Insulated Isothermal Polymerase Chain Reaction ii-PCR

UIN Syarif Hidayatullah Jakarta Keterangan : 1. Konsentrasi DNA 200 ng25 µ L 2. KonsentrasiDNA 20 ng25 µ L 3. KonsentrasiDNA 2 ng25 µL 4. KonsentrasiDNA 0,2 ng25 µ L 5. KonsentrasiDNA 0,02ng25 µ L 6.KonsentrasiDNA 0,002ng25 µ L 7.KonsentrasiDNA 0,0002ng25 µ L Gambar 9. Hasil elektroforesis produk PCR dengan menggunakan primer spesifik DNA Leptospira pada uji sensitivitas primer. Pada gambar 9 dapat terlihat, dari tujuh konsentrasi yang digunakan, primer Leptospira mampu mengamplifikasi DNA Leptospira sampai dengan konsentrasi 0,002 ng25 µL, meskipun pada konsentrasi 0,002 ng25 µL menghasilkan pita yang tipis. Pada konsentrasi 0,0002 ng25 µL tidak terlihat adanya pita pada gel elektroforesis yang menandakan bahwa primer Leptospira tidak dapat mengamplifikasi DNA Leptospira pada konsentrasi 0,0002 ng25 µL, sehingga dapat dikatakan bahwa primer spesfik Leptospira yang digunakan sensitif dan mampu mengamplifikasi DNA Leptospira sampai konsentrasi 0,002 ng25 µ L.

4.3 Insulated Isothermal Polymerase Chain Reaction ii-PCR

Alat ii-PCR tidaksepertialat PCR konvensional, alat ii-PCR tidak mempunyai pengaturan suhu dan waktu denaturasi, annealing ,dan ekstensi. Reaksi ii-PCR dilakukan dalam tabung kapiler khusus yang disebut R-tube. R- tube dirancang khusus karena R-tube terbuat dari bahan plastik optis untuk memastikan transmisi dari fluoresensi optimal. Bahan plastik optis tersebut memastikan tidak adanya kontaminasi dari DNA maupun RNase dari luar reaksi UIN Syarif Hidayatullah Jakarta yang tidak diinginkan. Desain dari struktur tabung dan rasio yang dihitung dari diameter tabung atau panjang yang memastikan efisiensi dari reaksi konveksi termal pada proses reaksi ii-PCR. Penutup karet R-tube juga didesain khusus untuk membuat cairan reaksi aman dan mencegah penguapan selama reaksi yang dapat menyebabkan terjadinya kontaminasi Anonim, 2012. Reaksi ii-PCR bergantung pada tiga temperatur yang digunakan, yaitu denaturasi pada suhu 92-95 o C, annealing pada suhu 37-65 o C, dan ekstensi pada suhu 72 o C Anonim, 2012. Suhu annealing pada saat proses ii-PCR berlangsung tidak dapat diketahui secara pasti dan suhu annealing dapat berbeda-beda di setiap siklusnya, sehingga optimasi komposisi perlu dilakukan. Optimasi komposisi campuran ii-PCR dengan melakukan variasi dari Taq DNA polymerase dan buffer yang digunakan. Taq DNA polimerase yang digunakan adalah dari Thermo Scientific™ Long PCR Enzyme Mix dan KAPA2G™ Robust PCR Kit serta buffer yang digunakan adalah ii-buffer dan buffer dari masing-masing Taq polimerase yang digunakan. Pada akhir reaksi ii-PCR yang berlangsung selama 58 menit didapati hasil positif dan negatif pada layar touch panel Gambar 10. Gambar tersebut menunjukkan hasil reaksi ii-PCR dengan ii-buffer dengan buffer dari Taq DNA polimerase Thermo S cientific™ Long PCR Enzyme Mix yang keduanya menggunakan Taq DNA poli merase Thermo Scientific™ Long PCR Enzyme Mix.Gambar 11 menunjukkan hasil reaksi ii-PCR dengan ii-buffer danTaq DNA poli merase KAPA2G™ Robust PCR Kit dengan buffer dari Taq DNA KAPA2G™ Robust dimana keduanya menggunakan Taq DNA polimerase KAPA2G™ Robust PCR Kit. UIN Syarif Hidayatullah Jakarta Gambar 10.Hasilreaksi ii-PCR denganTaq DNA polimerase Thermo Scientific™ Long PCR Enzyme Mix A dengan ii-buffer dan B dengan menggunakan buffer dari kit. Gambar 11.Hasilreaksi ii-PCR dengan menggunakanTaq DNA polimerase KAPA2G™ RobustA dengan menggunakan buffer dari kit dan B dengan ii-buffer. Pada Gambar 10 dan 11 dapat terlihat hasil positif diperoleh dengan menggunakan Taq DNA polimerase KAPA2G™ Robust PCR Kit dengan ii- buffer, sedangkan reaksi lainnya menunjukkan hasil negatif. Hal ini berkaitan dengan jenis dari Taq DNA polymerase dan buffer yang digunakan. Jenis dari Taq DNA polymerase berhubungan dengan panjang target yang akan diamplifikasi dan efisiensi dari amplifikasi suatu produk Handoyo, Darmodan Ari Rudiretna, 2001; Arezi, dkk., 2003. Taq DNA polymerase Thermo Scientific™ Long PCR UIN Syarif Hidayatullah Jakarta Enzyme Mix yang memiliki hasil dan ketepatan yang tinggi digunakan untuk hasil amplifikasi dengan panjang basa yang lebih tinggi jika dibandingkan dengan Taq DNA polymerase KAPA2G™ Robust PCR Kit dan membutuhkan proses reaksi PCR yang cukup lama jika dibandingkan dengan Taq DNA polymerase KAPA2G™ Robust PCR Kit, sedangkan proses reaksi yang terdapat pada ii-PCR hanya dalam waktu singkat, sehingga efisiensi dari Taq DNA polymerase Thermo Scientific™ Long PCR Enzyme Mix memberikan hasil yang tidak baik dan memunculkan hasil negatif pada alat ii-PCR. Reaksi PCR hanya akan berlangsung pada kondisi pH tertentu, oleh karena itu untuk melakukan proses PCR diperlukan buffer PCR Handoyo, Darmodan Ari Rudiretna, 2001. Penggunaan buffer yang disarankan oleh alat ii-PCR adalah ii- buffer yang berfungsi untuk menstabilkan gradient suhu, mengurangi interaksi antara campuran reaksi dan R-tube, dan meningkatkan efisiensi DNA polymerase untuk mensukseskan reaksi ii-PCR Anonim, 2012. Oleh karena itu penggunaan buffer selain ii-buffer memunculkan hasil negatif. Hasil dari reaksi ii-PCR tersebut kemudian dielektroforesis untuk melihat pita yang dihasilkan dari reaksi ii-PCR ini Gambar 12. Keterangan : 1. KAPA2G™ Robust + ii- buffer 2. KAPA2G™ Robusrt + buffer kit 3. Thermo scientific™ Long PCR Enzyme Mix + buffer kit 4. Thermo scientific™ Long PCR Enzyme Mix + ii- buffer M. Ladder 100 bp Gambar 12. Hasil elektroforesis produk ii-PCR UIN Syarif Hidayatullah Jakarta Pada Gambar 12 menunjukkan hasil elektroforesis dari reaksi ii-PCR dengan menggunakan empat komposisi yang berbeda. Gambar ini menunjukkan dua komposisi yang digunakan dapat teramplifikasi, yaitu dengan menggunakan Taq DNA polimerase KAPA2G™ Robust, namun hanya reaksi yang menggunakan komposisi no.1 yang terdeteksi positif oleh alat ii-PCR. Hasil positif yang dimunculkan oleh alat ii-PCR disebabkan oleh fluoresensi dari probe hidrolisis dapat dideteksi secara efisien oleh sistem optik di dalam alat ii-PCR. Fluoresensi yang dihasilkan di dalam alat ii-PCR ditunjukkan dalam rasio SN signal intensity after signal intensity before yang mempunyai ambang batas minimal 1,34 untuk dapat memberikan hasil positif pada alat ii-PCR Tsai, dkk., 2012. Pada sampel no. 1 menunjukkan rasio SN 1,8062 sedangkan pada sampel no.2 sampai dengan no.4 menunjukkan rasio SN di bawah 1,34 Lampiran 6. Rasio SN yang dihasilkan sampel no.1 menunjukkan nilai ambang batas di atas 1,34, sehingga memberikan hasil positif pada alat ii-PCR. Pada Gambar 12 dapat terlihat juga bahwa hasil elektroforesis yang didapat dari keempat hasil reaksi ii-PCR menunjukkan pita yang smear. Hasil pita yang smear ini disebabkan oleh suhu annealing yang beragam dari alat ii-PCR yang berkisar pada 37-65 o C. Suhu annealing yang terlalu tinggi dari suhu annealing optimum akan menyebabkkan primer tidak menempel dengan DNA cetakan. Sedangkan jika suhu penempelan primer terlalu rendah dari suhu penempelan primer optimum menyebabkan mispriming, yaitu penempelan primer pada tempat yang salah pada DNA cetakan sehingga dihasilkan produk non spesifik Yuwono, 2006. 37 UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

BAB 5 KESIMPULAN DAN SARAN