Uji aktivitas merkuri reduktase bakteri dari ekosistem air hitam Kalimantan Tengah
UJI AKTIVITAS MERKURI REDUKTASE BAKTERI
DARI EKOSISTEM AIR HITAM KALIMANTAN TENGAH
OLEH
SULASTRI
PROGRAM PASCA SARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
2002
ABSTRAK
SULASTRI. Uji Aktivitas Merkuri Reduktase Bakteri dari Ekosistem Air Hitarn,
Kalimantan Tengah (Mercuric Reductase Activity Assay of Bacteria Isolatedfrom Black
Wafer Ecosystem, Central Kalimantan) Dibimbing oleh DWI ANDREAS SANTOSA
dan MAGGY T. SUHARTONO.
Penelitian ini dilakukan dengan tujuan untuk mengisolasi bakteri pereduksi
merkuri dari Ekosistem Air Hitam (EAH) Kalimantan Tengah serta melakukan uji
aktivitas merkuri reduktase dan identifikasi terhadap isolat terpilih.
Isolasi bakteri pereduksi merkuri dilakukan pada media agar LB yang
mengandung HgC12 20 pg/ml. Isolat yang diperoleh diseleksi lebih lanjut dengan
menumbuhkan pada media agar LB yang mengandung HgC12 lebih tinggi yaitu: 50,
100, 200, 300, 400, 500 dan 1000 pglml. Sebanyak 7 isolat dapat tumbuh pada
konsentrasi HgC12 1000 pg/ml yaitu ICBB 2798, ICBB 2799, ICBB 2810, ICBB 2812,
ICBB 2813, ICBB 2820 dan ICBB 2847. Uji aktivitas merkuri reduktase dilakukan
pada ke-7 isolat tersebut ditambah isolat bakteri pereduksi merkuri koleksi ICBB yaitu
ICBB 1507, ICBB 1508 diisolasi dari EAH Kalimantan Tengah dan ICBB 1506, ICBB
1512 diisolasi dari Pongkor Jawa Barat. Aktivitas merkuri reduktase diukur berdasarkan
oksidasi NADPH pada h 340 nrn mengikuti metode yang dilakukan oleh Ogunseitan
(1 998).
Aktivitas maksimum dari yang paling tinggi berturut-turut adalah isolat ICBB
2813, ICBB 1508, ICBB 2820, ICBB 1507, ICBB ICBB 1506, ICBB 2847, ICBB 281 0,
ICBB 1812, ICBB 1512, ICBB 2799 dan ICBB 2798 berturut-turut sebesar 18,83;
17,51; 15,66; 10,71; 9,08; 9,03; 8,33; 7,OO; 5,94 dan 5,74 pM NADPH mg-'mnf' pada
konsentrasi HgClz 200 pglml, kecuali untuk isolat ICBB 1512 pada 300 pglml, ICBB
1507 pada 400 pg/ml dan ICBB 2799 pada HgCl2 100 pglml. Aktivitas maksimum
merkuri reduktase terjadi pada pH 7 dan suhu 27OC untuk isolat ICBB 2799, ICBB1506
dan ICBB 1507, suhu 37OC untuk isolat ICBB 2810, ICBB 2812, ICBB 2813, ICBB
2820, ICBB ICBB 2798, ICBB 1512, ICBB 1508 dan isolat ICBB 2847 pada suhu
50°C. Semua isolat dapat menggunakan NADH sebagai koenzim, kecuali isolat ICBB
1508 dan ICBB 2820, namun aktivitas yang terukur sangat kecil. Berdasarkan
karakterisasi morfologi dan fisiologi diperoleh hasil bahwa isoiat ICBB 2810 diduga
adalah Escherichia coli-inactive, ICBB 28 13 adalah Aeromonas caviae, ICBB 2820
adalah Hafnia alvei, ICBB 2847 adalah Citrobacter frundii, ICBB 1512 adalah
Pseudomonas psedomallei dan isolat ICBB 1506, ICBB 1507, ICBB 1508 adalah
Enterobacter agglomerans.
SURAT PERNYATAAN
Dengan ini saya menyatakan bahwa tesis yang berjudul :
Uji Aktivitas Merkuri Reduktase Bakteri dari Ekosistem Air Hitam
Kalimantan Tengah
adalah benar merupakan hasil karya saya sendiri dart belurn pernah dipublikasikan.
Semua sumber data dan inforrnasi yang digunakan telah dinyatakan secara jelas dan
dapat diperiksa kebenarannya.
Bogor, Maret 2002
%
UJI AKTIVITAS MERKURI REDUKTASE BAKTERI
DARI-EKOSISTEM AIR HITAM KALIMANTAN TENGAH
SULASTRI
Tesis
Sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
Magister Sains pada
Program Studi Ilmu Tanah
PROGRAM PASCA SARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
2002
Judul Tesis
: Uji Aktivitas Merkuri Reduktase Bakteri Dari Ekosistem Air
Nama Mahasiswa
: Sulastri
: 99747
: Ilmu Tanah
Hitam Kalimantan Tengah
NRP
Program Studi
Menyetujui,
1. Komisi Pembimbing
/yA
,-'
Dr. Ir.
Ketua
2. Ketua Program Studi Ilmu Tanah
Prof. Dr. Ir. H. Sudarsono, MSc
Tanggal Lulus : 19 Maret 2002
Prof. Dr. Ir. Magw T. Suhartono
Anggota
RIWAYAT HIDUP
Penulis dilahirkan di Cilacap, Jawa Tengah pada tanggal 22 Januari 1975
sebagai anak pertama pada keluarga Bapak Ir. Kasno Djumar dan keluarga Ibu
Admilah. Pendidikan SD diselesaikan pada tahun 1987 dan pendidikan SMP
diselesaikan pada tahun 1990 di Cilacap. Penulis lulus dari SMAN I Cilacap pada
tahun 1993. Selanjutnya pada tahun 1994 penulis diterima di Program Studi Agronomi
Jurusan Budidaya Pertanian pada Universitas Jenderal Soedinnan, Purwokerto dan lulus
tahun 1999. Pada semester genap tahun ajaran 1999/2000 tepatnya Februari 2000,
penulis diterima pada Program Studi Ilmu Tanah, Program Pascasarjana Institut
Pertanian Bogor .
PRAKATA
Puji dan syukur penulis panjatkan kehadirat Allah SWT atas segala rahmat
karunia-Nya sehingga penulis dapat menyelesaikan penelitian dan penulisan tesis ini.
Tesis ini disusun sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Magister Sains
pada Program Pasca Sarjana di Institut Pertanian Bogor.
Penulis menyampaikan ucapan terima kasih dan penghargaan yang setinggitingginya kepada :
1. Bapak Dr. Ir. Dwi Andreas Santosa, MS selaku pembimbing dan juga selaku
Direktur Indonesian Center For Biodiversity And Biotechnology (ICBB) yang
telah memberikan dukungan dana bagi pelaksanaan penelitian ini. Perhatian,
dorongan semangat, bimbingan, saran, arahan dan keteladanan beliau sangat
membantu penulis dalam menyelesaikan semua pekerjaan ini.
2. Ibu Prof. Dr. Ir. Maggy T. Suhartono selaku pembimbing yang telah banyak
memberikan dukungan, bimbingan, saran, serta arahan selama penelitian dan
penulisan tesis ini.
3. Kepala Lababoratorium PPLH IPB, Kepala Laboratorium Biologi Tanah
Faperta IPB, dan Kepala Laboratorium Pusat Antar Universitas Bioteknologi
IPB, yang telah memberikan ijin untuk penggmaan Laboratoriurn beserta
fasilitasnya.
4. Bapak Dr. Ir. H. Sudarsono, MSc, Dr. Ir. Gunawan Djajakirana, MSc., clan
seluruh staf Program Studi Ilmu Tanah Pascasarjana IPB atas semua bimbingan
bantuan dan perhatiannya.
5. Staf Lababoratorium PPLH IPB: Pak Ade, Pak Gamal, Pak Hendrik dan Pak
Deni, staf Laboratoriurn Biologi Tanah Faperta IPB: Pak Sarjito, Ibu Asih, Ibu
Juleha dan staf Laboratorium PAU Bioteknologi IPB: Ibu Ika, Mbak Ari, Pak
Eddy dan Pak Mulya.
6. Rekan-rekan di Lab. Mikrobiologi PPLH IPB: Mbak Rina, Mbak Donna, Rizal,
Pak IWB. Suyasa, Bu Umi, Bu Yus, Bu Saida, Pak Heru, Pak Puji, Bu Etik,
Reza, Mbak Neni, dan Mbak Amah atas bantuan, kebersamaan dan
kejasarnanya.
7. Teman-teman di Program Studi Ilmu Tanah: Ninuk, Mbak Desi, Bu Deni, Pak
Wayan, Uut, Bu Hanum, Pak Kasno, Pak Mulxadi, dan semua teman-teman
angkatan 1999 dan 2000 serta semua angota HMPIT atas bantuan,
persahabatan dan kebersamaannya selama ini, serta semua pihak baik secara
langsung ataupun tidak langsung yang telah berperan dalarn pelaksanaan
penelitian ataupun penulisan tesis ini.
8. Secara khusus penulis mengucapkan terima kasih kepada "Ayah" Ir. Kasw
Djumar dan "Ibu" Admilah, Mbah Deje (alm), Mbah Siti, Om Nano, Om PayTante Susi, Tante Nia-Om Hojin, adiku Adri, Rudi dan Ibu Olga sekeluarga
atas doa, dorongan semangat, perhatian dan kasih sayangnya, serta Dede Ace1
dan Kevina yang selalu memberi keceriaan.
Bogor, Maret 2002
Penulis
DAFTAR IS1
DAFTAR TABEL ........................................................................................
DAFTAR GAMBAR ....................................................................................
DAFTAR LAMPIRAN .................................................................................
PENDAHULUAN ........................................................................................
Latar Belakang .......................................................................................
Tujuan Penelitian ...................................................................................
TINJAUAN PUSTAKA ...............................................................................
Merkuri ..................................................................................................
Mekanisme Detoksifikasi Merkuri ........................................................
Faktor-faktor yang Mempengaruhi Aktivitas Enzim .............................
Tanah Sebagai Habitat Mikroba ............................................................
Ekosistem Air Hitam .............................................................................
BAHAN DAN METODE .............................................................................
Tempat dan Waktu ...............................................................................
Bahan dan Alat .......................................................................................
Metode ...................................................................................................
HASIL DAN PEMBAHASAN .....................................................................
Isolasi dan Seleksi Bakteri Pereduksi Merkuri ...................................
Aktivitas Merkuri Reduktase pada Berbagai Konsentrasi HgC12 .......
Kinetika Merkuri Reduktase ...............................................................
Pengaruh pH Terhadap Aktivitas Merkuri Reduktase ........................
Pengaruh Suhu Terhadap Aktivitas Merkuri Reduktase .....................
Penggunaan NADH Sebagai Koenzim ..............................................
Identifikasi Bakteri Pereduksi Merkuri ...............................................
KESIMPULAN DAN SARAN ....................................................................
Kesimpulan ............................................................................................
Saran ......................................................................................................
DAFTAR PUSTAKA ...................................................................................
Halaman
vi
DAFTAR TABEL
Halaman
1 . Mekanisme transformasi merkuri ...........................................................
2. Klasifikasi enzim secara internasional berdasarkan atas reaksi yang dikatalisis
3 . Hasil seleksi bakteri pereduksi merkuri ..................................................
4 . Hasil uji aktivitas enzim pada berbagai konsentrasi HgClz ....................
5 . Hasil pengujian aktivitas enzim pada konsentrasi HgClz 1000 d m 1 ....
6 . Hasil uji aktivitas enzim dengan NADH sebagai koenzim .....................
7. Karakterisasi morfologi isolat terpilih ....................................................
8. Karakterisasi fisiologi isolat terpilih .......................................................
5
8
21
23
26
33.
35
36
DAFTAR GAMBAR
1. Proses detoksifikasi merkuri pada bakteri resisten merkuri .....................
8
2. Model operon mer ....................................................................................
9
3. Mekanisme reduksi H ~ menjadi
~ + ~ ~ O ~~seudomonas
a d a
aeruginosa ...
9
merkuri reduktase.....................................
17
4. Skema deteksi kalorimetrik
5. Aktivitas merkuri reduktase dari (a) isolat ICBB 1506,ICBB 1507,ICBB
1508,ICBB 1512,ICBB 2798,ICBB 2810,dan (b) isolat ICBB 2799,
ICBB 2812, ICBB 2813, ICBB 2820, ICBB 2847, pada berbagai
konsentrasi HgC12 ...................................................................................
25
................
7. Aktivitas merkuri reduktase pada berbagai pH ........................................
8. Aktivitas merkuri reduktase pada berbagai suhu .....................................
28
9. Hasil foto isolat bakteri pereduksi merkuri pada pembesaran 400x ........
37
6. Kinetika merkuri reduktase pada konsentrasi HgC1250 pg/ml
29
30
DAFTAR LAMPIRAN
Halaman
1 . Daftar sampel tanah dari EAH Kalimantan Tengah yang diisolasi
.......
2. Pembuatan larutan stok ..........................................................................
3 . Kurva pertumbuhan bakteri pada konsentrasi HgC1250 pg'ml yang
diturnbuhkan pada 50 ml media cair LB .................................................
4 . Kurva standar protein .............................................................................
5 . Kurva standar NADPH ...........................................................................
6. Kurva standar NADH .............................................................................
43
43
PENDAHULUAN
Latar Belakang
Pembuangan limbah yang tidak layak, penyalahgunaan bahan kimia dan efek
dari penggunaan bahan kimia yang menyebabkan pelepasan senyawa organik dan
anorganik beracun ke lingkungan telah menyebabkan pencemaran terhadap tanah,
air tanah dan wilayah perairan. Limbah bahan beracun dan berbahaya (B3) yang
telah mencemari lingkungan terutama adalah golongan logam berat (Co, A g Sb, Cd,
Cr, Zn, Au, Mn,Sn, Hg, Mo, Pd, Pb dan Ti). Salah satu logam berat yang bersifat
meracun dan telah masuk lingkungan dalam jurnlah yang cukup banyak adalah
merkuri (Hg).
Sumber terbesar pelepasan senyawa merkun ke lingkungan adalah
pembakaran batu b a a dan produk minyak bumi yang secara alami kaya den@
merkuri. Deposit alam (ore) yang mengandung merkuri tersebar pada batuan, tanah,
udara dan air. Cinnabar (merkuri sulfida) adalah bentuk mineral yang paling umum
ditemukan di alam. Menurut Dugan (1974), pada batuan sedimen, organrc-nch
shale dan minyak bumi mentah kandungan merkurinya mencapai 20.000 pbb.
Sumber pencemaran merkuri yang juga cukup banyak adalah dari industri
pertarnbangan, terutama yang tanpa izin seperti penambangan emas rakyat. Merkuri
digunakan untuk memisahkan emas dari pasir sungai. Industri lain yang potensial
mengeluarkan limbah merkuri adalah industri pupuk. Pada industri pupuk, gas yang
digunakan pada proses produksinya banyak mengandung merkuri. Industri soda
kausatik yang banyak diperlukan pabrik kertas, baterai dan kosmetik j u g banyak
menghasilkan limbah merkuri. Fenil merkuri, merthiolat dan merkurokrom
digunakan dalam peralatan nunah tangga dan digunakan sebagai desinfektan pada
rumah sakit. Fenil merkuri dm metil merkuri digunakan dalam pertanian sebagai
v
fungisida, insektisida dan bakteriosida (Misra, 1992).
Banyaknya pelepasan merlnui dari berbagai sumber tersebut telah
mengakibatkan permasalahan lingkungan yang cukup serius. Beberapa peneliti
melaporkan bahwa kandungan Hg pada beberapa jenis biota tambak di Teluk Jakarta
sudah mencapai tingkat mengkhawatirkan, yaitu antara 0 sampai 7,9 pg Hg/g biota
basah, pada udang rata-rata 1,19 pg Hg/g udang basah, pada ikan 1,23 pg HgJg ikan
basah dan pada rajungan 3,72 pg Hglg rajungan basah (Anonim, 1991). WHO
menetapkan kadar Hg yang diizinkan adalah 0,s pg Hglg ikan basah. Selain itu
Sungai Cisadane, Ciliwung dan Sunter juga mengalami tingkat pencemaran yang
sudah sangat mengkhawatirkan. Kandungan merkuri di Sungai Cisadane mencapai
3,33 pbb, jauh diatas baku mutu konsumsi yang 1 pbb.
Sungai Kenjeran di
Surabaya juga mengalami ha1 yang serupa akibat dari pembuangan limbah industri
dan limbah nunah tangga yang memadati areal sepanjang sungai (Anonim, 2000).
Sementara itu pencemaran merkuri di Pasaman Sumatra Barat juga telah melebihi
arnbang batas. Hasil penelitian yang dilakukan oleh Bapedalda di desa Talang
Babungo Kecarnatan Lembah G h a n t i Kabupaten Solok dan Batang Palangki
Kabupaten Sawahlunto/Sijunjung menemukan bahwa dari 100 pekerja tambang
kadar merkuri yang ditemukan sebesar 11,7-89 mgkg rambut. Jumlah tersebut
masuk dalam koridor pencemaran merkuri di Minamata yaitu antara 17,7-705 mglkg
rambut. Penelitian di Batang Malandu dan Batang Masus, menemukan limbah yang
mencemari air sungai sudah mencapai 0,172 mg Hg/liter air (Anonim, 2001).
Berbagai usaha untuk membersihkan lingkungan dari bahan pencemar
berbahaya telah banyak dilakukan dan teknologi yang digunakan juga semakin
-
.
-
berkembang. Berbagai macam teknologi diantaranya adalah pembenarnan, vapor
extraction, stabilisasi dan solidifikasi, soil washing, soil jlushing, critical fluid
extraction, presipitsi kimia, vitrification, desorpsi thermal dan pembakaran
(Skadany dan Meeting, 1993). Teknologi fisikokimia yang telah banyak dilakukan
pada beberapa industri yang menghasilkan lirnbah berbahaya tersebut tidak dapat
secara nyata memusnahkan senyawa-senyawa yang berbahaya, bahkan kadangkadang justru bertarnbah.
Adanya dampak negatif dari teknologi tersebut
mendorong berkembangnya penerapan metode bioremediasi diatas pemukaan tanah
(ex situ) dan di dalam tanah (in situ).
Bioremediasi adalah merupakan proses penyehatan (remediasi) secara
biologis terhadap komponen lingkungan, tanah dan air yang telah tercemar oleh
kegiatan manusia (Sa'id dan Fauzi, 1996). Metode ini sangat dibutuhkan untuk
mengatasi dampak negatif dari metode fisikokimia dan sangat penting untuk
digunakan bersama dengan teknologi yang lain agar usaha perlindungan tanah akibat
pencemaran bahan-bahan berbahaya berhasil dengan baik. Bakteri resisten merkuri
merupakan salah satu mikroorganisme yang dapat digunakan dalam metode
bioremediasi. Bakteri resisten merkun dapat mereduksi H$ menjadi bentuk inert
dan volatile (H~') yang kemudian didihsikan keluar sel melalui membran sel.
Proses ini berlangsung secara intraseluler oleh merkun reduktase (Gupta et al.,
1999). Bakteri pereduksi merkuri dapat ditemukan pada bakteri Gram positif
maupun Gram negatif
Ekosistem Air Hitam (Black Water Ecosystem), suatu ekosistem yang
dicirikan dengan kondisi airnya yang berwarna inerah kehitaman jernih dan
memiltki komposisi flora dan fauna khas
dan terbentuk melalui proses yang
berlangsung lebih dari 5000 tahun. Ekosistem unik semacarn ini tidak hanya penting
karena jenis flora dan fauna khas yang dimilikinya, tetapi yang lebih penting adalah
terdapatnya rnikroba-mikroba yang niampu hidup dalam kondisi ekstrim baik pada
pH rendah (acidofilik), pH tinggi (alkalofilik), suhu tinggi (termofilik), serta
mikroba-mikroba lain yang memiliki potensi untuk dikembangkan dalam industri
bioteknologi dan bioremediasi.
Pada Ekosistem Air Hitam ini telah berhasil
dieksplorasi bakteri pendegradasi minyak bumi dengan kemampuan mendegradasi
minyak bumi yang tinggi (18,69°/~0,49%), bakteri penghasil protease dengan
aktivitas yang cukup tinggi juga (1,5-3 UNmVmnt), bakteri perombak fenol, bakteri
penghasil selulosa dan lain-lain (Santosa et al., 2000).
Berdasarkan ha1 tersebut, diperkirakan pada Ekosistem Air Hitarn (EAH)
juga dapat ditemukan bakteri resisten merkuri yang memiliki potensi yang tinggi,
dimana nantinya diharapkan dapat digunakan untuk mengatasi pencemaran oleh
merkuri baik pada lahan pertanian maupun daerah perairan.
Tujuan Penelitian
Penelitian ini bertujuan untuk :
1. Mengisolasi bakteri resisten merkuri dari Ekosistem Air Hitam Kalimantan
Tengah.
2. Melakukan pengujian aktivitas merkuri reduktase terhadap isolat terpilih.
3. Melakukan identifikasi terhadap isolat yang mempunyai aktivitas merkuri
reduktase tinggi.
TINJAUAN PUSTAKA
Merkuri
Pelepasan merkuri dan senyawa merkuri dari sumber antropogenik dan
geogenik telah menyebabkan pencemaran air, tanah, sedirnen dan atmosfer. Merkuri
dan senyawa merkuri toksisitasnya sangat tinggi karena reaktif terhadap gugus
sulfihdril pada molekul-molekul yang aktif secara biologi, sehingga menyebabkan
molekul-molekul tersebut tidak aktif. Selain itu jika telah mas& lingkungan, polutan
merkuri cepat tersebar luas karena mobilitasnya sangat tinggi dan dapat terkonsentrasi
melalui rantai makanan (Chang et al. 1999).
Transformasi merkuri di alam dapat terjadi secara biologi dan non biologi
seperti yang ditunjukan pada Tabel 1 dibawah ini.
Tabel 1 . Mekanisme transformasi merkuri (Barkay, 1992).
Biologi
Reduksi Hg2+
Enzimatik :
Merkuri reduktase
Demetilasi
Enzimatik:
Organomerkurial
Iiase
Tidak langsung:
reduksi metabolit
Non biologi
Radikal bebas
berasosiasi dengin
senyawa humik
Metilasi
Transfer gugus metil
oleh korinoid koenzim
(bakteri)
Sintesis metionin
(fungi)
Protonolitik
pada Asarn humik dan hlfik
ikatan C-Hg (reaksi
sangat lambat)
Fotolisis
Metilasi CH3Hg'
menjadi (CH3)zHg
dengan adanya H2S
Merkuri di alam terdapat dalarn empat bentuk yaitu H
ion merkuri
~ Oatau
logam merkuri,
( ~ 2 3alkil
, merkuri (metil merkuri dan dimetil merkuri) dan sebagai
ligan dengan sulfida (HgS). Toksisitas yang tinggi dari merkuri terhadap lingkungan
disebabkan oleh : ( I ) afinitas yang tinggi dari H$ dan organomerkuri terhadap gugus
thiol, (2) kecenderungan untuk membentuk ikatan kovalen dengan molekul organik,
(3) stabilitas yang tinggi dari ikatan Hg-C yang menyebabkan afinitasnya rendah
terhadap oksigen dm, (4) memiliki kecenderungan yang kuat untuk memaksimalkan
ikatan 2 ligan dalam struktur kimia linier (Barkay, 1992).
Merkuri di atmosfer berada dalam bentuk gas atau diabsorpsi menjadi partikel
(Hapl). Fraksi gas terdiri dari H$, C H ~ H ~Hg2+,
+ , (CH3)zHg dan bentuk terklorinasi.
Keberadaan merkuri di atmosfer tergantung pada kondisi fisikokimia atmosfer. Pada
kondisi masam, H$ teroksidasi oleh H202 (terbentuk dari reaksi Hz0 dengan 03)
menjadi Hg2+ dengan reaksi yang sangat lambat.
Selanjutnya dengan adanya
penambahan H~~~ ke sedimen, H~~~ ini akan mengalami metilasi dengan
methylocobalamin (B 12) sebagai donor menjadi metil merkuri yang merupakan
bentuk yang sangat stabil. Proses metilasi merkuri dapat juga terjadi oleh bakteri
yang terdapat pada insang, perut ikan atau organ ikan yang lain secara langsung. Pada
sedimen mikroorganisme aerob sebagaimana juga mikroorganisme anaerob, dapat
juga membentuk metil merkuri (Silver dan Kinscherf, 1982).
meningkat dengan meningkatnya tempera-
Metil merkuri
dan konsentrasi H$+ dan optimal pada
pH
DARI EKOSISTEM AIR HITAM KALIMANTAN TENGAH
OLEH
SULASTRI
PROGRAM PASCA SARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
2002
ABSTRAK
SULASTRI. Uji Aktivitas Merkuri Reduktase Bakteri dari Ekosistem Air Hitarn,
Kalimantan Tengah (Mercuric Reductase Activity Assay of Bacteria Isolatedfrom Black
Wafer Ecosystem, Central Kalimantan) Dibimbing oleh DWI ANDREAS SANTOSA
dan MAGGY T. SUHARTONO.
Penelitian ini dilakukan dengan tujuan untuk mengisolasi bakteri pereduksi
merkuri dari Ekosistem Air Hitam (EAH) Kalimantan Tengah serta melakukan uji
aktivitas merkuri reduktase dan identifikasi terhadap isolat terpilih.
Isolasi bakteri pereduksi merkuri dilakukan pada media agar LB yang
mengandung HgC12 20 pg/ml. Isolat yang diperoleh diseleksi lebih lanjut dengan
menumbuhkan pada media agar LB yang mengandung HgC12 lebih tinggi yaitu: 50,
100, 200, 300, 400, 500 dan 1000 pglml. Sebanyak 7 isolat dapat tumbuh pada
konsentrasi HgC12 1000 pg/ml yaitu ICBB 2798, ICBB 2799, ICBB 2810, ICBB 2812,
ICBB 2813, ICBB 2820 dan ICBB 2847. Uji aktivitas merkuri reduktase dilakukan
pada ke-7 isolat tersebut ditambah isolat bakteri pereduksi merkuri koleksi ICBB yaitu
ICBB 1507, ICBB 1508 diisolasi dari EAH Kalimantan Tengah dan ICBB 1506, ICBB
1512 diisolasi dari Pongkor Jawa Barat. Aktivitas merkuri reduktase diukur berdasarkan
oksidasi NADPH pada h 340 nrn mengikuti metode yang dilakukan oleh Ogunseitan
(1 998).
Aktivitas maksimum dari yang paling tinggi berturut-turut adalah isolat ICBB
2813, ICBB 1508, ICBB 2820, ICBB 1507, ICBB ICBB 1506, ICBB 2847, ICBB 281 0,
ICBB 1812, ICBB 1512, ICBB 2799 dan ICBB 2798 berturut-turut sebesar 18,83;
17,51; 15,66; 10,71; 9,08; 9,03; 8,33; 7,OO; 5,94 dan 5,74 pM NADPH mg-'mnf' pada
konsentrasi HgClz 200 pglml, kecuali untuk isolat ICBB 1512 pada 300 pglml, ICBB
1507 pada 400 pg/ml dan ICBB 2799 pada HgCl2 100 pglml. Aktivitas maksimum
merkuri reduktase terjadi pada pH 7 dan suhu 27OC untuk isolat ICBB 2799, ICBB1506
dan ICBB 1507, suhu 37OC untuk isolat ICBB 2810, ICBB 2812, ICBB 2813, ICBB
2820, ICBB ICBB 2798, ICBB 1512, ICBB 1508 dan isolat ICBB 2847 pada suhu
50°C. Semua isolat dapat menggunakan NADH sebagai koenzim, kecuali isolat ICBB
1508 dan ICBB 2820, namun aktivitas yang terukur sangat kecil. Berdasarkan
karakterisasi morfologi dan fisiologi diperoleh hasil bahwa isoiat ICBB 2810 diduga
adalah Escherichia coli-inactive, ICBB 28 13 adalah Aeromonas caviae, ICBB 2820
adalah Hafnia alvei, ICBB 2847 adalah Citrobacter frundii, ICBB 1512 adalah
Pseudomonas psedomallei dan isolat ICBB 1506, ICBB 1507, ICBB 1508 adalah
Enterobacter agglomerans.
SURAT PERNYATAAN
Dengan ini saya menyatakan bahwa tesis yang berjudul :
Uji Aktivitas Merkuri Reduktase Bakteri dari Ekosistem Air Hitam
Kalimantan Tengah
adalah benar merupakan hasil karya saya sendiri dart belurn pernah dipublikasikan.
Semua sumber data dan inforrnasi yang digunakan telah dinyatakan secara jelas dan
dapat diperiksa kebenarannya.
Bogor, Maret 2002
%
UJI AKTIVITAS MERKURI REDUKTASE BAKTERI
DARI-EKOSISTEM AIR HITAM KALIMANTAN TENGAH
SULASTRI
Tesis
Sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
Magister Sains pada
Program Studi Ilmu Tanah
PROGRAM PASCA SARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
2002
Judul Tesis
: Uji Aktivitas Merkuri Reduktase Bakteri Dari Ekosistem Air
Nama Mahasiswa
: Sulastri
: 99747
: Ilmu Tanah
Hitam Kalimantan Tengah
NRP
Program Studi
Menyetujui,
1. Komisi Pembimbing
/yA
,-'
Dr. Ir.
Ketua
2. Ketua Program Studi Ilmu Tanah
Prof. Dr. Ir. H. Sudarsono, MSc
Tanggal Lulus : 19 Maret 2002
Prof. Dr. Ir. Magw T. Suhartono
Anggota
RIWAYAT HIDUP
Penulis dilahirkan di Cilacap, Jawa Tengah pada tanggal 22 Januari 1975
sebagai anak pertama pada keluarga Bapak Ir. Kasno Djumar dan keluarga Ibu
Admilah. Pendidikan SD diselesaikan pada tahun 1987 dan pendidikan SMP
diselesaikan pada tahun 1990 di Cilacap. Penulis lulus dari SMAN I Cilacap pada
tahun 1993. Selanjutnya pada tahun 1994 penulis diterima di Program Studi Agronomi
Jurusan Budidaya Pertanian pada Universitas Jenderal Soedinnan, Purwokerto dan lulus
tahun 1999. Pada semester genap tahun ajaran 1999/2000 tepatnya Februari 2000,
penulis diterima pada Program Studi Ilmu Tanah, Program Pascasarjana Institut
Pertanian Bogor .
PRAKATA
Puji dan syukur penulis panjatkan kehadirat Allah SWT atas segala rahmat
karunia-Nya sehingga penulis dapat menyelesaikan penelitian dan penulisan tesis ini.
Tesis ini disusun sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Magister Sains
pada Program Pasca Sarjana di Institut Pertanian Bogor.
Penulis menyampaikan ucapan terima kasih dan penghargaan yang setinggitingginya kepada :
1. Bapak Dr. Ir. Dwi Andreas Santosa, MS selaku pembimbing dan juga selaku
Direktur Indonesian Center For Biodiversity And Biotechnology (ICBB) yang
telah memberikan dukungan dana bagi pelaksanaan penelitian ini. Perhatian,
dorongan semangat, bimbingan, saran, arahan dan keteladanan beliau sangat
membantu penulis dalam menyelesaikan semua pekerjaan ini.
2. Ibu Prof. Dr. Ir. Maggy T. Suhartono selaku pembimbing yang telah banyak
memberikan dukungan, bimbingan, saran, serta arahan selama penelitian dan
penulisan tesis ini.
3. Kepala Lababoratorium PPLH IPB, Kepala Laboratorium Biologi Tanah
Faperta IPB, dan Kepala Laboratorium Pusat Antar Universitas Bioteknologi
IPB, yang telah memberikan ijin untuk penggmaan Laboratoriurn beserta
fasilitasnya.
4. Bapak Dr. Ir. H. Sudarsono, MSc, Dr. Ir. Gunawan Djajakirana, MSc., clan
seluruh staf Program Studi Ilmu Tanah Pascasarjana IPB atas semua bimbingan
bantuan dan perhatiannya.
5. Staf Lababoratorium PPLH IPB: Pak Ade, Pak Gamal, Pak Hendrik dan Pak
Deni, staf Laboratoriurn Biologi Tanah Faperta IPB: Pak Sarjito, Ibu Asih, Ibu
Juleha dan staf Laboratorium PAU Bioteknologi IPB: Ibu Ika, Mbak Ari, Pak
Eddy dan Pak Mulya.
6. Rekan-rekan di Lab. Mikrobiologi PPLH IPB: Mbak Rina, Mbak Donna, Rizal,
Pak IWB. Suyasa, Bu Umi, Bu Yus, Bu Saida, Pak Heru, Pak Puji, Bu Etik,
Reza, Mbak Neni, dan Mbak Amah atas bantuan, kebersamaan dan
kejasarnanya.
7. Teman-teman di Program Studi Ilmu Tanah: Ninuk, Mbak Desi, Bu Deni, Pak
Wayan, Uut, Bu Hanum, Pak Kasno, Pak Mulxadi, dan semua teman-teman
angkatan 1999 dan 2000 serta semua angota HMPIT atas bantuan,
persahabatan dan kebersamaannya selama ini, serta semua pihak baik secara
langsung ataupun tidak langsung yang telah berperan dalarn pelaksanaan
penelitian ataupun penulisan tesis ini.
8. Secara khusus penulis mengucapkan terima kasih kepada "Ayah" Ir. Kasw
Djumar dan "Ibu" Admilah, Mbah Deje (alm), Mbah Siti, Om Nano, Om PayTante Susi, Tante Nia-Om Hojin, adiku Adri, Rudi dan Ibu Olga sekeluarga
atas doa, dorongan semangat, perhatian dan kasih sayangnya, serta Dede Ace1
dan Kevina yang selalu memberi keceriaan.
Bogor, Maret 2002
Penulis
DAFTAR IS1
DAFTAR TABEL ........................................................................................
DAFTAR GAMBAR ....................................................................................
DAFTAR LAMPIRAN .................................................................................
PENDAHULUAN ........................................................................................
Latar Belakang .......................................................................................
Tujuan Penelitian ...................................................................................
TINJAUAN PUSTAKA ...............................................................................
Merkuri ..................................................................................................
Mekanisme Detoksifikasi Merkuri ........................................................
Faktor-faktor yang Mempengaruhi Aktivitas Enzim .............................
Tanah Sebagai Habitat Mikroba ............................................................
Ekosistem Air Hitam .............................................................................
BAHAN DAN METODE .............................................................................
Tempat dan Waktu ...............................................................................
Bahan dan Alat .......................................................................................
Metode ...................................................................................................
HASIL DAN PEMBAHASAN .....................................................................
Isolasi dan Seleksi Bakteri Pereduksi Merkuri ...................................
Aktivitas Merkuri Reduktase pada Berbagai Konsentrasi HgC12 .......
Kinetika Merkuri Reduktase ...............................................................
Pengaruh pH Terhadap Aktivitas Merkuri Reduktase ........................
Pengaruh Suhu Terhadap Aktivitas Merkuri Reduktase .....................
Penggunaan NADH Sebagai Koenzim ..............................................
Identifikasi Bakteri Pereduksi Merkuri ...............................................
KESIMPULAN DAN SARAN ....................................................................
Kesimpulan ............................................................................................
Saran ......................................................................................................
DAFTAR PUSTAKA ...................................................................................
Halaman
vi
DAFTAR TABEL
Halaman
1 . Mekanisme transformasi merkuri ...........................................................
2. Klasifikasi enzim secara internasional berdasarkan atas reaksi yang dikatalisis
3 . Hasil seleksi bakteri pereduksi merkuri ..................................................
4 . Hasil uji aktivitas enzim pada berbagai konsentrasi HgClz ....................
5 . Hasil pengujian aktivitas enzim pada konsentrasi HgClz 1000 d m 1 ....
6 . Hasil uji aktivitas enzim dengan NADH sebagai koenzim .....................
7. Karakterisasi morfologi isolat terpilih ....................................................
8. Karakterisasi fisiologi isolat terpilih .......................................................
5
8
21
23
26
33.
35
36
DAFTAR GAMBAR
1. Proses detoksifikasi merkuri pada bakteri resisten merkuri .....................
8
2. Model operon mer ....................................................................................
9
3. Mekanisme reduksi H ~ menjadi
~ + ~ ~ O ~~seudomonas
a d a
aeruginosa ...
9
merkuri reduktase.....................................
17
4. Skema deteksi kalorimetrik
5. Aktivitas merkuri reduktase dari (a) isolat ICBB 1506,ICBB 1507,ICBB
1508,ICBB 1512,ICBB 2798,ICBB 2810,dan (b) isolat ICBB 2799,
ICBB 2812, ICBB 2813, ICBB 2820, ICBB 2847, pada berbagai
konsentrasi HgC12 ...................................................................................
25
................
7. Aktivitas merkuri reduktase pada berbagai pH ........................................
8. Aktivitas merkuri reduktase pada berbagai suhu .....................................
28
9. Hasil foto isolat bakteri pereduksi merkuri pada pembesaran 400x ........
37
6. Kinetika merkuri reduktase pada konsentrasi HgC1250 pg/ml
29
30
DAFTAR LAMPIRAN
Halaman
1 . Daftar sampel tanah dari EAH Kalimantan Tengah yang diisolasi
.......
2. Pembuatan larutan stok ..........................................................................
3 . Kurva pertumbuhan bakteri pada konsentrasi HgC1250 pg'ml yang
diturnbuhkan pada 50 ml media cair LB .................................................
4 . Kurva standar protein .............................................................................
5 . Kurva standar NADPH ...........................................................................
6. Kurva standar NADH .............................................................................
43
43
PENDAHULUAN
Latar Belakang
Pembuangan limbah yang tidak layak, penyalahgunaan bahan kimia dan efek
dari penggunaan bahan kimia yang menyebabkan pelepasan senyawa organik dan
anorganik beracun ke lingkungan telah menyebabkan pencemaran terhadap tanah,
air tanah dan wilayah perairan. Limbah bahan beracun dan berbahaya (B3) yang
telah mencemari lingkungan terutama adalah golongan logam berat (Co, A g Sb, Cd,
Cr, Zn, Au, Mn,Sn, Hg, Mo, Pd, Pb dan Ti). Salah satu logam berat yang bersifat
meracun dan telah masuk lingkungan dalam jurnlah yang cukup banyak adalah
merkuri (Hg).
Sumber terbesar pelepasan senyawa merkun ke lingkungan adalah
pembakaran batu b a a dan produk minyak bumi yang secara alami kaya den@
merkuri. Deposit alam (ore) yang mengandung merkuri tersebar pada batuan, tanah,
udara dan air. Cinnabar (merkuri sulfida) adalah bentuk mineral yang paling umum
ditemukan di alam. Menurut Dugan (1974), pada batuan sedimen, organrc-nch
shale dan minyak bumi mentah kandungan merkurinya mencapai 20.000 pbb.
Sumber pencemaran merkuri yang juga cukup banyak adalah dari industri
pertarnbangan, terutama yang tanpa izin seperti penambangan emas rakyat. Merkuri
digunakan untuk memisahkan emas dari pasir sungai. Industri lain yang potensial
mengeluarkan limbah merkuri adalah industri pupuk. Pada industri pupuk, gas yang
digunakan pada proses produksinya banyak mengandung merkuri. Industri soda
kausatik yang banyak diperlukan pabrik kertas, baterai dan kosmetik j u g banyak
menghasilkan limbah merkuri. Fenil merkuri, merthiolat dan merkurokrom
digunakan dalam peralatan nunah tangga dan digunakan sebagai desinfektan pada
rumah sakit. Fenil merkuri dm metil merkuri digunakan dalam pertanian sebagai
v
fungisida, insektisida dan bakteriosida (Misra, 1992).
Banyaknya pelepasan merlnui dari berbagai sumber tersebut telah
mengakibatkan permasalahan lingkungan yang cukup serius. Beberapa peneliti
melaporkan bahwa kandungan Hg pada beberapa jenis biota tambak di Teluk Jakarta
sudah mencapai tingkat mengkhawatirkan, yaitu antara 0 sampai 7,9 pg Hg/g biota
basah, pada udang rata-rata 1,19 pg Hg/g udang basah, pada ikan 1,23 pg HgJg ikan
basah dan pada rajungan 3,72 pg Hglg rajungan basah (Anonim, 1991). WHO
menetapkan kadar Hg yang diizinkan adalah 0,s pg Hglg ikan basah. Selain itu
Sungai Cisadane, Ciliwung dan Sunter juga mengalami tingkat pencemaran yang
sudah sangat mengkhawatirkan. Kandungan merkuri di Sungai Cisadane mencapai
3,33 pbb, jauh diatas baku mutu konsumsi yang 1 pbb.
Sungai Kenjeran di
Surabaya juga mengalami ha1 yang serupa akibat dari pembuangan limbah industri
dan limbah nunah tangga yang memadati areal sepanjang sungai (Anonim, 2000).
Sementara itu pencemaran merkuri di Pasaman Sumatra Barat juga telah melebihi
arnbang batas. Hasil penelitian yang dilakukan oleh Bapedalda di desa Talang
Babungo Kecarnatan Lembah G h a n t i Kabupaten Solok dan Batang Palangki
Kabupaten Sawahlunto/Sijunjung menemukan bahwa dari 100 pekerja tambang
kadar merkuri yang ditemukan sebesar 11,7-89 mgkg rambut. Jumlah tersebut
masuk dalam koridor pencemaran merkuri di Minamata yaitu antara 17,7-705 mglkg
rambut. Penelitian di Batang Malandu dan Batang Masus, menemukan limbah yang
mencemari air sungai sudah mencapai 0,172 mg Hg/liter air (Anonim, 2001).
Berbagai usaha untuk membersihkan lingkungan dari bahan pencemar
berbahaya telah banyak dilakukan dan teknologi yang digunakan juga semakin
-
.
-
berkembang. Berbagai macam teknologi diantaranya adalah pembenarnan, vapor
extraction, stabilisasi dan solidifikasi, soil washing, soil jlushing, critical fluid
extraction, presipitsi kimia, vitrification, desorpsi thermal dan pembakaran
(Skadany dan Meeting, 1993). Teknologi fisikokimia yang telah banyak dilakukan
pada beberapa industri yang menghasilkan lirnbah berbahaya tersebut tidak dapat
secara nyata memusnahkan senyawa-senyawa yang berbahaya, bahkan kadangkadang justru bertarnbah.
Adanya dampak negatif dari teknologi tersebut
mendorong berkembangnya penerapan metode bioremediasi diatas pemukaan tanah
(ex situ) dan di dalam tanah (in situ).
Bioremediasi adalah merupakan proses penyehatan (remediasi) secara
biologis terhadap komponen lingkungan, tanah dan air yang telah tercemar oleh
kegiatan manusia (Sa'id dan Fauzi, 1996). Metode ini sangat dibutuhkan untuk
mengatasi dampak negatif dari metode fisikokimia dan sangat penting untuk
digunakan bersama dengan teknologi yang lain agar usaha perlindungan tanah akibat
pencemaran bahan-bahan berbahaya berhasil dengan baik. Bakteri resisten merkuri
merupakan salah satu mikroorganisme yang dapat digunakan dalam metode
bioremediasi. Bakteri resisten merkun dapat mereduksi H$ menjadi bentuk inert
dan volatile (H~') yang kemudian didihsikan keluar sel melalui membran sel.
Proses ini berlangsung secara intraseluler oleh merkun reduktase (Gupta et al.,
1999). Bakteri pereduksi merkuri dapat ditemukan pada bakteri Gram positif
maupun Gram negatif
Ekosistem Air Hitam (Black Water Ecosystem), suatu ekosistem yang
dicirikan dengan kondisi airnya yang berwarna inerah kehitaman jernih dan
memiltki komposisi flora dan fauna khas
dan terbentuk melalui proses yang
berlangsung lebih dari 5000 tahun. Ekosistem unik semacarn ini tidak hanya penting
karena jenis flora dan fauna khas yang dimilikinya, tetapi yang lebih penting adalah
terdapatnya rnikroba-mikroba yang niampu hidup dalam kondisi ekstrim baik pada
pH rendah (acidofilik), pH tinggi (alkalofilik), suhu tinggi (termofilik), serta
mikroba-mikroba lain yang memiliki potensi untuk dikembangkan dalam industri
bioteknologi dan bioremediasi.
Pada Ekosistem Air Hitam ini telah berhasil
dieksplorasi bakteri pendegradasi minyak bumi dengan kemampuan mendegradasi
minyak bumi yang tinggi (18,69°/~0,49%), bakteri penghasil protease dengan
aktivitas yang cukup tinggi juga (1,5-3 UNmVmnt), bakteri perombak fenol, bakteri
penghasil selulosa dan lain-lain (Santosa et al., 2000).
Berdasarkan ha1 tersebut, diperkirakan pada Ekosistem Air Hitarn (EAH)
juga dapat ditemukan bakteri resisten merkuri yang memiliki potensi yang tinggi,
dimana nantinya diharapkan dapat digunakan untuk mengatasi pencemaran oleh
merkuri baik pada lahan pertanian maupun daerah perairan.
Tujuan Penelitian
Penelitian ini bertujuan untuk :
1. Mengisolasi bakteri resisten merkuri dari Ekosistem Air Hitam Kalimantan
Tengah.
2. Melakukan pengujian aktivitas merkuri reduktase terhadap isolat terpilih.
3. Melakukan identifikasi terhadap isolat yang mempunyai aktivitas merkuri
reduktase tinggi.
TINJAUAN PUSTAKA
Merkuri
Pelepasan merkuri dan senyawa merkuri dari sumber antropogenik dan
geogenik telah menyebabkan pencemaran air, tanah, sedirnen dan atmosfer. Merkuri
dan senyawa merkuri toksisitasnya sangat tinggi karena reaktif terhadap gugus
sulfihdril pada molekul-molekul yang aktif secara biologi, sehingga menyebabkan
molekul-molekul tersebut tidak aktif. Selain itu jika telah mas& lingkungan, polutan
merkuri cepat tersebar luas karena mobilitasnya sangat tinggi dan dapat terkonsentrasi
melalui rantai makanan (Chang et al. 1999).
Transformasi merkuri di alam dapat terjadi secara biologi dan non biologi
seperti yang ditunjukan pada Tabel 1 dibawah ini.
Tabel 1 . Mekanisme transformasi merkuri (Barkay, 1992).
Biologi
Reduksi Hg2+
Enzimatik :
Merkuri reduktase
Demetilasi
Enzimatik:
Organomerkurial
Iiase
Tidak langsung:
reduksi metabolit
Non biologi
Radikal bebas
berasosiasi dengin
senyawa humik
Metilasi
Transfer gugus metil
oleh korinoid koenzim
(bakteri)
Sintesis metionin
(fungi)
Protonolitik
pada Asarn humik dan hlfik
ikatan C-Hg (reaksi
sangat lambat)
Fotolisis
Metilasi CH3Hg'
menjadi (CH3)zHg
dengan adanya H2S
Merkuri di alam terdapat dalarn empat bentuk yaitu H
ion merkuri
~ Oatau
logam merkuri,
( ~ 2 3alkil
, merkuri (metil merkuri dan dimetil merkuri) dan sebagai
ligan dengan sulfida (HgS). Toksisitas yang tinggi dari merkuri terhadap lingkungan
disebabkan oleh : ( I ) afinitas yang tinggi dari H$ dan organomerkuri terhadap gugus
thiol, (2) kecenderungan untuk membentuk ikatan kovalen dengan molekul organik,
(3) stabilitas yang tinggi dari ikatan Hg-C yang menyebabkan afinitasnya rendah
terhadap oksigen dm, (4) memiliki kecenderungan yang kuat untuk memaksimalkan
ikatan 2 ligan dalam struktur kimia linier (Barkay, 1992).
Merkuri di atmosfer berada dalam bentuk gas atau diabsorpsi menjadi partikel
(Hapl). Fraksi gas terdiri dari H$, C H ~ H ~Hg2+,
+ , (CH3)zHg dan bentuk terklorinasi.
Keberadaan merkuri di atmosfer tergantung pada kondisi fisikokimia atmosfer. Pada
kondisi masam, H$ teroksidasi oleh H202 (terbentuk dari reaksi Hz0 dengan 03)
menjadi Hg2+ dengan reaksi yang sangat lambat.
Selanjutnya dengan adanya
penambahan H~~~ ke sedimen, H~~~ ini akan mengalami metilasi dengan
methylocobalamin (B 12) sebagai donor menjadi metil merkuri yang merupakan
bentuk yang sangat stabil. Proses metilasi merkuri dapat juga terjadi oleh bakteri
yang terdapat pada insang, perut ikan atau organ ikan yang lain secara langsung. Pada
sedimen mikroorganisme aerob sebagaimana juga mikroorganisme anaerob, dapat
juga membentuk metil merkuri (Silver dan Kinscherf, 1982).
meningkat dengan meningkatnya tempera-
Metil merkuri
dan konsentrasi H$+ dan optimal pada
pH