Identifikasi Isolat Bakteri Tahan Krom(VI) dan Pengujian Aktivitas Enzim Krom(VI) Reduktase

IDENTIFIKASI ISOLAT BAKTERI TAHAN KROM(VI) DAN
PENGUJIAN AKTIVITAS ENZIM KROM(VI) REDUKTASE

NINA HERMAYANI SADI

SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2009

PERNYATAAN MENGENAI TESIS DAN SUMBER
INFORMASI
Dengan ini saya menyatakan bahwa tesis IDENTIFIKASI ISOLAT
BAKTERI TAHAN KROM(VI) DAN PENGUJIAN AKTIVITAS ENZIM
KROM(VI) REDUKTASE adalah karya saya sendiri dengan arahan dari Komisi
Pembimbing dan belum diajukan dalam bentuk apapun kepada perguruan tinggi
manapun. Sumber informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan
maupun tidak diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan
dicantumkan dalam Daftar Pustaka di bagian akhir tesis ini.

Bogor, Agustus 2009

Nina Hermayani Sadi
NIM. G851070031

ABSTRACT
NINA HERMAYANI SADI. Identification of Cr(VI)-Resistant Bacteria and
the Study of Its Cr(VI)-Reductase Activity. Under the direction of LAKSMI
AMBARSARI and YOPI.
Cr(VI) (chromate) is a toxic, soluble environmental contaminant. A
Gram-negative, Cr(VI)-resistant bacterium, has been isolated from effluent of
electroplating wastewater treatment reactor. This strain had maximum identity
value as high as 96% to Ralstonia pickettii and Ralstonia sp. M2S3. This value
indicated that the strain was a species of Ralstonia genera. Because of this reason,
the strain was designated as Ralstonia sp. Cr6NS.
Ralstonia sp. Cr6NS was able to grow aerobically in 250 ppm Cr(VI) and
had Cr(VI) reducing-capacity as high as 4,11 x 10-8µg Cr(VI)/hour/cell. From the
study of enzymatic activity, Ralstonia sp. Cr6NS showed the activity of Cr(VI)reductase both in periplasmic and sitoplasmic content. The highest activity was
found in periplasmic matrix. However, the strain seemed not secreting this
enzyme to the external medium.
Keywords: Cr(VI) resistant bacterial, 16S rRNA, Cr(VI)-reductase enzyme ,
periplasm, sitoplasm

RINGKASAN
Nina Hermayani Sadi. Identifikasi Isolat Bakteri Tahan Krom(VI) dan
Pengujian Aktivitas Enzim Krom(VI) Reduktase. Dibimbing oleh LAKSMI
AMBARSARI dan YOPI.
Krom(VI) adalah ion logam berat toksik karena sifatnya sebagai oksidator
kuat dan bersifat mutagenik. Masuknya Cr(VI) ke lingkungan akan menimbulkan
polusi bagi lingkungan tersebut. Industri logam dan pelapisan logam merupakan
industri yang menghasilkan limbah yang mengandung Cr(VI) dalam kisaran 0,1100 mg/L. Salah satu alternatif sistem pengolahan limbah Cr(VI) adalah
pengolahan secara biologis dengan menggunakan bakteri sebagai agen
bioremediasi. Cr(VI) yang toksik direduksi secara enzimatis menjadi Cr(III) yang
kurang toksik dalam sistem ini. Oleh sebab itu, bakteri yang dapat digunakan
sebagai agen bioremediasi Cr(VI) adalah bakteri tahan Cr(VI) yang memiliki
aktivitas enzim Cr(VI) reduktase.
Penelitian ini bertujuan untuk mengisolasi bakteri tahan Cr(VI) dari
reaktor pengolahan limbah pelapisan logam yang terdapat di Laboratorium
Pengendalian Pencemaran Puslit Limnologi LIPI, menyeleksi dan
mengidentifikasi isolat unggul, serta menguji aktivitas enzim Cr(VI) reduktase
dari ekstrak kasar enzim ekstraseluler, enzim periplasma, dan enzim sitoplasma.
Isolat unggul dipilih berdasarkan nilai daya penyisihan Cr(VI) tertinggi.

Identifikasi isolat unggul dilakukan melalui pengamatan morfologi bakteri dan
analisis 16 rRNA. Sebagai substrat pada uji aktivitas enzim digunakan larutan
K2CrO4 dengan konsentrasi akhir 0,2 mM. Diamati juga pengaruh NADH sebagai
donor elektron terhadap aktivitas enzim Cr(VI) reduktase.
Hasil penelitian mendapatkan bahwa 95 isolat bakteri tahan Cr(VI)
berhasil diisolasi dari efluen reaktor pengolahan limbah pelapisan logam. Dari ke95 isolat tersebut ternyata isolat nomor 15 memiliki nilai daya penyisihan Cr(VI)
tertinggi dibanding isolat uji lainnya, yaitu 4,11 x 10-8 µg Cr(VI)/jam/sel bakteri.
Oleh sebab itu isolat nomor 15 dijadikan isolat unggul dan digunakan dalam uji
selanjutnya. Isolat no.15 memiliki bentuk sel batang dan merupakan bakteri Gram
negatif. Bakteri ini merupakan anggota dari genus Ralstonia karena memiliki
kemiripan sebesar 96% dengan dua bakteri dari genus Ralstonia, yaitu Ralstonia
pickettii 12D dan Ralstonia sp. M2S3. Berdasarkan hal ini, isolat nomor 15
selanjutnya diberi nama Ralstonia sp. Cr6NS. Hasil uji aktivitas enzim
menunjukkan bahwa enzim Cr(VI) reduktase terdapat di daerah periplasma dan
sitoplasma bakteri. Aktivitas spesifik enzim terbesar ditemukan di daerah
periplasma dengan nilai aktivitas spesifik 27,30 unit/mg protein. Penambahan
NADH dalam uji aktivitas enzim meningkatkan aktivitas enzim sebesar 17,88%
pada enzim periplasma dan 306,21% pada enzim sitoplasma. Walau di daerah
periplasma terdapat enzim pereduksi Cr(VI), enzim ini tidak disekeresikan ke luar
sel karena dalam medium kutur tidak ditemukan adanya reduksi Cr(VI) dalam uji

aktivitas enzim.
Kata kunci: Bakteri tahan Cr(VI), 16S rRNA, enzim Cr(VI) reduktase,
periplasma, sitoplasma

© Hak Cipta milik Institut Pertanian Bogor, tahun 2009
Hak Cipta dilindungi Undang-Undang
Dilarang mengutip sebagian atau seluruh karya tulis ini tanpa mencantumkan
atau menyebutkan sumber. Pengutipan hanya untuk kepentingan pendidikan,
penelitian, penulisan karya ilmiah, penyusunan laporan, penulisan kritik atau
tinjauan suatu masalah; dan pengutipan tersebut tidak merugikan kepentingan
yang wajar IPB.
Dilarang mengumumkan dan memperbanyak sebagian atau seluruh karya tulis
dalam bentuk apapun tanpa izin Institut Pertanian Bogor.

IDENTIFIKASI ISOLAT BAKTERI TAHAN KROM(VI) DAN
PENGUJIAN AKTIVITAS ENZIM KROM(VI) REDUKTASE

NINA HERMAYANI SADI

Tesis

sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
Magister Sains pada
Program Studi Biokimia

SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2009

Penguji Luar Komisi pada Ujian Tesis: Dr. Ir. I Made Artika, M.App.Sc.

Judul Tesis
Nama
NIM

: Identifikasi Isolat Bakteri Tahan Krom(VI) dan Pengujian
Aktivitas Enzim Krom(VI) Reduktase
: Nina Hermayani Sadi
: G851070031

Disetujui
Komisi Pembimbing

Dr. Laksmi Ambarsari, M.S.
Ketua

Dr. Yopi
Anggota

Diketahui
Ketua Program Studi Biokimia

Dekan Sekolah Pascasarjana

Prof. Dr. drh. Maria Bintang,
M.Si.

Prof. Dr. Ir. Khairil Anwar Notodiputro,
M.S.

Tanggal Ujian: 21 Agustus 2009

Tanggal Lulus:

PRAKATA
Alhamdulillahirabbil’alamin, segenap puja dan puji syukur penulis
panjatkan ke hadirat Allah SWT atas rahmat dan hidayah-Nya yang telah
dilimpahkan kepada penulis sehingga tesis ini dapat diselesaikan. Tesis ini
mengambil tema mengenai identifikasi bakteri tahan krom(VI) dan pengujian
aktivitas enzim pereduksi krom (VI) yang diisolasi dari isolat bakteri tersebut.
Penyusunan tesis bukanlah pekerjaan yang mudah. Tanpa adanya
dukungan dari berbagai pihak tentu sukar bagi penulis untuk menyelesaikan tugas
ini. Oleh sebab itu, penulis mengucapkan terima kasih dengan tulus dan
penghargaan setinggi-tingginya kepada: Ibu Dr. Laksmi Ambarsari, M.S., dan
Bapak Dr. Yopi selaku pembimbing yang telah banyak memberikan masukan dan
pengetahuan baru kepada penulis; Ibu Dr. Ir. Gadis Sri Haryani selaku Kepala
Puslit Limnologi LIPI dan Bapak Dr. Tri Widiyanto, M.Si., selaku Kepala Bidang
Poduktivitas Perairan Darat Puslit Limnologi LIPI yang telah memberikan
dukungan dan fasilitas untuk terlaksananya penelitian ini; Bapak Dr. Ir. I Made
Artika, M.App.Sc. atas koreksi dan masukannya bagi perbaikan tesis ini; Tanoto

Foundation, yang memberi kepercayaan melalui pemberian beasiswa kepada
penulis; Bapak Ahmad Thontowi, S.Si, M.Si., yang telah membimbing penulis
selama melakukan analisis 16S rRNA di Laboratorium Bioremediasi Puslit
Bioteknologi LIPI, Cibinong; Ibu Sekar Larasati, S.Si., M.Si., Ibu Dra.
Djamhuriyah S. Said, M.Si., Ibu Evy Susanti, S.Si., M.Si., Bapak Drs. Tjandra
C., M.Sc., Adisty Juniar dan rekan-rekan di Laboratorium Mikrobiota Puslit
Limnologi LIPI, Cibinong; suami tercinta Ir. Gunawan Pratama Yoga, M.Sc.,
ayahanda, ibunda, anak-anakku tersayang Mbak Ajeng dan Pipiet, dan seluruh
keluarga untuk kasih sayang, doa, dan dukungannya selama penulis menjalankan
studi.
Penulis menyadari bahwa karya ini masih memiliki banyak kekurangan
dalam berbagai sisi. Karena itu, saran dan kritik bagi penulis akan sangat
berharga untuk perbaikan-perbaikan di masa yang akan datang.
Semoga sekelumit pengetahuan yang penulis tuangkan dalam karya ini
dapat bermanfaat.

Bogor, Agustus 2009

Penulis

RIWAYAT HIDUP

Penulis dilahirkan di Bogor pada tanggal 1 April 1974 dari ayah
Let.Kol.Pol.(Purn.) Emon Sadi dan ibu Nunung R. Pada tanggal 10 Agustus 1997
penulis menikah dengan Ir. Gunawan Pratama Yoga, M.Sc., dan saat ini telah
dikaruniai dua orang putri yaitu Ajeng Meiwita Nurrizky dan Vitaya Nur
Khaleeda.
Setelah lulus dari Sekolah Menengah Analis Kimia Bogor pada tahun
1993, penulis bekerja di Puslit Limnologi LIPI sebagai analis kimia air.
Perkenalan dengan dunia bakteri dimulai pada tahun 2002 ketika penulis
ditugaskan di Laboratorium Mikrobiota pada puslit yang sama. Pada awalnya
penulis banyak ‘bersentuhan’ dengan bakteri fotosintetik anoksigenik dan
metabolisme sulfidanya dalam penerapannya sebagai agen bioremediasi perairan.
Pada tahun 2000 penulis mendapat kesempatan melanjutkan pendidikan
sarjana pada Program Studi Kimia FMIPA Universitas Pakuan, Bogor. Dengan
mengambil tema skripsi mengenai karakteristik penyerapan beberapa logam berat
pada bakteri fotosintetik anoksigenik (BFA), penulis lulus dan memperoleh gelar
Sarjana Sains pada tahun 2005.
Atas dukungan dari Dr. Tri Widiyanto, M.Si., sebagai Kepala Bidang
Produktivitas Perairan Darat Puslit Limnologi LIPI, tahun 2007 penulis

melanjutkan pendidikan pascasarjana S2 pada Program Studi Biokimia, Sekolah
Pascasarjana Institut Pertanian Bogor. Selama mengikuti perkuliahan di Program
Studi Biokimia, penulis sangat tertarik pada bidang enzimologi. Artikel mengenai
pemanfaatan enzim dalam pengolahan limbah pestisida yang dibuat penulis dan
dimuat pada majalah Warta Limnologi tahun 2008, telah di ulas oleh harian
Koran Jakarta pada bulan Oktober 2008.
Saat menjalani studi pascasarjana, pada tahun 2008 penulis mendapat
kepercayaan dari Tanoto Foundation berupa pemberian beasiswa kepada penulis.
Pada tahun yang sama penulis menjadi anggota dari Perhimpunan Biokimia dan
Biologi Molekuler.

IDENTIFIKASI ISOLAT BAKTERI TAHAN KROM(VI) DAN
PENGUJIAN AKTIVITAS ENZIM KROM(VI) REDUKTASE

NINA HERMAYANI SADI

SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2009

PERNYATAAN MENGENAI TESIS DAN SUMBER
INFORMASI
Dengan ini saya menyatakan bahwa tesis IDENTIFIKASI ISOLAT
BAKTERI TAHAN KROM(VI) DAN PENGUJIAN AKTIVITAS ENZIM
KROM(VI) REDUKTASE adalah karya saya sendiri dengan arahan dari Komisi
Pembimbing dan belum diajukan dalam bentuk apapun kepada perguruan tinggi
manapun. Sumber informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan
maupun tidak diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan
dicantumkan dalam Daftar Pustaka di bagian akhir tesis ini.

Bogor, Agustus 2009
Nina Hermayani Sadi
NIM. G851070031

ABSTRACT
NINA HERMAYANI SADI. Identification of Cr(VI)-Resistant Bacteria and
the Study of Its Cr(VI)-Reductase Activity. Under the direction of LAKSMI
AMBARSARI and YOPI.
Cr(VI) (chromate) is a toxic, soluble environmental contaminant. A
Gram-negative, Cr(VI)-resistant bacterium, has been isolated from effluent of
electroplating wastewater treatment reactor. This strain had maximum identity
value as high as 96% to Ralstonia pickettii and Ralstonia sp. M2S3. This value
indicated that the strain was a species of Ralstonia genera. Because of this reason,
the strain was designated as Ralstonia sp. Cr6NS.
Ralstonia sp. Cr6NS was able to grow aerobically in 250 ppm Cr(VI) and
had Cr(VI) reducing-capacity as high as 4,11 x 10-8µg Cr(VI)/hour/cell. From the
study of enzymatic activity, Ralstonia sp. Cr6NS showed the activity of Cr(VI)reductase both in periplasmic and sitoplasmic content. The highest activity was
found in periplasmic matrix. However, the strain seemed not secreting this
enzyme to the external medium.
Keywords: Cr(VI) resistant bacterial, 16S rRNA, Cr(VI)-reductase enzyme ,
periplasm, sitoplasm

RINGKASAN
Nina Hermayani Sadi. Identifikasi Isolat Bakteri Tahan Krom(VI) dan
Pengujian Aktivitas Enzim Krom(VI) Reduktase. Dibimbing oleh LAKSMI
AMBARSARI dan YOPI.
Krom(VI) adalah ion logam berat toksik karena sifatnya sebagai oksidator
kuat dan bersifat mutagenik. Masuknya Cr(VI) ke lingkungan akan menimbulkan
polusi bagi lingkungan tersebut. Industri logam dan pelapisan logam merupakan
industri yang menghasilkan limbah yang mengandung Cr(VI) dalam kisaran 0,1100 mg/L. Salah satu alternatif sistem pengolahan limbah Cr(VI) adalah
pengolahan secara biologis dengan menggunakan bakteri sebagai agen
bioremediasi. Cr(VI) yang toksik direduksi secara enzimatis menjadi Cr(III) yang
kurang toksik dalam sistem ini. Oleh sebab itu, bakteri yang dapat digunakan
sebagai agen bioremediasi Cr(VI) adalah bakteri tahan Cr(VI) yang memiliki
aktivitas enzim Cr(VI) reduktase.
Penelitian ini bertujuan untuk mengisolasi bakteri tahan Cr(VI) dari
reaktor pengolahan limbah pelapisan logam yang terdapat di Laboratorium
Pengendalian Pencemaran Puslit Limnologi LIPI, menyeleksi dan
mengidentifikasi isolat unggul, serta menguji aktivitas enzim Cr(VI) reduktase
dari ekstrak kasar enzim ekstraseluler, enzim periplasma, dan enzim sitoplasma.
Isolat unggul dipilih berdasarkan nilai daya penyisihan Cr(VI) tertinggi.
Identifikasi isolat unggul dilakukan melalui pengamatan morfologi bakteri dan
analisis 16 rRNA. Sebagai substrat pada uji aktivitas enzim digunakan larutan
K2CrO4 dengan konsentrasi akhir 0,2 mM. Diamati juga pengaruh NADH sebagai
donor elektron terhadap aktivitas enzim Cr(VI) reduktase.
Hasil penelitian mendapatkan bahwa 95 isolat bakteri tahan Cr(VI)
berhasil diisolasi dari efluen reaktor pengolahan limbah pelapisan logam. Dari ke95 isolat tersebut ternyata isolat nomor 15 memiliki nilai daya penyisihan Cr(VI)
tertinggi dibanding isolat uji lainnya, yaitu 4,11 x 10-8 µg Cr(VI)/jam/sel bakteri.
Oleh sebab itu isolat nomor 15 dijadikan isolat unggul dan digunakan dalam uji
selanjutnya. Isolat no.15 memiliki bentuk sel batang dan merupakan bakteri Gram
negatif. Bakteri ini merupakan anggota dari genus Ralstonia karena memiliki
kemiripan sebesar 96% dengan dua bakteri dari genus Ralstonia, yaitu Ralstonia
pickettii 12D dan Ralstonia sp. M2S3. Berdasarkan hal ini, isolat nomor 15
selanjutnya diberi nama Ralstonia sp. Cr6NS. Hasil uji aktivitas enzim
menunjukkan bahwa enzim Cr(VI) reduktase terdapat di daerah periplasma dan
sitoplasma bakteri. Aktivitas spesifik enzim terbesar ditemukan di daerah
periplasma dengan nilai aktivitas spesifik 27,30 unit/mg protein. Penambahan
NADH dalam uji aktivitas enzim meningkatkan aktivitas enzim sebesar 17,88%
pada enzim periplasma dan 306,21% pada enzim sitoplasma. Walau di daerah
periplasma terdapat enzim pereduksi Cr(VI), enzim ini tidak disekeresikan ke luar
sel karena dalam medium kutur tidak ditemukan adanya reduksi Cr(VI) dalam uji
aktivitas enzim.
Kata kunci: Bakteri tahan Cr(VI), 16S rRNA, enzim Cr(VI) reduktase,
periplasma, sitoplasma

© Hak Cipta milik Institut Pertanian Bogor, tahun 2009
Hak Cipta dilindungi Undang-Undang
Dilarang mengutip sebagian atau seluruh karya tulis ini tanpa mencantumkan
atau menyebutkan sumber. Pengutipan hanya untuk kepentingan pendidikan,
penelitian, penulisan karya ilmiah, penyusunan laporan, penulisan kritik atau
tinjauan suatu masalah; dan pengutipan tersebut tidak merugikan kepentingan
yang wajar IPB.
Dilarang mengumumkan dan memperbanyak sebagian atau seluruh karya tulis
dalam bentuk apapun tanpa izin Institut Pertanian Bogor.

IDENTIFIKASI ISOLAT BAKTERI TAHAN KROM(VI) DAN
PENGUJIAN AKTIVITAS ENZIM KROM(VI) REDUKTASE

NINA HERMAYANI SADI

Tesis
sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
Magister Sains pada
Program Studi Biokimia

SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2009

Penguji Luar Komisi pada Ujian Tesis: Dr. Ir. I Made Artika, M.App.Sc.

Judul Tesis
Nama
NIM

: Identifikasi Isolat Bakteri Tahan Krom(VI) dan Pengujian
Aktivitas Enzim Krom(VI) Reduktase
: Nina Hermayani Sadi
: G851070031

Disetujui
Komisi Pembimbing

Dr. Laksmi Ambarsari, M.S.
Ketua

Dr. Yopi
Anggota

Diketahui
Ketua Program Studi Biokimia

Dekan Sekolah Pascasarjana

Prof. Dr. drh. Maria Bintang,
M.Si.

Prof. Dr. Ir. Khairil Anwar Notodiputro,
M.S.

Tanggal Ujian: 21 Agustus 2009

Tanggal Lulus:

PRAKATA
Alhamdulillahirabbil’alamin, segenap puja dan puji syukur penulis
panjatkan ke hadirat Allah SWT atas rahmat dan hidayah-Nya yang telah
dilimpahkan kepada penulis sehingga tesis ini dapat diselesaikan. Tesis ini
mengambil tema mengenai identifikasi bakteri tahan krom(VI) dan pengujian
aktivitas enzim pereduksi krom (VI) yang diisolasi dari isolat bakteri tersebut.
Penyusunan tesis bukanlah pekerjaan yang mudah. Tanpa adanya
dukungan dari berbagai pihak tentu sukar bagi penulis untuk menyelesaikan tugas
ini. Oleh sebab itu, penulis mengucapkan terima kasih dengan tulus dan
penghargaan setinggi-tingginya kepada: Ibu Dr. Laksmi Ambarsari, M.S., dan
Bapak Dr. Yopi selaku pembimbing yang telah banyak memberikan masukan dan
pengetahuan baru kepada penulis; Ibu Dr. Ir. Gadis Sri Haryani selaku Kepala
Puslit Limnologi LIPI dan Bapak Dr. Tri Widiyanto, M.Si., selaku Kepala Bidang
Poduktivitas Perairan Darat Puslit Limnologi LIPI yang telah memberikan
dukungan dan fasilitas untuk terlaksananya penelitian ini; Bapak Dr. Ir. I Made
Artika, M.App.Sc. atas koreksi dan masukannya bagi perbaikan tesis ini; Tanoto
Foundation, yang memberi kepercayaan melalui pemberian beasiswa kepada
penulis; Bapak Ahmad Thontowi, S.Si, M.Si., yang telah membimbing penulis
selama melakukan analisis 16S rRNA di Laboratorium Bioremediasi Puslit
Bioteknologi LIPI, Cibinong; Ibu Sekar Larasati, S.Si., M.Si., Ibu Dra.
Djamhuriyah S. Said, M.Si., Ibu Evy Susanti, S.Si., M.Si., Bapak Drs. Tjandra
C., M.Sc., Adisty Juniar dan rekan-rekan di Laboratorium Mikrobiota Puslit
Limnologi LIPI, Cibinong; suami tercinta Ir. Gunawan Pratama Yoga, M.Sc.,
ayahanda, ibunda, anak-anakku tersayang Mbak Ajeng dan Pipiet, dan seluruh
keluarga untuk kasih sayang, doa, dan dukungannya selama penulis menjalankan
studi.
Penulis menyadari bahwa karya ini masih memiliki banyak kekurangan
dalam berbagai sisi. Karena itu, saran dan kritik bagi penulis akan sangat
berharga untuk perbaikan-perbaikan di masa yang akan datang.
Semoga sekelumit pengetahuan yang penulis tuangkan dalam karya ini
dapat bermanfaat.

Bogor, Agustus 2009

Penulis

RIWAYAT HIDUP

Penulis dilahirkan di Bogor pada tanggal 1 April 1974 dari ayah
Let.Kol.Pol.(Purn.) Emon Sadi dan ibu Nunung R. Pada tanggal 10 Agustus 1997
penulis menikah dengan Ir. Gunawan Pratama Yoga, M.Sc., dan saat ini telah
dikaruniai dua orang putri yaitu Ajeng Meiwita Nurrizky dan Vitaya Nur
Khaleeda.
Setelah lulus dari Sekolah Menengah Analis Kimia Bogor pada tahun
1993, penulis bekerja di Puslit Limnologi LIPI sebagai analis kimia air.
Perkenalan dengan dunia bakteri dimulai pada tahun 2002 ketika penulis
ditugaskan di Laboratorium Mikrobiota pada puslit yang sama. Pada awalnya
penulis banyak ‘bersentuhan’ dengan bakteri fotosintetik anoksigenik dan
metabolisme sulfidanya dalam penerapannya sebagai agen bioremediasi perairan.
Pada tahun 2000 penulis mendapat kesempatan melanjutkan pendidikan
sarjana pada Program Studi Kimia FMIPA Universitas Pakuan, Bogor. Dengan
mengambil tema skripsi mengenai karakteristik penyerapan beberapa logam berat
pada bakteri fotosintetik anoksigenik (BFA), penulis lulus dan memperoleh gelar
Sarjana Sains pada tahun 2005.
Atas dukungan dari Dr. Tri Widiyanto, M.Si., sebagai Kepala Bidang
Produktivitas Perairan Darat Puslit Limnologi LIPI, tahun 2007 penulis
melanjutkan pendidikan pascasarjana S2 pada Program Studi Biokimia, Sekolah
Pascasarjana Institut Pertanian Bogor. Selama mengikuti perkuliahan di Program
Studi Biokimia, penulis sangat tertarik pada bidang enzimologi. Artikel mengenai
pemanfaatan enzim dalam pengolahan limbah pestisida yang dibuat penulis dan
dimuat pada majalah Warta Limnologi tahun 2008, telah di ulas oleh harian
Koran Jakarta pada bulan Oktober 2008.
Saat menjalani studi pascasarjana, pada tahun 2008 penulis mendapat
kepercayaan dari Tanoto Foundation berupa pemberian beasiswa kepada penulis.
Pada tahun yang sama penulis menjadi anggota dari Perhimpunan Biokimia dan
Biologi Molekuler.

DAFTAR ISI
Halaman
Daftar Tabel

i

Daftar Gambar

ii

Daftar Lampiran

iii

PENDAHULUAN.......................................................................................

1

TINJAUAN PUSTAKA
Bakteri Tahan Krom .........................................................................
Reduksi Krom (VI) secara Enzimatis pada Beberapa Bakteri .........
16S RNA Ribosoma (rRNA) .....………………………..................
Reaktor Pengolah Limbah Pelapisan Krom .....................................

6
8
11
13

BAHAN DAN METODE
Waktu dan Tempat Penelitian ........................................................
Alat dan Bahan ................................................................................
Metode Penelitian ............................................................................

17
17
18

HASIL DAN PEMBAHASAN
Isolat Bakteri Tahan Krom(VI) .......................................................
Hasil Identifikasi Isolat Unggul Tahan Cr(VI) ...............................
Aktivitas Enzim Cr(VI) Reduktase .................................................

25
28
31

SIMPULAN DAN SARAN ......................................................................

36

DAFTAR PUSTAKA ...............................................................................

37

LAMPIRAN ..............................................................................................

42

DAFTAR TABEL
Halaman
1. Nilai Km dan Vmax dari enzim pereduksi Cr(VI) yang diisolasi dari
beberapa jenis bakteri
2. Hasil pengujian aktivitas enzim Cr(VI) reduktase pada ekstrak
kasar enzim dari isolat Ralstonia sp. Cr6NS

11
33

DAFTAR GAMBAR
Halaman
1. Kerangka pemikiran penelitian ..........................................................
2. Pohon filogenetik rDNA ....................................................................
3. Disain reaktor kolom dan instalasi reaktor kolom pengolahan
limbah cair pelapisn logam dan limbah dari kegiatan analisis
Laboratorium Hidrokimia Puslit Limnologi LIPI ..............................
4. Ukuran Fe(0) yang digunakan dalam reaktor kolom..........................
5. Pertumbuhan koloni di tepi kertas saring pada uji resistensi
terhadap Cr(VI) 250 mg/L .................................................................
6. Bentuk koloni ke enam isolat bakteri tahan Cr(VI) ...........................
7. Bentuk kurva pertumbuhan ke enam isolat bakteri tahan Cr(VI) ......
8. Nilai daya penyisihan isolat bakteri tahan Cr(VI)
..............................
9. Hasil elektroforesis amplikon
.............................................................
10. Hasil pensejajaran urutan basa dari primer 9F pada program
BLASTN ............................................................................................
11. Hasil analisis taksonomi dari genus Ralstonia pada program
BLASTN ............................................................................................
12. Kurva pertumbuhan Ralstonia sp. Cr6NS dalam medium PYECr-25
100% ..................................................................................................
13. Mekanisme penyerapan Cr(VI) oleh sel hidup O. anthropi ...............
14. Pengaruh penambahan NADH sebagai donor elektron terhadap
aktivitas enzim Cr(VI) reduktase .......................................................

5
12

14
15
25
26
27
28
29

30
30
32
34
35

DAFTAR LAMPIRAN
Halaman
1.
2.
3.
4.
5.

Komposisi medium Peptone Yeast Extract (PYE) ...........................
Analisis protein (metoda Bradford) ..................................................
Analisis kadar krom(VI) dengan metoda difenilkarbazida ...............
Bentuk koloni dan bentuk sel isolat bakteri tahan Cr(VI) ................
Kromatogram hasil sekuens 16S rDNA ............................................

42
43
44
45
60

PENDAHULUAN

Latar Belakang
Kromium heksavalen, Cr(VI), merupakan bahan pencemar lingkungan
yang bersifat toksik, mutagenik, dan karsinogenik bagi hampir semua mahluk
hidup (ATSDR, 2001; Sugden, et.al,. 2001). Oksianion kromat (CrO42-) adalah
bentuk Cr(VI) yang paling toksik dan bersifat mudah larut. Struktur kromat yang
mirip ion fosfat dan sulfat menjadikannya lebih mudah masuk melewati membran
sel dengan perantaraan jalur penukaran untuk anion fosfat dan sulfat (Alexander
and Aaseth, 1995; Ohtake, et.el., 1987). Ion Cr(VI) di dalam sel akan direduksi
oleh glutation menjadi Cr(III) melalui pembentukan senyawa antara Cr(V) dan
Cr(IV) dan radikal dari oksigen (ROS) (Goyer, 1986; Shi and Dalal, 1988;
Sumner, et.el. 2005).
Toksisitas Cr(VI) diakibatkan oleh sifat Cr(VI) sebagai oksidator kuat dan
juga karena dalam reaksi reduksinya pada sistem biologis menghasilkan spesiesspesies radikal yang tidak stabil seperti reactive oxygen species (ROS) dan Cr(V)
(ATSDR, 2001; Sumner, et.al., 2005). Potensi genotoksisitas kromium valensi
tinggi dipelajari oleh Sugden, et.al. (2001), secara in vitro dengan menggunakan
kompleks

Cr(V)-organik

dan

oligonukleotida

sintetik

berbasa

25

(5’-

d(ATGGCGTAATCATXGTC-ATAGCTGT)-3’). Kerusakan oksidatif akibat
senyawa antara Cr(V) memacu pembentukan basa termodifikasi, terutama 8-oksoG. Bentuk senyawa ini sangat tidak stabil dan mudah teroksidasi menjadi
guanidinohidantoin (GH) dan spiroiminodihidantoin (SH). GH dan SH telah lama
digunakan sebagai biomarker bagi tingkat keparahan penyakit seperti kanker dan
penuaan (aging). GH dan SH bersifat mutagenik karena menyebabkan kesalahan
penggabungan oposit dimana basa sitosin yang seharusnya bergabung digantikan
oleh adenin. Akibat lanjutnya ketika terjadi replikasi atau transkripsi, basa G akan
digantikan oleh basa T. Walau penelitian ini dilakukan secara in vitro, penemuan
ini dapat menggambarkan mekanisme in vivo dari interaksi kromium dengan
oligonukleotida yang menghasilkan lesi DNA akibat reaksi mutasi transversi G
T.

Jalur utama masuknya Cr(VI) ke dalam tubuh manusia adalah melalui
pernafasan, pencernaan, dan absorpsi oleh kulit. Organ yang menjadi target
toksisitas Cr(VI) yang masuk melalui pernafasan adalah paru-paru sehingga
meningkatkan resiko kanker paru-paru. Pencemaran kromium di udara
disebabkan antara lain oleh hasil pembakaran bahan bakar minyak dan dari
menara pendingin pabrik yang menggunakan bahan kimia yang mengandung
kromat sebagai bahan pencegah karat. Cr(VI) yang kontak dengan kulit akan
menimbulkan gejala dermatitis dan pelepuhan kulit. Penelitian yang dilakukan di
Amerika Serikat mendapatkan bahwa sekitar 20% dari pekerja yang bidang
kerjanya terpapar Cr(VI), seperti pekerja percetakan, tukang cat, penyamakan
kulit, dan pekerja bangunan, menunjukkan gejala alergi dermatitis dalam bentuk
eksim di kulit (ATSDR, 2001).
Studi yang dilakukan Sumner, et.al. (2005), menunjukkan bahwa pada
ragi Saccharomyces cerevisiae toksisitas Cr(VI) terutama disebabkan oksidasi
protein oleh spesies oksigen reaktif (ROS), dibandingkan interaksi ROS dengan
makromolekul lainnya seperti fosfolipid dan DNA. Sejumlah enzim glikolitik dan
heat-shock protein (HSP) menjadi target spesifik perusakan oksidatif akibat Cr.
Toksisitas Cr(VI) pada beberapa tanaman, seperti tebu, buncis, padi,
jagung, dan lain-lain, telah dipelajari. Pemaparan kromium berefek terhadap
proses pertumbuhan dan perkembangan tanaman dan fisiologis tanaman (Shanker,
et.al., 2005). Efek Cr(VI) terhadap respon pertumbuhan alga hijau Chlorella
pyrenoidosa telah dipelajari oleh Hörcsik dan Balogh (2002). Peningkatan
konsentrasi Cr(VI) dengan nyata mempengaruhi pertumbuhan alga ini dengan
nilai EC50 sebesar 1,6 mg/L dan nilai LC50 pada kisaran 20 mg/L, walau pada
konsentrasi yang sangat rendah kromium meningkatkan pertumbuhan alga.
Akumulasi kromium terbesar terdapat pada dinding sel alga, yaitu sebesar 70%,
sementara jumlah kromium pada fraksi membran setara dengan jumlah pada
fraksi terlarut. Masuknya kromium ke dalam sel alga diduga melalui mekanisme
pertukaran ion dengan besi dan terutama magnesium.
Asupan Cr(VI) ke lingkungan perairan berasal dari lingkungan alamiah
dan berbagai industri seperti pertambangan, penyamakan kulit, pelapisan logam,
pengawetan kayu, industri pembuatan zat warna, dan bahan pencegah korosi.

Industri penyamakan kulit dan pengolahan kulit, industri pembuatan baja, dan
industri elektronik dan peralatan listrik merupakan sumber utama limbah
kromium industrial. Konsentrasi Cr(VI) yang terdapat dalam limbah dari ketiga
jenis industri diatas berkisar antara 0,1 – 100 mg/L. Teknologi konvensional
pengolahan limbah yang mengandung Cr(VI) sebagian besar melibatkan metoda
reduksi Cr(VI) secara kimia membentuk Cr(III) yang kurang toksik dan
dilanjutkan dengan tahap pengendapan dalam kondisi basa (Patterson, et.al.,
1998). Menurut Ganguli dan Tripathi (2002), metoda pengolahan limbah Cr(VI)
konvensional membutuhkan bahan kimia dan sumber energi dalam jumlah besar
sehingga cara tersebut secara ekonomis kurang cocok untuk diterapkan pada
industri berskala kecil. Selain itu, studi pendahuluan menunjukkan bahwa reaktor
pengolahan limbah pelapisan logam yang menggunakan metoda reduksi oleh
serbuk besi (dalam bentuk Fe(0) dan Fe(II)) menghasilkan efluen yang
mengandung Fe (II) terlarut 68,062 mg/L dan Fe(III) terlarut 50,383 mg/L.
Sejumlah bakteri telah diketahui kemampuannya dalam mereduksi Cr(VI)
menjadi Cr(III) yang tidak toksik (Bopp, et.al., 1983; Goris, 2001; McLean and
Beveridge, 2001; Michel, et.al., 2001) dan telah dipelajari kemampuannya dalam
pengolahan air yang tercemar Cr(VI) (Bhide, et.al., 1996; Ganguli and Tripathi,
2002). Reduksi Cr(VI) menjadi Cr(III) secara biologis menawarkan suatu
alternatif baru dalam penanganan limbah berCr(VI) karena lebih ekonomis, aman,
dan berkelanjutan (Eccless dalam Ganguli and Tripathi, 2002). Dalam proses
reduksi tersebut, bakteri-bakteri menggunakan berbagai tipe enzim Cr(VI)reduktase (enzim ekstraseluler, enzim sitoplasma terlarut, enzim yang terikat pada
membran plasma, atau sitokrom). Enzim Cr(VI) reduktase yang dimiliki bakteri
memberikan peluang untuk dimanfaatkan dalam mengatasi masalah pencemaran
Cr(VI) di lingkungan perairan dan tanah yang tidak dapat diolah menggunakan
sistem pengolah limbah biologis, atau merupakan pelengkap bagi sistem
pengolahan limbah yang telah ada (Goris, et.al., 2001).
Salah satu aspek penting dalam pengolahan limbah secara biologis dengan
menggunakan bakteri sebagai agen bioremediasi adalah identifikasi bakteri.
Identifikasi bakteri bertujuan untuk memastikan bahwa teknologi yang digunakan
bersifat aman dan tidak membahayakan kesehatan lingkungan sekitar (Tani,

et.al., 2002). Identifikasi bakteri dapat dilakukan melalui pengamatan morfologi,
pengujian biokimia terhadap struktur sel maupun produk yang dihasilkan, atau
melalui pendekatan molekuler. Salah satu metoda identifikasi bakteri secara
molekuler adalah dengan melakukan perbandingan urutan basa 16S RNA
ribosom (rRNA) (Pangastuti, 2006). Identifikasi berdasarkan urutan basa 16S
rRNA telah banyak diterapkan, antara lain dalam bidang kesehatan (Claridge,
et.al., 2004), pertanian (Khakvar, et.al., 2008), dan pertahanan (Sacchi, et.al.,
2002).

Tujuan Penelitian
Penelitian yang telah dilakukan bertujuan untuk mengisolasi bakteri tahan
Cr(VI) berkonsentrasi tinggi dari efluen reaktor pengolahan limbah pelapisan
logam sebagai sumber isolat, menyeleksi isolat unggul, mengidentifikasi isolat
unggul melalui analisis 16S rRNA, melakukan isolasi enzim Cr(VI) reduktase
dari isolat unggul, dan menguji aktivitas enzim Cr(VI) reduktase.

Manfaat Penelitian
Isolat bakteri tahan Cr(VI) diharapkan dapat dimanfaatkan dalam
pengolahan limbah yang mengandung Cr(VI) dan enzim Cr(VI) reduktase yang
dihasilkan oleh bakteri tahan Cr(VI) dapat dimanfaatkan untuk aplikasi lain
seperti biosensors Cr(VI).

Hipotesis
1. Dalam reaktor pengolahan limbah pelapisan logam krom terdapat isolat
bakteri yang tahan terhadap Cr(VI) berkonsentrasi tinggi.
2. Bakteri yang tahan Cr(VI) konsentrasi tinggi dapat mereduksi Cr(VI).
3. Bakteri yang dapat mereduksi Cr(VI) dapat memproduksi enzim Cr(VI)
reduktase.
Kerangka Pemikiran
Reaktor pengolahan limbah pelapisan logam krom yang terdapat di
Laboratorium Pengendalian Pencemaran Puslit Limnologi LIPI adalah pengolah

limbah kimiawi yang menggunakan prinsip reaksi redoks dalam menyisihkan
Cr(VI). Cr(VI) yang berasal dari limbah pelapisan logam dalam reaktor tersebut
direduksi oleh logam besi Fe0 sehingga terbentuk Cr3+ yang kemudian
mengendap bersama-sama Fe3+ hasil oksidasi dan keluar sebagai efluen reaktor.
Efluen reaktor dengan konsentrasi logam-logam yang tinggi diduga mengandung
bakteri yang tahan terhadap logam Cr(VI) yang toksik dengan reaksi reduksi
Cr(VI) secara enzimatis sebagai strategi pertahanannya. Bakteri tahan Cr(VI)
tersebut diisolasi dan diidentifikasi, untuk kemudian dipilih satu isolat unggul
yang memiliki daya penyisihan Cr(VI) tertinggi dan dikarakterisasi sistem enzim
Cr(VI)-reduktase yang dimilikinya. Kerangka pemikiran penelitian ini dapat
dilihat pada Gambar 1.

Efluen Reaktor Pengolahan Limbah Pelapisan Logam
Isolasi Bakteri Tahan Cr(VI)
Pengamatan morfologi (warna dan bentuk koloni, bentuk sel,
pewarnaan Gram), pengelompokan, & pengamatan kurva
pertumbuhan
Uji eliminasi Cr(VI)
Isolat unggul

Analisis
16S rRNA

Ektrasi enzim :
Ekstraseluler, periplasmik,
sitoplasmik
Uji aktivitas enzim

Gambar 1. Kerangka pemikiran penelitian

TINJAUAN PUSTAKA

Bakteri Tahan Krom
Banyak mikroorganisme dapat hidup dan bereproduksi dalam habitat yang
terkontaminasi

logam

berat

seperti

Cr(VI).

Kelompok

Pseudomonas,

Enterobacteria, Streptomyces spp., dan Corynebacteria yang diisolasi dari
sedimen sungai Ottawa yang tercemar limbah industri mampu hidup dalam
medium yang mengandung 100 µg Cr(VI) /L, dengan Pseudomonas sebagai
kelompok yang paling banyak ditemukan (Luli, et.al., 1983). Dari lindi tempat
pembuangan akhir sampah, Larashati (2004) mengisolasi bakteri Bacillus
pumilus, Bacillus firmus, dan Bacillus brevis yang tahan terhadap kromat dalam
konsentrasi tinggi dan mampu menyisihkan kromat dari medium. B. pumilus dan
B. firmus resisten terhadap kromat sampai konsentrasi 500 mg/L, sedangkan
Bacillus brevis resisten sampai konsentrasi kromat mencapai 400 mg/L. Bakteri
jenis Bacillus banyak ditemukan di tempat pembuangan sampah dan ada yang
memiliki resistensi dan kemampuan reduksi terhadap Cr(VI).
Kemampuan mikroorganisme untuk hidup dalam lingkungan yang
terkontaminasi logam berat disebabkan oleh sejumlah mekanisme pertahanan
yang dikembangkan mikroorganisme dalam mengatasi toksisitas logam berat.
Gadd (1990) menyebutkan bahwa mekanisme pertahanan tersebut dapat melalui:
1. Presipitasi atau pembentukan kompleks ekstraseluler.
2. Menurunkan permeabilitas logam atau transport logam melewati membran
sel.
3. Kompartementalisasi intraseluler, antara lain melalui penumpukan dalam
vakuola.
4. Detoksifikasi melalui sejumlah reaksi kimia dalam sel.
Sedangkan menurut Bontidean, et.al. (2000) umumnya daya tahan bakteri
terhadap berbagai jenis logam berat disebabkan adanya suatu faktor penentu yang
memberikan resitensi terhadap satu atau sejumlah kecil logam berat. Mungkin
karena bakteri adalah sel sederhana dengan kompartemen yang sederhana, pada
umumnya resistensi bersifat sederhana untuk satu atau beberapa logam.
Mekanisme resistensi pada bakteri meliputi pengaliran logam keluar sel bakteri

(efluks logam), modifikasi spesies logam, pengurungan logam, atau kombinasi
dari mekanisme tadi. Mayoritas faktor penentu resistensi

logam bersifat

terinduksi oleh ion logam. Sistem metaloregulator yang telah diidentifikasi
hingga saat ini adalah untuk kation atau oksianion Ag, As, Cd, Cr, Cu, Fe, dan Hg
(Bontidean, et. al., 2000).
Terdapat indikasi bahwa resistensi terhadap kromium berkorelasi dengan
keberadaan plasmid pada beberapa isolat (Bopp, et.el., 1983; Luli, et.al., 1983;
Ohtake, et.al. 1987). Pseudomonas fluorescens LB300 yang diisolasi dari
sedimen sungai Hudson yang terkontaminasi kromium dapat tumbuh dalam
medium yang mengandung lebih dari 1,5 mg K2CrO4 per mL atau 200 kali lebih
resisten dibandingkan bakteri lain yang diisolasi dari lokasi yang sama. Resistensi
terhadap Cr(VI) ini diperoleh dari plasmid pLHB1 (Bopp, et.al.,1983). Penelitian
selanjutnya terhadap bakteri yang sama, yaitu Pseudomonas fluorescens LB300,
mendapatkan bahwa adanya plasmid pLBH1 berhubungan dengan penurunan
penyerapan Cr(VI). Strain sensitif-Cr(VI) P. fluorescens LB303 yang tidak
memiliki plasmid, menyerap Cr(VI) 2,2 kali lebih banyak dibandingkan P.
fluorescens LB300 yang resisten-Cr(VI). Selain itu, sensitivitas seluler terhadap
kromat dipengaruhi oleh sulfat (Ohtake, et.al., 1987).
Hasil penelitian Wang, et.al. (1990) mendapatkan bahwa pada
Enterobacter cloacae HO1 yang diisolasi dari lumpur aktif menggunakan CrO42sebagai akseptor elektron pada kondisi anaerob dengan cara mereduksinya. Hal
ini ditandai oleh:
1. Pertumbuhan bakteri dalam kondisi anaerob yang disertai dengan
penurunan krom dalam medium.
2. Aktivitas reduksi-kromat pada sel yang sedang tumbuh dihambat oleh
oksigen.
3. Reduksi terjadi lebih cepat dalam sel yang ditumbuhkan dalam medium
gliserol dan asetat dibandingkan sel yang ditumbuhkan dalam medium
glukosa.
Banyak lingkungan asam yang terjadi secara alami maupun yang
diakibatkan oleh kegiatan manusia kaya akan krom dan logam-logam lainnya.
Pada kondisi yang demikian, toksisitas logam seringkali muncul karena logam-

logam terdapat dalam bentuk yang bioavailable. Penelitian Cummings dan
kawan-kawan (2007) mendapatkan bahwa bakteri pereduksi Fe(III) Acidiphilum
cryptum memiliki toleransi yang tinggi terhadap beberapa logam berat termasuk
Cr(VI) dan mampu mereduksi Cr(VI) melalui dua cara. Cara pertama, Cr(VI)
direduksi secara langsung oleh komponen seluler yang sensitif terhadap Hg2+ dan
tergantung pH (enzim). Reduksi Cr(VI) secara enzimatis ini tidak berhubungan
dengan konservasi energi, tetapi lebih ditujukan sebagai strategi detoksifikasi.
Cara kedua, Cr(VI) direduksi secara tidak langsung melalui perantaraan reaksi
reduksi enzimatis Fe(III) menjadi Fe(II) yang secara cepat mentranspor
elektronnya ke Cr(VI) sehingga tereduksi menjadi Cr(III) dalam tiga kali transfer
elektron. Cara kedua tersebut dapat ditemui pada respirasi mikroba seperti
Shewanell alga strain BrY (Wielinga, et.al., 2001). Pada bakteri tersebut reduksi
besi merupakan proses penerimaan elektron terminal (TEAP, terminal electron
accepting process) yang dominan dan reduksi tak langsung terhadap kromat oleh
hasil samping respirasi tampaknya merupakan jalur reduktif utama seperti pada
reaksi berikut:
¾ C3H5O3 + 3Fe(OH)3  ¾ C2H3O2 + 3Fe2+ + ¾ HCO3 + 2H2O + 5¼ OH (1)
3Fe2+ + HCrO4 + 8H2O  3Fe(OH)3 + Cr(OH)3 + 5H+ (2)

Reduksi Krom (VI) secara Enzimatis pada Beberapa Bakteri
Beberapa penelitian pada sejumlah bakteri yang berbeda mendapatkan
bahwa akumulasi kromium tampaknya melibatkan proses reduksi enzimatis
ekstraseluler atau intraseluler, atau keduanya dengan salah satu proses sebagai
proses reduksi utamanya seperti isolat Pseudomonad CRB5 (Mc Lean, 2000).
Berbagai spesies bakteri mengembangkan sistem reduksi Cr(VI) yang berbedabeda, bahkan pada spesies yang sama seperti Pseudomonas putida PRS2000
(Ishibashi, et.al., 1990) dan Pseudomonas putida MK1 (Park, et.al., 2000)
memiliki enzim terlarut yang sifatnya sangat berbeda yang digunakan untuk
mereduksi Cr(VI).

Pseudomonas putida PRS2000 yang dipelajari oleh Ishibashi dan kawankawan (1990) diketahui memiliki aktivitas enzim kromium reduktase dalam
ekstrak sel, sementara pada fraksi membran sel tidak ditemukan aktivitas
pereduksi krom (VI). Enzim terlarut ini bersifat heat labile dimana pemanasan
pada 50oC selama 10 menit dapat menurunkan aktivitas hingga 40-50%,
sementara pH optimum diperoleh pada kisaran 6,5 – 7,5. Ekstrak enzim dari sel
P. putida PRS2000 membutuhkan NADH atau NADPH sebagai donor elektron
untuk mereduksi kromat. Walau konsentrasi sulfat dalam medium mempengaruhi
sensitivitas seluler terhadap Cr(VI) (sebagai CrO42-) (Ohtake, et.al., 1987),
reduksi kromat tidak dipengaruhi oleh sulfat dan oksianion lain (SO32-, MoO42-,
VO42-, PO42-, dan NO3-), serta Cr3+. Hg2+ dan Ag+ merupakan inhibitor kuat bagi
enzim ini.
Enzim solubel pereduksi Cr(VI) yang didapatkan dari ekstrak periplasma
sel P. putida MK1 (Park, et.al., 2000)

memiliki perbedaan dari P. putida

PRS2000, dimana enzim MK1 memiliki pH optimum 5,0 dan suhu optimum
80oC. Selain itu, enzim MK1 ini dihambat oleh sulfat, sedangkan enzim PRS2000
tidak terhambat. Karena kromat dengan mudah melewati membran sel dan di
dalam sitoplasma bersifat toksik, maka sifat enzim MK1 sebagai protein
periplasmik memberi keuntungan bagi sel karena detoksifikasi kromat dapat
langsung terjadi begitu kromat memasuki sel bakteri.
Proses reduksi enzimatis ekstraseluler ditemukan di bakteri Enterobacter
cloacae HO1, Escherichia coli ATCC 33456, dan Ochrobactrum anthtopi. Wang,
et.al. (1990) mendapatkan bahwa, pada Enterobacter cloacae HO1 dalam kondisi
anaerobik, aktivitas tertinggi enzim yang dapat mereduksi Cr(VI) terdapat di
fraksi membran sel. Aktivitas enzim kromat-reduktase membran paling tinggi
(yaitu sebesar 5,47 µg CrO42-/menit/mg protein) terjadi ketika fenazin metosulfat
yang telah direduksi oleh asam askorbat ditambahkan sebagai donor elektron ke
dalam medium. Pemanasan membran sel pada 100oC selama satu menit
menyebabkan hilangnya aktivitas reduksi (Wang, et.al, 1990). Penelitian terhadap
E. coli ATCC 33456 yang dilakukan Shen dan Wang (1993) mendapatkan bahwa
reduksi Cr(VI) menjadi Cr(III) sebagian besar terjadi dalam medium eksternal.
Sementara penelitian terhadap O. anthropi (Li, et.al., 2008) mendapatkan bahwa

reduksi enzimatis ekstraseluler mendominasi reduksi Cr(VI) dan hanya sebagian
kecil saja Cr(VI) ditemukan di dalam sel dan tereduksi menjadi Cr(III).
Akumulasi kromium dipermukaan sel menyebabkan permukaan sel menjadi
kasar.
Reduksi enzimatis Cr(VI) menjadi Cr(III) secara intraseluler ditemukan
pada P. ambigua G-1 (Suzuki, et.al.,1992), P. putida (Ishibashi et al., 1990;
Park, et.al., 2000; Ackerley, et.al., 2004), dan P.fluorescens (Mc Lean, 2000 dan
2001) yang menggunakan enzim reduktase terlarut yang terdapat di dalam
sitoplasma untuk mereduksi kromat baik secara aerobik maupun anaerobik.
Walau demikian laju reduksi tertinggi terjadi di dalam kondisi anaerobik.
Beberapa enzim yang diketahui memiliki aktivitas pereduksi-Cr(VI) adalah
glutation reduktase, aldehida oksidase, dan sitokrom P-450 (Suzuki, et.al., 1992).
Suzuki, et.al. (1992) mendapatkan bahwa ekstrak sel P. ambigua G-1
membutuhkan 3 mol NADH sebagai donor elektron untuk mereduksi secara
enzimatis 1 mol Cr(VI) menjadi Cr(III). Dalam reaksi ini, Cr(V) terbentuk
sebagai senyawa antara sehingga Suzuki dan kawan-awan menyimpulkan bahwa
reaksi reduksi Cr(VI) adalah reaksi dua tahap. Pertama, Cr(VI) menerima satu
elektron dari satu molekul NADH dan menghasilkan senyawa antara Cr(V).
Tahap kedua, senyawa antara Cr(V) menerima dua elektron dari dua molekul
NADH sehingga terbentuk Cr(III). Tahap pertama terjadi lebih cepat dari tahap
kedua. Pada kedua tahap ini, NADH berubah menjadi NAD+.
Isolat Pseudomonad CRB5 yang berkerabat dekat dengan P. fluorescens
mereduksi

Cr(VI)

menjadi

Cr(III)

menggunakan

enzim

terlarut

yang

kemungkinan besar terdapat di sitoplasma atau di periplasma, sementara pada
fraksi membran plasma tidak ditemukan aktivitas kromat reduktase (Mc Lean,
2000; Mc Lean and Beveridge, 2001). Aktivitas enzim reduktase ini juga
ditemukan dalam medium setelah 48 jam inkubasi. Hal ini mungkin merupakan
suatu proses detoksifikasi ekstraseluler dimana enzim disekresikan ke lingkungan
yang terkontaminasi Cr(VI) atau keberadaannya disebabkan oleh lisis sel yang
mati. Isolat CR5 tidak membutuhkan donor elektron eksternal seperti NADH,
tetapi isolat ini dapat menggunakan sumber elektron endogenus. Walau demikian,

reduksi minor Cr(VI) yang berasosiasi dengan membran ditemukan dalam
kondisi anaerob non-pertumbuhan dengan adanya donor elektron organik.
Tabel 1 menyajikan nilai Km dan Vmax enzim pereduksi Cr(VI) dari
beberapa bakteri. Enzim pereduksi Cr(VI) dari bakteri P. putida, yang telah
dipurifikasi menggunakan kolom Superose 12 HR 10/30, memiliki nilai Km dan
Vmax yang lebih tinggi dibandingkan bakteri lainnya. Metoda pemurnian enzim
mempengaruhi nilai Km dan Vmax enzim.
Tabel 1.

Bakteri
P. putida

Nilai Km dan Vmax dari enzim peredusi Cr(VI) yang diisolasi dari
beberapa jenis bakteri.
Lokasi
Enzim
sitoplasma

Metoda
Purfikasi
Superose
12
HR
10/30
(NH4)2SO4

Donor
Elektron
NADH

Km

NADH

14 µM

374
µM

Bacillus
sp.

sitoplasma

V. harveyi

sitoplasma

Sephadex
G-75

NADH

5,4
µM

P.ambigua

sitoplasma

Sephadex
G-75

NADH

13 µM

Vmax

Pustaka

1,72
µmol/menit/mg
protein
3,8
nmol/menit/mg
protein
10
nmol/menit/mg
protein
27
nmol/menit/mg
protein

Park,
et.al., 2000
Elangovan,
et.al., 2006
Kwak,
et.al., 2003
Kwak,
et.al., 2003

16S RNA Ribosom (rRNA)
RNA ribosom (rRNA) merupakan komponen inti dari mesin pembentuk
protein pada semua makhluk hidup yaitu ribosom. Molekul rRNA bersifat
ubikuitus dengan fungsi yang identik pada seluruh organisme (Pangastuti, 2006).
Ribosom merupakan kompleks ribonukleoprotein yang terdiri atas dua subunit
yaitu subunit kecil (small subunit) dan subunit besar (large subunit). Terdapat
tiga jenis RNA dalam ribosom prokaryot berdasarkan nilai koefisien sedimentasi,
yaitu 5S, 16S, dan 23S rRNA. 16S rRNA merupakan bagian dari subunit kecil
ribosom dan berperan penting dalam pengenalan ujung 5’-mRNA serta
memposisikannya pada letak yang tepat dalam ribosom.
RNA ribosom pada semua sel memiliki daerah yang urutan basanya
sangat lestari dan beberapa daerah yang urutan basanya variatif. Perbandingan
urutan basa yang lestari berguna untuk mengkonstruksi pohon filogenetik karena

mengalami perubahan dengan relatif lambat dan mencerminkan kronologi evolusi
bumi. Sebaliknya, urutan basa yang bersifat variatif dapat digunakan untuk
melacak keragaman dan menempatkan galur-galur dalam satu spesies (Pangastuti,
2006).
Dari tiga jenis rRNA yang dimiliki prokaryot, gen penyandi 16S rRNA
paling sering digunakan sebagai penanda molekuler karena memiliki ukuran basa
yang paling ideal dari segi analisis statistika dibandingkan gen penyandi 5S
rRNA dan 23S rRNA. Molekul 5S rRNA memiliki ukuran basa yang terlalu
pendek sehingga tidak ideal untuk analisis statistika, sementara molekul 23S
rRNA memiliki srtuktur sekunder dan tersier yang cukup panjang sehingga
menyulitkan analisis (Pangastuti, 2006).

Gambar 2. Pohon filogenetik rDNA
(http://lecturer.ukdw.ac.id/dhira/ClassAndPhylo/molPhylogeny.html)

Tingkat kelestarian yang tinggi dan kemudahannya untuk mengukur
variasi dari 16S rRNA menjadikan gen penyandi 16S rRNA (rDNA) secara luas
digunakan pada penentuan taksonomi, filogeni (hubungan evolusioner), dan

memperkirakan laju penyebaran bakteri (Weisburg, et.al., 2001). Penelitian
mengenai kekerabatan evolusioner di antara mikroorganisme berdasarkan
perbandingan urutan basa 16S rDNA dipelopori oleh Carl Woese (Krane and
Raymer, 2003). Berdasarkan urutan basa 16S rDNA, Woese mengajukan tiga
Domain dalam sistem klasifikasi yaitu Archaea, Bacteria, dan Eucarya (Gambar
2). Dua bakteri dapat dikelompokkan dalam satu genus bila memiliki kemiripan
maksimum (maximum identity) > 93% (Hagstrom, et.al., 2002), sementara dua
bakteri dianggap sebagai satu spesies bila memiliki kemiripan maksimum >97%
(Hagstrom, et.al., 2002; Schloss and Handelsman, 2004; Pangastuti, 2006).

Reaktor Pengolah Limbah Pelapisan Krom
Cr(VI) mudah tereduksi oleh Fe(II) di alam (Moore and Ramamoorthy,
1984). Mineral besi yang melimpah, seperti pirit dan mineral besi-sulfur lainnya,
memegang peranan penting dalam siklus geokimia sejumlah unsur-unsur renik
termasuk kromium (Houda, et.al.,2007).
Laboratorium Pengendalian Pencemaran di Puslit Limnologi LIPI telah
mengembangkan reaktor kolom pengolahan limbah cair Cr(VI) yang berasal dari
produk akhir limbah pelapisan logam berdasarkan reaksi reduksi-oksidasi antara
krom dan besi. Disain reaktor tersebut dapat dilihat pada Gambar 8. Spesifikasi
reaktor kolom pengolahan limbah Cr(VI) sebagai berikut:

Dimensi :

Diameter

: 16 cm

Tinggi

: 80 cm

Volume void

: 16 L

Media Reaktor : tinggi 70 cm
Komposisi:

Fe(0) diameter

Karakteristik: Porosity Fe

: 10 mm
: 10,7349%

Bulk sample

: 1,7945 gram/cm3

Q (Loading rate)

: 4 Liter/hari

HRT

: 0,5 day

Superficial Velocity

: 36 cm/hari

Gambar 3. Disain reaktor kolom dan Instalasi reaktor kolom pengolahan
limbah cair pelapisan logam dan limbah dari kegiatan analisis
Laboratorium Hidrokimia P2-Limnologi LIPI.Keterangan: 1. Influent; 2.
Pompa; 3. Flowmeter; 4a. Reaktor kolom 1; 4b. Reaktor kolom 2; 5a.
Effluent 1 (tertutup); 5b. Effluent 2 (tertutup); 6a. Gas Buangan (terbuka,
larutan NaCl); 6b. Gas Buangan (terbuka, larutan NaCl); 7. Gas Port; 8.
Sampling Port
Prinsip reaktor pengolah limbah ini adalah berdasarkan reaksi reduksioksidasi antara Cr(VI) dan Fe(0) yang menghasilkan Cr(III) dan Fe(II) dan
Fe(III). Ketika Fe(0) terendam air anoksik maka akan terjadi korosi secara
elektrokimia dan elektron-elektron dilepaskan pada suatu area (bagian anoda).
Sementara pada bagian katoda ion-ion hidrogen dihasilkan dari disosiasi air untuk
memproduksi atom-atom hidrogen atau molekul-molekul pada daerah katoda:
Fe0  Fe2+ + 2e-

anoda

2H+ + 2e-  H2(g)

katoda

____________________________________
Fe0 + 2H+  Fe2+ + H2(g)

reaksi

Ketika kromat (CrO42-) tersedia, tejadi reaksi sebagai berikut:

Fe0  Fe3+ + 3e2-

ano