Alur Penelitian Cara Kerja

tabung, penggaris, erlenmeyer, kamera, baki, autoclave, alat tulis, label, laminar air flow, inkubator.

3.4.2 Bahan

Bahan yang digunakan pada penelitian ini, antara lain ekstrak daun sirih hijau, agar darah, pelarut etanol 96, aquades steril, thioglikolat cair, larutan standar 0,5 Mc Farland, biakan bakteri Streptococcus pyogenes, cakram uji antibiotik eritromisin, cakram uji kosong.

3.5 Alur Penelitian

Bagan 3.1 Alur penelitian Ekstrak Daun Sirih Hijau Konsentrasi 25 Konsentrasi 50 Konsentrasi 75 Konsentrasi 100 Kontrol + Eritromisin Kontrol - Etanol 96 Bakteri Streptococcus pyogenes pada agar darah Zona Hambat Analisis Statistik Determinasi di LIPI Bogor Ekstraksi di BALITRO Bogor Perendaman blank disc

3.6 Cara Kerja

3.6.1 Sterilisasi Alat dan Bahan

Seluruh alat yang akan digunakan pada penelitian ini dicuci bersih, dikeringkan dan dibungkus dengan kertas kemudian disterilisasi di dalam autoclave selama 30 menit pada suhu 121˚C dan tekanan 1,5 atm.

3.6.2 Persiapan dan Determinasi Daun Sirih Hijau

Daun sirih hijau yang dibeli di pasar Ciputat sebanyak 1000 g. Kemudian dilakukan determinasi di LIPI Bogor yang bertujuan untuk memastikan kebenaran dari tanaman yang digunakan. Determinasi tanaman sirih hijau dilakukan dengan cara mencocokkan ciri-ciri morfologi yang ada pada tanaman sirih terhadap kepustakaan dan dibuktikan bidang Botani Pusat Penelitian Biologi LIPI Bogor.

3.6.3 Pembuatan Ekstrak Daun Sirih Hijau

Metode yang digunakan untuk mengekstrak daun sirih hijau Piper betle L. adalah metode maserasi. Pada metode maserasi ini menggunakan pelarut etanol 96. Sebanyak 1000 g daun sirih hijau dicuci bersih, selanjutnya dikeringkan dalam oven pada suhu 40˚C. Kemudian dihaluskan hingga menjadi serbuk kering. Serbuk kering direndam dalam pelarut etanol 96 selama 3x24 jam. Kemudian diambil filtratnya dengan penyaringan. Maserasi dilakukan dengan pengadukan sebanyak 12 kali selama 15 menit dengan tenggang waktu antar pengadukan selama 5 menit. Kemudian dilakukan penyaringan dengan corong dan kertas saring untuk memisahkan filtrat dari ampas. Hasil saringan kemudian diuapkan dengan rotary vacuum evaporator, sehingga didapatkan 36,5 g ekstrak kental yang bebas dari pelarut.

3.6.4 Pembuatan Stok Variabel Konsentrasi

Stok konsentrasi ekstrak daun sirih hijau yang divariasikan dengan menggunakan pelarut etanol 96 yaitu 25, 50, 75, dan 100 . Kontrol negatif yang digunakan adalah pelarut etanol 96 dan kontrol positif yang digunakan adalah antibiotik eritromisin yang merupakan antibiotik golongan makrolid yang dapat menghambat sintesis protein pada bakteri. Sehingga seluruhnya berjumlah 6 variabel. Penelitian ini dikerjakan secara triplo. Stok variabel konsentrasi yang dituangkan dalam 5 cawan petri yang berbeda diberi cakram uji kosong 1 cawan petri berisi 3 cakram uji kosong yang direndam selama 10-15 menit.

3.6.5 Pembuatan Stok bakteri

Pembuatan stok bakteri dilakukan untuk memperbanyak bakteri dengan cara menginokulasikan 1 ose biakan bakteri Streptococcus pyogenes ke dalam agar darah, kemudian diinkubasi pada suhu 37˚C selama 24 jam didalam inkubator.

3.6.6 Tahap Pengujian

Bakteri diencerkan dengan mencampurkan 1 ose bakteri Streptococcus pyogenes kedalam tabung reaksi yang berisi thioglikolat cair. Kemudian dihomogenkan dengan menggunakan vortex dan dibandingkan kekeruhannya dengan larutan standar 0,5 Mc Farland. Suspensi bakteri Streptococcus pyogenes kemudian dioleskan pada agar darah menggunakan kapas lidi steril. Cakram uji kosong direndam didalam masing-masing stok konsentrasi ekstrak daun sirih hijau selama 15-30 menit, setelah itu cakram dibiarkan kering. Cakram uji kosong yang telah direndam dalam berbagai konsentrasi ekstrak daun sirih hijau dan cakram uji antibiotik eritromisin kemudian diletakkan di atas permukaan agar darah secara steril di laminar air flow. Kemudian agar darah tersebut diinkubasi dalam inkubator pada suhu 37˚C selama 24 jam. Setelah 24 jam, diukur diameter zona terang clear zone yang terbentuk menggunakan penggaris.

3.7 Analisis Data