Karakterisasi Protease Escherichia coli DH5a Rekombinan Hasil Kloning dari DNA Tanah Black Water Ecosystem Kalimantan
ｾＯｲＨＧＦ＠
°Y-'J Il)
YIAi
SKRIPSI
KARAKTERISASI PROTEASE Escherichia coli DH5a
REKOMBINAN HASll KlONING DARt DNA TANAH
BLACK WATER ECOSYSTEM KALIMANTAN
OlEH:
PURNAMA SARI
F02495100
1999
JURMSAN TEKNOlOGI PANGAN DAN GIZI
FAKUl TAS TEKNOlOGI PERTANIAN
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
Purnama Sari. F02495I 00. Karakterisasi Protease Escherichia coli DH5a
Rekombinan Hasil Kloning dari DNA Tanah Black Water Ecosystem Kalimantan. Di
bawah Bimbingan Maggy Thenawijaya Suhartono.
RlNGKASAN
Kondisi lingkungan non fisiologis sering ditemui dalam industri bioteknologi.
Kondisi non fisiologis ini seng'lja dibuat untuk meningkatkan laju proses produksi
dan pemul'nian produk yang sering kali tidak menguntungkan untuk pertumbuhan
mikroorganisme maupun aktivitas enzim yang terlibat. Karena itu pencarian bakteri
dan enzim yan!!. tahan dalam suasana non fisiologis merupakan cara yang paling
masuk akal dan memiliki aspek ekonomis yang besar dalam industri bioteknologi.
Eksplorasi dan isolasi bakteri yang ada dalam suatu ekosistem alallli bukan
merupakan hal yang mudah. Lebih kurang 99% bakteri belum dapat ditumbuhkan
deilgan metode konvensional (Alexander, 1978). Sehingga pendekatan teknik biologi
molekuler merupakan alternatif yang sangat bermanfaat untuk mengeksplorasi
bakteri-bakteri yang belum bisa ditumbuhkan tersebut.
Pendekatan biologi molekuler terse but dengan menggunakan teknik DNA
rekombinan, yaitu dengan cara mengklonkan suatu gen yang menyandikan enzim
tersebut ke dalam sel inruig dengan menggunakan vektor. Dalam hal ini, gen yang
menyandikan enzim protease berasal dari DNA tanah Black Water Ecosystem
sedangkan sel inangnya adalah Escherichia coli DH5a. Black Water Ecosystem
merupakan ekosistem dengan kondisi air berwarna kehital11an jernih, komposisi flora
dan faunanya khas, memiliki pH air 3-4 selia kandungan H2S 1000 kali dan fenolnya
300 kali baku mutu air yang dipersyaratkan untuk biota air. Mengandung logam berat
(Mn, Cu, Zn) 3-30 kali baku mutu air. Dari tanah tersebut telah dilakukan isolasi
fragmen acak DNA dan kloning ke dalam E.coli DH5a untuk dipilah munculnya
ekspresi enzim protease (D.A. Santosa, PAU Biotelmologi IPB).
Tujuan peneIitian ini adalah mengetahui sifat-sifat protease E.coli DH5a
rekombinan hasil kloning dari DNA tanah Black Water Ecosystem melalui
karalcterisasi biokimiawi.
Produksi protease dilakukan dalam media Luria Bertani Broth (LB) 10%
dengan penambahan skim I % dan KH2P04 0,5% selia CaCh 2 mM selama 24 jam
pada suhu 37°C. Setelah itu disentrifugasi dingin pada 3000 rpm selama 15 menit
untuk memisahkan sel bakteri dan diperoleh filtrat enzim kasar. Filtrat ini diendapkan
dengan 40% Amoniul11 Sulfat teknis. Endapan yang diperoleh dipisahkan dengan
sentrifugasi dingin pada 1500 g selama 15 menit dan setelah itu dilarutkan kembali
dalam 0,02 M buffer Na-fosfat pH 7 dengan volume minimal.
Pengujian yang dilakukan antara lain: penentuan suhu dan pH optimum,
stabilitas terhadap pemanasan dan penyimpanan, pengaruh senyawa kimiawi terhadap
aktivitas enzim. Protease yang dihasilkan oleh E.coli DH5a rekombinan memiliki pH
optimum 7-11 dan suhu optimum 45°C. Hal ini berarti protease rekombinan bersifat
KARAKTERISASI PROTEASE Escherichia coli DH5a
REKOMBINAN HASIL KLONING DARI DNA TANAH
BLACK WATER ECOSYSTEM KALIMANTAN
OLEH:
PURNAMA SARI
F02495100
SKRIPSI
S'Bbagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
..
SARJANA TEKNOLOGI PERTANIAN
Pada Jurusan Teknologi Pangan dan Gizi
Fakultas Teknologi Pertanian
Institut Pertanian Bogor
1999
JURUSAN TEKNOLOGI PANGAN DAN GIZI
FAKULTAS TEKNOLOGI PERTANIAN
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
FAKULTAS TEKNOLOGI PERTANIAN
KARAKTERISASI PROTEASE Escherichia coli DH5c(
REKOMBINAN HASIL KLONING DARI DNA TANAH
BLACK WATER ECOSYSTEM KALIMANTAN
OLEH:
PURNAMA SARI
F02495100
SKRIPSI
Sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
SARJANA TEKNOLOGI PERTANIAN
Pad a Jurusan Teknologi Pangan dan Gizi
Fakultas Teknologi Pertanian
Institut Pertanian Bogor
KATA PENGANTAR
Penulis mengucapkan syukur kepada Tuhan Yesus Kristus atas penyertaan'Ie
Nya dalam menyelesaikan tugas akhir ini. Penulis juga belierima kasih kepada
Prof.Dr.Ir. Maggy T. Suhartono untuk bimbingan dan dukungannya selama ini.
Terima kasih untuk anggota Lab. MB (yang sulit disebutkan satu persatu)
yang tumt mendukung penulis dan rekan-rekan satu bimbingan (Anny. Debbie.
Freddy, Siska dan Willy) selama melakukan penelitian dalam suka dan duka.
Thanks for everything.
Bogor, Oktober 1999
Penulis
ｾＯｲＨＧＦ＠
°Y-'J Il)
YIAi
SKRIPSI
KARAKTERISASI PROTEASE Escherichia coli DH5a
REKOMBINAN HASll KlONING DARt DNA TANAH
BLACK WATER ECOSYSTEM KALIMANTAN
OlEH:
PURNAMA SARI
F02495100
1999
JURMSAN TEKNOlOGI PANGAN DAN GIZI
FAKUl TAS TEKNOlOGI PERTANIAN
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
Purnama Sari. F02495I 00. Karakterisasi Protease Escherichia coli DH5a
Rekombinan Hasil Kloning dari DNA Tanah Black Water Ecosystem Kalimantan. Di
bawah Bimbingan Maggy Thenawijaya Suhartono.
RlNGKASAN
Kondisi lingkungan non fisiologis sering ditemui dalam industri bioteknologi.
Kondisi non fisiologis ini seng'lja dibuat untuk meningkatkan laju proses produksi
dan pemul'nian produk yang sering kali tidak menguntungkan untuk pertumbuhan
mikroorganisme maupun aktivitas enzim yang terlibat. Karena itu pencarian bakteri
dan enzim yan!!. tahan dalam suasana non fisiologis merupakan cara yang paling
masuk akal dan memiliki aspek ekonomis yang besar dalam industri bioteknologi.
Eksplorasi dan isolasi bakteri yang ada dalam suatu ekosistem alallli bukan
merupakan hal yang mudah. Lebih kurang 99% bakteri belum dapat ditumbuhkan
deilgan metode konvensional (Alexander, 1978). Sehingga pendekatan teknik biologi
molekuler merupakan alternatif yang sangat bermanfaat untuk mengeksplorasi
bakteri-bakteri yang belum bisa ditumbuhkan tersebut.
Pendekatan biologi molekuler terse but dengan menggunakan teknik DNA
rekombinan, yaitu dengan cara mengklonkan suatu gen yang menyandikan enzim
tersebut ke dalam sel inruig dengan menggunakan vektor. Dalam hal ini, gen yang
menyandikan enzim protease berasal dari DNA tanah Black Water Ecosystem
sedangkan sel inangnya adalah Escherichia coli DH5a. Black Water Ecosystem
merupakan ekosistem dengan kondisi air berwarna kehital11an jernih, komposisi flora
dan faunanya khas, memiliki pH air 3-4 selia kandungan H2S 1000 kali dan fenolnya
300 kali baku mutu air yang dipersyaratkan untuk biota air. Mengandung logam berat
(Mn, Cu, Zn) 3-30 kali baku mutu air. Dari tanah tersebut telah dilakukan isolasi
fragmen acak DNA dan kloning ke dalam E.coli DH5a untuk dipilah munculnya
ekspresi enzim protease (D.A. Santosa, PAU Biotelmologi IPB).
Tujuan peneIitian ini adalah mengetahui sifat-sifat protease E.coli DH5a
rekombinan hasil kloning dari DNA tanah Black Water Ecosystem melalui
karalcterisasi biokimiawi.
Produksi protease dilakukan dalam media Luria Bertani Broth (LB) 10%
dengan penambahan skim I % dan KH2P04 0,5% selia CaCh 2 mM selama 24 jam
pada suhu 37°C. Setelah itu disentrifugasi dingin pada 3000 rpm selama 15 menit
untuk memisahkan sel bakteri dan diperoleh filtrat enzim kasar. Filtrat ini diendapkan
dengan 40% Amoniul11 Sulfat teknis. Endapan yang diperoleh dipisahkan dengan
sentrifugasi dingin pada 1500 g selama 15 menit dan setelah itu dilarutkan kembali
dalam 0,02 M buffer Na-fosfat pH 7 dengan volume minimal.
Pengujian yang dilakukan antara lain: penentuan suhu dan pH optimum,
stabilitas terhadap pemanasan dan penyimpanan, pengaruh senyawa kimiawi terhadap
aktivitas enzim. Protease yang dihasilkan oleh E.coli DH5a rekombinan memiliki pH
optimum 7-11 dan suhu optimum 45°C. Hal ini berarti protease rekombinan bersifat
KARAKTERISASI PROTEASE Escherichia coli DH5a
REKOMBINAN HASIL KLONING DARI DNA TANAH
BLACK WATER ECOSYSTEM KALIMANTAN
OLEH:
PURNAMA SARI
F02495100
SKRIPSI
S'Bbagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
..
SARJANA TEKNOLOGI PERTANIAN
Pada Jurusan Teknologi Pangan dan Gizi
Fakultas Teknologi Pertanian
Institut Pertanian Bogor
1999
JURUSAN TEKNOLOGI PANGAN DAN GIZI
FAKULTAS TEKNOLOGI PERTANIAN
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
FAKULTAS TEKNOLOGI PERTANIAN
KARAKTERISASI PROTEASE Escherichia coli DH5c(
REKOMBINAN HASIL KLONING DARI DNA TANAH
BLACK WATER ECOSYSTEM KALIMANTAN
OLEH:
PURNAMA SARI
F02495100
SKRIPSI
Sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
SARJANA TEKNOLOGI PERTANIAN
Pad a Jurusan Teknologi Pangan dan Gizi
Fakultas Teknologi Pertanian
Institut Pertanian Bogor
KATA PENGANTAR
Penulis mengucapkan syukur kepada Tuhan Yesus Kristus atas penyertaan'Ie
Nya dalam menyelesaikan tugas akhir ini. Penulis juga belierima kasih kepada
Prof.Dr.Ir. Maggy T. Suhartono untuk bimbingan dan dukungannya selama ini.
Terima kasih untuk anggota Lab. MB (yang sulit disebutkan satu persatu)
yang tumt mendukung penulis dan rekan-rekan satu bimbingan (Anny. Debbie.
Freddy, Siska dan Willy) selama melakukan penelitian dalam suka dan duka.
Thanks for everything.
Bogor, Oktober 1999
Penulis
°Y-'J Il)
YIAi
SKRIPSI
KARAKTERISASI PROTEASE Escherichia coli DH5a
REKOMBINAN HASll KlONING DARt DNA TANAH
BLACK WATER ECOSYSTEM KALIMANTAN
OlEH:
PURNAMA SARI
F02495100
1999
JURMSAN TEKNOlOGI PANGAN DAN GIZI
FAKUl TAS TEKNOlOGI PERTANIAN
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
Purnama Sari. F02495I 00. Karakterisasi Protease Escherichia coli DH5a
Rekombinan Hasil Kloning dari DNA Tanah Black Water Ecosystem Kalimantan. Di
bawah Bimbingan Maggy Thenawijaya Suhartono.
RlNGKASAN
Kondisi lingkungan non fisiologis sering ditemui dalam industri bioteknologi.
Kondisi non fisiologis ini seng'lja dibuat untuk meningkatkan laju proses produksi
dan pemul'nian produk yang sering kali tidak menguntungkan untuk pertumbuhan
mikroorganisme maupun aktivitas enzim yang terlibat. Karena itu pencarian bakteri
dan enzim yan!!. tahan dalam suasana non fisiologis merupakan cara yang paling
masuk akal dan memiliki aspek ekonomis yang besar dalam industri bioteknologi.
Eksplorasi dan isolasi bakteri yang ada dalam suatu ekosistem alallli bukan
merupakan hal yang mudah. Lebih kurang 99% bakteri belum dapat ditumbuhkan
deilgan metode konvensional (Alexander, 1978). Sehingga pendekatan teknik biologi
molekuler merupakan alternatif yang sangat bermanfaat untuk mengeksplorasi
bakteri-bakteri yang belum bisa ditumbuhkan tersebut.
Pendekatan biologi molekuler terse but dengan menggunakan teknik DNA
rekombinan, yaitu dengan cara mengklonkan suatu gen yang menyandikan enzim
tersebut ke dalam sel inruig dengan menggunakan vektor. Dalam hal ini, gen yang
menyandikan enzim protease berasal dari DNA tanah Black Water Ecosystem
sedangkan sel inangnya adalah Escherichia coli DH5a. Black Water Ecosystem
merupakan ekosistem dengan kondisi air berwarna kehital11an jernih, komposisi flora
dan faunanya khas, memiliki pH air 3-4 selia kandungan H2S 1000 kali dan fenolnya
300 kali baku mutu air yang dipersyaratkan untuk biota air. Mengandung logam berat
(Mn, Cu, Zn) 3-30 kali baku mutu air. Dari tanah tersebut telah dilakukan isolasi
fragmen acak DNA dan kloning ke dalam E.coli DH5a untuk dipilah munculnya
ekspresi enzim protease (D.A. Santosa, PAU Biotelmologi IPB).
Tujuan peneIitian ini adalah mengetahui sifat-sifat protease E.coli DH5a
rekombinan hasil kloning dari DNA tanah Black Water Ecosystem melalui
karalcterisasi biokimiawi.
Produksi protease dilakukan dalam media Luria Bertani Broth (LB) 10%
dengan penambahan skim I % dan KH2P04 0,5% selia CaCh 2 mM selama 24 jam
pada suhu 37°C. Setelah itu disentrifugasi dingin pada 3000 rpm selama 15 menit
untuk memisahkan sel bakteri dan diperoleh filtrat enzim kasar. Filtrat ini diendapkan
dengan 40% Amoniul11 Sulfat teknis. Endapan yang diperoleh dipisahkan dengan
sentrifugasi dingin pada 1500 g selama 15 menit dan setelah itu dilarutkan kembali
dalam 0,02 M buffer Na-fosfat pH 7 dengan volume minimal.
Pengujian yang dilakukan antara lain: penentuan suhu dan pH optimum,
stabilitas terhadap pemanasan dan penyimpanan, pengaruh senyawa kimiawi terhadap
aktivitas enzim. Protease yang dihasilkan oleh E.coli DH5a rekombinan memiliki pH
optimum 7-11 dan suhu optimum 45°C. Hal ini berarti protease rekombinan bersifat
KARAKTERISASI PROTEASE Escherichia coli DH5a
REKOMBINAN HASIL KLONING DARI DNA TANAH
BLACK WATER ECOSYSTEM KALIMANTAN
OLEH:
PURNAMA SARI
F02495100
SKRIPSI
S'Bbagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
..
SARJANA TEKNOLOGI PERTANIAN
Pada Jurusan Teknologi Pangan dan Gizi
Fakultas Teknologi Pertanian
Institut Pertanian Bogor
1999
JURUSAN TEKNOLOGI PANGAN DAN GIZI
FAKULTAS TEKNOLOGI PERTANIAN
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
FAKULTAS TEKNOLOGI PERTANIAN
KARAKTERISASI PROTEASE Escherichia coli DH5c(
REKOMBINAN HASIL KLONING DARI DNA TANAH
BLACK WATER ECOSYSTEM KALIMANTAN
OLEH:
PURNAMA SARI
F02495100
SKRIPSI
Sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
SARJANA TEKNOLOGI PERTANIAN
Pad a Jurusan Teknologi Pangan dan Gizi
Fakultas Teknologi Pertanian
Institut Pertanian Bogor
KATA PENGANTAR
Penulis mengucapkan syukur kepada Tuhan Yesus Kristus atas penyertaan'Ie
Nya dalam menyelesaikan tugas akhir ini. Penulis juga belierima kasih kepada
Prof.Dr.Ir. Maggy T. Suhartono untuk bimbingan dan dukungannya selama ini.
Terima kasih untuk anggota Lab. MB (yang sulit disebutkan satu persatu)
yang tumt mendukung penulis dan rekan-rekan satu bimbingan (Anny. Debbie.
Freddy, Siska dan Willy) selama melakukan penelitian dalam suka dan duka.
Thanks for everything.
Bogor, Oktober 1999
Penulis
ｾＯｲＨＧＦ＠
°Y-'J Il)
YIAi
SKRIPSI
KARAKTERISASI PROTEASE Escherichia coli DH5a
REKOMBINAN HASll KlONING DARt DNA TANAH
BLACK WATER ECOSYSTEM KALIMANTAN
OlEH:
PURNAMA SARI
F02495100
1999
JURMSAN TEKNOlOGI PANGAN DAN GIZI
FAKUl TAS TEKNOlOGI PERTANIAN
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
Purnama Sari. F02495I 00. Karakterisasi Protease Escherichia coli DH5a
Rekombinan Hasil Kloning dari DNA Tanah Black Water Ecosystem Kalimantan. Di
bawah Bimbingan Maggy Thenawijaya Suhartono.
RlNGKASAN
Kondisi lingkungan non fisiologis sering ditemui dalam industri bioteknologi.
Kondisi non fisiologis ini seng'lja dibuat untuk meningkatkan laju proses produksi
dan pemul'nian produk yang sering kali tidak menguntungkan untuk pertumbuhan
mikroorganisme maupun aktivitas enzim yang terlibat. Karena itu pencarian bakteri
dan enzim yan!!. tahan dalam suasana non fisiologis merupakan cara yang paling
masuk akal dan memiliki aspek ekonomis yang besar dalam industri bioteknologi.
Eksplorasi dan isolasi bakteri yang ada dalam suatu ekosistem alallli bukan
merupakan hal yang mudah. Lebih kurang 99% bakteri belum dapat ditumbuhkan
deilgan metode konvensional (Alexander, 1978). Sehingga pendekatan teknik biologi
molekuler merupakan alternatif yang sangat bermanfaat untuk mengeksplorasi
bakteri-bakteri yang belum bisa ditumbuhkan tersebut.
Pendekatan biologi molekuler terse but dengan menggunakan teknik DNA
rekombinan, yaitu dengan cara mengklonkan suatu gen yang menyandikan enzim
tersebut ke dalam sel inruig dengan menggunakan vektor. Dalam hal ini, gen yang
menyandikan enzim protease berasal dari DNA tanah Black Water Ecosystem
sedangkan sel inangnya adalah Escherichia coli DH5a. Black Water Ecosystem
merupakan ekosistem dengan kondisi air berwarna kehital11an jernih, komposisi flora
dan faunanya khas, memiliki pH air 3-4 selia kandungan H2S 1000 kali dan fenolnya
300 kali baku mutu air yang dipersyaratkan untuk biota air. Mengandung logam berat
(Mn, Cu, Zn) 3-30 kali baku mutu air. Dari tanah tersebut telah dilakukan isolasi
fragmen acak DNA dan kloning ke dalam E.coli DH5a untuk dipilah munculnya
ekspresi enzim protease (D.A. Santosa, PAU Biotelmologi IPB).
Tujuan peneIitian ini adalah mengetahui sifat-sifat protease E.coli DH5a
rekombinan hasil kloning dari DNA tanah Black Water Ecosystem melalui
karalcterisasi biokimiawi.
Produksi protease dilakukan dalam media Luria Bertani Broth (LB) 10%
dengan penambahan skim I % dan KH2P04 0,5% selia CaCh 2 mM selama 24 jam
pada suhu 37°C. Setelah itu disentrifugasi dingin pada 3000 rpm selama 15 menit
untuk memisahkan sel bakteri dan diperoleh filtrat enzim kasar. Filtrat ini diendapkan
dengan 40% Amoniul11 Sulfat teknis. Endapan yang diperoleh dipisahkan dengan
sentrifugasi dingin pada 1500 g selama 15 menit dan setelah itu dilarutkan kembali
dalam 0,02 M buffer Na-fosfat pH 7 dengan volume minimal.
Pengujian yang dilakukan antara lain: penentuan suhu dan pH optimum,
stabilitas terhadap pemanasan dan penyimpanan, pengaruh senyawa kimiawi terhadap
aktivitas enzim. Protease yang dihasilkan oleh E.coli DH5a rekombinan memiliki pH
optimum 7-11 dan suhu optimum 45°C. Hal ini berarti protease rekombinan bersifat
KARAKTERISASI PROTEASE Escherichia coli DH5a
REKOMBINAN HASIL KLONING DARI DNA TANAH
BLACK WATER ECOSYSTEM KALIMANTAN
OLEH:
PURNAMA SARI
F02495100
SKRIPSI
S'Bbagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
..
SARJANA TEKNOLOGI PERTANIAN
Pada Jurusan Teknologi Pangan dan Gizi
Fakultas Teknologi Pertanian
Institut Pertanian Bogor
1999
JURUSAN TEKNOLOGI PANGAN DAN GIZI
FAKULTAS TEKNOLOGI PERTANIAN
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
FAKULTAS TEKNOLOGI PERTANIAN
KARAKTERISASI PROTEASE Escherichia coli DH5c(
REKOMBINAN HASIL KLONING DARI DNA TANAH
BLACK WATER ECOSYSTEM KALIMANTAN
OLEH:
PURNAMA SARI
F02495100
SKRIPSI
Sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
SARJANA TEKNOLOGI PERTANIAN
Pad a Jurusan Teknologi Pangan dan Gizi
Fakultas Teknologi Pertanian
Institut Pertanian Bogor
KATA PENGANTAR
Penulis mengucapkan syukur kepada Tuhan Yesus Kristus atas penyertaan'Ie
Nya dalam menyelesaikan tugas akhir ini. Penulis juga belierima kasih kepada
Prof.Dr.Ir. Maggy T. Suhartono untuk bimbingan dan dukungannya selama ini.
Terima kasih untuk anggota Lab. MB (yang sulit disebutkan satu persatu)
yang tumt mendukung penulis dan rekan-rekan satu bimbingan (Anny. Debbie.
Freddy, Siska dan Willy) selama melakukan penelitian dalam suka dan duka.
Thanks for everything.
Bogor, Oktober 1999
Penulis