Genetic Diversity of Clostridium bifennentans Strains by Amplified Ribosomal DNA Restriction Analysis and Their Toxicity to Mosquito Larvae

KERAGAMAN GENETIK SUUMLAH ISOLAT
Closfridium bifermentan BERDASARKAN AMPLTRED
RIBOSOMAL DNA REmC77ON ANAL YSIS DAN TOKSISITASNYA
TERHADAP LARVA NYAMUK

OLEH :
FATURRAHMAN

PROGRAM PASCASARJANA
INSTrrUT PERTANIAN BOGOR
2002

ABSTRACT
FATURRAHMAN. Genetic Diversity of Clostridium bifennentans Strains by
Amplified Ribosomal DNA Restriction Analysis and Their Toxicity to Mosquito
Larvae. Under the direction of ANTONIUS SUWANTO, ANJA MERYANDINI, and
LILY NATALIA

The genus of Clostndium is phylogenetically closely related to Bacillus, the
only genus that generated commercially available bioinsecticides, known as Bt-toxin.
The purpose of this study is to examine the presence Bt-like toxin in a number of

isolates of Clostndium bifermentans, a clostridial species that has been used for
many kind of industrial fermentation. One hundred fifty one clostridial isolates were
screened out from various habitats such as : cow's intestine, rumen contents of
water buffalo, rumen contents of sheep, river sediments, swamp sediments, lake
sediments, mangrove forest floor and milk processing waste. Sixteen isolate were
identified as Clostridium bifermentans based on its physiology and biochemical
characteristics. These isolates were further characterized employing flourescein
antibody technique. Ten
isolates out of 16 showed positive flourescence
appearance. These C. bfirmentans isolates shows the phenotiic diversity, due to
the intensity of it capacity in gelatine hydrolyze.
Amplified Ribosomal DNA Restriciton Analysis (ARDRA) was carry out for 10
isolates. The result showed that isolates could be separated into three distinct
groups, i.e : group 1 (Cb. ATCC638, R l d l b , R2-6, R3-1, Mel-6a, R8-la, Lb-9, dan
Sul-4), groups 2 (St-1 and La2-6), and group 3 that consisted only isolate Si-4.
These ten isolates were subsequently characterized for their insecticidal
activity toward mosquito larvae, either Aedes aegypty or Culex spp.. The larvicidal
activity was calculated as percentage of the death to the total larvae in the
experiment, after exposure to spore of Clostndium for 48 h. The 3rd - 4rd instar
larvae mortality was approximately 0-30 % for Aedes aegypti challenged with lo6 10' sporelml,

and 5-40% for Culex spp. with challenged lo8 spore/ml. C
hifernentans ATCC638 as standard of comparison also showed that the percentage
of the death of larvae is relatively low, i.e. 25% when challenged with lo8 spore/ml.
As comparison, 6. thunngiensis subsp. israelensis (Vectobact) at concentration lo4
spore/ml was able to kill either of these mosquito larvae up to 100% .

SURAT PERNYATAAN
Dengan ini saya menyatakan bahwa Tesis yang berjudul :
KERAGAMAN GENETIK SEJUMLAH ISOLAT
Clostridium bifennentans BERDASARKAN AMPLIFIED RIBOSOMAL DNA
RESTRICTION ANALYSIS DAN TOKSISITASNYA TERHADAP
LARVA NYAMUK
adalah benar dan merupakan hasil karya saya sendiri dan belum pemah
dipublikasikan. Semua sumber data dan informasi yang digunakan telah dinyatakan
secara jelas dan dapat diperiksa kebenarannya.
Bogor, Pebruari 2002
Yang menyatakan,

KERAGAMAN GENETIK SUUMLAH ISOLAT
Closfridium bifermentans BERDASARKAN AMPLIFIED

RIBOSOMAL DNA RESTRIOTON ANAL YSIS DAN TOKSISITASNYA
TERHADAP LARVA NYAMUK

FATURRAHMAN

Tesis
Sebagai Salah Satu Syarat
untuk Mendapatkan Gelar Magister Sains
pada Program Pascasajana Institut Pertanian Bogor

PROGRAM PASCASAFUANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
2002

HALAMAN PENGESAHAN
Judul Tesis

: Keragaman
bifementans

Genetik

Sejumlah

berdasarkan

Amplified

lsolat

Clostridium

Ribosomal

DNA

Restriction Analysis (ARDRA) dan Toksisitasnya terhadap
Larva Nyamuk
Nama Mahasiswa

: Faturrahman

Nomor Pokok

: 99641

Program Studi

: Bioteknologi

Menyetujui :
1. Komisi Pembimbing

n

Dr. Ir. Antonius Suwanto, M.Sc
Ketua

Dr. Ania Mervandini. M.S
Anggota

Drh. Lil Natalia M.S
Anggota

2. Ketua Program Studi
Bioteknologi,

Tanggal Lulus : 17 Januari 2002

-

.

Penulis dilahirkan di Sumbawa pada tanggal 03 Juli 1975, sebagai anak kedua
dari tiga bersaudara, anak dari pasangan Mustafa dan Musta'rah.
Penulis lulus dari SMA Negeri Ampenan, Mataram pada tahun1994 dan pada
tahun yang sama penulis diterima di Jurusan llmu Produksi Temak Fakultas
Petemakan, Universitas Mataram. Selama studi S1, penulis pemah menjadi Asisten
Dosen beberapa mata kuliah dan

pernah menjabat sebagai ketua Badan

Perwakilan Mahasiswa (BPM) Fakultas Petemakan UNRAM.
Pada tahun 1999, penulis melanjutkan pendidikan Magister pada Program
Studi Bioteknologi,

lnstitut Pertanian Bogor. Beberapa kegiatan yang menunjang

kemampuan akademis dan penelitian penulis adalah Magang Penelitian di
Laboratorium Mikrobiologi dan Bioteknologi PPLH-IPB dan Lab. Bakteriologi
Anaerob Balai Penelitian Veterinet selama 6 bulan dan pemah menjadi Asisten
Dosen pada mata kuliah Biologi Molekuler Keragaman Prokariot, PPs Biologi
(Mikrobiologi) IPB.
Sebagian dari tulisan ini pernah dipublikasikan dalam bentuk poster (poster
presentation) pada The second Indonesian Biotechnology Conference (IBC) 2001 di
Yogya karta.

PRAKATA

Segala puji bagi Allah, Rabb pencipta alam semesta beserta apa yang ada

didalamnya,

yang diperuntukkan bagi kesejahteraan manusia. Biodiversitas,

keteraturan dan kesetimbangan ciptaan-Nya merupakan bagian dari keagunganNya yang tiada tara. Manusia diperintahkan untuk mempelajari dan mengelolanya
untuk diambil kemanfaatan yang sebesar-besamya.
Penelitian dengan topik "Keragaman Genetik Sejumlah lsolat Clostridium
bifermentans Berdasarkan

Amplified Ribosomal DNA Restriction Analysis dan

Toksisitasnya terhadap Larva Nyamuk" merupakan tugas akhir, sebagai salah satu
prasarat untuk mendapatkan gelar Magister pada Program Studi Bioteknologi,
lnstitut Pertanian Bogor dan upaya untuk mempelajari sebagian kecil dari
keanekragaman mikroorganisme dari aspek molekuler, fisiologi, morfologi dan
biokimiawi serta kemungkinan pemanfaatannya untuk kontrol biologi.
Terima kasih saya ucapkan yang setinggi-tingginya kepada Dr. Ir. Antonius
Suwanto, M.Sc, Dr. Anja Meryandini, M.S., dan Drh. Lily Natalia, M.S selaku
pembimbing, yang telah meluangkan waktu, tenaga, biaya dan pikiran selama
penelitian ini berlangsung.

Pada kesempatan ini saya juga ingin menyampaikan terima kasih yang tiada
terhingga kepada kedua orang tua "Ayah dan Bunda" yang telah dengan tulus dan
dengan tiada putus-putusnya mendoakan, membimbing, dan memberikan motivasi
sehingga apa yang kami cita-citakan bisa terwujud. Dan buat istri-ku terkasih,
kupersembahkan tulisan ini sebagai kado pernikahan kita.
Juga rasa terima kasih saya sampaikan kepada pak Syafaruddin, dik Yulia
Enggel, mbak Heni, pak Oman, mas Yogi, mas Irawan, mbak Esti, mbak Rina, Anit,
dan rekan-rekan yang lain yang telah banyak membantu penulis.
Kepada pengelola Research Center for Microbial Diversity (RCMD) yang
telah mensponsori penelitian ini, saya sampaikan ucapkan terima kasih. Akhirnya
semoga tulisan ini dapat memberi manfaat yang sebesar-besamya bagi kepentingan
pendidikan dan industri bioteknologi.

Faturrahman

DAFTAR IS1

HALAMAN JUDUL ................................................................................
HALAMAN PENGESAHAN ...................................................................
DAFTAR IS1............................................................................................

DAFTAR TABEL ...................................................................................
DAFTAR GAMBAR ...............................................................................
DAFTAR LAMPIRAN .............................................................................
PRAKATA .............................................................................................
PENDAHULUAN ..................................................................................
TINJAUAN PUSTAKA
Mikroorganisme Penghasil Biopestisida ......................................
Karakteristik Clostridum bifennentans........................................
Nilai Bioekonomis C. bifementans ..............................................
ldentiiikasi dengan Fluorescein Antibody Technique ..................
Analisis Keragaman ~ e n e t i kdengan ARDRA .............................
Biologi Aedes aegypti dan Culex spp ..........................................
lnteraksi antara Toksin dengan Target Hama ............................
MATERI DAN METODE
Waktu dan Tempat Penelitian ....................................................
Bahan dan Alat ............................................................................
Metode Penelitian ........................................................................
HASlL DAN PEMBAHASAN
ldentifikasi C. bifennentans ..........................................................
ldentifikasi berdasarkan Fluorescein Antibody Technique .........

lndeks Gelatinolitik .......................................................................
Analisis Keragaman Genetik ........................................................
Toksisitas lsolat C. bifennentans .................................................
KESIMPULAN .......................................................................................
DAFTAR PUSTAKA ............................................................................
LAMPIRAN ...........................................................................................

DAFTAR TABEL

1. Morfologi dan Penampakan Koloni Beberapa
Spesies Clostridium............................................................................

9

2. Jadwal imunisasi ...............................................................................

24

3. Hasil uji biokimiawi isolat-isolat yang diduga C. bifermentans .........

36

4. lsolat yang teridentifikasi sebagai C. bifermentans
berdasarkan uji FAT ..........................................................................

39

5. Mortalitas larva Aedes aegypti setelah pemaparan selama

48 jam dengan suspensi spora C. bifementans (%) .....................

48

6. Mortalitas larva Culex spp setelah pemaparan selama
48 jam dengan suspensi C. bifermentans (%) ..............................

49

DAFTAR GAMBAR

1. Uji proteolitik isolat R14-1b dan R3-1 pada medium
Skim Milk Agar selama 48 jam .........................................................

37

2. lndeks aktivitas gelatinolitik isolat C. bifementans pada 48 jam .....

41

3. Hasil amplifikasi gen 16s rDNA .......................................................

42

4. Profil RFLP 16s rDNA setelah pemotongan dengan Rsal ...............

44

5 . Dendrogram hubungan kekerabatan galur C. barmentans ............

46

PENDAHULUAN
Latar Belakang

Serangga merupakan salah satu kelompok organisme yang keberadaannya
paling banyak dipermukaan bumi, dan sebaiian dari mereka memberikan pengaruh
merugikan bagi kehidupan manusia. Diperkirakan bahwa lebih dari 15 % tanaman
diseluruh dunia rusak akibat serangan hama serangga (Ceron, et a/., 1994) dan 30
% dari biaya produksi tanaman perkebunan dialokasikan untuk pembelian pestisida

(Krattinger, 1997). Nyamuk dan lalat tedibat dalam masalah-masalah kesehatan
manusia di sebagian besar belahan bumi. Sebagai vektor dari sejumlah penyakit
seperti malaria, encephalitis, demam berdarah, filariasis dan yellow fever (Becker
dan Margalit, 1993; Charles and LeRoux, 2000), setiap tahunnya terjadi insiden
malaria sebanyak 200-300 juta kasus yang menyebabkan kematian lebih dari 1 juta
anak di Afrika (Lacey and Undeen, 1989).
Sejak tahun 1940-an, sejumlah insektisida kimiawi telah dikembangkan
dengan maksud untuk mengendalikan populasi insekta berbahaya (Glick dan
Pastemak, 1994). Meskipun dalam beberapa ha1 efektif, penggunaan insektisida
kimiawi sering menimbulkan pengaruh yang tidak diinginkan, seperti timbulnya
resistensi hama dan seringkali tidak selektii atau kehilangan spesifitasnya sehingga
menyebabkan kerusakan ekologi (Margalit, 1993) yaitu berupa akumulasi residu
yang berbahaya bagi makhluk hidup, pencemaran lingkungan, matinya musuh alami
hama yang bersangkutan dan musnahnya organisme bukan sasaran (Drobniewski,
1994).
Oleh karena itu penting mendapatkan agen biologi yang

memiliki

kemampuan untuk mengendalikan insekta berbahaya. Penggunaan insektisida yang

diproduksi secara alami oleh mikroorganisme atau tanaman menjadi pilihan terbaik,
selain karena spesifitasnya yang tinggi terhadap serangga target, juga bersifat dapat
diuraikan secara biologis (biodegradable), dapat diproduksi dalarn skala industri,
ramah lingkungan, dan resistensinya terhadap serangga target lambat (Margalit,
1990; Glick dan Pasternak, 1994).
Suatu insektisida mikrobial dapat diperoleh dari mikroorganisme yang
memproduksi substansi toksik yang dapat mematikan spesies serangga atau
memiliki kapabilitas infeksi fatalitik terhadap serangga target spesifik (Glick dan
Pasternak, 1994). Penemuan protoksin mosquitosidal dari 5acillus thuringiensis var
isfaelensis pada tahun 1976 membuka era baru dalam kontrol biologi (Becker dan
Margalit, 1993), walaupun sebenamya penggunaan 5. thuringiensis

(selanjutnya

disingkat 0.t.) sebagai insektisida mikroba telah dikembangkan sejak tahun 1929
oleh Methalnikov dan Chlorine untuk mengendalikan hama ngengat Gypsi (Dubois
dan Lewis, 1981), selanjutnya 5.t. menjadi salah satu mikrwrganisme yang paling
luas dipelajari dan digunakan untuk mengendalikan hama insekta.
Bacillus thuringiensis

dicirikan oleh produksi kristal paraspora yang

terbentuk selarna rnasa sporulasi (Schnepf, et a1.,1998), tersusun atas molekulmolekul protein yang diketahui sebagai Gendotoksin atau kristal protein insektisida
(k.p.i), disandi oleh gen cry, bersifat toksik terhadap bermacam larva insekta seperti
Lepidoptera, Diptera dan Coleoptera (Ceron, et a/., 1994), nematoda (Barloy, et al. ,
1997). Didalam ulasannya Schnepf , et al., (1998) rnenyebutkan bahwa beberapa
jenis k.p.i. juga toksik terhadap

Hymenoptera, Homoptera, Orthoptera dan

Mallophaga.
K.p.i. dari 5.t telah digunakan sebagai biopestisida selama lebih dari 30
tahun, beragam produk komersial sekarang tersedia dan digunakan

dilahan

pertanian (Ceron, et a/., 1994), bahkan beberapa gen penyandi k.p.i. telah
diintroduksi kedalam genom tanaman dengan laju proteksi yang tinggi melawan
serangan beberapa hama serangga (Ballester, et a/., 1999; Ceron, et a/., 1994).
Walaupun aplikasi bioinsektisida 6.t telah digunakan begitu luas dan
menunjukkan sifat persistensi yang rendah di lingkungan, namun sejumlah laporan
menyebutkan terjadinya resistensi pada beberapa hama insekta dengan variasi
resistensi diantara subspecies yang berbeda dan dengan lokasi geografi yang
berbeda (Tabashnik, et a/., 1993; Iqbal, et a/., 1997; Schnepf, et a1.,1998;
Tabashnik, et a/., 2000). Resistensi pertama kali dilaporkan terjadi pada Plutella
xylostella, yang

resisten terhadap B.t subsp. kurstaki tetapi tidak resisten terhadap

toksin dari 5.t. subsp. aizawai (Tabashnik, et al., 1993).
Salah satu usaha untuk mengatasi masalah tersebut diatas adalah dengan
meningkatkan keanekaragaman produk gen cry sebagai bahan akti insektisida
(Barloy, et a/., 1997) terutama yang mengarah kepada usaha untuk mengisolasi
mikroorganisme barn yang secara potensial menunjukkan aktivitas pengendalian
hama (controlbiology).
Clostridium bifermentans subsp. malaysia yang ditemukan pada penghujung
tahun 1989, merupakan bakteri

anaerobik pertama yang diketahui bersifat

entomopatogenik dan juga bakteri non-B.t yang memiliki gen cry dalam genomnya.
Strain ini memiliki aktivitas yang tinggi melawan larva nyamuk dan lalat ( b l a c ~ y ) .
Protoksin yang dihasilkan C.b. subsp. malaysia disandi oleh dua buah gen, yaitu
cbm71 dan cbm72, yang disebut sebagai gen serupa-cry (cry like-genes) oleh
karena sekuen polipeptida-nya yang sangat mirip dengan Gendotoksin dari B.t.,
yang kemudian dinamakan cryl6A dan cryl7A (Seleena, et a/., 1997; Barloy, et al.,
1996;

dan Barloy, et al., 1998). Penemuan gen serupa-cry diluar 6.t memberi

isyarat bahwa mungkin terdapat lebih banyak lagi gen serupa-cry yarg terdistribusi
secara lebih luas pada berbagai spesies bakteri.
Pendekatan paling mutakhir yang dilakukan untuk memilih galur-galur bakteri
pembawa

gen cry yang secara potensial unggul sebagai biopestisida adalah

analisis molekuler keragaman genetik. Pendekatan ini penting selain untuk
menyeleksi strain-strain unggul secara genetis juga untuk pengklasmkasiannya. Kuo
dan Chak, (1996) menggunakan teknik Restriction Fragment Length Polymorphisms-

PCR

untuk mengidentifikasi galur-galur 8. thuringiensis yang mengandung gen cry

novel. Beberapa metode molekuler yang telah diterapkan khususnya terhadap B.

thuringiensis adalah analisis pola plasmid (Leredus, et al., 1982), penetapan sekuen
DNA oleh Kronstad dan Whiteley pada tahun 1986, dan analisis PCR (Carozzi, et a/,
1991). Pada penelitian ini, analisis keragaman genetik

C. bikmentans dilakukan

dengan teknik Amplifed Ribosomal DNA Restriction Analysis (ARDRA). Selain
karena sifatnya yang reproducible, juga relati cepat, murah dan sederhana.
Tujuan Penelitian
Penelitian ini dilaksanakan dengan tujuan untuk mengidentikasi Clostridum

bifementans yang diisolasi dari berbagai habiat, mengetahui keragaman genetik
sejumlah isolat Clostridium Mermentans berdasarkan Amplfled Ribosomal DNA

Restriction Analysis dan toksisitasnya terhadap larva nyamuk Aedes aegypti dan
Culex spp.

TINJAUAN PUSTAKA
Mikroorganisme Penghasil Bioinsektisida

lnsektisida mikrobial dapat diperoleh dari mikroorganisme yang memiliki daya
infeksi yang mematikan terhadap serangga target (Glick dan Pasternak, 1994).
Menurut Lacey dan Unden (1986), ada lima kelompok mikroorganisme yang dapat
digunakan sebagai bahan aktif insektisida mikroba, yaitu bakteri, virus, protozoa,
kapang, dan nematoda.
Pada awalnya bahan aktii insektisida yang diketahui dapat menyebabkan
penyakit dan kematian pada serangga adalah B. thuringiensis yang pertama kali
diisolasi oleh lshiwata pada tahun 1901 dari larva Bombyx mon yang sakit. Pada
tahun 1911, Berfiner menemukan bakteri serupa dari larva ngengat Mediterania,
Anagasta kuehnilla, di propinsi Thuringia Jerman, yang kemudian dinamai B.
thuringiensis (Dulmage, 1981). Pada tahun1927, Mattes mengisolasi kembali
Bacillus dari A. kuehnilla dan dua tahun kemudian, 1929, oleh Mathalnikov dan
Cholorine dinamakan 5. thuringiensis dan mereka menjadi pelopor bagi penggunaan
B.t. sebagai insektisida mikrobial yaitu untuk membasmi hama ngenget Gypsi
(Dubois dan Lewis, 1981). Selanjutnya diketahui bahwa penyebabkan patogenisitas
bakteri adalah protein kristal yang dihasilkan pada saat pembentukan spora atau
selama fase stasioner.
Karakteristik B.t. yang sangat spesifik terhadap serangga target mendorong
para peneliti untuk mencari galur-galur baru seiring dengan upaya untuk
mengklasifikasikannya. Beberapa metode yang digunakan untuk klasifikasi B.t.
adalah sebagai berikut :1) berdasarkan sifat morfologi dan biokimianya oleh Angus
dan Heimpel tahun 1958, 2) serologi kristal protein oleh Toumanoff dan Lewroller

tahun 1959, 3) spesifitas antigen flagelum oleh de Barjac dan Bonnefoi tahun 1962,
4) kerentanan terhadap antibiotik oleh Landen, Hesson dan Boman tahun 1981, 5)

pola plasmid oleh Lereclus dkk. tahun 1982, 6) penetapan sekuen DNA gen kristal
protein oleh Kroustad dan Whiteley tahun 1986, 7) aktiiitas insektisida oleh Krieg
dkk. tahun 1987, 8) analisis nukleotida oleh Hofte dan Whiteley tahun 1989
(disarikan dari Meryandini,l990 dan Darwis, 1995); dan analisis PCR oleh Coroui
dkk. pada tahun 1991. Hingga tahun 1994, dikenal lebih dari 30 subspesies B.t yang
terbagi kedalam 34 sub kelompok antigen-H (Udayasurian, et a/, 1994). Dan pada
tahun 1998 terdapat tidak kurang dari 100 gen cry yang berasal dari berbagai
spesies bakteri, kemudian Crickmore, et al., (1998) melakukan revisi nomenklatur
gen cry tersebut atas dasar homologi sekuen DNA dan membagi gen cry kedalam
22 kelas dan 2 gen cyt, dimana cbm71 (cryl6A) dan cbm72(cry17A) berubah
menjadi cryl6Aa dan cryl7Aa. lnformasi terkini yang saya peroleh bahwa sudah
terdapat 30 kelas gen cry.
Penggunaan B.t untuk kontrol spesies diptera baru dilakukan pada tahun
1977 sejak ditemukannya B. thuringiensis serovar israeknsis (Btr) dan spesies yang
sangat toksik B. sphaericus (Bsp) strain 1593 (Charles and LeRoux, 2000).
Berdasarkan pertimbangan ekologi dan perkembangan resistensi, program
skrining mikroorganisme baru yang potensial untuk pengendalian hama terus
dilakukan. Hingga tahun 1990 tak satupun catatan yang menunjukkan adanya
spesies bakteri diluar B.t. yang memiliki gen penyandi bioinsektisida (gen cry) dalam
genomnya.

Pada tahun 1990, Seleena dan Lee berhasil mengisolasi bakteri

anaerobik obligat dari sampel tanah hutan mangrove Malaysia yang aktif melawan
larva nyamuk dan lalat, kemudian diketahui sebagai

Clostridium bifennentans

subsp. malaysia (Cbm) berdasarkan antigen-H -nya (Seleena, et a/., 1997). Dengan

demikian C. bifermentans subsp. malaysia bukan hanya bakteri anaerobik obligat
pertama yang diketahui bersifat entomopatogenik, tetapi juga InefUpakan spesies
non B.t. pertama yang memiliki gen cry dalam genomnya (Barloy, et al., 1998.
Dalam waktu yang relatii singkat sejumlah bakteri entomopatogenik yang
membawa gen serupa-cry berhasil diidentifikasi seperti B. popilliae yang aktif
melawan Coleoptera (Zhang, et a/., 1997). C.b. subsp. paraiba yang aktif melawan
nyamuk, beberapa spesies Clostridium yang patogen terhadap manusia dan hewan
seperti

C. sonlellii dan C. septicum (Barloy, et a/., 1998), dan Brevibacillus

latemsponrs yang juga memiliki toksisitas tinggi terhadap nyamuk Ae. aegypti dan A.
stephensi (Charles and Le-Roux, 2000).
Selain bakteri, beberapa cendawan dari kelas Deuteromycetes yang
berpotensi sebagai agen pengendali populasi vector (entomopatogen) adalah
Beauveria, Culicinomyces, Metarhizium (Munif dan Mardiana, 1991). Cendawan
patogen umumnya melakukan penetrasi dengan menggunakan haustorium, yaitu
hifa infeksi yang berfungsi sebagai struktur penyerap nutrisi dan hidup dalam
jaringan inang.
Karakteristik C. bifermentans

Clostridium mempunyai banyak spesies yang berbeda. Beberapa spesies
seperti C. camis, C. histolitycum, dan C. tertium bersifat aerotoleran dan lainnya
anaerobik

obligat

(Smith,1975).

Dalam Bergey's

Manual of

Determinative

Bacteriology dinyatakan bahwa diantara spesies Clostridium, mungkin bersifat
sakarolitik, proteolitik, tidak tergolong kedalam keduanya atau bahkan bersifat
sakarolitik dan proteolitik. Akan tetapi umumnya mereka menunjukkan sifat katalase

negati. Kebanyakan spesies ini adalah kemoorganotropik, beberapa kemoautotropik
atau kemolitotropik; dan potensial memproduksi eksotoksin.
Organisme

ini biasanya ditemukan pada saluran pencemaan temak dan

manusia (Wang et a/., 1996), lapisan tanah dan sedimen laut (Smith, 1975), sedimen
danau, sungai dan rawa; spesimen klinik (Smith, 1975; Cowen and Steele, 1974),
serta habitat-habitat yang bersifat anaerob.
C. bifermentans adalah satu diantara spesies Clostridium yang telah
diketahui mengandung gen serupa-cry dalam genomnya (Barloy et a/., 1998).
Spesies ini memiliki aktivitas yang tinggi melawan berbagai serangga hama.
Contohnya adalah C. bifermentans subsp. malaysia dan C. b subsp. paraiba yang
aktif melawan larva nyamuk dan lalat (blackfly).
Pada mulanya C. bifermentans dianggap sebagai subspesies dari C. sordellii
karena adanya kemiripan sifat biokimiawi antara keduanya. Bahkan sejak ditemukan
oleh Tissier dan Martelty pada tahun 1902 telah menjadi subjek yang kontroversial
diantara para pakar bakteriologi mengenai hubungan taksonominya (Nishida et a/.,
1964). Pembedaan kedua spesies ini didasarkan atas kemampuan produksi urease
oleh C. sordellii (Nishida et a/., 1964; Shapton and Board, 1971), toksigenisitas, dan
potensi sporulasi (Nishida et a/., 1964 ),

dan kemampuan untuk mengaglutinasi

(Huang, et a/., 1965).
Organisme ini bisa dibedakan dari spesies lainnya berdasarkan morfologi
dan penampakan koloni (morphology and colonial appearance); bentuk, posisi, dan
produksi spora; serta karakteristik biokimiawi dan fisiologinya (Smith, 1975).
Penampakan koloni, bentuk sel dan posisi spora beberapa spesies Clostridum
ditunjukkan pada Tabel 1.

Tabel 1. Morfologi dan penampakan koloni beberapa spesies Clostridum
species

Spores

Bacilli

C. botulinus
C. perfringens
C. tetani

OCIS
OC

Normal
Large thick
Normal

C. novyi
C. septicum
C. fallax
C. sordellii
C. bifermentans
C. histolyticum
C. sporogenes
C. tedium
C. cochleariom
C. butyncum
C. nigrificans
C.themosacamlyticum

0s
0s
0s

RT

OC IS
OC I S

0s
0s
OT

OC

Large
Normal
Thick
Large thick
Large thick
Normal
Thin
Long thin
Thin
Normal
Normal
Normal

Haemo
lysis
+
+

+

+

+
-

+

+

-

+

-

-

Colony appearance on blood
agar
Large,fimbriate, transparent
Flat, circular, regular
Small , grey, fimbriate,
translucent
Flat, spreading, transparent
Irreguler, transparent
Large, irregular, opaque
Small, crenated
Small, circular, transprant
Small, regular, transprant
Medusa head,fimbriate, opaque
Small, regular, transprant
Circular, transprant
White, circular, irregular
Black
Granular, feather edges

Spores : 0, oval; R, round; S, subterminal; C, central; T, terminal
Lebih lanjut dikatakan oleh Smith, (1975) bahwa spora C. bifermentans
berbentuk oval, terletak pada posisi subterminal atau sentral dan diproduksi secara
berlimpah serta seringkali berantai. Penampakan koloni C. bifermentans pada media
agar darah adalah kecil, regular dan transparan (Willis and Hobbs, 1959). Akan
tetapi Smith (1 975) menyebutkan bahwa diameter koloni C. bifennentans berkisar
antara 2

-

3 mm, tidak terlalu konvek, dan agak tidak teratur. Wama koloni

tergantung pada umur dan tahap sporulasi. Koloni yang masih muda terdiri dari set
sel nonspora atau sel vegetatif, bersifat translusen dan bennrama buram, sedangkan
koloni yang lebih tua berbentuk opaque dan berwama seperti porselin putih, terdiri
dari sel yang mengandung spora.
Beberapa karakter biokimiawi dari spesies ini adalah dapat memfermentasi
fruktosa,

glukosa,

maltosa,

mannosa,

ribosa,

dan

sorbitol;

tidak

dapat

menfermentasi laktosa, arabinosa, selulobiosa, inositol, manitol, adonitol, amigdalin,

dulcitol, eritritol, inulin, xilosa, ramnosa, melibisa, rafinosa, salisin, sorbosa,
melezitosa, sukrosa dan trehalosa (Seleena, et al., 1997).
Gelatin dihidrolisis, eskulin dan pati tidak dapat dihidrolisis, produksi indol,
dan tidak dapat mereduksi nitrat (Seleena, et a/., 1997), kasein dan daging didigesti;
lesitinase diproduksi; katalase, urease dan lipase tidak diproduksi (Smith, 1975).
Sedangkan produk akhir fermentasi meliputi asetat, isobutirat, isovalerat, asam
isokaproat, dengan atau tanpa sejumlah kecil asam butirat dan ethyl, propil, dan
isobutyl alcohol (Levett, 1991; Buchanan and Gibbons, 1974).
Spora C. bifermentans akan mengalami germinasi bila terdapat L-alanin dan
ion sodium. L-alanin disubstitusikan dengan kombinasi fenilalanin, arginin, laktat,
serin, dan glisin. Seperti halnya bakteri pembentuk spora lainnya, gerrninasi spora
dapat distimulasi melalui aktivasi dengan pemanasan mendadak (heat shock) pada
85

OC

selama 10 menit (Smith, 1975). Faktor pertumbuhan yang dibutuhkan oleh

organisme ini adalah biotin, asam nicotinat atau amida, asam pantotenat, dan
piridoksal atau piridoksamin.
Nilai Bioekonomis C. bifermentans

Umum diketahui bahwa genus Clostnidum merupakan kelompok bakteri
paling penting sebagai agen penyebab penyakit pada manusia dan hewan. Sebagai
contoh adalah

C.

botulinum yang

menyebabkan kerusakan syaraf

menghasilkan neurotoksin yang dapat

irreversible atau kematian, C. perffingens

menimbulkan penyaki gas gangrene dan enterotoksemia baik pada manusia
maupun ternak, dan C. chauvoei yang mengakibatkan kerugian ekonomi yang
cukup besar bagi peternak karena penyaki blackleg yang menimpa ternak besar
(Smith, 1975).

Dalam industri bioteknologi, pemanfaatan Clostridium sebagai pabrik biologis
sangatlah luas. Bahkan Barloy, et a/., (1996) mengutif Moms, (1993) mengatakan
bahwa lebih 90 % pekerjaan-pekerjaan yang melibatkan genus Clostridium ditujukan
untuk bioindustri dan aspek-aspek medis. Sejumlah produk penting seperti asam
butirat,

aseton dan

butanol dapat

diproduksi oleh

C.

bifennentans,

C.

asetobutylicum, C. butyricum dan C. pasteurianum. C. kluyveri memproduksi etanol
dan asetat. Spesies yang lainnya seperti C. aceticum dan C. thennoaceticum dapat
membentuk asetat dari C02dan H20.
C. bifermentans yang tergolong kedalam non patogenik Clostridia diketahui
mampu melakukan biotransformasi atau bioremediasi senyawa nitroaromatik seperti
2,4,6trinitrotoluena (TNT) dan turunannya melalui mekanisme hidroliik (Lewis, et
a/., 1996). Lebih lanjut Sembries dan Crawford, (1997) menyatakan bahwa spora
isolat C. bifennentans KMR-1 dapat digunakan sebagai inokulan untuk bioremediasi
tanah dan air yang terkontaminasi TNT dan 1,3,5-triaza-1,3,5trinitrosikloheksana
(RDX).
Penggunaan C. Mermentans makin luas sejak ditemukannya suatu strain
baru, C.6. subsp malaysia,

yang dapat berperan sebagai kontrol biologi untuk

insekta. Strain ini adalah strain bakteri anaerobik pertama yang diidentiikasi memiliki
toksisitas terhadap larva nyamuk, dimana aktivitas larvasidalnya sangat tinggi
terhadap spesies Anopheles dibandingkan terhadap Aedes aegypti maupun Culex
pipiens (Barloy et a/., 1996). Berbeda halnya dengan C.b. subsp malaysia, C.b.
subsp paraiba,

justru lebih toksik terhadap Culex quinquesfaciatus daripada

Anopheles maculatus dan Aedes aesypti,

ldentifikasi dengan Antibodi Fluoresen

Teknik imunologi memegang peranan penting dalam bakteriologi modern.
Penerapan teknik imunologi terutama dalam mikrobiologi medik, meliputi diagnosa
penyakit, epidemiological typing, dan investgasi dasar mekanisme patogenik.
Eksploitasi metode-metode imunologi diarahkan untuk deteksi, identiikasi

dan

quantiikasi bakteri, komponen bakteri ataupun produknya (Poxton, 1991).
ldentikasi

Clostridia

dengan

teknik

imunologi

telah

menunjukkan

keberhasilan, mulai dari penggunaan reaksi Nagler untuk identikasi spesifik C.
perfringens pada Egg Yolk agar (EYA) sampai identifikasi definitive C. tetani dan C.
botulinum melalui test netralisasi toksin pada tikus, disamping itu metode antibodi
imunofluoresen telah dikembangkan untuk Clostridia tertentu.
Metode antibodi imunofluoresen merupakan metode yang sederhana dan
cepat untuk mengidentiikasi bakteri sampai pada tingkat spesies. Metode ini
didasarkan atas adanya fluoresensi bakteri target sebagai akibat dari terbentuknya
konjugat antara antibodi terlabel dengan komponen permukaan

bakteri, seperti

flagella, fili, lipopolisakarida, kapsul, dan protein membran luar. Fluoresensi ini
dapat diamati melalui mikroskop fluoresen.
Beberapa

antigen yang dapat digunakan untuk tujuan identifikasi meliputi

komponen permukaan sel seperti asam teichoic (secondary wall carbohydrate),
asam lipoteichoic (membrane carbohydrate), protein membran, kapsul dan
eksopolisakarida lain, peptidoglikan, flagella, dan produk ekstraseluler (exotoxins
dan exoenzyme) (Poxton, 1991)
Teknik antibodi fluoresen meliputi beberapa tahapan pekerjaan yaitu
preparasi antigen; produksi antisera dan pemurnian imunoglobulin; pelabelan

antibodi; dan identikasi bakteri (Poxton, 1991). Pada teknik ini, antigen yang
digunakan adalah sel-sel bakteri yang telah dimatikan dengan pemanasan pada air
mendidih (heat kilo.
Metode konvensional untuk produksi antibodi adalah dengan

cara

menginjeksikan antigen kedalam tubuh hewan percobaan yang imuno kompeten
dalam laboratorium untuk membangkitkan tanggapan kekebalan (Johnstone and
Thorpe, 1982). Setelah pengambilan darah, serum seharusnya sesegera mungkin
dipisahkan dari sel, sebab bila sel lisis akan melepaskan kontaminan protein
termasuk enzim proteolitik yang dapat mendegradasi antibodi.
Antibodi termasuk kedalam kelompok protein yang disebut sebagai
immunoglobulin. Mereka memiliki s t ~ k t yang
~ r umum dengan dua buah rantai yaitu
dua buah rantai berat (heavy chain) dan rantai ringan (light chain). lsolasi
imunoglobulin G yang biasa dilakukan adalah kombinasi antara presipitasi dengan
penambahan sodium atau ammonium sulfat dan dilanjutkan dengan kromatografi
kolom (Johnstone and Thorpe, 1982). Untuk membuat antibodi fluoresen (FAT)
maka

imunoglobulin yang telah murni dikonjugasikan dengan fluorokrom.

Fluorokrom yang umum digunakan adalah fluorescein atau tetrametilrodamin
isothiosianat, selain karena mereka dapat bereaksi secara langsung dengan
imunoglobulin, menghasilkan konjugat yang stabil dan juga memberikan sinar
fluoresensi yang jelas.
Analisis Keragaman Genetik dengan ARDRA
Metode-metode molekuler untuk identikasi dan pencirian mikroba dapat
dilakukan berdasarkan pendekatan asam nukleat maupun protein. Analisis profit
asam

nukleat

meliputi sidikjari plasmid (plasmid fingerprinting), restriction

endonuklease

(REA),

restriction

fragment

length

polymorpClisms

(RFLP),

macrorestn'cfion fragment length polymorphisms (MFLP) yang melibatkan pulsed
field gel electrophoresis (PFGE), dan amplifikasi asam nukleat (Suwanto, 2000).
Pemilihan metode analisis sangat tergantung dari cakupan tujuan dan derajat
diskriminasi

yang diinginkan, sebab menurut Suwanto, (2000) tak satupun dari

teknik tersebut menampilkan hasil yang keliru, masing-masing menyediakan cara
yang berbeda dalam memandang persoalan yang sama.
Pengetahuan mengenai keragaman genetik

mikroba pada tahun-tahun

belakangan ini meningkat secara drastis, terutama setelah diperkenalkan teknik
amplifikasi PCR gen rRNA

-

RFLP atau amplified ribosomal DNA resWfion

analysis. Karakterisasi bakteri yang didasarkan pada amplifikasi gen 16s rRNA
(small subunit rRNA) dengan teknik PCR telah digunakan secara luas untuk studi
mengenai evolusi, taksonomi dan ekologi (Nubel, et a/., 1996).

lnformasi sekuen

16s ribosomal DNA (rDNA) dapat digunakan untuk menganalisis filogenetik bakteri
yang belum bisa dikulturkan dari beragam lingkungan (Tanner, et a/., 1998)
Nusslein dan Tiedje, (1998) memanfaatkan metode ARDRA untuk menduga
keragaman dan mengkarakterisasi komunitas bakteri tanah Kepulauan Hawai
berdasarkan komposisi basa G + C.
Teknik ampNed ribosomal DNA mstn'ction analysis (ARDRA)

pada

dasarnya merupakan turunan dari PCR-RFLP, yaitu amplifikasi sekuen dari gen
16s-rDNA (gen penyandi 16s RNA ribosom) dengan menggunakan primer universal
untuk bakteri atau prokariot. Hasil amplifikasi PCR ini kemudian dipotong dengan
enzim endonuklease restriksi yang memotong sering. Menurut Suwanto, (1995)
adanya perbedaan baik dalam jumlah fragmen maupun ukuran profil pita DNA

sebagai hasil pemotongan dengan enzim restriksi tertentu menunjukkan keragaman
genetik.
Enzim endonuklease restriksi merupakan enzim yang memotong DNA pada
situs pengenalan 4 atau 6 pasang basa yang spesifik yang bersifat poliandrom. Oleh
karena sekuen pengenalan dari endonuklease restriksi adalah terletak secara acak
dalam molekul 16s rDNA dan sekuen 16s rDNA berbeda-beda, maka pola yang
dihasilkan dari pemotongan akan bersifat unik.
Dasar penggunaan gen penyandi ribosomal RNA sebagai indikator universal
dalam analisis keragaman genetik adalah karena molekul rRNA sangat khas,
tersusun oleh daerah-daerah yang terkonservasi yang berubah relati lambat secara
evolusi dan daerah-daerah yang sekuennya cukup bervariasi. Perbandingan sekuen
yang terkonservasi ini sangat berguna untuk konstruksi pohon filogenetik universal,
sebaliknya sekuen pada 16s rRNA yang hipervariabel banyak digunakan untuk
melacak keragaman dan menempatkan galur-galur dalam satu spesies. Sifat rRNA
yang sangat terkonservasi memungkinkan untuk mensintesis primer universal untuk
proses PCR yang mampu melekat pada sekuen terlestari

dari ketiga domain

filogenetik Archaea, Bakteria dan Eukarya (Amann, et a/., 1994).
Pada laboratorium Biologi Molekuler SEAMEO-BIOTROP, teknik ARDRA
secara rutin digunakan untuk menyeleksi strain-strain yang unik diantara sejumlah
isolat yang belum disekuensing dan juga untuk menganalisis hubungan kekerabatan
diantara komunitas mikroba yang diisolasi langsung dari lingkungan.
Biologi Aedes aegypti dan Culex spp

Culex dan Aedes dua dari lebih dari 30 genera pada sub famili Culicinae
(Robert dan Jonavy, 1996). Famili ini telah dikenal dengan baik, keberadaannya

sangat luas dan berfimpah, serta termasuk group yang sangat penting mengingat
aksinya yang dapat merusak kesejahteraan dan kesehatan manusia. Tahapan
larvanya ada di dalam air dan yang dewasa dapat dikenali dari tulang daun sayap,
sisik-sisik sepangjang pembuluh darah sayap dan proboskosnya yang panjang
(Borror et a/., 1992).
Spesies Aedes memiliki aktiiitas yang aneh mereka dapat beraksi harian
atau tidak tentu, berbeda halnya dengan pengigit malam Culex spp. Mereka
menyimpan telumya kedalam air yang kotor, lumpur atau tanah yang terkena banjir.
Kebanyakan spesies Aedes menjadi vektor dari berrnacam-macam penyakit. Aedes

aegypti, sinyamuk kuning penyebab demam berdarah, adalah salah satu yang
sangat penting dan memiliki pengaruh yang sangat luas. Nyamuk ini merupakan
spesies yang berasal dari keturunan nyamuk dari negara Sylvatii, tepi ketika
bergabung dengan habitat manusia, nyamuk tersebut melahirkan keturunan secara
bebas didalam kontainer dan unit penyimpenan air lainnya (Robert dan Janovy,
1996).
Siklus hidup nyamuk Aedes aegypti adalah sebagai berikut : Telur Aedes
berukurab panjang 1 mm dan berdiameter 0.25 mm. Ada dua rangsangan yang
mempercepat proses penetasan telur yaitu pencelupan telur kedalam air dan
rendahnya tekanan. Air mendidih, hampa udara atau adanya bakteri (berasosiasi
dengan makanan larva) sering digunakan untuk menstimulasi proses penetasan.
Larva nyamuk sangat tepat dalam air, jika habitatnya mengering maka larva akan
mati. Larva akan berturut-turut berganti bulu untuk mencapai tingkat pupa. Larva
kemudian berkembang dari sekitar 1,5 mm sampai 15 mm panjangnya setelah tiga
kali berganti bulu. Ukuran maksimum dapat berubah-ubah sekitar 10 mm sampai
lebih dari 20 mm terganjung zat makanan dan spesies. Dalam kondisi optimum

tahapan larva dapat lebih pendek dari 4 hari. Dalam kondisi kelaparan atau
temperatur yang kurang optimum, larva bisa berumur satu bulan dalam keadaan
tidak akti. Makanan larva berupa sisa organik, bakteri, jamur dan segala sesuatu
yang dikumpukan dari dasar habitatnya di air (Munstermann, 1997).
Setelah empat kali berganti stadium, timbul bentuk pupa koma. Pada tahap
pupa dapat terjadi perubahan metabolisme dan struktural tambahan secara biasa.
Perubahan ini memungkinkan yang dewasa naik untuk bertahan hidup dalam
lingkungan global. Perototan, sayapsayap, sisik-sisik, bagian-bagian mulut dan
bagian dalan serta elemen struktural permukaan lainnya harus terbentuk sebelum
tahap ini selesai. Periode ini berlangsung 2-3 hari, lalu pupa mengapung diantara
air-udara dan yang dewasa naik ke permukaan air. Dipermulaan antara 24-48 jam
kehidupan si dewasa, perkembangan internal terus berlanjut untuk menyesuaikan
perubahan benuk ke kehidupan global.

Culex betina berbentuk bulat disekitar perutnya, sungut mereka lebih pendek
dari pada hidungnya. Mereka tidak mempunyai spikular dada atau post spikular,
larva berbentuk panjang dan ramping. Kebanyakan inang Culex spp adalah burung
akan tetapi tidak mempunyai inang yang spesiftk.
Dalam catatan ilmiahnya, Seleena dan Lee (1997) melaporkan adanya
perbedaan toksisitas antara C.b. subsp. Malaysia dengan C.b. paraiba terhadap
larva C. quinquesfaciatus, Aedes aegypti dan Anopheles maculates. C.b. paraiba
cukup toksik terhadap Aedes aegypti, C. quinquesfaciatus dan An. Maculates, akan
tetapi C.b. subsp. Malaysia sangat toksik terhadap Aedes aegypti dan tidak toksik
terhadap C. quinquesfaciatus.

lnteraksi antara Toksin dengan Serangga
Pada B. thuringensis telah diketahui dengan baik terdapatnya hubungan
yang sangat spesifik antara kristal protein yang dihasilkan dengan larva serangga
sasarannya yang rentan. Akan tetapi pada C. bifementans belum ada laporan yang
mengungkapkannya. Protoksin yang dihasilkan oleh C.6 dan 6endotoksin B.t.
diaktivasi oleh suasana alkali usus serangga.
Terdapat perbedaan antara faktor toksik B.t dengan C. bifermentans yaitu
C.6 tidak memproduksi protein kristal atau parasporal bodi sebagaimana halnya
pada B.t, B. sphaericus dan B. laterosporus. Toksisitas protein C.6 menurun dengan
cepat atau mengalami inaktivasi oleh perlakuan fisik atau kimiawi (Charles and
LeRoux, 2000) seperti filtrasi, sonikasi, freezing-thawing atau oleh protease yang
dilepaskan pada saat sel lisis (Barloy, et al., 1996).
Semua protein toksin yang termasuk kedalam famili Cry terdiri dari tiga
domain, yaitu domain I, II dan Ill. (Schnepf, et al., 1998; Aronson, 2000). Domain I
tersusun atas seberkas (bundle) a-heliks antiparalel yang berjumlah tujuh yang
kebanyakan terlibat dalam pembentukan saluran ion (Aronson, 2000). Domain II
memiliki tiga buah @sheet antiparalel yang bergabung membentuk suatu tipe "kunci
Yunani atau Greek key". Sedangkan domain Ill terdiri dari dua @sheet antiparalel
yang membentuk sebuah @sandwich dengan tipologi jelly roll (Schnepf, et a/.,
1998).
Devidas, (1992) menyatakan bahwa kristal protein yang termakan oleh
serangga yang rentan akan terlawt menjadi protoksin oleh alkali usus tengah larva.
Proses pelarutan ini bervariasi diantara genus, spesies dan bahkan mungkin
stadium perkembangan serangga. Selanjutnya, hidrolisis protoksin oleh protease

alkali di usus akan melepaskan sub unit insektisidal. Kerja protease tersebut
menyebabkan protoksin kehilangan fragmen struktur ujung C dan membentuk
fragmen aktii yang disebut toksin. Toksin dapat dibagi tiga daerah struktural, yaitu 1)
area ujung N yang merupakan domain toksik, terdiri dari beberapa area hidrofobik
yang terlestari, dan mengandung a-heliks yang menyebabkan pembentukan pori
pada usus serangga, 2) area ujung C yang terlestari, dan 3) area variabel yang
terletak diantara dua area tersebut.
Lebih lanjut Frankenhuyzen et a/., (1993) menyebutkan bahwa ada beberapa
faktor yang menentukan spesifitas inang yang meliputi berbagai faktor struktural dan
proses yang

memungkinkan toksin berikatan dengan reseptor,

kecepatan

pencemaan, pelarutan dan stabilitas toksin dalam usus. Dengan demikian protein
toksin atau 6-endotoksin yang berbeda akan mempunyai aktivitas insektisidal yang
berbeda pula.
Toksin pada umumnya mempunyai daya ikat dengan membran sel usus
serangga. Pada kondisi ini toksin akan berasosiasi dengan reseptor tertentu pada
epitelium usus. Setelah terikat pada epitelium usus serangga, toksin membentuk pori
berukuran kecil (0,51,0 nm) pada membran. Toksin yang aktii selanjutnya
mengaktiian aliran ion K dan air sehingga mengganggu keseimbangan osmose
pada akhimya epitelium usus membengkak, mikropilus hilang dan akhimya sel
mengalami lisis. Keadaan ini menyebabkan kematian sel dan selanjutnya kematian
serangga (Hofle and Whiteley, 1989; Aronson, 2000).
Pada B. thuringensis subsp. kurstaki (galur yang toksik terhadap lepidoptera)
diketahui

bahwa

protein

toksik

ini

mempunyai

afinitas

terhadap

N-

asetilgalaktosamina dan diduga bahwa sel saluran pencernaan akan mengalami lisis

karena pengikatan tersebut. Setelah toksin terikat pada reseptor membran plasma,
akan terbentuk pori-pori kecil atau secara tak langsung mengganggu molekulmolekul membran plasma. Toksin merusak transport ion dan glukosa sehingga
mendorong hilangnya ATP (Ellar et al., 1987). Gejala gangguan oleh toksin adalah
stimulasi pengambilan glukosa oleh sel epitelium saluran pencernaan, kemudian sel
epitelium mengalami lisis, otot saluran pencemaan dan bagian mulut lumpuh,
kemampuan makan berhenti dan kematian akan muncul 30 menit hingga 3 hari
setelah tosin terrnakan (Lynch dan Hobbi, 1988).
Reaksi yang

spesifik antara protease dengan macam toksin dapat

menyebabkan spektrum hama yang sempit sehingga spesifitas insektisida ini sangat
tinggi. Spektrum hama yang sempit misalnya pada C.b. subsp. malaysia (toksin cbm
71) yang sangat toksik terhadap Blatella gennanica, akan tetapi C.b. subsp. paraiba

tidak menunjukkan produksi blatisidal (Seleena, Lee and Lecadet, 1997). Analisis
resistensi pada skala laboratorium maupun dilapangan menunjukkan telah terjadinya
resistensi pada sejumlah hama target terhadap satu atau lebih toksin B.t (Schnepf,

et al., 1998). Peningkatan keanekaragaman gen cry yang memiliki struktur toksin
dan mekanisme kerja yang berbeda menjadi solusi yang baik untuk memecahkan
masalah resistensi hama (Barloy, et al., 1996).

BAHAN DAN METODE
Tempat dan Waktu Penelitian
Penelitian ini dilakukan di Laboratorium Bakteriologi Anaerob Balai Penelitian
Veteriner Bogor, Laboratorium Mikrobiologi FMlPA IPB dan Laboratorium Biologi
Molekuler South East Regional Center for Tropical Biology (SEAMEO-BIOTROP),
Bogor. Penelitian ini berlangsung mulai bulan Februari-Oktober 2001.
Bahan dan Alat
Bakteri yang digunakan adalah 151 isolat Clostridium yang diperoleh dari
kegiatan penelitian sebelumnya. Selain itu disertakan pula C. bifermentans
ATCC638 koleksi dari Laboratorium Biologi Molekuler SEAMEO-BIOTROP dan 5.
thuringiensis var israelensis (Vectobac) koleksi Laboratorium Teknologi Bioproses
PPB-IPB, sebagai kontrol. Keterangan mengenai asal dan jenis isolat dapat dilihat
pada Tabel Lampiran 2.
Bahan-bahan kimia yang digunakan dalam penelitian ini adalah akuades,
media pertumbuhan yaitu Robertson Cooked Meat Medium (RCMM), Tripthone
Yeast Extract Glucose (TYG), dan medium agar darah (5%), NaCl fisologis, NaOH,
reagen Kovac's, CuS04, merah fenol, proteinase-k, N-CetyCN,N,N-TrimethylAmmonium Bromide (CTAB), Sodium Dodesyl Sulphate (SDS) lo%, fenol,
kloroform, isoamil alkohol, isopropanol, etanol (absolut dan 70%), agarosa, buffer
TrisEDTA (TE),

enzim Tag DNA Polimerase, loading buffer, ethidium bromida,

enzim restriksi Rsal, Haelll dan Sau3Al (Fermentas) beserta bufemya, marker
molekuler 1-Kb DNA Ladder (Biolabs), ~ e n e ~ u l 50
e rbp
~~
DNA Ladder (PharmaciaBiotech).

Dua spesies larva nyamuk yang akan dipakai yaitu Aedes aegypti dan Culex
spp. Sumber larva diperoleh dari telur yang di koleksi Laboratorium Entomologi
Kesehatan FKH, IPB.
Alat-alat yang digunakan antara lain yaitu botol Bijou, perangkat anaerobik
jar (Bio-Rad, Richmond, CA), mesin PCR ( ~ e n e ~ m pPCR
@ System 2400, PerkinElmer, Branchburg, New Jersey),
England),

Gene Quant (Pharmacia-Biotech, Cambridge,

piranti elektroforesis (Bio-Rad, Richmond, CA),

UV transilluminator

(UVB-36 ULTRALUM, Carson, California), Gel Doc 1000 (Bio-Rad, Richmond, CA),
mikroskop UV fluoresen, dan mikroskop fase kontras.

Metode Penelitian
A. ldentifikasi C. bifermentans
Pewarnaan Spora. Koloni yang diwrigai sebagai C. bflermentans diuji
dengan pewamaan endospora menggunakan metode Schaeffer-Fulton. Spesimen
dikering udarakan diatas kaca objek, difiksasi panas, ditutup dengan kertas serap
yang telah dijenuhkan dengan zat wama hijau malakit 0.5% (wtv), dan ditaruh diatas
air mendidih selama 5 menit. Kaca objek tersebut diolesi dengan aquades, dan
olesan diwamai dengan pewama tandingan yaitu safranin selama 30 detik, lalu
diwci dengan air, dikeringkan dan diimati dibawah mikroskop dengan perbesaran
1oox.
Uji Katalase. Pada umumnya Clostridum sp. menunjukkan katalase negatif.

Uji katalase dapat dilakukan dengan pemberian tetes 3% H202pada koloni bakteri.
Terbentuknya gas pada permukaan cawan menunjukkan terjadinya reaksi katalase.
Uji Blacking Media. Genus Clostridium dapat identikasi dari kemampuan
mereka membentuk wama hitam (blacking) pada Differential Reinforced Clost~iclal

Medium (DRCM). lnokulum ditumbuhkan pada DRCM dan diinkubasi selama 2 hari
pada suhu 37°C.
Uji Fermentasi Gula. Uji fermentasi glukosa, laktosa, maltosa, fruktosa,
sukrosa dan salisin dilakukan dalam tabung ulir yang mengandung RCMM dengan
memasukkan

keenam gula tersebut sebagai sumber karbohidratnya. lnkubasi

dilakukan dalam anaerobic jar pada suhu 37 OC selama 48. lndikator yang dgunakan
ialah merah fenol.
Uji Indol. Sebanyak 100 pl biakan dalam RCMM dimasukkan kedalam kaldu
tripton 1% dalam tabung ulir dan diinkubasi secara anaerob selama 48 jam pada
suhu 37 OC. Adanya indol dapat diketahui dengan menggunakan beberapa tetes
reagen Kovac's; uji positii ditunjukkan oleh terbentuknya lapisan berwama merah
diatas biakan.
Uji Hidrolisis Pati dan Gelatin. Hidrolisis pati dan gelatin dilakukan dengan
memasukkan soluble pati 1% atau gelatin 0.4% dalam Nutrien Agar. Terjadinya
hidrolisis pati ditandai dengan adanya zona bening disekiiar koloni setelah
penambahan Lugol's iodine. Hidrolisis gelatin ditandai dengan pemberian indikator
HgCl 15% (wlv) dalam 1 M HCI.
Uji Lesitinase dan Lipase. Uji keberadaan lesitinase dan lipase dilakukan
dengan mentotolkan isolat pada medium Egg Yolk Agar. Adanya lesitinase ditandai
dengan terbentuknya presipitat yang melewati lebar koloni. Adanya lipase ditandai
oleh adanya lapisan mengkilap pada permukaan koloni. Kepastian adanya lipase
dilakukan dengan meneteskan larutan CuS04 jenuh pada areal sekitar koloni dan
adanya wama hijau biru.

Uji Hidrolisis

Urea.

Uji hidrolisis urea dilakukan dalam

medium

Christensen's yang mengandung 20 % urea dan 0.2% merah fenol. Perubahan
merah fenol dari kuning (pH 6,8) menjadi merah keunguan (pH 8,1 atau lebih)
menunjukkan terjadinya hidrolisis urea menjadi amoniak.

Uji Proteolitik. lsolat yang diduga C. bifementans ditumbuhkan pada
medium Skim Milk Agar yang mengandung 2% susu skim (Dancow, Indonesia), 2 %
Bacto agar, 0.5 % NaCl dan 0.5 % ekstrak khamir. lnkubasi dilakukan secara
anaerobik pada suhu 37' C, lalu diukur indeks proteolitiknya.
B. ldentifikasi dengan FAT (FluoresceinAntibody Technique)

Pembuatan

Antigen C. bifennenfans.

C. bifermentans ATCC638

dibiakkan pada lempeng Agar Darah dan diinkubasi pada suhu 37 OC selama 48
jam. Koloni tunggal yang tumbuh diambil dan diinokulasikan dalam media p