PEMBAHASAN HASIL DAN PEMBAHASAN

UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

4.2 PEMBAHASAN

Garcinia benthami Pierre atau yang lebih dikenal sebagai tanaman manggis-manggisan merupakan tumbuhan tropis. Dari berbagai penelitian yang dilakukan pada beberapa spesies Garcinia berhasil diisolasi senyawa-senyawa kelompok xanton, benzofenon, flavonoid, dan triterpenoid Verheij Coronel, 1992; Likhitwitayawuid et al., 1998. Umumnya senyawa-senyawa tersebut mempunyai aktivitas biologik dan farmakologik seperti antiinflamasi, antimikroba, antifungi, dan antioksidan Likhitwitayawuid et al., 1998; Iinuma et al., 1998. Bagian tanaman yang berbeda dari Genus Garcinia seperti buah, kulit buah, bunga, daun, kulit batang dan batang telah digunakan secara global sebagai ethnomedicine untuk mengobati beberapa gangguan seperti peradangan, stres oksidatif, infeksi mikroba, kanker, dan obesitas Hemshekhar et al., 2011. Oleh karena itu penelitian mengenai tanaman ini terus-menerus dikembangkan. Salah satunya dibidang mikrobiologi, yaitu dengan mengisolasi mikroba endofit dari tanaman ini dan kemudian diuji aktivitas antibakterinya. Tahap awal dari proses isolasi mikroba endofit dari daun tanaman Garcinia benthami Pierre ini adalah sterilisasi permukaan. Sebelum isolasi, dilakukan terlebih dahulu sterilisasi permukaan terhadap sampel tanaman. Sterilisasi permukaan ini bertujuan untuk menghilangkan mikroorganisme epifit yang berada di permukaan tumbuhan, sehingga koloni yang diperoleh merupakan koloni endofit yang berasal dari dalam jaringan tumbuhan Larran et al., 2001. Alkohol 70 digunakan sebagai bahan untuk sterilisasi permukaan karena alkohol 70 bekerja dengan cara merusak lapisan membran sel mikroorganisme. Alkohol dapat melarutkan lipid dan mendenaturasi protein yang ada pada membran sel. Hal tersebut dapat mengganggu fungsi membran sel dalam mengatur transportasi cairan ke dalam dan keluar sel sehingga membuat sel mikroorganisme menjadi lisis McDonnell Russell, 1999. Kemampuan alkohol untuk mensterilkan permukaan organ tumbuhan tersebut mempunyai spektrum yang sempit atau sangat terbatas sehingga perlu dikombinasikan dengan bahan kimia lainnya, dan biasanya sering dikombinasikan dengan larutan natrium hipoklorit NaOCl Agusta, 2009. Natrium hipoklorit merupakan senyawa klorin. Senyawa klorin diketahui mampu menghambat UIN Syarif Hidayatullah Jakarta pertumbuhan sel mikroorganisme dengan cara mengganggu proses oksidasi dari enzim-enzim penting sehingga fungsi metabolisme dari sel tersebut terganggu dan sel mikroorganisme tidak dapat tumbuh Valera et al., 2009 dalam Agusta, 2009. NaOCl pada konsentrasi 5,25 digunakan karena telah diketahui sebagai dekontaminan yang efektif terhadap bakteri Gram negatif, Gram positif dan bentuk spora dari mikroorganisme Tilakchand, Mahima et al., 2014. Isolasi mikroba endofit dari daun Garcinia benthami Pierre dilakukan pada media PDA untuk kapang endofit dan NA untuk bakteri endofit. Media PDA mengandung ekstrak kentang, salah satu sumber karbohidrat. Kapang dapat tumbuh pada media PDA karena kapang mempunyai enzim untuk memotong polisakarida tersebut menjadi monosakarida yang siap digunakan kapang untuk kelangsungan hidupnya. NA merupakan salah satu media yang umum digunakan dalam prosedur bakteriologi seperti uji biasa dari air, produk pangan, untuk membawa stok kultur, untuk pertumbuhan sampel pada uji bakteri, dan untuk mengisolasi organisme dalam kultur murni. Pada pembuatan media NA ini ditambahkan pepton agar mikroba cepat tumbuh, karena mengandung banyak N 2 Dwidjoseputro, 1998. Kapang endofit yang diisolasi tumbuh setelah 5 hari dari proses penanaman potongan daun pada media PDA. Berdasarkan literatur, kapang endofit akan mulai tumbuh pada minggu kedua setelah inkubasi, dan kapang yang tumbuh sebelum waktu tersebut kemungkinan besar adalah kontaminan. Mungkin rekomendasi tersebut cukup beralasan jika kita mengasumsikan bahwa kapang tersebut terdapat pada bagian dalam jaringan tumbuhan. Namun, perlu diingat bahwa media tumbuh yang digunakan selama proses isolasi adalah media yang kaya akan nutrisi sehingga sangat mungkin untuk mempercepat perkembangan kapang endofit tersebut Agusta, 2009. Kapang endofit yang berhasil diisolasi dari daun tanaman Garcinia benthami Pierre sebanyak 18 isolat. Kapang endofit yang diisolasi dari pucuk daun dan daun yang berada di dekat pucuk daun berjumlah masing-masing 1 isolat yaitu isolat GB5 dari pucuk daun dan isolat GB8 dari daun yang berada di dekat pucuk daun. Sedangkan kapang endofit yang diisolasi dari daun yang berada di tengah ranting dan di pangkal ranting berjumlah masing-masing 8 isolat yaitu GB1, GB2, GB4, GB6, UIN Syarif Hidayatullah Jakarta GB9, GB10, GB11, GB12 dari daun yang berada di tengah ranting dan GB3, GB7, GB13, GB14, GB15, GB16, GB17, GB18 dari daun yang berada di pangkal ranting. Bakteri endofit yang diisolasi tumbuh setelah 3 hari dari proses penanaman potongan daun pada media NA. Bakteri endofit yang berhasil diisolasi dari daun tanaman Garcinia benthami Pierre sebanyak 7 isolat, yaitu 4 isolat bakteri endofit IGB1, IGB2, IGB3, IGB4 berasal dari pucuk daun dan 3 isolat bakteri endofit IGB5, IGB6, IGB7 berasal dari daun yang berada didekat pucuk daun. Berdasarkan hasil karakterisasi bakteri endofit secara mikrokopis, dapat diketahui bahwa semua isolat bakteri endofit yang berhasil diisolasi merupakan bakteri Gram positif. Mikroba endofit yang telah tumbuh dimurnikan ke medianya masing- masing. Untuk kapang endofit dimurnikan ke media PDA, sedangkan untuk bakteri endofit dimurnikan ke media NA. Tujuan pemurnian isolat mikroba endofit adalah untuk memisahkan hasil inokulasi yang terdiri dari banyak koloni yang berlainan jenis sehingga didapatkan koloni murni pada setiap cawan petri. Koloni mikroba yang diambil untuk dimurnikan adalah koloni yang dominan Hadioetomo, 1995. Hal ini dilakukan terus-menerus sampai diperoleh koloni murni. Koloni murni adalah koloni yang memiliki morfologi yang sama karena berasal dari pembelahan satu sel Waluyo, 2005. Uji kemurnian bakteri uji dilakukan sebelum bakteri uji digunakan untuk tahapan skrining mikroba endofit yang mempunyai aktivitas antibakteri. Uji kemurnian ini dilakukan untuk memastikan bahwa bakteri uji yang digunakan merupakan bakteri uji yang benar-benar murni tanpa adanya kontaminasi. Maka dilakukan pengamatan secara makroskopis dan mikroskopis. Berdasarkan hasil yang diperoleh didapatkan bahwa bakteri uji benar-benar murni, sehingga dapat digunakan untuk skrining antibakteri dan uji aktivitas antibakteri. Pengamatan kurva pertumbuhan dari masing-masing bakteri uji perlu dilakukan sebelum skrining ataupun pengujian aktivitas antibakteri. Kurva pertumbuhan dapat diperoleh dari hubungan antara jumlah selmL terhadap waktu jam. Tujuannya adalah untuk mengetahui pertumbuhan bakteri. Pada kurva pertumbuhan dapat dilihat pertumbuhan bakteri berdasarkan fasenya, yaitu fase UIN Syarif Hidayatullah Jakarta lag, fase log fase eksponensial, fase stasioner, dan fase kematian. Fase lag merupakan fase adaptasi, yaitu fase penyesuaian bakteri pada suatu lingkungan baru. Fase log fase eksponensial merupakan fase pada saat bakteri tumbuh dan membelah pada kecepatan maksimum. Fase log fase eksponensial ini merupakan fase yang cocok untuk pengujian antibakteri. Suatu zat antibakteri ketika akan diuji aktivitas antibakterinya, maka bakteri uji yang digunakan harus dalam keadaan fase aktif pembelahan sel dengan laju yang konstan. Selanjutnya adalah fase stasioner yaitu pada saat pertumbuhan bakteri berhenti dan terjadi keseimbangan antara jumlah sel yang membelah dengan jumlah sel yang mati, selain itu pada fase ini juga terjadi akumulasi produk buangan yang toksik. Fase terakhir adalah fase kematian, yaitu pada saat jumlah sel yang mati meningkat, hal ini disebabkan ketidaktersediaan nutrisi dan akumulasi produk buangan yang toksik Pratiwi, 2008. Pada kurva pertumbuhan bakteri Gram positif yaitu Escherichia coli menunjukkan fase lag fase adaptasi terjadi pada jam ke-0 hingga jam ke-2 dan mulai meningkat pertumbuhan selnya fase log pada jam ke-4 hingga jam ke-15. Selanjutnya pada jam ke-17 hingga jam ke-22 bakteri mengalami fase stasioner. Sedangkan pada kurva pertumbuhan Staphylococcus aureus menunjukkan fase lag fase adaptasi terjadi pada jam ke-0 hingga jam ke-2 dan mulai meningkat pertumbuhan selnya fase log pada jam ke-3 hingga jam ke-9. Pada kurva pertumbuhan bakteri Gram negatif yaitu Bacillus subtilis menunjukkan fase lag fase adaptasi terjadi pada jam ke-0 hingga jam ke-12 dan mulai meningkat pertumbuhan selnya fase log pada jam ke-13 hingga jam ke-16. Selanjutnya pada jam ke-18 hingga jam ke-23 bakteri mengalami fase stasioner. Pada kurva pertumbuhan Shigella dysenteriae menunjukkan fase lag fase adaptasi terjadi pada jam ke-0 hingga jam ke-4 dan mulai meningkat pertumbuhan selnya fase log pada jam ke-12 hingga jam ke-19. Pada kurva pertumbuhan Salmonella typhimurium menunjukkan fase lag fase adaptasi terjadi pada jam ke-0 hingga jam ke-9 dan mulai meningkat pertumbuhan selnya fase log pada jam ke-10 hingga jam ke-19. Bakteri uji siap digunakan untuk uji antibakteri apabila OD Optical Density telah mencapai 0,08-0,1 setara 10 7 CFUmL. Jika OD lebih besar dari UIN Syarif Hidayatullah Jakarta 0,1 maka dilakukan pengenceran dengan menggunakan larutan NaCl fisiologis Fitriyah et al., 2013. Skrining mikroba endofit yang mempunyai aktivitas antibakteri dilakukan untuk menentukan mikroba endofit yang akan dilanjutkan pada proses fermentasi dan uji aktivitas antibakteri dari hasil fermentasi. Bakteri uji yang digunakan yaitu bakteri Gram positif Staphylococcus aureus ATCC 6538, Bacillus subtilis ATCC 6633 dan Gram negatif Escherichia coli ATCC 35218, Shigella dysenteriae ATCC 13313, Salmonella typhimurium ATCC 14028. Berdasarkan hasil skrining, didapatkan 6 kapang yang mempunyai zona hambat terhadap bakteri uji, yaitu isolat kapang endofit GB2, GB8, GB14, GB16, GB17, dan GB18. Sehingga 6 isolat kapang inilah yang dilanjutkan pada proses fermentasi dan uji aktivitas antibakteri. Berdasarkan hasil skrining tersebut, terdapat satu isolat kapang yang memberikan zona hambat paling baik dibandingkan lima isolat kapang lainnya yaitu isolat kapang GB2. Isolat kapang GB2 memberikan hasil positif terhadap 4 bakteri uji yaitu dengan zona hambat 13,9 mm terhadap Bacillus subtilis, 18,375 mm terhadap Staphylococcus aureus, 12,05 mm terhadap Shigella dysenteriae, dan 10,8 mm terhadap Salmonella typhimurium. Zona hambat menunjukkan kemampuan kapang tersebut mensekresikan senyawa bioaktif ke dalam media dengan tujuan mempertahankan hidup dengan menghambat pertumbuhan mikroba lain yang ada di sekitarnya Melliawati Puspita, 2008. Berdasarkan hasil skrining bakteri endofit, terdapat 6 isolat yang menunjukkan daya mengantagonis bakteri uji, yaitu IGB1, IGB2, IGB3, IGB4, IGB5, dan IGB6. Akan tetapi dalam proses fermentasi, 7 isolat yang telah didapatkan tetap diikutsertakan dalam proses fermentasi, hal ini dilakukan karena mengingat jumlah isolat bakteri endofit yang diperoleh tidak terlalu banyak bila dibandingkan dengan isolat kapang endofit. Isolat bakteri endofit yaitu IGB1, IGB2, IGB3, IGB4, IGB5, IGB6, dan IGB7. Isolat mikroba endofit yang terseleksi dari hasil skrining dilanjutkan pada proses fermentasi. Fermentasi bertujuan untuk menghasilkan sel mikroba endofit dalam jumlah yang banyak sehingga senyawa metabolit sekunder yang dihasilkan menjadi lebih optimal. Proses fermentasi menggunakan media cair karena UIN Syarif Hidayatullah Jakarta fermentasi dengan medim cair lebih efektif untuk memproduksi biomassa Pokhrel dan Ohga, 2007 dan senyawa bioaktif dibandingkan fermentasi dalam media padat Yan et al., 2010. Media fermentasi yang dipilih adalah media PDY Potato Dextrose Yeast untuk fermentasi kapang endofit dan media NB Nutrient broth untuk fermentasi bakteri endofit. Media PDY mengandung sumber karbon yang berasal dari ekstrak kentang dan dektrosa serta yeast extract sebagai sumber nitrogen yang diperlukan kapang selama fermentasi. Sedangkan media NB mengandung beef extract dan pepton. Proses fermentasi kapang endofit dilakukan secara stasioner selama 21 hari pada suhu ruang dan fermentasi bakteri endofit dilakukan dengan di shaker pada kecepatan 170 rpm selama 2 hari pada suhu ruang. Hasil fermentasi yang diperoleh kemudian disentrifugasi untuk memisahkan endapan biomassa dan supernatan. Untuk kapang endofit disentrifugasi dengan kecepatan 3000 rpm selama 15 menit, sedangkan untuk bakteri endofit disentrifugasi dengan kecepatan 3000 rpm selama 20 menit pada suhu 4°C. Kemudian supernatan yang diperoleh segera dipindahkan sebanyak 1 mL pada masing-masing tube steril dengan menggunakan mikropipet dan tip untuk digunakan sebagai larutan uji aktivitas antibakteri. Pengujian aktivitas antibakteri dilakukan dengan metode difusi cakram disc diffusion methods. Sebanyak 20 µL larutan uji supernatan dari hasil fermentasi mikroba endofit diserapkan pada kertas cakram steril berdiameter 6 mm. Sebelum cakram diletakkan di atas media yang telah mengandung bakteri uji, cakram terlebih dahulu dikeringkan sehingga supernatanlarutan uji terserap sempurna di dalam cakram. Setelah cakram kering, maka segera diletakkan pada permukaan media MHA padat yang sebelumnya telah diinokulasi bakteri uji Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis, Escherichia coli, Shigella dysenteriae, dan Salmonella typhimurium dengan metode pour plate. Sebagai kontrol positif digunakan cakram kloramfenikol konsentrasi 30 µg dan kontrol negatif yaitu aquades steril yang diserapkan pada cakram dan dikeringkan. Setelah semua cakram yang berisi larutan uji, kontrol positif, dan kontrol negatif diletakkan di atas permukaan media MHA tersebut, kemudian diinkubasi selama 24 jam pada suhu 35ºC. Aktivitas antibakteri dinyatakan sebagai diameter zona hambat mm UIN Syarif Hidayatullah Jakarta yang dihasilkan oleh supernatan hasil fermentasi mikroba endofit. Diameter zona hambat diukur dengan menggunakan jangka sorong Radji et al., 2011 dengan modifikasi. Penggunaan kloramfenikol sebagai kontrol positif dikarenakan antibiotik ini mempunyai spektrum yang luas terhadap bakteri Gram positif dan negatif. Kloramfenikol dapat menghambat sintesis protein mikroba dengan cara berikatan dengan ribosom subunit 50s dan menghambat enzim peptidil transferase sehingga ikatan peptida tidak terbentuk pada proses sintesis protein mikroba Gunawan, 2011. Berdasarkan hasil uji aktivitas antibakteri dari supernatan hasil fermentasi kapang endofit yang dilakukan selama 21 hari didapatkan 1 isolat aktif terhadap Escherichia coli, 6 isolat aktif terhadap Bacillus subtilis, 3 isolat aktif terhadap Shigella dysenteriae, dan 2 isolat aktif terhadap Salmonella typhimurium. Isolat- isolat aktif tersebut mampu menghambat pertumbuhan bakteri uji baik secara tuntas memberikan zona bening maupun zona parsial. Supernatan dari suspensi koloni kapang endofit yang aktif sebagai antibakteri terhadap Escherichia coli yaitu dari isolat GB18 dengan zona hambat 6,73 mm. Tidak ada supernatan dari isolat kapang endofit yang aktif sebagai antibakteri terhadap Staphylococcus aureus. Supernatan dari isolat kapang endofit yang aktif sebagai antibakteri terhadap Bacillus subtilis yaitu GB2 7,31 mm, GB8 7,27 mm, GB14 7,32 mm, GB16 7,1 mm, GB17 7,12 mm, dan GB18 7,55 mm. Supernatan dari isolat kapang endofit yang aktif sebagai antibakteri terhadap Shigella dysenteriae yaitu GB2 6,98 mm, GB16 8,08 mm, dan GB17 7,34 mm. Supernatan dari isolat kapang endofit yang aktif sebagai antibakteri terhadap Salmonella typhimurium yaitu GB2 6,75 mm dan GB8 6,87 mm. Berdasarkan hasil uji aktivitas antibakteri dari supernatan hasil fermentasi bakteri endofit selama 2 hari didapatkan 3 isolat aktif terhadap Staphylococcus aureus, 2 isolat aktif terhadap Bacillus subtilis, 7 isolat aktif terhadap Escherichia coli, 2 isolat aktif terhadap Shigella dysenteriae, dan 1 isolat aktif terhadap Salmonella typhimurium. Isolat-isolat aktif tersebut mampu menghambat pertumbuhan bakteri uji baik secara tuntas memberikan zona bening maupun zona parsial. UIN Syarif Hidayatullah Jakarta Supernatan dari suspensi isolat bakteri endofit yang aktif sebagai antibakteri terhadap Staphylococcus aureus yaitu IGB3 7,07 mm, IGB5 7,57 mm, dan IGB6 7,22 mm. Supernatan dari isolat bakteri endofit yang aktif sebagai antibakteri terhadap Bacillus subtilis yaitu IGB1 5,88 mm dan IGB3 6,8 mm. Supernatan dari suspensi isolat bakteri endofit yang aktif sebagai antibakteri terhadap Escherichia coli yaitu IGB1 6,95 mm, IGB2 6,9 mm, IGB3 7,08 mm, IGB4 6,67 mm, IGB5 6,52 mm, IGB6 6,68 mm, dan IGB7 6,48 mm. Supernatan dari isolat bakteri endofit yang aktif sebagai antibakteri terhadap Shigella dysenteriae yaitu IGB3 6,92 mm dan IGB6 6,58 mm. Supernatan dari isolat bakteri endofit yang aktif sebagai antibakteri terhadap Salmonella typhimurium yaitu IGB3 5,93 mm. Temuan dalam penelitian ini adalah berhasil diisolasi mikroba endofit sebanyak 25 isolat yang terdiri dari 18 isolat kapang endofit dan 7 isolat bakteri endofit, serta telah diuji aktivitas antibakterinya terhadap Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis, Escherichia coli, Shigella dysenteriae, dan Salmonella typhimurium yang memberikan hasil positif pada 13 isolat mikroba endofit yaitu isolat kapang GB2, GB8, GB14, GB16, GB17, dan GB18 aktif terhadap Bacillus subtilis; isolat kapang GB18 aktif terhadap Escherichia coli; isolat kapang GB2, GB16, dan GB17 aktif terhadap Shigella dysenteriae; isolat kapang GB2 dan GB8 aktif terhadap Salmonella typhimurium; isolat bakteri IGB1, IGB2, IGB3, IGB4, IGB5, IGB6, dan IGB7 aktif terhadap Escherichia coli; isolat bakteri IGB3, IGB5, dan IGB6 aktif terhadap Staphylococcus aureus; isolat bakteri IGB1 dan IGB3 aktif terhadap Bacillus subtilis; isolat bakteri IGB3 dan IGB6 aktif terhadap Shigella dysenteriae; isolat bakteri IGB3 aktif terhadap Salmonella typhimurium. 81 UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

BAB V PENUTUP

5.1 Kesimpulan

1 25 isolat mikroba endofit berhasil diisolasi dari daun tanaman Garcinia benthami Pierre, yaitu terdiri dari 18 isolat kapang endofit GB1, GB2, GB3, GB4, GB5, GB6, GB7, GB8, GB9, GB10, GB11, GB12, GB13, GB14, GB15, GB16, GB17, dan GB18 dan 7 isolat bakteri endofit IGB1, IGB2, IGB3, IGB4, IGB5, IGB6, dan IGB7. 2 Dari 18 isolat kapang endofit, terdapat 6 isolat kapang endofit yang aktif sebagai antibakteri, yaitu: - Isolat kapang GB2, GB8, GB14, GB16, GB17, dan GB18 aktif terhadap Bacillus subtilis. - Isolat kapang GB18 aktif terhadap Escherichia coli. - Isolat kapang GB2, GB16, dan GB17 aktif terhadap Shigella dysenteriae. - Isolat kapang GB2 dan GB8 aktif terhadap Salmonella typhimurium. 3 Didapatkan 7 isolat bakteri endofit yang aktif sebagai antibakteri, yaitu: - Isolat bakteri IGB1, IGB2, IGB3, IGB4, IGB5, IGB6, dan IGB7 aktif terhadap Escherichia coli. - Isolat bakteri IGB3, IGB5, IGB6 aktif terhadap Staphylococcus aureus. - Isolat bakteri IGB1 dan IGB3 aktif terhadap Bacillus subtilis. - Isolat bakteri IGB3 dan IGB6 aktif terhadap Shigella dysenteriae. - Isolat bakteri IGB3 aktif terhadap Salmonella typhimurium.

5.2 Saran

1 Diperlukan penelitian lanjutan untuk mengetahui senyawa yang terdapat dalam isolat mikroba endofit yang berhasil diisolasi dari daun Garcinia benthami Pierre, khususnya isolat yang memiliki aktivitas antibakteri. 2 Perlu dilakukan uji antibakteri dengan spesies bakteri yang lain untuk melihat potensi antibakteri dari mikroba endofit dari daun Garcinia benthami Pierre sehingga diharapkan mikroba endofit ini dapat dimanfaatkan untuk pengobatan.