Hasil Amplifikasi DNA Gelatin dengan Metode Hydrolysis Probe

UIN Syarif Hidayatullah Jakarta percobaan waktu annealing dan extension dengan durasi paling maksimal yaitu pada 20 detik 30 detik, diharapkan mendapatkan hasil amplifikasi yang maksimal, sebagaimana yang berhasil dilakukan pada primer sapi. Namun hasil percobaan menunjukkan terjadi amplifikasi pada DNA dagang sapi, DNA gelatin sapi, dan NTC yang seharusnya tidak terjadi amplifikasi lampiran 12. Terbentuknya produk amplifikasi yang nonspesifik diduga terjadinya amplifikasi dikarenakan terbentuknya primer-dimer atau mis-priming. Oleh karena itu diputuskan untuk menurunkan waktu extension menjadi 25 detik untuk percobaan selanjutnya. Pada percobaan dengan waktu annealing 20 detik dan extension 25 detik, didapatkan hasil kurva amplifikasi yang lebih baik dibandingkan dengan waktu 20 detik 30 detik. Pada percobaan ini, di siklus 45, DNA gelatin babi teramplifikasi tanpa diikuti teramplifikasinya DNA daging sapi, DNA gelatin sapi, dan NTC. Namun, hasil amplifikasi DNA gelatin babi belum terbentuk kurva Plateau yang menunjukkan bahwa proses amplifikasi belum selesai. Oleh karena itu, proses amplifikasi dilanjutnya sampai didapatkan kurva yang plateau. Pada siklus 60, DNA gelatin sapi sudah membentuk kurva amplifikasi yang plateau. Akan tetapi penambahan siklus ini, juga menyebabkan teramplifikasinya DNA yang tidak mengandung babi, yaitu DNA daging sapi, DNA gelatin sapi, dan NTC yang sebelumnya tidak teramplifikasi gambar 4.6. Peningkatan kurva amplifikasi pada DNA daging sapi, DNA gelatin sapi, dan NTC disebabkan karena terjadinya amplifikasi yang nonspesifik seperti mis- priming atau primer-dimer. 4.3.2 Hasil Amplifikasi DNA Gelatin Sapi dan Gelatin Babi Menggunakan Real Time PCR dengan Metode Hydrolysis Probe

a. Hasil Amplifikasi DNA Gelatin dengan Metode Hydrolysis Probe

Menggunakan Primer Sapi Proses amplifikasi DNA dengan metode Hydrolysis Probe dilakukan dalam tiga tahap, yaitu tahap inisial denaturasi, tahap amplifikasi, dan tahap pendinginan. Konsentrasi DNA daging sapi; DNA UIN Syarif Hidayatullah Jakarta daging babi; DNA gelatin sapi; dan DNA gelatin babi yang digunakan dalam proses amplifikasi masing-masing adalah 8, 59 ngμL; 8,0 ngμL; 19, 38 ngμL; dan 13,63 ngμL. Metode analisis menggunakan Hydrolysis Probe tidak dilakukan optimasi suhu annealing terlebih dahulu. Suhu annealing yang digunakan dipilih berdasarkan hasil optimasi yang telah dilakukan Rahmawati 2012, yaitu 60 o C. Hasil amplifikasi DNA gelatin sapi dan DNA gelatin babi dengan primer sapi dapat dilihat melalui gambar 4.8. dibawah ini. Gambar 4.8 Kurva Amplifikasi dengan Metode Hydrolysis Probe Menggunakan Primer-Probe Sapi Keterangan : DS = Daging sapi; GS = Gelatin Sapi; GB = Gelatin Babi; DB = Daging Babi; NTC = No Template Control; dan CP = Crossing Point Pada gambar 4.8, daging sapi memberikan nilai CP lebih awal yaitu pada 16,49 meskipun konsentrasi DNA daging sapi yang digunakan hanya 8, 59 ngμL. Sedangkan gelatin sapi yang memiliki konsentrasi lebih tinggi yaitu 19, 38 ngμL memberikan nilai CP lebih lama yaitu pada 29,41. Secara teoritis, seharusnya nilai CP pada DNA gelatin sapi lebih kecil dibandingkan DNA daging sapi. Hal ini sejalan dengan kurva yang dihasilkan metode SYBR Green yaitu disebabkan karena kemurnian DNA gelatin yang rendah dan DNA gelatin yang banyak terfragmentasi Glasel, 1995; Edward et al., 1996. Spesifisitas amplifikasi dengan menggunakan Hydrolysis Probe tidak dapat dianalisa melalui Melting Peaks, karena perbedaan prinsip pewarnaan fluoresens antara metode SYBR Green dengan Hydrolysis UIN Syarif Hidayatullah Jakarta Probe. Spesifisitas metode Hydrolysis Probe dilihat berdasarkan kenaikan kurva amplifikasi pada kontrol negatif. Pada gambar 4.8, DNA daging babi, DNA gelatin babi, dan NTC yang merupakan kontrol negatif, tidak terjadi kenaikan kurva amplifikasi. Hal ini menunjukkan bahwa primer-probe sapi dapat mengamplifikasi DNA sapi secara spesifik. Oleh karena hal tersebut, metode ini dapat digunakan untuk analisa lebih lanjut pada sampel yang mengandung gelatin.

b. Hasil Amplifikasi DNA Gelatin dengan Metode Hydrolysis Probe

Dokumen yang terkait

Perbandingan Metode Kit Komersial dan SDS untuk Isolasi DNA Babi dan DNA Sapi dari Simulasi Cangkang Kapsul Keras untuk Deteksi Kehalalan Menggunakan Real-Time PCR (Polymerase Chain reaction)

2 12 82

Analisis Cemaran Daging Babi Pada Kornet Sapi di Wilayah Ciputat dengan Menggunakan Metode Polymerase Chain Reaction (PCR)

3 16 72

Deteksi DNA Babi dan DNA Sapi dengan Menggunakan Metode Insulated Isothermal Polymerase Chain Reaction (ii-PCR)

1 9 66

Deteksi DNA Gelatin Sapi Dan Gelatin Babi Pada Simulasi Gummy Vitamin C Menggunakan Real -Time PCR Untuk Analisis Kehalalan

1 11 70

Analisis Cemaran Daging Babi pada Produk Bakso Sapi yang Beredar di Wilayah Ciputat Menggunakan Real- Time Polymerase Chain Reaction (PCR) dengan Metode Hydrolysis Probe.

1 51 86

Perbandingan antara metode SYBR green dan metode hydrolysis probe dalam analisis DNA gelatin sapi dan DNA gelatin babi dengan menggunakan real time PCR

1 33 90

Amplifikasi DNA Leptospira dengan menggunakan metode Insulated Isothermal Polymerase Chain Reaction (ii-PCR)

2 24 64

Analisis Kandungan Gelatin Babi dan Gelatin Sapi pada Cangkang Kapsul Keras yang Mengandung Vitamin A Menggunakan Real-Time Polymerase Chain Reaction

0 13 80

Perbandingan metode KIT komersial dan SDS untuk isolasi DNA babi dan DNA sapi pada simulasi cangkang kapsul keras untuk deteksi kehalalan menggunakan real-time PCR (polymerase chain reaction)

0 12 82

Perbandingan Metode SYBR Green dan Hydrolysis Probe dalam Analisis DNA Gelatin Sapi dan Babi Menggunakan Real Time PCR

0 0 8