UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
percobaan waktu annealing dan extension dengan durasi paling maksimal yaitu pada 20 detik 30 detik, diharapkan mendapatkan hasil
amplifikasi yang maksimal, sebagaimana yang berhasil dilakukan pada primer sapi. Namun hasil percobaan menunjukkan terjadi amplifikasi
pada DNA dagang sapi, DNA gelatin sapi, dan NTC yang seharusnya tidak terjadi amplifikasi lampiran 12. Terbentuknya produk amplifikasi
yang nonspesifik diduga terjadinya amplifikasi dikarenakan terbentuknya primer-dimer atau mis-priming. Oleh karena itu diputuskan untuk
menurunkan waktu extension menjadi 25 detik untuk percobaan selanjutnya.
Pada percobaan dengan waktu annealing 20 detik dan extension 25 detik, didapatkan hasil kurva amplifikasi yang lebih baik dibandingkan
dengan waktu 20 detik 30 detik. Pada percobaan ini, di siklus 45, DNA gelatin babi teramplifikasi tanpa diikuti teramplifikasinya DNA daging
sapi, DNA gelatin sapi, dan NTC. Namun, hasil amplifikasi DNA gelatin babi belum terbentuk kurva Plateau yang menunjukkan bahwa proses
amplifikasi belum selesai. Oleh karena itu, proses amplifikasi dilanjutnya sampai didapatkan kurva yang plateau. Pada siklus 60, DNA gelatin sapi
sudah membentuk kurva amplifikasi yang plateau. Akan tetapi penambahan siklus ini, juga menyebabkan teramplifikasinya DNA yang
tidak mengandung babi, yaitu DNA daging sapi, DNA gelatin sapi, dan NTC yang sebelumnya tidak teramplifikasi gambar 4.6. Peningkatan
kurva amplifikasi pada DNA daging sapi, DNA gelatin sapi, dan NTC disebabkan karena terjadinya amplifikasi yang nonspesifik seperti mis-
priming atau primer-dimer.
4.3.2 Hasil Amplifikasi DNA Gelatin Sapi dan Gelatin Babi Menggunakan Real Time PCR dengan Metode Hydrolysis Probe
a. Hasil Amplifikasi DNA Gelatin dengan Metode Hydrolysis Probe
Menggunakan Primer Sapi
Proses amplifikasi DNA dengan metode Hydrolysis Probe dilakukan dalam tiga tahap, yaitu tahap inisial denaturasi, tahap
amplifikasi, dan tahap pendinginan. Konsentrasi DNA daging sapi; DNA
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
daging babi; DNA gelatin sapi; dan DNA gelatin babi yang digunakan dalam proses amplifikasi masing-masing adalah 8,
59 ngμL; 8,0 ngμL; 19,
38 ngμL; dan 13,63 ngμL. Metode analisis menggunakan Hydrolysis Probe tidak dilakukan optimasi suhu annealing terlebih dahulu. Suhu
annealing yang digunakan dipilih berdasarkan hasil optimasi yang telah dilakukan Rahmawati 2012, yaitu 60
o
C. Hasil amplifikasi DNA gelatin
sapi dan DNA gelatin babi dengan primer sapi dapat dilihat melalui gambar 4.8. dibawah ini.
Gambar 4.8 Kurva Amplifikasi dengan Metode Hydrolysis Probe
Menggunakan Primer-Probe Sapi
Keterangan : DS = Daging sapi; GS = Gelatin Sapi; GB = Gelatin Babi; DB = Daging Babi; NTC = No Template Control; dan CP = Crossing Point
Pada gambar 4.8, daging sapi memberikan nilai CP lebih awal yaitu pada 16,49 meskipun konsentrasi DNA daging sapi yang digunakan
hanya 8, 59 ngμL. Sedangkan gelatin sapi yang memiliki konsentrasi
lebih tinggi yaitu 19, 38 ngμL memberikan nilai CP lebih lama yaitu
pada 29,41. Secara teoritis, seharusnya nilai CP pada DNA gelatin sapi lebih kecil dibandingkan DNA daging sapi. Hal ini sejalan dengan kurva
yang dihasilkan metode SYBR Green yaitu disebabkan karena kemurnian DNA gelatin yang rendah dan DNA gelatin yang banyak terfragmentasi
Glasel, 1995; Edward et al., 1996. Spesifisitas amplifikasi dengan menggunakan Hydrolysis Probe
tidak dapat dianalisa melalui Melting Peaks, karena perbedaan prinsip pewarnaan fluoresens antara metode SYBR Green dengan Hydrolysis
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
Probe. Spesifisitas metode Hydrolysis Probe dilihat berdasarkan kenaikan kurva amplifikasi pada kontrol negatif. Pada gambar 4.8, DNA
daging babi, DNA gelatin babi, dan NTC yang merupakan kontrol negatif, tidak terjadi kenaikan kurva amplifikasi. Hal ini menunjukkan
bahwa primer-probe sapi dapat mengamplifikasi DNA sapi secara spesifik. Oleh karena hal tersebut, metode ini dapat digunakan untuk
analisa lebih lanjut pada sampel yang mengandung gelatin.
b. Hasil Amplifikasi DNA Gelatin dengan Metode Hydrolysis Probe