kelompok aktinomiset tersebut paling sering ditemukan di
tanah dan mampu dikulturkan kembali (Otoguro et al. 2009, Widyastuti & Ando
2009). Streptomyces mempunyai filamen yang panjang dan bercabang serta
membentuk rantai panjang spora udara yang disebut konidia. Pada media agar
berwarna buram atau opak, tidak mengkilat, dan melekat kuat pada medianya.
Streptomyces spp. secara umum menyerupai kapang dengan ciri-ciri membentuk
miselium aerial (Madigan & Martinko 2006). Struktur seluler kapang yang dimiliki
Streptomyces sp. menyebabkan Streptomyces juga mempunyai kemiripan dalam
siklus hidupnya. Daur hidup pada medium padat dimulai dari germinasi spora,
ditandai dengan banyak miselium multiseluler, kemudian di atas miselia tumbuh
8
miselia aerial yang diikuti fragmentasi hifa yang membentuk cabang-cabang spora.
Perbedaan dalam bentuk dan pembentukan filamen aerial serta munculnya struktur
penataan spora dari beberapa spesies merupakan bagian utama yang digunakan
untuk mengklasifikasi spesies Streptomyces. Konidia dan spora yang berpigmen
memberikan peran dalam mengkarakterisasi koloni yang matang (Madigan &
Martinko 2006). Menurut Miyadoh (1997), Streptomyces diklasifikasikan secara
taksonomi sebagai berikut:
Dunia
: Bacteria
Divisi
: Actinobacteria
Kelas
: Actinobacteria
Ordo
: Actinomycetales
Famili
: Streptomycetaceae
Genus
: Streptomyces
Schaad et al. (2000) melaporkan dari sekitar 400 spesies Streptomyces, sangat
sedikit yang diketahui menjadi patogen pada tanaman. Isolasi aktinomiset dari
jaringan tanaman dan lahan pertanian sering kali diperoleh aktinomiset yang
bersifat saprofitik. Beberapa aktinomiset terbukti erat terkait dengan tumbuhan,
yaitu pada penelitian Brunchorst yang berhasil mengisolasi genus Frankia dari
nodul akar non legum pada tahun 1886 yang menunjukkan peran penambatan N2
dalam akar mirip dengan Rhizobium pada tanaman kacang-kacangan (Bandara et al.
2006).
Mikrob endofit merupakan mikrob yang hidup di dalam jaringan tanaman
pada periode tertentu dan mampu membentuk koloni dalam jaringan tanaman tanpa
membahayakan inangnya (Strobel & Daisy 2003). Mikrob endofit berasosiasi
dengan tanaman dan terkadang membentuk asosiasi mutualisme dengan tumbuhan
inang. Keuntungan dari asosiasi mikrob endofit pada padi meliputi penambatan N2
dari udara, meningkatkan kemampuan penyerapan nutrisi, memproduksi hormon
pertumbuhan, meningkatkan kualitas butir padi, meningkatkan resistensi dari
patogen dan meningkatkan toleransi terhadap kekeringan (Cockrell 2004).
Aktinomiset endofit yang tumbuh secara endofit pada tanaman dapat berperan
sebagai simbion, parasit, maupun saprofit (Hasegawa et al. 2006).
9
Beberapa metabolit aktinomiset endofit langsung mempengaruhi fisiologi
tanaman inang tetapi mikrob yang lain melakukannya secara tidak langsung dengan
mempengaruhi populasi mikrob antibiosis atau melalui kompetisi. Aktinomiset
pada tumbuhan inang dapat menghasilkan metabolit sebagai antibiotik, promoter
pertumbuhan tanaman, inhibitor pertumbuhan tanaman, dan penghasil enzim. Oleh
sebab itu, aktinomiset digunakan sebagai agen biokontrol, memproduksi jaringan
tumbuhan yang memiliki ketahanan terhadap penyakit dan jaringan tumbuhan yang
tahan terhadap kekeringan (Hasegawa et al. 2006).
Berdasarkan penelitian yang dilakukan oleh Tian et al. (2004), koloni
Streptomyces griseofuscus yang berhasil diisolasi mendominasi berkisar 36.1% 69% pada padi dengan dua spesies berbeda di Guangdong, China. Selain itu,
diketahui pula distribusi aktinomiset endofit pada tanaman padi kebanyakan
berhasil diisolasi dari bagian akar daripada daun padi (Tian et al. 2004). Sardi et al.
(1992) juga berhasil mengisolasi aktinomiset endofit dari akar 28 spesies tanaman
padi, dan didominasi oleh Streptomyces spp.. Aktinomiset endofit yang ditemukan
tersebut memiliki kemampuan untuk memproduksi paling sedikit tiga jenis senyawa
antagonistik di jaringan tanaman termasuk antibiotik, enzim, dan siderophores
(Trejo-Estrada et al. 1998, Hasegawa et al. 2006).
Tian et al. (2004) dan Sardi et al. (1992) berhasil mengisolasi dan mengetahui
dominansi Streptomyces spp. pada padi namun, penelitian mengenai aktinomiset
endofit pada padi masih jarang dilakukan dengan kapasitasnya sebagai penambat
N2. Penelitian aktinomiset endofit penambat N2 telah diaplikasikan pada kedelai
oleh Soe et al. (2010), dengan inokulasi Streptomyces sp. disandingkan dengan
Bradyrhizobium. Dari hasil penelitian
tersebut dinyatakan bahwa penggunaan
Streptomyces tidak menunjukkan hasil yang cukup signifikan namun lebih efektif
ditambahkan pada inokulan dibandingkan penggunaan inokulasi Bradyrhizobium
sendiri. Thaporongwakul (2003) dalam Soe (2010) juga telah mengaplikasikan
isolat aktinomiset endofit (Streptomyces sp.) yang diisolasi dari sweet pea dan
diaplikasikan pada kedelai. Isolat tersebut menunjukkan kemampuan anti cendawan
patogen dan dapat meningkatkan pasokan nitrogen pada kedelai mencapai 83%
serta kompatibel dengan penambahan Bradyrhizobium. Aplikasi aktinomiset endofit
10
pada padi yang ditujukan untuk kemampuan penambatan N2 masih belum banyak
dilakukan penelitian lebih lanjut.
Penambatan Nitrogen
Penambatan N2 merupakan proses pengubahan N2 menjadi NH4+ yang
berguna secara biologi. Penambatan N2 melibatkan penggunaan ATP dan proses
reduksi ekuivalen berasal dari metabolisme primer. Semua reaksi yang terjadi
dikatalisis oleh nitrogenase (White 2000).
Feredoksin teroksidasi
Protein Fe tereduksi
Protein Mo Fe teroksidasi
Feredoksin tereduksi
Protein Fe teroksidasi
Protein Mo Fe tereduksi
Gambar 1 Proses penambatan N2 (Deacon 2012).
Mekanisme penambatan N2 menurut Sylvia et al. (1999), dimulai dengan
dinitrogenase reduktase yang menerima elektron dari donor berupa ferredoksin
tereduksi atau flavodoksin, dan berikatan dengan dua molekul MgATP. Elektron
ditransfer menuju ke dinitrogenase. Dinitrogenase reduktase dan dinitrogenase
membentuk kompleks, elektron ditransfer dan dua MgATP dihidrolisis menjadi dua
molekul MgADP+Pi. Kompleks nitrogenase tersebut berdisosiasi dan dilakukan
pengulangan proses. Ketika dinitrogenase telah mengumpulkan cukup elektron,
senyawa tersebut mengikat molekul N2, mereduksinya dan dilanjutkan dengan
pelepasan amonia. Dinitrogenase kemudian menerima tambahan elektron dari
dinitrogenase reduktase untuk mengulangi proses tersebut. Reaksi penambatan N2
dapat dituliskan berdasarkan persamaan berikut:
N2 + 8H+ + 8e- + 16 ATP 2NH3 + H2 + 16ADP + 16 Pi
11
Serapan hidrogenase akan dikembalikan dalam bentuk H dalam sistem
penambatan N2 (Gambar 1). Serapan hidrogenase yang dihasilkan dapat digunakan
juga pada jalur konsumsi dioksigen untuk membantu menjaga kondisi lingkungan
dalam keadaan anaerobik. Lingkungan anaerobik sangat penting bagi aktivitas
nitrogenase diakibatkan karena kedua kompleks protein nitrogenase yang memiliki
sensitivitas tinggi terhadap oksigen, sehingga kehadiran oksigen dapat menekan
sistem serapan hidrogen dalam proses nitrogenase (Moat 2002).
Mikrob yang dapat melakukan penambatan N2 secara biologi disebut diazotrof
dengan peranan utama dari enzim kompleks dinitrogenase. Diazotrof terdiri atas
aerob (misal Azotobacter, Beijerinckia, Derxia), fakultatif anaerob (misal
Clostridium, Pseudomonas, Rhizobium), heterotrof (misal Klebsiella, Enterobacter)
dan fototrof (misal Anabaena, Azospirillum, Nostoc). Berdasarkan hubungan
fungsional dan spasial antar diazotrof dan inangnya, sistem diazotrof terdiri atas
sistem diazotrof eksofit (bila diazotrof terdapat di luar tanaman inang) dan sistem
diazotrof endofit (bila diazotrof terdapat di dalam tanaman inang). Sistem eksofit
tersebut dapat merupakan free-living (bila diazotrof tidak kontak langsung dengan
tanaman inang), asosiatif (bila diazotrof mendominasi permukaan luar, namun
terkadang di dalam tanaman inang yaitu pada ruang interseluler) atau simbiotik
(ketika diazotrof secara intraseluler berada pada tanaman inang) (Shenoy et al.
2001). Studi yang dilakukan telah menunjukkan bahwa nitrogen berasal dari udara
dengan penambatan N2 yang berhasil ditambat oleh bakteri endofit berkisar 0-35%
pada padi (Shrestha & Maskey 2005).
Metode reduksi asetilen merupakan salah satu cara untuk mengukur aktivitas
nitrogenase dalam menambat N2. Nitrogenase mampu mereduksi N2 menjadi NH3,
selain itu juga dapat mereduksi C2H2 menjadi C2H4, dengan kesetaraan reduksi
C2H2 dan penambatan N2 sebesar 4:1 (Hardy 1973). Selain itu, pengukuran
produksi amonia dengan nessler juga dapat dilakukan untuk mengukur output
penambatan N2 yang dilakukan oleh mirob. Pengukuran produksi amonia tersebut
didasarkan oleh prinsip pengikatan amonia (NH4) dengan Hg yang akan
menimbulkan warna jingga pada sampel sesuai dengan reaksi berikut :
2K2 [HgI4] + 2 NH3 NH4HgI3 + 4 KI + NH4I
12
Kajian kemampuan aktinomiset endofit dalam menambat N2 dapat dikaji baik
secara in-vitro seperti reduksi asetilen, kemampuan tumbuh pada media bebas
nitrogen, pengukuran produksi amonia, teknik
15
N-isotop maupun secara in-planta
dengan mengkombinasi inokulasi aktinomiset endofit dengan beberapa dosis pupuk
anorganik.
Padi
Padi merupakan tanaman yang berumpun kuat dengan tinggi batang yang
beragam (0,5-2 m). Helai daun berbentuk garis, kebanyakan bertepi kasar dan
panjangnya 15-80 cm, serta memiliki malai dengan panjang 15-40 cm yang tumbuh
ke atas dan ujungnya menggantung. Malai berupa bulir yang beraneka ragam,
dengan ukuran 7-10 cm. Bulir yang masak akan menghasilkan buah yang kaya akan
pati. Tanaman padi yang dapat tumbuh baik di daerah tropis ialah indica, sedangkan
japonica banyak diusahakan di daerah subtropis (Luh, 1991). Padi merupakan inang
yang tepat bagi bakteri endofit yang dapat berdampak positif bagi pertumbuhan
padi terutama pada akar, batang dan daunnya.
Menurut Cockrell (2004), padi memiliki nutrisi pembatas berupa nitrogen dan
asosiasi dengan bakteri endofit penambat N2 dapat meningkatkan suplai nitrogen
serta meningkatkan produktivitas pada tanaman padi. Padi membutuhkan 1 kg
nitrogen untuk memproduksi 15-20 kg biji padi. Padi dataran rendah di daerah
tropik dapat menggunakan cukup N yang tersedia alami untuk memproduksi 2-3 ton
ha-1. Untuk hasil perolehan yang lebih tinggi, tambahan nitrogen harus
diaplikasikan (Ladha & Reddy 2000). Berdasarkan Grist (1960), padi dapat
diklasifikasikan secara taksonomi sebagai berikut:
Dunia
: Plantae
Divisi
: Spermatophyta
Sub divisi
: Angiospermae
Kelas
: Monocotyledoneae
Ordo
: Poales
Famili
: Ginaceae
Genus
: Oryza
Spesies
: sativa
13
Padi yang akan digunakan dalam penelitian ini ialah padi varietas IR64 yang
biasanya berumur 110-120 hari, memiliki bentuk tanaman tegak dengan rata-rata
tinggi tanaman 115-126 cm. Padi IR64 memiliki anakan produktif 20-35 batang
dengan warna kaki dan warna batang hijau, sedangkan warna telinga dan lidah daun
tidak berwarna. Permukaan daun padi IR64 kasar dengan warna daun hijau dan
posisi daun bendera tegak. Gabah padi IR64 memiliki bentuk ramping, panjang dan
berwarna kuning bersih (Suprihatno et al. 2009). Keunggulan padi IR64 adalah
tahan kerontokan, kerebahan serta memiliki tekstur nasi yang dihasilkan pulen
dengan kadar amilosa 23%. Padi IR64 baik ditanam di lahan sawah irigasi dataran
rendah sampai sedang dan merupakan padi yang diintroduksi oleh IRRI pada tahun
1986. Padi IR64 menghasilkan rata-rata produksi 5,0 t/ha dan memiliki potensi
menghasilkan 6,0 t/ha (Suprihatno et al. 2009).
14
15
BAHAN DAN METODE
Kerangka Penelitian
Kerangka penelitian yang direncanakan (Gambar 2) meliputi peremajaan dan
seleksi aktinomiset baik in-vitro maupun in-planta pada tanaman padi.
Isolat Aktinomiset Endofit
Peremajaan Isolat Aktinomiset
Uji Kemampuan Aktinomiset Endofit dalam Penambatan N 2 secara In-Vitro
Kemampuan Tumbuh di
Uji Fiksasi Nitrogen dengan
Uji Produksi Amonia dengan
Media Bebas Nitrogen
Metode Reduksi Asetilen
Metode Nessler
(Mahendra & Alvarez-Cohen 2005)
(Phillips et al. 2000)
Isolat Aktinomiset Endofit Terpilih Secara In-Vitro
Uji Kemampuan Aktinomiset Endofit dalam Penambatan N 2 secara In-Planta
Uji Kandungan Nitrogen
Pengamatan Mikroskopis
Pengukuran Pertumbuhan Vegetatif
pada Padi dengan Metode
Jaringan Akar Padi
Padi meliputi Tinggi tanaman padi,
Kjeldahl (ACIAR 1990)
(Patriquin & Doberainer 1978)
Jumlah Anakan, Panjang Akar,
Warna Daun dan Bobot Kering
Tanaman
Isolat Aktinomiset Endofit Penambat Nitrogen Terpilih
Gambar 2 Diagram alur penelitian.
16
Rancangan Percobaan
Penelitian dilakukan dengan menggunakan Rancangan Acak Lengkap (RAL)
faktorial dengan dua faktor yaitu perlakuan isolat aktinomiset endofit yang terpilih
secara in-vitro dan dosis pupuk urea pada tanah steril dan tidak steril. Faktor
perlakuan
isolat aktinomiset endofit terpilih terdiri atas tiga taraf yaitu tanpa
inokulasi (K), penambahan isolat aktinomiset endofit terpilih 1 (SSW-02) (S), dan
penambahan isolat aktinomiset endofit terpilih 2 (AB131-2) (
NITROGEN DAN PERANNYA DALAM MENINGKATKAN
PERTUMBUHAN TANAMAN PADI
ANNISA PARAMITA PRATYASTO
SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2012
PERNYATAAN MENGENAI TESIS DAN SUMBER INFORMASI
Dengan ini saya menyatakan bahwa tesis Kemampuan Aktinomiset Endofit
sebagai Penambat Nitrogen dan Perannya dalam Meningkatkan Pertumbuhan
Tanaman Padi adalah karya saya dengan arahan dari komisi pembimbing dan
belum diajukan dalam bentuk apapun kepada perguruan tinggi mana pun. Sumber
informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan maupun tidak
diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam
Daftar Pustaka di bagian akhir tesis ini.
Bogor, Oktober 2012
Annisa Paramita Pratyasto
G351100161
ABSTRACT
ANNISA PARAMITA PRATYASTO. Capability of Endophytic Actinomycetes
in Fixing Nitrogen and Their Role in Promoting Rice Seedlings Growth. Under
direction of YULIN LESTARI and NISA RACHMANIA MUBARIK.
Nitrogen is the nutrient that most frequently limits on paddy productivity.
Excessive chemical nitrogen fertilizer applied on conventional farming may have
negative impact to the degradation of environment. An alternative solution for this
problem is by using biological nitrogen fixation (BNF) to enhance crop growth
which can be done by applying nitrogen fixing endophytic actinomycetes. The
objective of this research was to obtain endophytic actinomycetes isolates which
have the capability in fixing N2 based on in-vitro and in-planta assay. Based on invitro assay, SSW-02 was considered as the most promising N2 fixing bacteria
based on its ability to reduce 2.1750 nmol acetylene/hour and produced ammonia
2.144 ppm for 15 days in free nitrogen medium. In-planta assessment was
conducted in a greenhouse using IR-64 rice variety on sterile and non sterile soil
with two-factors completely randomized factorial design. The factors were
endophytic actinomycetes treatments which consisted of SSW-02, AB131-2,
control and urea dosage which consisted of 0%, 50%, 100% dosage from 200
Kg/Ha. Each treatment had been done in three replications. Based on in-planta
assay, SSW-02 application with 100% urea dosage increased total plant dry
weight and leaf color. Although not significantly different, SSW-02 application
with 50% urea dosage also had the highest number of tillering and ability to
increase plant height and root length. Nitrogen content also increased by SSW-02
application with 100% urea dosage in sterile soil. Microscopic observation of
SSW-02 and AB131-2 of rice treatment using reducing tetrazolium method
showed that both of isolates were able to penetrate and colonize the root of rice,
confirming them as endophytes. The results indicated that SSW-02 had promising
role as a N2 fixing bacteria on rice plant.
Keywords : Collonization, Endophytic Actinomycetes, N2 Fixation, Rice
RINGKASAN
ANNISA PARAMITA PRATYASTO. Kemampuan Aktinomiset Endofit sebagai
Penambat Nitrogen dan Perannya dalam Meningkatkan Pertumbuhan Tanaman
Padi . Dibimbing oleh YULIN LESTARI dan NISA RACHMANIA MUBARIK.
Pertambahan populasi penduduk di dunia berdampak langsung terhadap
peningkatan kebutuhan akan produktivitas padi sebagai bahan pangan pokok di
dunia, terutama di Indonesia. Produktivitas padi dibatasi salah satunya oleh
kebutuhan akan nitrogen. Pengembangan keragaman pupuk yang responsif dan
ditambah dengan kesadaran petani tentang pentingnya kebutuhan nitrogen, telah
menyebabkan tingginya tingkat penggunaan pupuk nitrogen anorganik pada padi
yang dapat membahayakan lingkungan. Salah satu solusi dari permasalahan di
atas ialah memanfaatkan mikrob penambat N2 yaitu aktinomiset endofit yang
dapat menjadi pelaku penambatan N2 di samping keistimewaannya dalam
menghasilkan senyawa bioaktif dengan beragam fungsi seperti fitohormon,
antimikrob dan enzim. Penelitian ini bertujuan untuk mengkaji kemampuan
aktinomiset endofit terpilih dalam menambat N2 secara in-vitro dan in-planta serta
mengetahui kemampuannya dalam meningkatkan pertumbuhan tanaman padi.
Mikrob yang digunakan dalam penelitian ialah 10 isolat aktinomiset endofit
yang merupakan kelompok Streptomyces yaitu AB131-2, PS4-16, Impara 6A,
AB131-1, AB131-3, A Fat, Membramo A, LSW-05, LBR-02, dan SSW-02
koleksi Laboratorium Mikrobiologi IPB. Peremajaan isolat aktinomiset endofit
dilakukan dengan menggoreskan koloni isolat aktinomiset endofit pada media
Yeast Extract Starch Agar (YSA). Tahapan dalam penelitian ini dibagi menjadi
dua tahapan yaitu uji kemampuan aktinomiset endofit dalam penambatan nitrogen
secara in-vitro dan aktinomiset endofit terpilih diujikan secara in-planta. Secara
in-vitro, pada aktinomiset endofit dilakukan pengamatan kemampuan tumbuh
pada media bebas nitrogen, uji penambatan nitrogen dengan metode reduksi
asetilen dan uji produksi amonia dengan metode Nessler.
Aplikasi isolat aktinomiset endofit terpilih secara in-planta dilakukan pada
padi varietas IR-64 di rumah kaca dengan kombinasi metode seed dressing dan
dipping dengan inokulan aktinomiset endofit terpilih. Desain penelitian dilakukan
dengan Rancangan Acak Lengkap (RAL) faktorial dengan dua faktor yaitu faktor
isolat aktinomiset endofit terpilih terdiri atas tiga taraf yaitu tanpa inokulasi (K),
penambahan isolat aktinomiset endofit terpilih 1 (SSW-02) (S), dan penambahan
isolat aktinomiset endofit terpilih 2 (AB131-2) (A); faktor dosis urea terdiri tiga
taraf yaitu penggunaan dosis pupuk NPK sesuai standar (1) sebesar 200 Kg
Urea/Ha: 100 Kg SP-36/Ha : 100 Kg KCl/Ha, setengah dosis standar pupuk Urea
(0.5) dan tanpa pupuk Urea (0). Pengulangan dilakukan sebanyak tiga kali.
Pengamatan mikrob endofit dalam jaringan akar padi dilakukan dengan
pewarnaan tetrazolium dan pengamatan pertumbuhan vegetatif padi dilakukan
setelah padi berumur 6 MST.
Sepuluh isolat aktinomiset endofit dapat tumbuh baik dengan morfologi
koloni yang beragam pada media YSA. AB131-1, SSW-02, A Fat, Membramo A
memiliki miselia berwarna coklat tua, AB131-2 dengan miselia berwarna hijau
tua, Impara 6A memiliki miselia berwarna putih serta lainnya memiliki warna
miselia coklat muda. Perbedaan dalam pembentukan miselia aerial serta
munculnya penataan rantai spora menunjukkan karakter Streptomyces spp.
Penataan rantai spora pada aktinomiset endofit pun beragam seperti A Fat, LBR02, PS4-16 dan LSW 05 memiliki tipe rantai spora Spirales, Impara 6 A dan
AB131-3 memiliki tipe rantai spora Rectiflexibiles dan lainnya memiliki tipe
rantai spora Retinaculiaperti.
Secara in-vitro, isolat aktinomiset endofit SSW-02 merupakan isolat terbaik
yang mampu menambat nitrogen berdasarkan kemampuannya mereduksi asetilen
sebesar 2.1750 nmol etilen/jam atau dengan reduksi asetilen spesifik sebesar 1.55
nmol etilen/jam per mg sel serta berdasarkan kemampuan produksi amonia yang
dihasilkan sebesar 2.144 ppm dalam waktu optimum pertumbuhan 15 hari.
Berdasarkan kemampuan reduksi asetilen dan produksi amonia, maka isolat
aktinomiset endofit yang terpilih untuk diamati kemampuan penambatan N2
secara in-planta adalah isolat SSW-02 sebagai isolat dengan kemampuan
penambatan N2 terbaik dan isolat AB131-2 sebagai isolat dengan kemampuan
penambatan N2 rendah, namun memiliki kemampuan produksi IAA tertinggi.
Isolat SSW-02 dan AB131-2 juga mampu melakukan penetrasi di jaringan
interseluler akar padi berdasarkan uji tetrazolium dengan akar padi setelah 6
minggu masa pertumbuhan vegetatif padi. Isolat SSW-02 memasuki bagian
jaringan interselular akar, sedangkan, AB131-2 sebagian besar berada di daerah
eksodermis dari arah irisan melintang akar. Kedua isolat juga berada di bagian
pertengahan internal akar atau sekitar area korteks dan endodermis akar dari arah
irisan membujur akar. Pada pengamatan hasil pertumbuhan vegetatif padi,
aplikasi isolat SSW-02 mampu meningkatkan nilai warna hijau daun tertinggi
sebesar 3.08 dan 3.00 pada tanah steril dan tidak steril juga peningkatan terhadap
bobot kering total tanaman sebesar 17.44% dibandingkan kontrol pada tanah steril
dengan penggunaan pupuk urea sebesar 100% (≈200 Kg Urea/Ha). Aplikasi
SSW-02 dengan penggunaan pupuk urea 50% (≈100 Kg Urea/Ha) juga mampu
menunjukkan peningkatan terhadap tinggi tanaman padi sebesar 4.05%,
peningkatan panjang akar sebesar 10% dan peningkatan jumlah anakan sebesar
9% dibandingkan dengan kontrol di tanah steril. SSW-02 dengan dosis urea 100%
juga menunjukkan peningkatan serapan nitrogen total tanaman padi tertinggi pada
tanah steril sebesar 1.5005 g, namun di tanah tidak steril aplikasi AB131-2
memberikan hasil tertinggi sebesar 1.9426 g. Hal ini menunjukkan potensi
aplikasi SSW-02 sebagai penambat N2 pada tanaman padi khususnya di tanah
steril. Hal ini menunjukkan potensi aplikasi SSW-02 sebagai penambat N2 pada
tanaman padi.
Kata kunci: Aktinomiset Endofit, Kolonisasi, Padi, Penambatan N2
© Hak Cipta milik IPB, tahun 2012
Hak Cipta dilindungi Undang-Undang
1. Dilarang mengutip sebagian atau seluruh karya tulis ini tanpa
mencantumkan atau menyebutkan sumber.
a. Pengutipan hanya untuk kepentingan pendidikan, penelitian,
penulisan karya ilmiah, penyusunan laporan, penulisan kritik,
atau tinjauan suatu masalah.
b. Pengutipan tidak merugikan kepentingan yang wajar IPB
2. Dilarang mengumumkan dan memperbanyak sebagian atau seluruh Karya
tulis dalam bentuk apa pun tanpa izin IPB
KEMAMPUAN AKTINOMISET ENDOFIT SEBAGAI PENAMBAT
NITROGEN DAN PERANNYA DALAM MENINGKATKAN
PERTUMBUHAN TANAMAN PADI
ANNISA PARAMITA PRATYASTO
Tesis
sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
Magister Sains pada
Program Studi Mikrobiologi
SEKOLAH PASCA SARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2012
Penguji Luar Komisi pada Ujian Tesis: Dr. Ir. Sugiyanta M.Si.
Judul Tesis
Nama Mahasiswa
NRP
: Kemampuan Aktinomiset Endofit sebagai Penambat
Nitrogen dan Perannya dalam Meningkatkan Pertumbuhan
Tanaman Padi
: Annisa Paramita Pratyasto
: G351100161
Disetujui
Komisi Pembimbing
Dr. Ir. Yulin Lestari
Ketua
Dr. Nisa Rachmania Mubarik M.Si.
Anggota
Diketahui
Ketua Program Studi Mikrobiologi
Dekan Sekolah Pascasarjana
Prof. Dr. Anja Meryandini, M.S.
Dr. Ir. Dahrul Syah, M.Sc.Agr.
Tanggal Ujian: 8 Oktober 2012
Tanggal Lulus:
PRAKATA
Puji syukur penulis panjatkan kepada Allah SWT atas segala karunia-Nya
sehingga tesis ini berhasil diselesaikan. Judul yang dipilih dalam penelitian ini
yaitu Kemampuan Aktinomiset Endofit sebagai Penambat Nitrogen dan Perannya
dalam Meningkatkan Pertumbuhan Tanaman Padi
Terima kasih penulis ucapkan kepada Dr. Ir. Yulin Lestari dan Dr. Nisa
Rachmania Mubarik M.Si selaku pembimbing yang telah banyak memberikan
arahan dan sarannya selama penulisan karya ilmiah ini. Terima kasih juga
disampaikan kepada Dr. Ir. Sugiyanta M.Si.selaku penguji luar komisi dan Prof.
Dr. Anja Meryandini, M.S. selaku Ketua Program Mayor Mikrobiologi IPB.
Kepada I-MHERE B2c. IPB 2010/2012 terima kasih atas kepercayaannya untuk
memberikan beasiswa kuliah selama menempuh pendidikan pascasarjana di IPB
dan terimakasih atas hibah penelitian I-MHERE B2c. IPB a.n Dr. Ir. Yulin Lestari
sehingga, penelitian yang saya lakukan dapat terlaksana dengan baik.
Penulis menyampaikan terima kasih kepada staf laboratorium Mikrobiologi,
yaitu Mbak Heni dan Bapak Jaka, serta seluruh staf laboratorium Balai Penelitian
Tanah, Litbang Pertanian Bogor khususnya Bapak Jatmo, Bu Ratih, dan Pak Yadi
yang bersedia membantu penelitian saya. Ungkapan terima kasih juga penulis
sampaikan kepada Gesti, Aya, Eka, Nia, Putri, Mbak Yessy, Mbak Diah, Sari, Pak
Puji atas bantuan dan motivasinya selama penelitian. Ungkapan terima kasih
disampaikan kepada ayah, ibu, Nadira Puspita Pratyasto, Citta Faradisa Pratyasto,
serta Yudhi Hidayat atas doa, dukungan dan semangat yang diberikan. Kepada
teman-teman Pascasarjana Mikrobiologi IPB 2010 terima kasih atas kebersamaan
yang singkat dan sangat indah. Semoga penelitian ini dapat bermanfaat bagi
kemajuan ilmu pengetahuan selanjutnya.
Bogor, Oktober 2012
Annisa Paramita Pratyasto
RIWAYAT HIDUP
Penulis dilahirkan di Denpasar pada tanggal 2 Oktober 1987 dari ayah Ir.
Lintjah Pratyasto dan ibu Ir. Ida Agustini Saidi, MP. Penulis merupakan putri
pertama dari tiga bersaudara. Penulis lulus Sekolah Menengah Umum Negeri 16
Surabaya tahun 2005. Pada tahun yang sama penulis diterima masuk Universitas
Gadjah Mada (UGM) sebagai mahasiswa Jurusan Teknologi Pangan dan Hasil
Pertanian, Fakultas Teknologi Pertanian dan dinyatakan lulus S1 tahun 2009.
Penulis sempat bekerja sebagai New Product Development Staff di PT. Synergy
Beverage Indonesia pada periode Oktober 2010-Agustus 2011
Penulis
melanjutkan
pendidikan
program
Magister
pada
Sekolah
Pascasarjana-Institut Pertanian Bogor (IPB) dengan memilih Program Mayor
Mikrobiologi (MIK) dengan beasiswa program I-MHERE B2c. IPB pada tahun
2010. Saat menempuh pendidikan penulis pernah bekerja sebagai freelance
reporter pada PT. Media Pangan Indonesia periode Juni 2011 hingga sekarang.
Sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Magister Sains, penulis
melakukan penelitian dengan judul “Kemampuan Aktinomiset Endofit sebagai
Penambat Nitrogen dan Perannya dalam Meningkatkan Pertumbuhan Tanaman
Padi”. Penelitian yang dilakukan dibimbing oleh Dr. Ir. Yulin Lestari dan Dr. Nisa
Rachmania Mubarik, M.Si. Sebagian hasil penelitian ini juga pernah
dipresentasikan secara lisan oleh penulis dalam “The 7th International Student
Conference at Ibaraki University” (ISCIU7), 3-4 Desember 2011 di Ibaraki,
Jepang dan “International Seminar Agriculture Adaptation in The Tropics:
Research and Innovation toward Environment Resilience and Food Security”, 5-6
September 2012 di Bogor, Indonesia.
DAFTAR ISI
Halaman
DAFTAR TABEL ........................................................................................
xvi
DAFTAR GAMBAR ...................................................................................
xvii
DAFTAR LAMPIRAN .................................................................................
xviii
PENDAHULUAN
Latar Belakang ......................................................................................
Perumusan Masalah ..............................................................................
Hipotesis ................................................................................................
Tujuan Penelitian ..................................................................................
Manfaat Penelitian .................................................................................
Ruang Lingkup Penelitian ....................................................................
1
4
4
5
5
5
TINJAUAN PUSTAKA
Aktinomiset Endofit .............................................................................
Penambatan Nitrogen ...........................................................................
Padi .......................................................................................................
7
10
12
BAHAN DAN METODE
Kerangka Penelitian ..............................................................................
Rancangan Percobaan ...........................................................................
Bahan ....................................................................................................
Peremajaan dan Pengamatan Mikroskopis Aktinomiset Endofit .........
Pengukuran Bobot Kering Sel Aktinomiset .........................................
Uji Kemampuan Aktinomiset Endofit dalam Penambatan N2
secara In-Vitro .......................................................................................
Uji Kemampuan Aktinomiset Endofit dalam Penambatan N2
secara In-Planta .....................................................................................
HASIL
Pertumbuhan dan Morfologi Koloni Aktinomiset Endofit ..................
Kemampuan Tumbuh Aktinomiset Endofit di Media Bebas
Nitrogen ...............................................................................................
Aktivitas Penambatan Nitrogen Aktinomiset Endofit Berdasarkan
Metode Reduksi Asetilen .....................................................................
Produksi Amonia oleh Aktinomiset Endofit ......................................
Kolonisasi Aktinomiset Endofit pada Jaringan Akar Padi...................
Kemampuan Aktinomiset Endofit Penambat Nitrogen dalam
Peningkatan Pertumbuhan Vegetatif Tanaman Padi ............................
Kemampuan Aktinomiset Endofit Penambat Nitrogen dalam
Peningkatan Serapan Nitrogen Tanaman Padi .....................................
PEMBAHASAN
Pertumbuhan dan Morfologi Koloni Aktinomiset Endofit ..................
15
16
16
18
18
18
19
23
24
25
25
28
29
37
43
Kemampuan Aktinomiset Endofit dalam Penambatan N2 secara
In-Vitro .................................................................................................
Kolonisasi Aktinomiset Endofit pada Jaringan Akar Padi ...................
Kemampuan Aktinomiset Endofit Penambat Nitrogen dalam
Peningkatan Pertumbuhan Vegetatif Tanaman Padi ............................
Kemampuan Aktinomiset Endofit Penambat Nitrogen dalam
Peningkatan Serapan Nitrogen Tanaman Padi .....................................
44
46
47
51
SIMPULAN DAN SARAN ..........................................................................
55
Simpulan ...............................................................................................
Saran .....................................................................................................
55
55
DAFTAR PUSTAKA ...................................................................................
57
LAMPIRAN .................................................................................................
65
DAFTAR TABEL
Halaman
1
Diazotrof endofit dan area kolonisasinya pada tanaman padi ............
2
2
Kemampuan aktinomiset endofit dalam mereduksi asetilen .............. 25
3
Hasil uji kuantitatif produksi amonia aktinomiset endofit umur 15
hari ...................................................................................................... 26
4
Pola produksi amonia pada isolat aktinomiset endofit terpilih .......... 27
5
Pengaruh dosis urea dan aktinomiset terhadap tinggi tanaman padi
umur 6 MST pada tanah steril ............................................................ 30
6
Pengaruh dosis urea dan aktinomiset terhadap tinggi tanaman padi
umur 6 MST pada tanah tidak steril ................................................... 30
7
Pengaruh dosis urea dan aktinomiset terhadap panjang akar
tanaman padi umur 6 MST pada tanah steril ...................................... 31
8
Pengaruh dosis urea dan aktinomiset terhadap jumlah anakan
tanaman padi umur 6 MST pada tanah steril ...................................... 32
9
Pengaruh dosis urea dan aktinomiset terhadap jumlah anakan
tanaman padi umur 6 MST pada tanah tidak steril ............................. 33
10 Pengaruh dosis urea dan aktinomiset terhadap nilai warna daun
tanaman padi umur 6 MST pada tanah steril ...................................... 33
11 Pengaruh dosis urea dan aktinomiset terhadap nilai warna daun
tanaman padi umur 6 MST pada tanah tidak steril ............................. 34
12 Pengaruh dosis urea dan aktinomiset terhadap bobot kering akar
tanaman padi umur 6 MST pada tanah steril ...................................... 34
13 Pengaruh dosis urea dan aktinomiset terhadap bobot kering akar
tanaman padi umur 6 MST pada tanah tidak steril ............................. 35
14 Pengaruh dosis urea dan aktinomiset terhadap bobot kering tajuk
tanaman padi umur 6 MST pada tanah tidak steril ............................. 36
15 Pengaruh dosis urea dan aktinomiset terhadap bobot kering total
tanaman padi umur 6 MST pada tanah steril ...................................... 37
16 Pengaruh dosis urea dan aktinomiset terhadap serapan nitrogen
akar tanaman padi umur 6 MST pada tanah steril .............................. 38
DAFTAR GAMBAR
Halaman
1
Proses penambatan N2 ....................................................................... 10
2
Diagram alur penelitian ..................................................................... 15
3
Pertumbuhan koloni isolat aktinomiset endofit di media YSA
umur 15 hari ....................................................................................... 23
4
Tipe penataan rantai spora aktinomiset ............................................. 24
5
Pertumbuhan koloni isolat aktinomiset endofit di media bebas
nitrogen umur 15 hari ........................................................................ 24
6
Hasil uji kualitatif produksi amonia dengan metode Nessler ............. 26
7
Pola produksi amonia dengan metode Nessler ................................... 27
8
Kolonisasi aktinomiset endofit pada jaringan akar padi 6 MST ........ 28
9
Pertumbuhan vegetatif tanaman padi pada tanah steril ..................... 29
10 Pertumbuhan vegetatif tanaman padi pada tanah tidak steril ............. 29
11 Pengaruh dosis urea dan perlakuan aktinomiset terhadap panjang
akar tanaman padi umur 6 MST pada tanah tidak steril .................... 31
12 Pengaruh dosis urea dan perlakuan aktinomiset terhadap bobot
kering tajuk tanaman padi umur 6 MST pada tanah tidak steril ........ 35
13 Pengaruh dosis urea dan perlakuan aktinomiset terhadap bobot
kering total tanaman padi umur 6 MST pada tanah tidak steril ......... 37
14 Pengaruh dosis urea dan perlakuan aktinomiset terhadap serapan
nitrogen akar tanaman padi umur 6 MST pada tanah tidak steril ...... 38
15 Pengaruh dosis urea dan perlakuan aktinomiset terhadap serapan
nitrogen tajuk tanaman padi umur 6 MST pada tanah steril (a) dan
tidak steril (b)...................................................................................... 39
16 Pengaruh dosis urea dan perlakuan aktinomiset terhadap serapan
nitrogen total tanaman padi umur 6 MST pada tanah steril (a) dan
tidak steril (b)...................................................................................... 40
DAFTAR LAMPIRAN
Halaman
1
Hasil analisis sidik ragam dan hasil uji lanjut Duncan nilai reduksi
asetilen dengan selang kepercayaan 95% ...................................................... 67
2
Hasil analisis sidik ragam dan hasil uji lanjut Duncan nilai produksi
amonia dengan selang kepercayaan 95% ...................................................... 68
3
Hasil produksi amonia oleh aktinomiset endofit pada hari ke-15 ................. 69
4
Hasil produksi amonia isolat SSW-02 dan AB131-2 pada hari ke-5 ............ 70
5
Hasil produksi amonia isolat SSW-02 dan AB131-2 pada hari ke-10 .......... 70
6
Hasil produksi amonia isolat SSW-02 dan AB131-2 pada hari ke-15 .......... 71
7
Perhitungan kebutuhan pupuk N, P, dan K dalam skala pot 5 Kg tanah ....... 71
8
Data analisis sifat kimia tanah ultisol Cimanggu sebelum tanam ................. 72
9
Kriteria penilaian sifat kimia tanah ............................................................... 72
10 Hasil analisis sidik ragam dan hasil uji lanjut Duncan tinggi padi pada
tanah steril dengan selang kepercayaan 95% ................................................ 73
11 Hasil analisis sidik ragam dan hasil uji lanjut Duncan tinggi padi pada
tanah tidak steril dengan selang kepercayaan 95% ....................................... 74
12 Hasil analisis sidik ragam dan hasil uji lanjut Duncan panjang akar pada
tanah steril dengan selang kepercayaan 95% ................................................ 75
13 Hasil analisis sidik ragam dan hasil uji lanjut Duncan panjang akar pada
tanah tidak steril dengan selang kepercayaan 95% ....................................... 76
14 Hasil analisis sidik ragam dan hasil uji lanjut Duncan jumlah anakan
pada tanah steril dengan selang kepercayaan 95% ........................................ 77
15 Hasil analisis sidik ragam dan hasil uji lanjut Duncan jumlah anakan
pada tanah tidak steril dengan selang kepercayaan 95% ............................... 78
16 Hasil analisis sidik ragam dan hasil uji lanjut Duncan nilai warna daun
pada tanah steril dengan selang kepercayaan 95% ........................................ 79
17 Hasil analisis sidik ragam dan hasil uji lanjut Duncan nilai warna daun
pada tanah tidak steril dengan selang kepercayaan 95% ............................... 80
18 Hasil analisis sidik ragam dan hasil uji lanjut Duncan bobot kering akar
pada tanah steril dengan selang kepercayaan 95% ........................................ 81
19 Hasil analisis sidik ragam dan hasil uji lanjut Duncan bobot kering akar
pada tanah tidak steril dengan selang kepercayaan 95% ............................... 82
20 Hasil analisis sidik ragam dan hasil uji lanjut Duncan bobot kering
tajuk pada tanah steril dengan selang kepercayaan 95% ............................. 83
21 Hasil analisis sidik ragam dan hasil uji lanjut Duncan bobot kering
tajuk pada tanah tidak steril dengan selang kepercayaan 95% ..................... 84
22 Hasil analisis sidik ragam dan hasil uji lanjut Duncan bobot kering total
tanaman pada tanah steril dengan selang kepercayaan 95% ......................... 85
23 Hasil analisis sidik ragam dan hasil uji lanjut Duncan bobot kering total
tanaman pada tanah tidak steril dengan selang kepercayaan 95% ................ 86
24 Hasil analisis sidik ragam dan hasil uji lanjut Duncan serapan nitrogen
akar pada tanah steril dengan selang kepercayaan 95% ............................... 87
25 Hasil analisis sidik ragam dan hasil uji lanjut Duncan serapan nitrogen
akar pada tanah tidak steril dengan selang kepercayaan 95% ...................... 88
26 Hasil analisis sidik ragam dan hasil uji lanjut Duncan serapan nitrogen
tajuk pada tanah steril dengan selang kepercayaan 95% .............................. 89
27 Hasil analisis sidik ragam dan hasil uji lanjut Duncan serapan nitrogen
tajuk pada tanah tidak steril dengan selang kepercayaan 95% ..................... 90
28 Hasil analisis sidik ragam dan hasil uji lanjut Duncan serapan nitrogen
total pada tanah steril dengan selang kepercayaan 95% ............................... 91
29 Hasil analisis sidik ragam dan hasil uji lanjut Duncan serapan nitrogen
total pada tanah tidak steril dengan selang kepercayaan 95% ...................... 92
PENDAHULUAN
Latar Belakang
Seiring dengan peningkatan penduduk di dunia, kebutuhan padi sebagai
bahan baku utama produk pangan juga semakin meningkat. Produktivitas padi
dibatasi salah satunya oleh kebutuhan akan nitrogen (Dawe 2000, Shenoy et al.
2001). Padi membutuhkan 1 Kg nitrogen untuk memproduksi 15-20 kg biji padi.
Padi dataran rendah di tropik dapat menggunakan cukup N yang tersedia secara
alami untuk memproduksi 2-3 Ton ha-1. Untuk hasil perolehan yang lebih tinggi,
tambahan nitrogen harus diaplikasikan (Ladha & Reddy 2000). Pengembangan
keragaman pupuk yang responsif dan ditambah dengan kesadaran petani tentang
pentingnya kebutuhan nitrogen, telah menyebabkan tingginya tingkat penggunaan
pupuk nitrogen anorganik pada padi. Penggunaan sejumlah besar pupuk anorganik
dalam jangka waktu yang lama dapat menimbulkan pencemaran lingkungan,
meningkatkan kebutuhan gas akan sumber daya alam yang tak dapat diperbarui,
serta sisa produksi berupa gas CO2 dan NO2 yang berpotensi menimbulkan efek
rumah kaca.
Salah satu solusi dari permasalahan di atas ialah memanfaatkan mikrob
penambat N2 yang dapat mengurangi dampak lingkungan akibat penggunaan pupuk
nitrogen sintetis. Jika sistem penambatan N2 secara biologis berbasis mikrob endofit
dapat diterapkan pada tanaman padi, maka suplai nitrogen bagi tanaman akan
meningkat sehingga pertumbuhan dan produktivitas padi juga meningkat. Jika
sistem penambatan N2 secara biologi dapat dilakukan pada tanaman padi, maka hal
ini dapat meningkatkan suplai nitrogen yang tersedia bagi tanaman hingga sebesar
50 Kg N/Ha lahan (Ladha & Reddy 2000, Cockrell 2004).
Beberapa penelitian telah dilakukan terkait dengan diazotrof endofit dan area
kolonisasinya pada tanaman padi (Tabel 1). Potensi nitrogen yang telah ditambat
oleh bakteri endofit tidak ada yang hilang dan dilepas ke atmosfer (Cockrell 2004).
Di samping itu, beberapa bakteri endofit tersebut selain mampu menambat N2 juga
mampu mensekresikan
asam indol-3-asetat
yang penting untuk
hormon
pertumbuhan padi (Ladha et al. 1997). Selain itu keuntungan dari asosiasi endofit
ialah diazotrof terlindung dari kompetisi, sehingga lebih banyak pertukaran
2
metabolit yang terdapat pada inang, proteksi terhadap kadar konsentrasi oksigen
yang tinggi dan dapat mentransportasi nitrogen yang tertambat langsung kepada
inang (Shenoy et al. 2001).
Tabel 1 Diazotrof endofit dan area kolonisasinya pada tanaman padi
Spesies
Area kolonisasi
Referensi
Acetobacter
diazotrophicus
PA15
Akar padi
Sevilla & Kennedy
(2000)
Azoarcus sp.BH72
Interselular pada akar
Hurek & ReinholdHurek (2003)
Azospirillum
brasilense
Rambut akar atau
zona elongasi
Bacilio-Jimenez et al.
(2001)
Burkholderia sp.
M209
Epidermis dan bagian
akar lateral
Baldani et al. (1997)
Enterobacter sp.
USML2
Akar dan daun padi
Tharek et al. (2011)
Herbaspirillum
seropedicae Z67
Akar padi
Barraquio et al. (1997)
Pseudomonas
stutzeri A15
Korteks dan
epidermis akar padi
You et al. (1991)
Rhizobium
leguminosarum
bv. trifolii Ell, E12
Akar lateral
Yanni et al. (1997)
Rhizobium spp.
Akar dan daun padi
Chi et al. (2005)
Serratia
marcesens
Ruang interseluler
dan parenkim akar,
batang, dan daun
Gyaneshwar et al.
(2001)
Berbagai macam bakteri penambat N2 juga telah diteliti pada ekosistem padi
dengan sawah tergenang dan dinyatakan telah berkontribusi pada pertambahan
kadar nitrogen di tanah (Shrestha & Maskey 2005). Kemampuan penambatan N2
secara biologi pada bakteri heterotrof berkisar antara 11-16 kg N ha-1 atau sekitar
16-21% dari kebutuhan nitrogen pada padi (Shrestha & Maskey 2005). Beberapa
bakteri diazotrof endofit yang telah diteliti peranannya sebagai penambat N2 pada
padi diantaranya Klebsiella oxytoca pada padi varietas C5444 berhasil
3
meningkatkan tambatan nitrogen sebesar 11-19% total nitrogen, E. cloaceae pada
padi varietas T65 berhasil meningkatkan 0-18% total nitrogen, dan Alcaligenes
faecalis pada padi varietas Japonica dan Indica yang berhasil meningkatkan 2030% total nitrogen (Shrestha & Maskey 2005). Bakteri endofit yang berperan pula
sebagai diazotrof tersebut tersebar di berbagai area kolonisasi dari akar hingga duan
padi (Tabel 1).
Aktinomiset endofit dapat menjadi pelaku penambat N2 di samping
keistimewaannya dalam menghasilkan senyawa bioaktif dengan beragam fungsi
seperti fitohormon, antimikrob, peningkat pertumbuhan tanaman dan produsen
enzim yang sangat menguntungkan dalam bidang pertanian (Hasegawa et al. 2006,
Mano & Morisaki 2008, Joseph et al. 2012). Hal ini dilaporkan Yuan dan Crawford
(1995) yang telah meneliti beberapa spesies aktinomiset yang mampu menghasilkan
zat pemacu pertumbuhan pada tanaman serta antibiotik selain sebagai penambat N2.
Isolat aktinomiset endofit (Streptomyces sp.) yang diisolasi dari sweet pea juga
telah diaplikasikan pada tanaman kedelai (Thapanapongworakul 2003, diacu dalam
Soe et al. 2010). Isolat tersebut menunjukkan kemampuan anti cendawan patogen
dan mampu meningkatkan pasokan nitrogen pada kedelai mencapai 83% serta
kompatibel dengan penambahan Bradyrhizobium. Soe et al. (2010) juga
menunjukkan kompatibilitas antara Streptomyces dengan Bradyrhizobium dan
kemampuannya dalam peningkatan penambatan N2 pada tanaman kedelai.
Mahendra dan Alvarez-Cohen (2005) juga telah berhasil meneliti Pseudonocardia
dioxanivorans yang merupakan spesies aktinomiset baru dan memiliki kapabilitas
penambatan N2.
Berdasarkan hasil penelitian sebelumnya, penggunaan aktinomiset endofit
isolat AB131-2, PS4-16, Impara 6A, AB131-1, AB131-3, A Fat, Membramo A,
LSW-05, LBR-02, dan SSW-02 terbukti memiliki kemampuan yang beragam dalam
peningkatan pertumbuhan tanaman padi. Kemampuan yang dimiliki oleh
aktinomiset endofit tersebut diantaranya produksi IAA, siderofor, HCN, kitinase,
kemampuan pelarutan fosfat, dan kemampuan untuk menghambat cendawan dan
mikrob patogen khususnya Xanthomonas oryzae pv. oryzae (Xoo) yang merupakan
penyebab penyakit hawar daun bakteri pada padi (Yusepi 2011; Hastuti 2012).
Jelita (2011) juga melaporkan adanya dinamika populasi aktinomiset endofit pada
4
padi khususnya IR-64 yang meningkat sesuai dengan periode pertumbuhan tanaman
dan populasi tertinggi terjadi saat 4 minggu setelah tanam. Hal ini menunjukkan
peran aktinomiset endofit pada tanaman padi khususnya saat masa vegetatif
pertumbuhan padi.
Penelitian mengenai proses penambatan N2 secara biologi pada padi pada
umumnya didominasi oleh bakteri diazotrof endofit non-aktinomiset, sedangkan
aktinomiset endofit pada padi masih sangat jarang diteliti terutama pada
kemampuannya dalam menambat N2 (Tian et al. 2004). Oleh sebab itu, penelitian
terhadap aktinomiset endofit penambat N2 perlu dilakukan untuk melihat efektivitas
aktinomiset dalam penambatan N2. Kajian kemampuan aktinomiset endofit dalam
menambat N2 dapat dikaji baik secara in-vitro dengan metode reduksi asetilen,
kemampuan tumbuh pada media bebas nitrogen, pengukuran produksi amonia,
teknik
15
N-isotop maupun secara in-planta dengan mengkombinasi inokulasi
aktinomiset endofit dengan beberapa dosis pupuk anorganik. Dari hasil penelitian
ini diharapkan mampu menjawab permasalahan terhadap kebutuhan nitrogen pada
padi yang terbatas dan mampu meningkatkan pertumbuhan pada tanaman padi.
Perumusan Masalah
1. Nitrogen merupakan salah satu nutrisi pembatas pertumbuhan pada padi yang
berkontribusi langsung terhadap produktivitas hasil panen.
2. Penggunaan pupuk nitrogen anorganik yang berlebihan dan terus-menerus
mengakibatkan dampak negatif pada lingkungan.
3. Bakteri aktinomiset endofit dapat menjadi pelaku penambat N2 di samping
keistimewaannya dalam menghasilkan senyawa bioaktif seperti fitohormon,
antimikrob dan produsen enzim.
4. Penelitian tentang aktinomiset endofit pada padi masih jarang dilakukan dalam
kapasitasnya sebagai penambat N2.
Hipotesis
Isolat aktinomiset endofit terpilih baik secara seleksi in-vitro dan dilanjutkan
dengan seleksi in-planta mampu menambat nitrogen dan meningkatkan
pertumbuhan tanaman padi.
5
Tujuan Penelitian
Penelitian ini bertujuan untuk mengkaji kemampuan aktinomiset endofit
terpilih dalam menambat N2 secara in-vitro dan in-planta serta mengetahui
kemampuannya dalam meningkatkan pertumbuhan tanaman padi.
Manfaat Penelitian
Seleksi terhadap isolat aktinomiset endofit diharapkan mampu memilih satu
isolat penambat nitrogen pada tanaman padi dengan kapasitas penambatan nitrogen
paling optimal dan dapat meningkatkan pertumbuhan tanaman padi. Dari hasil yang
telah diperoleh tersebut, diharapkan dapat dikembangkan produk hayati berbasis
aktinomiset endofit yang mampu mensubstitusi kebutuhan nitrogen pada padi
sekaligus meningkatkan pertumbuhannya serta merupakan alternatif yang tepat
terhadap pemenuhan kebutuhan tanaman padi akan nitrogen yang ramah
lingkungan.
Ruang Lingkup Penelitian
Penelitian yang dilakukan meliputi penapisan isolat aktinomiset endofit
berdasarkan kapasitas penambatan N2 secara in-vitro dan in-planta. Penambatan N2
secara in-vitro dilakukan dengan melihat potensi kemampuan tumbuh di media
bebas nitrogen, kemampuan reduksi asetilen dan produksi amonia. Penambatan N2
secara in-planta dilakukan dengan kombinasi antara aplikasi aktinomiset endofit
pada tanaman padi dengan variasi level penggunaan pupuk urea selama masa
vegetatif.
6
7
TINJAUAN PUSTAKA
Aktinomiset Endofit
Aktinomiset adalah kelompok bakteri Gram positif dengan kandungan GC
yang tinggi (diatas 55 mol% G+C) (Otoguro et al. 2009, Sharma et al. 2012).
Mayoritas aktinomiset biasanya dapat hidup baik dalam lingkungan netral hingga
sedikit basa khususnya pada tanah, lingkungan rhizosfer dan mendegradasi bahan
organik (Widyastuti & Ando 2009, Sharma et al. 2012). Aktinomiset juga
menghasilkan struktur bertahan berupa spora yang dapat bertahan dalam kondisi
tidak menguntungkan, seperti rendahnya kadar air dan suhu tinggi serta dapat
bertahan dalam waktu yang lama. Tidak seperti bakteri penghasil spora lainnya,
aktinomiset memproduksi spora sebagai cara utama bakteri ini dalam melakukan
pemencaran atau dispersal (Schaad et al. 2000). Aktinomiset dikenal sebagai
bakteri yang bersifat saprofit dan sangat umum dijumpai di rhizosfer hingga lapisan
tanah dalam. Aktinomiset memiliki miselium aerial karena miselium dapat tumbuh
pada lapisan udara. Ukuran miselium umumnya memiliki diameter 0,5-1,0
m,
dengan panjang yang tidak tentu, dan tidak memiliki sekat pada fase vegetatif
(Madigan & Martinko 2006).
Pada umumnya aktinomiset dibagi menjadi dua kelompok yaitu Streptomyces
dan non-Streptomyces atau rare actinomycetes. Genus Streptomyces dibentuk oleh
Waksman & Henrici (1943) dan termasuk kelompok mikrob aerobik dengan
kandungan G+C yang tinggi (69–78 mol%) dengan bentuk asal spora batang dari
miselium substrat serta kelompok aktinomiset tersebut paling sering ditemukan di
tanah dan mampu dikulturkan kembali (Otoguro et al. 2009, Widyastuti & Ando
2009). Streptomyces mempunyai filamen yang panjang dan bercabang serta
membentuk rantai panjang spora udara yang disebut konidia. Pada media agar
berwarna buram atau opak, tidak mengkilat, dan melekat kuat pada medianya.
Streptomyces spp. secara umum menyerupai kapang dengan ciri-ciri membentuk
miselium aerial (Madigan & Martinko 2006). Struktur seluler kapang yang dimiliki
Streptomyces sp. menyebabkan Streptomyces juga mempunyai kemiripan dalam
siklus hidupnya. Daur hidup pada medium padat dimulai dari germinasi spora,
ditandai dengan banyak miselium multiseluler, kemudian di atas miselia tumbuh
8
miselia aerial yang diikuti fragmentasi hifa yang membentuk cabang-cabang spora.
Perbedaan dalam bentuk dan pembentukan filamen aerial serta munculnya struktur
penataan spora dari beberapa spesies merupakan bagian utama yang digunakan
untuk mengklasifikasi spesies Streptomyces. Konidia dan spora yang berpigmen
memberikan peran dalam mengkarakterisasi koloni yang matang (Madigan &
Martinko 2006). Menurut Miyadoh (1997), Streptomyces diklasifikasikan secara
taksonomi sebagai berikut:
Dunia
: Bacteria
Divisi
: Actinobacteria
Kelas
: Actinobacteria
Ordo
: Actinomycetales
Famili
: Streptomycetaceae
Genus
: Streptomyces
Schaad et al. (2000) melaporkan dari sekitar 400 spesies Streptomyces, sangat
sedikit yang diketahui menjadi patogen pada tanaman. Isolasi aktinomiset dari
jaringan tanaman dan lahan pertanian sering kali diperoleh aktinomiset yang
bersifat saprofitik. Beberapa aktinomiset terbukti erat terkait dengan tumbuhan,
yaitu pada penelitian Brunchorst yang berhasil mengisolasi genus Frankia dari
nodul akar non legum pada tahun 1886 yang menunjukkan peran penambatan N2
dalam akar mirip dengan Rhizobium pada tanaman kacang-kacangan (Bandara et al.
2006).
Mikrob endofit merupakan mikrob yang hidup di dalam jaringan tanaman
pada periode tertentu dan mampu membentuk koloni dalam jaringan tanaman tanpa
membahayakan inangnya (Strobel & Daisy 2003). Mikrob endofit berasosiasi
dengan tanaman dan terkadang membentuk asosiasi mutualisme dengan tumbuhan
inang. Keuntungan dari asosiasi mikrob endofit pada padi meliputi penambatan N2
dari udara, meningkatkan kemampuan penyerapan nutrisi, memproduksi hormon
pertumbuhan, meningkatkan kualitas butir padi, meningkatkan resistensi dari
patogen dan meningkatkan toleransi terhadap kekeringan (Cockrell 2004).
Aktinomiset endofit yang tumbuh secara endofit pada tanaman dapat berperan
sebagai simbion, parasit, maupun saprofit (Hasegawa et al. 2006).
9
Beberapa metabolit aktinomiset endofit langsung mempengaruhi fisiologi
tanaman inang tetapi mikrob yang lain melakukannya secara tidak langsung dengan
mempengaruhi populasi mikrob antibiosis atau melalui kompetisi. Aktinomiset
pada tumbuhan inang dapat menghasilkan metabolit sebagai antibiotik, promoter
pertumbuhan tanaman, inhibitor pertumbuhan tanaman, dan penghasil enzim. Oleh
sebab itu, aktinomiset digunakan sebagai agen biokontrol, memproduksi jaringan
tumbuhan yang memiliki ketahanan terhadap penyakit dan jaringan tumbuhan yang
tahan terhadap kekeringan (Hasegawa et al. 2006).
Berdasarkan penelitian yang dilakukan oleh Tian et al. (2004), koloni
Streptomyces griseofuscus yang berhasil diisolasi mendominasi berkisar 36.1% 69% pada padi dengan dua spesies berbeda di Guangdong, China. Selain itu,
diketahui pula distribusi aktinomiset endofit pada tanaman padi kebanyakan
berhasil diisolasi dari bagian akar daripada daun padi (Tian et al. 2004). Sardi et al.
(1992) juga berhasil mengisolasi aktinomiset endofit dari akar 28 spesies tanaman
padi, dan didominasi oleh Streptomyces spp.. Aktinomiset endofit yang ditemukan
tersebut memiliki kemampuan untuk memproduksi paling sedikit tiga jenis senyawa
antagonistik di jaringan tanaman termasuk antibiotik, enzim, dan siderophores
(Trejo-Estrada et al. 1998, Hasegawa et al. 2006).
Tian et al. (2004) dan Sardi et al. (1992) berhasil mengisolasi dan mengetahui
dominansi Streptomyces spp. pada padi namun, penelitian mengenai aktinomiset
endofit pada padi masih jarang dilakukan dengan kapasitasnya sebagai penambat
N2. Penelitian aktinomiset endofit penambat N2 telah diaplikasikan pada kedelai
oleh Soe et al. (2010), dengan inokulasi Streptomyces sp. disandingkan dengan
Bradyrhizobium. Dari hasil penelitian
tersebut dinyatakan bahwa penggunaan
Streptomyces tidak menunjukkan hasil yang cukup signifikan namun lebih efektif
ditambahkan pada inokulan dibandingkan penggunaan inokulasi Bradyrhizobium
sendiri. Thaporongwakul (2003) dalam Soe (2010) juga telah mengaplikasikan
isolat aktinomiset endofit (Streptomyces sp.) yang diisolasi dari sweet pea dan
diaplikasikan pada kedelai. Isolat tersebut menunjukkan kemampuan anti cendawan
patogen dan dapat meningkatkan pasokan nitrogen pada kedelai mencapai 83%
serta kompatibel dengan penambahan Bradyrhizobium. Aplikasi aktinomiset endofit
10
pada padi yang ditujukan untuk kemampuan penambatan N2 masih belum banyak
dilakukan penelitian lebih lanjut.
Penambatan Nitrogen
Penambatan N2 merupakan proses pengubahan N2 menjadi NH4+ yang
berguna secara biologi. Penambatan N2 melibatkan penggunaan ATP dan proses
reduksi ekuivalen berasal dari metabolisme primer. Semua reaksi yang terjadi
dikatalisis oleh nitrogenase (White 2000).
Feredoksin teroksidasi
Protein Fe tereduksi
Protein Mo Fe teroksidasi
Feredoksin tereduksi
Protein Fe teroksidasi
Protein Mo Fe tereduksi
Gambar 1 Proses penambatan N2 (Deacon 2012).
Mekanisme penambatan N2 menurut Sylvia et al. (1999), dimulai dengan
dinitrogenase reduktase yang menerima elektron dari donor berupa ferredoksin
tereduksi atau flavodoksin, dan berikatan dengan dua molekul MgATP. Elektron
ditransfer menuju ke dinitrogenase. Dinitrogenase reduktase dan dinitrogenase
membentuk kompleks, elektron ditransfer dan dua MgATP dihidrolisis menjadi dua
molekul MgADP+Pi. Kompleks nitrogenase tersebut berdisosiasi dan dilakukan
pengulangan proses. Ketika dinitrogenase telah mengumpulkan cukup elektron,
senyawa tersebut mengikat molekul N2, mereduksinya dan dilanjutkan dengan
pelepasan amonia. Dinitrogenase kemudian menerima tambahan elektron dari
dinitrogenase reduktase untuk mengulangi proses tersebut. Reaksi penambatan N2
dapat dituliskan berdasarkan persamaan berikut:
N2 + 8H+ + 8e- + 16 ATP 2NH3 + H2 + 16ADP + 16 Pi
11
Serapan hidrogenase akan dikembalikan dalam bentuk H dalam sistem
penambatan N2 (Gambar 1). Serapan hidrogenase yang dihasilkan dapat digunakan
juga pada jalur konsumsi dioksigen untuk membantu menjaga kondisi lingkungan
dalam keadaan anaerobik. Lingkungan anaerobik sangat penting bagi aktivitas
nitrogenase diakibatkan karena kedua kompleks protein nitrogenase yang memiliki
sensitivitas tinggi terhadap oksigen, sehingga kehadiran oksigen dapat menekan
sistem serapan hidrogen dalam proses nitrogenase (Moat 2002).
Mikrob yang dapat melakukan penambatan N2 secara biologi disebut diazotrof
dengan peranan utama dari enzim kompleks dinitrogenase. Diazotrof terdiri atas
aerob (misal Azotobacter, Beijerinckia, Derxia), fakultatif anaerob (misal
Clostridium, Pseudomonas, Rhizobium), heterotrof (misal Klebsiella, Enterobacter)
dan fototrof (misal Anabaena, Azospirillum, Nostoc). Berdasarkan hubungan
fungsional dan spasial antar diazotrof dan inangnya, sistem diazotrof terdiri atas
sistem diazotrof eksofit (bila diazotrof terdapat di luar tanaman inang) dan sistem
diazotrof endofit (bila diazotrof terdapat di dalam tanaman inang). Sistem eksofit
tersebut dapat merupakan free-living (bila diazotrof tidak kontak langsung dengan
tanaman inang), asosiatif (bila diazotrof mendominasi permukaan luar, namun
terkadang di dalam tanaman inang yaitu pada ruang interseluler) atau simbiotik
(ketika diazotrof secara intraseluler berada pada tanaman inang) (Shenoy et al.
2001). Studi yang dilakukan telah menunjukkan bahwa nitrogen berasal dari udara
dengan penambatan N2 yang berhasil ditambat oleh bakteri endofit berkisar 0-35%
pada padi (Shrestha & Maskey 2005).
Metode reduksi asetilen merupakan salah satu cara untuk mengukur aktivitas
nitrogenase dalam menambat N2. Nitrogenase mampu mereduksi N2 menjadi NH3,
selain itu juga dapat mereduksi C2H2 menjadi C2H4, dengan kesetaraan reduksi
C2H2 dan penambatan N2 sebesar 4:1 (Hardy 1973). Selain itu, pengukuran
produksi amonia dengan nessler juga dapat dilakukan untuk mengukur output
penambatan N2 yang dilakukan oleh mirob. Pengukuran produksi amonia tersebut
didasarkan oleh prinsip pengikatan amonia (NH4) dengan Hg yang akan
menimbulkan warna jingga pada sampel sesuai dengan reaksi berikut :
2K2 [HgI4] + 2 NH3 NH4HgI3 + 4 KI + NH4I
12
Kajian kemampuan aktinomiset endofit dalam menambat N2 dapat dikaji baik
secara in-vitro seperti reduksi asetilen, kemampuan tumbuh pada media bebas
nitrogen, pengukuran produksi amonia, teknik
15
N-isotop maupun secara in-planta
dengan mengkombinasi inokulasi aktinomiset endofit dengan beberapa dosis pupuk
anorganik.
Padi
Padi merupakan tanaman yang berumpun kuat dengan tinggi batang yang
beragam (0,5-2 m). Helai daun berbentuk garis, kebanyakan bertepi kasar dan
panjangnya 15-80 cm, serta memiliki malai dengan panjang 15-40 cm yang tumbuh
ke atas dan ujungnya menggantung. Malai berupa bulir yang beraneka ragam,
dengan ukuran 7-10 cm. Bulir yang masak akan menghasilkan buah yang kaya akan
pati. Tanaman padi yang dapat tumbuh baik di daerah tropis ialah indica, sedangkan
japonica banyak diusahakan di daerah subtropis (Luh, 1991). Padi merupakan inang
yang tepat bagi bakteri endofit yang dapat berdampak positif bagi pertumbuhan
padi terutama pada akar, batang dan daunnya.
Menurut Cockrell (2004), padi memiliki nutrisi pembatas berupa nitrogen dan
asosiasi dengan bakteri endofit penambat N2 dapat meningkatkan suplai nitrogen
serta meningkatkan produktivitas pada tanaman padi. Padi membutuhkan 1 kg
nitrogen untuk memproduksi 15-20 kg biji padi. Padi dataran rendah di daerah
tropik dapat menggunakan cukup N yang tersedia alami untuk memproduksi 2-3 ton
ha-1. Untuk hasil perolehan yang lebih tinggi, tambahan nitrogen harus
diaplikasikan (Ladha & Reddy 2000). Berdasarkan Grist (1960), padi dapat
diklasifikasikan secara taksonomi sebagai berikut:
Dunia
: Plantae
Divisi
: Spermatophyta
Sub divisi
: Angiospermae
Kelas
: Monocotyledoneae
Ordo
: Poales
Famili
: Ginaceae
Genus
: Oryza
Spesies
: sativa
13
Padi yang akan digunakan dalam penelitian ini ialah padi varietas IR64 yang
biasanya berumur 110-120 hari, memiliki bentuk tanaman tegak dengan rata-rata
tinggi tanaman 115-126 cm. Padi IR64 memiliki anakan produktif 20-35 batang
dengan warna kaki dan warna batang hijau, sedangkan warna telinga dan lidah daun
tidak berwarna. Permukaan daun padi IR64 kasar dengan warna daun hijau dan
posisi daun bendera tegak. Gabah padi IR64 memiliki bentuk ramping, panjang dan
berwarna kuning bersih (Suprihatno et al. 2009). Keunggulan padi IR64 adalah
tahan kerontokan, kerebahan serta memiliki tekstur nasi yang dihasilkan pulen
dengan kadar amilosa 23%. Padi IR64 baik ditanam di lahan sawah irigasi dataran
rendah sampai sedang dan merupakan padi yang diintroduksi oleh IRRI pada tahun
1986. Padi IR64 menghasilkan rata-rata produksi 5,0 t/ha dan memiliki potensi
menghasilkan 6,0 t/ha (Suprihatno et al. 2009).
14
15
BAHAN DAN METODE
Kerangka Penelitian
Kerangka penelitian yang direncanakan (Gambar 2) meliputi peremajaan dan
seleksi aktinomiset baik in-vitro maupun in-planta pada tanaman padi.
Isolat Aktinomiset Endofit
Peremajaan Isolat Aktinomiset
Uji Kemampuan Aktinomiset Endofit dalam Penambatan N 2 secara In-Vitro
Kemampuan Tumbuh di
Uji Fiksasi Nitrogen dengan
Uji Produksi Amonia dengan
Media Bebas Nitrogen
Metode Reduksi Asetilen
Metode Nessler
(Mahendra & Alvarez-Cohen 2005)
(Phillips et al. 2000)
Isolat Aktinomiset Endofit Terpilih Secara In-Vitro
Uji Kemampuan Aktinomiset Endofit dalam Penambatan N 2 secara In-Planta
Uji Kandungan Nitrogen
Pengamatan Mikroskopis
Pengukuran Pertumbuhan Vegetatif
pada Padi dengan Metode
Jaringan Akar Padi
Padi meliputi Tinggi tanaman padi,
Kjeldahl (ACIAR 1990)
(Patriquin & Doberainer 1978)
Jumlah Anakan, Panjang Akar,
Warna Daun dan Bobot Kering
Tanaman
Isolat Aktinomiset Endofit Penambat Nitrogen Terpilih
Gambar 2 Diagram alur penelitian.
16
Rancangan Percobaan
Penelitian dilakukan dengan menggunakan Rancangan Acak Lengkap (RAL)
faktorial dengan dua faktor yaitu perlakuan isolat aktinomiset endofit yang terpilih
secara in-vitro dan dosis pupuk urea pada tanah steril dan tidak steril. Faktor
perlakuan
isolat aktinomiset endofit terpilih terdiri atas tiga taraf yaitu tanpa
inokulasi (K), penambahan isolat aktinomiset endofit terpilih 1 (SSW-02) (S), dan
penambahan isolat aktinomiset endofit terpilih 2 (AB131-2) (