Validasi Single Nucleotide Polymorphisms (Snp) Berbasis Genom Dan Pemanfaatannya Untuk Uji Kekerabatan 50 Aksesi Kedelai

VALIDASI Single Nucleotide Polymorphisms (SNP) BERBASIS
GENOM DAN PEMANFAATANNYA UNTUK UJI
KEKERABATAN 50 AKSESI KEDELAI

ANDHIKA FAISAL MUBAROK

DEPARTEMEN BIOKIMIA
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2015

PERNYATAAN MENGENAI SKRIPSI DAN
SUMBER INFORMASI SERTA PELIMPAHAN HAK CIPTA*
Dengan ini Saya menyatakan bahwa skripsi berjudul Validasi Single
Nucleotide Polymorphisms (SNP) Berbasis Genom dan Pemanfaatannya untuk Uji
Kekerabatan 50 Aksesi Kedelai adalah benar karya saya dengan arahan dari
komisi pembimbing dan belum diajukan dalam bentuk apa pun kepada perguruan
tinggi mana pun. Sumber informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang
diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks
dan dicantumkan dalam Daftar Pustaka di bagian akhir skripsi ini.

Dengan ini saya melimpahkan hak cipta dari karya tulis saya kepada
Institut Pertanian Bogor dan Balai Besar Penelitian dan Pengembangan
Bioteknologi dan Sumber Daya Genetik Pertanian.
Bogor, September 2015
Andhika Faisal Mubarok
NIM G84110012

ABSTRAK
ANDHIKA FAISAL MUBAROK. Validasi Single Nucleotide Polymorphisms
(SNP) Berbasis Genom dan Pemanfaatannya untuk Uji Kekerabatan 50 Aksesi
Kedelai. Dibimbing oleh I MADE ARTIKA dan I MADE TASMA.
Single Nucleotide Polymorphisms (SNP) sudah terdeteksi dalam genom
kedelai varietas Anjasmoro, Tanggamus dan Wilis melalui sekuensing
menggunakan Next Generation Sequencing. Sekuen genom tersebut dijajarkan
dengan sekuen genom rujukan kedelai varietas William 82. SNP tersebut masih
berpeluang sebagai false SNP. Tujuan dalam penelitian ini memvalidasi SNP hasil
penjajaran sekuen genom kedelai varietas Anjasmoro, Tanggamus, dan Wilis
dengan genom rujukan William 82 menggunakan Single Nucleotide Amplified
Polymorphisms (SNAP) dan memanfaatkannya untuk menguji kekerabatan 50
aksesi kedelai. Sebanyak 19 pasang primer SNAP dirancang menggunakan

program SNAPER untuk membuktikan keberadaan SNP pada 19 posisi pilihan
dalam genom. Hasil dari penelitian ini bahwa sembilan SNP valid keberadaannya
dalam genom dari 19 SNP yang diuji. SNP tervalidasi tersebut belum mampu
untuk membedakan secara genetik beberapa aksesi dari 50 aksesi kedelai sehingga
kekerabatan antara 50 aksesi kedelai sangat tinggi dengan koefisien jarak genetik
0 sampai 0.3.
Kata kunci: Aksesi, genom, kedelai, SNP, SNAP

ABSTRACT
ANDHIKA FAISAL MUBAROK. Single Nucleotide Polymorphisms (SNP)
Validation Based on Genomic and Its Utilization for Genetic Relationship Test of
50 Soybean Accessions. Supervised by I MADE ARTIKA dan I MADE TASMA.
Single Nucleotide Polymorphisms (SNPs) have been detected in
Anjasmoro, Tanggamus and Wilis soybean variety genomes through sequencing
using Next Generation Sequencing. The genomic sequences obtained were
aligned with the soybean reference genomic sequence, William 82. Identified
SNPs from the NGS still have possibility to be false SNPs. The purposes of this
research was to validate SNPs from the alignment of Anjasmoro, Tanggamus, and
Wilis sequences with the reference genomic sequence, William 82 using Single
Nucleotide Amplified Polymorphisms (SNAP) method and apply it to analyze the

genetic relationship of 50 soybean accessions. There were 19 pairs of SNAP
primers were designed using SNAPER program to prove SNP existence in 19
selected positions in genome. Result of this study were 9 valid SNPs out of 19
SNPs in genomic sequences analyzed. Those validated SNPs were not capable yet
to differentiate genetically some accessions from 50 soybean accessions, so the
linkage values between 50 soybean accessions were relatively high with genetic
distance coefficient 0 to 0.3.
Keywords: Accessions, genomes, SNP, SNAP, soybean

VALIDASI Single Nucleotide Polymorphisms (SNP) BERBASIS
GENOM DAN PEMANFAATANNYA UNTUK UJI
KEKERABATAN 50 AKSESI KEDELAI

ANDHIKA FAISAL MUBAROK

Skripsi
sebagai salah satu syarat memperoleh gelar
Sarjana Sains pada
Departemen Biokimia

DEPARTEMEN BIOKIMIA
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2015

iv

Judul

Nama
NIM

: Validasi Single Nucleotide Polymorphisms (SNP) Berbasis
Genom dan Pemanfaatannya untuk Uji Kekerabatan 50 Aksesi
Kedelai
: Andhika Faisal Mubarok
: G84110012

Disetujui oleh

Dr Ir I Made Artika, MAppSc
Pembimbing I

Dr Ir I Made Tasma, MSc
Pembimbing II

Diketahui oleh

Dr Ir I Made Artika, MAppSc
Ketua Departemen

Tanggal lulus:

vi

PRAKATA
Puji syukur kepada Allah SWT atas rahmat dan karunia-Nya sehingga
penulis dapat menyelesaikan penelitian yang berjudul Validasi Single Nucleotide
Polymorphisms (SNP) Berbasis Genom dan Pemanfaatannya untuk Uji

Kekerabatan 50 Aksesi Kedelai. Penelitian ini dilaksanakan pada bulan Desember
hingga April 2015 di Laboratorium Biologi Molekuler, Balai Besar Penelitian dan
Pengembangan Bioteknologi dan Sumber Daya Genetik Pertanian (BB Biogen).
Penulis menyampaikan terima kasih kepada Bapak Dr Ir I Made Artika
MAppSc selaku pembimbing utama dan Bapak Dr Ir I Made Tasma MSc selaku
pembimbing kedua atas bimbingan dan pengarahan yang diberikan berikut kritik
dan sarannya dalam penyusunan skripsi ini. Penulis juga mengucapkan terima kasih
kepada Ibu Dr Puji Lestari SP MSi, para peneliti, staf, serta rekan sesama
mahasiswa penelitian di Laboratorium Biologi Molekuler, BB Biogen. Ucapan
terima kasih juga tak lupa penulis sampaikan kepada kedua orang tua atas
dukungan yang selalu diberikan. Penulis menyadari masih banyak kekurangan
dalam penyusunan usulan penelitian ini, maka diharapkan kritik dan saran yang
membangun untuk perbaikan dalam penulisan selanjutnya.

Bogor, September 2015
Andhika Faisal Mubarok

DAFTAR ISI
DAFTAR TABEL

viii

DAFTAR GAMBAR

viii

DAFTAR LAMPIRAN

viii

PENDAHULUAN

1

METODE

2

Bahan dan Alat

2

Prosedur Penelitian

2

HASIL

5

PEMBAHASAN

16

SIMPULAN DAN SARAN

22

Simpulan

22

Saran

23

DAFTAR PUSTAKA

23

LAMPIRAN

27

RIWAYAT HIDUP

35

viii

DAFTAR TABEL
1 Kuantitas dan kemurnian DNA genom kedelai
2 Posisi dan SNP target 19 pasang primer SNAP
3 Perbandingan hasil PCR observasi berdasarkan 19 pasang primer SNAP
dengan hasil PCR yang diharapkan
4 SNP pada 50 aksesi kedelai berdasarkan kinerja 12 pasang primer SNAP
dengan rujukan SNP pada varietas William 82, Wilis, Tanggamus dan
Anjasmoro dari database di IAARD GC
5 Tingkat heterozigositas dan polimorfisme sembilan marka SNAP melalui
50 aksesi kedelai
6 Matriks rerata jarak genetik antar daerah asal 50 aksesi kedelai

7
8
9

12
14
16

DAFTAR GAMBAR
1 Elektroforegram DNA genom tiga varietas kedelai
2 Elektroforegram DNA genom 50 aksesi kedelai
3 Elektroforegram hasil PCR menggunakan primer SOY-SNPR1 sampai
SOY-SNPR19 dengan 28 siklus PCR
4 Elektroforegram hasil PCR menggunakan primer SOY-SNPR4, SOYSNPR8, SOY-SNPR10, SOY-SNPR17, dan SOY-SNPR19 dengan 38
siklus PCR
5 Elektroforegram hasil PCR menggunakan primer SOY-SNPR16
6 Dendogram 50 aksesi kedelai berdasarkan sembilan marka SNAP

6
6
10

11
11
15

DAFTAR LAMPIRAN
1
2
3
4
5
6
7

Diagram alir penelitian
Tanaman kedelai yang digunakan dalam penelitian
Sekuen dan Melting Temperature (Tm) 19 pasang primer SNAP
Ukuran primer SNAP dan amplikon
Tingkat validitas SNP
Tampilan program SNAPER
Tampilan database SNP genom kedelai di web Indonesian Agency for
Agricultural Research and Development Genome Center

27
28
30
31
32
33
34

1

PENDAHULUAN
Kedelai (Glycine max (L.) Merr.) merupakan komoditas pangan terpenting
di Indonesia setelah komoditas padi dan jagung (Supadi 2009). Budidaya kedelai
di Indonesia masih mengalami berbagai permasalahan baik dari segi kualitas dan
kuantitas. Salah satu permasalahannya adalah produktivitas yang masih rendah
sehingga terjadi impor kedelai. Tahun 2010 sampai 2014, kebutuhan kedelai
setiap tahun sekitar 2300000 ton biji kering, sedangkan produksi nasional hanya
sekitar 807.57 ton (Eka et al. 2015). Peningkatan kuantitas dan kualitas kedelai
lokal masih terus diusahakan, salah satu caranya adalah pemuliaan tanaman.
Marka molekuler sangat membantu para pemulia salah satunya untuk
kegiatan seleksi. Seleksi menggunakan marka molekuler jauh lebih akurat
dibandingkan melalui pengamatan fenotipe karena tidak dipengaruhi oleh
lingkungan (Nuraida 2012). Single Nucleotide Polymorphisms (SNP) merupakan
marka molekuler yang sudah banyak dikembangkan saat ini karena mempunyai
kelebihan dibandingkan marka molukuler lain. Marka tersebut keberadaannya
sangat berlimpah, mudah untuk diskoring dan laju mutasinya rendah (Murani et
al. 2005). SNP merupakan nukleotida tunggal di lokasi spesifik dalam genom
yang mengalami variasi diantara individu dalam populasi yang sama (Jehan dan
Lakhanpaul 2006). Menurut Kumar et al. (2012), SNP dapat dengan cepat dan
relatif murah untuk ditemukan setelah adanya Next Generation Sequencing
(NGS). Hasil sekuensing dijajarkan dengan sekuen rujukan sehingga dapat
dideteksi adanya SNP.
Menurut You et al. (2011), SNP yang ditemukan dari sekuensing
menggunakan NGS harus divalidasi. Faktor yang mendukung bahwa validasi
sangat dibutuhkan adalah adanya potensi kesalahan pada sekuensing atau
kesalahan pada penjajaran sekuen genom. Validasi dapat menggunakan beberapa
cara seperti Illumina Goldengate dan KBiosciences Competitive Allele SpecificPCR SNP genotyping system (KASPar) (Kumar et al. 2012). Salah satu cara
validasi SNP yang saat ini sedang dikembangkan pada berbagai organisme karena
mudah digunakan dan biayanya relatif murah adalah Single Nucleotide Amplified
Polymorphisms (SNAP). SNAP berupa primer yang dirancang pada ujung 3 OH
spesifik terhadap salah satu dari dua nukleotida yang merupakan SNP. Primer
tersebut juga ditambahkan modifikasi pada salah satu dari tiga nukleotida dekat
ujung 3 OH sehingga tidak komplemen terhadap DNA cetakan (Lestari dan Koh
2013).
Kedelai Indonesia varietas Anjasmoro, Tanggamus dan Wilis sudah
dideteksi keberadaan SNP melalui penjajaran sekuen hasil sekuensing
menggunakan NGS dengan sekuen rujukan varietas William 82 (Lestari et al.
2014). Database SNP tersebut sudah tersedia di Indonesian Agency for
Agricultural Research and Development Genome Center (IAARD GC). SNP
tersebut belum divalidasi sehingga belum dapat dimanfaatkan sebagai marka
molekuler. Keberadaan SNP di aksesi kedelai selain tiga varietas tersebut juga
belum diketahui sehingga pemanfaatan SNP untuk meningkatkan efisiensi dan
efektifitas pemuliaan kedelai Indonesia masih terhambat. Menurut Chaerani et al.
(2011), aksesi kedelai dapat dimanfaatkan sebagai bahan yang digunakan untuk
merakit kedelai jenis baru yang unggul. Oleh karena itu, sangat diperlukan

2

validasi SNP menggunakan marka SNAP yang murah dan mudah serta
memanfaatkanya melalui aksesi kedelai. Pemanfaatan SNP salah satunya dapat
digunakan untuk membedakan secara genetik antar individu (Montes et al. 2014).
Tujuan penelitian ini adalah memvalidasi SNP hasil sekuensing genom
menggunakan SNAP dan memanfaatkannya untuk menguji kekerabatan 50 aksesi
kedelai. Hipotesis penelitian ini adalah marka SNAP berhasil membuktikan
adanya SNP dengan tingkat validitas tinggi dan SNP tersebut dapat membedakan
50 aksesi kedelai dengan jarak genetik tinggi. Manfaat penelitian ini adalah
memberikan alternatif pemilihan marka molekuler, yaitu marka SNAP yang lebih
efisien dan efektif untuk kegiatan pemuliaan tanaman agar lebih cepat
menghasilkan jenis kedelai unggul Indonesia. Penelitian dilakukan di Balai Besar
Penelitian dan Pengembangan Bioteknologi dan Sumber Daya Genetik Pertanian.

METODE
Bahan dan Alat
Bahan-bahan yang digunakan adalah 50 benih aksesi kedelai dan 3 benih
varietas kedelai yang merupakan koleksi BB Biogen (Lampiran 2), nitrogen cair,
larutan cetyltrimethylammonium bromide (CTAB) 2%, polivinilpirolidon (PVP)
2%, β-merkaptoetanol 0.2%, natrium bisulfit 0.38 %, natrium asetat (NaOAc) 3M,
kloroform:isoamilalkohol (chisam) 24:1, isopropanol dingin, etanol 70% dingin,
bufer Tris-EDTA (TE) 1× pH 8.0, RNAase, KAPA2G Fast ReadyMix PCR Kit
yang terdiri atas KAPA2G Fast DNA Polymerase (0.5 U per 25 µL reaksi) dalam
bufer reaksi (dNTPs 0.2 mM untuk 1 × reaksi, MgCl2 1.5 mM untuk 1 × reaksi,
stabilizer dan tracking dye 2x), primer SNAP forward dan reverse masing-masing
berjumlah 19, Double Distilled Water (ddH2O), gel agarosa, bufer Tris Asetat
EDTA (TAE) 1× pH 8.0, Blue JuiceTM Gel Loading Buffer (4×), SYBR® Gold
Nucleic Acid Gel Stain (100 × in TE) dan TrackltTM 1 Kb Plus DNA Ladder
Invitrogen.
Alat-alat yang digunakan adalah media semai, penangas air, inkubator
thermostat, mikropipet, spin down, tip pipet, autoklaf, parafilm, blue sterile
pastle, tabung eppendorf 1.5 mL, tabung 2 mL, labu Erlenmeyer, gelas ukur, 96well PCR plate, sentrifus 5810R eppendorf, batang magnet, mesin pendingin,
Vortex, sarung tangan karet, neraca analitik, sudip, thermal cycler biometra T1,
spektrofotometer nanodrop thermoscientific 2000c, ice maker, microwave,
perangkat elektroforesis dan UV transilluminator High Performance 2UV.

Prosedur Penelitian
Penanaman dan Pengambilan Sampel (Santoso et al. 2006)
Setiap benih ditanam dalam media semai. Setiap jenis benih ditanam pada
delapan lubang dan setiap lubang ditanami tiga benih. Tanaman kedelai
ditumbuhkan selama 10 hari. Setelah 10 hari, setiap tanaman yang tumbuh
diambil daunnya dengan karakteristik daun paling muda dan ukurannya untuk
setiap tanaman proporsional. Sampel daun kedelai dimasukkan dalam tabung 2

3

mL dengan jumlah maksimal 10 helai daun. Daun kedelai dengan karakteristik
yang sesuai dan masih terdapat di tanaman diambil dan dimasukkan ke dalam
plastik untuk cadangan. Tabung 2 mL dan plastik yang berisi daun kedelai
disimpan di dalam mesin pendingin -50 oC.
Isolasi DNA Menggunakan Modifikasi Metode Doyle & Doyle (1987)
Daun yang berada di tabung 2 mL digerus sampai halus menggunakan
blue sterile pastle yang sebelumnya tabung dan pastle telah dibasuh dengan
nitrogen cair. Bufer ekstraksi (CTAB 2%, 0.2 % β-merkaptoetanol, 2% PVP dan
0.38% natrium bisulfit) yang telah dipanaskan sebelumnya pada suhu 60 oC
ditambahkan sebanyak 750 µL pada daun yang telah halus. Sampel diinkubasi
pada suhu 65 oC selama 60 menit dan secara berkala dilakukan pencampuran.
Sebanyak 750 µL kloroform isoamilalkohol ditambahkan ke dalam sampel dan
dicampurkan dengan cara dibolak-balik secara perlahan selama 5 menit.
Campuran tersebut kemudian disentrifus selama 15 menit pada 12000 rpm (20 oC)
kemudian lapisan atas hasil sentrifus dipindahkan ke dalam tabung 1.5 mL baru.
Sebanyak (1/10×volume supernatan) Na asetat 3M ditambahkan ke dalam
supernatan dan dicampurkan dengan cara dibolak-balik secara perlahan, kamudian
sebanyak (1×volume supernatan) isopropanol dingin ditambahkan ke dalam
supernatan. Selanjutnya, sampel diinkubasi pada suhu -20 oC selama 1 jam,
kemudian dibolak-balik sebentar dan diinkubasi kembali pada -20 oC selama 15
menit.
Selanjutnya, sampel disentrifus selama 20 menit pada 12000 rpm (10 oC).
Supernatan yang dihasilkan dibuang dan pelet yang dihasilkan dibilas dengan 200
µL etanol 70 % dingin. Sampel disentrifus kembali pada 12000 rpm selama 5
menit dengan suhu 4 oC. Supernatan hasil sentrifus dibuang dan pelet dikeringkan
pada udara terbuka selama satu malam. Endapan hasil pengeringan kemudian
dilarutkan dengan 100 µL bufer TE pH 8.0 dan dipanaskan pada 65 oC hingga
larut. Enzim RNAse kemudian ditambahkan sebanyak 2 µL dan kemudian
diinkubasi kembali dengan suhu 37 oC selama 30 menit. Selanjutnya, DNA hasil
isolasi diuji kualitas dan kuantitasnya.
Analisis Kualitas dan Kuantitas DNA
Analisis kualitatif DNA menggunakan modifikasi Sambrook dan
Russel (2001). Uji kualitatif menggunakan elektroforesis gel agarosa sebesar 1.5
%. Gel agarosa dibuat dengan menambahkan agarosa sebanyak 0.9 g ke dalam 60
mL larutan TAE 1×. Campuran tersebut dipanaskan hingga larut, kemudian
didinginkan hingga hangat dan dituang ke dalam cetakan gel. Gel yang sudah
padat dipindahkan ke dalam bak elektroforesis yang berisi TAE 1×. Selanjutnya
dibuat loading bufer dengan campuran blue juice 4× sebanyak 2 μL, SYBR Gold
100× sebanyak 0.5 µL dan ddH2O sebanyak 2.5 µL. Loading bufer tersebut
dicampur dengan DNA sebanyak 3 µL. Campuran tersebut diinjeksi ke dalam
sumur gel agarosa. Marker yang digunakan adalah TrackltTM 1 Kb Plus DNA
Ladder Invitrogen ditambah 0.5 µL SYBR Gold 100×. Setelah semua sampel
selesai diinjeksi maka alat elektroforesis dihubungkan pada power supply yang
dialiri tegangan listrik 100 volt selama 1 jam. Hasil elektroforesis difoto dengan
bantuan lampu UV dalam transilluminator High Performance 2UV dan gambar
hasil elektroforesis disimpan di dalam komputer untuk keperluan dokumentasi.

4

Uji kuantitatif DNA. Uji kuantitatif DNA dilakukan dengan
menggunakan spektrofotometer nanodrop thermoscientific dengan blanko yang
digunakan adalah larutan TE pH 8.0. Sebelum digunakan lubang optik
dibersihkan terlebih dahulu dengan menggunakan nuclease water. Sebanyak 2 ul
Larutan TE dimasukkan ke dalam lubang optik nanodrop thermoscientific dan
kemudian dipilih menu measure blank pada komputer. Kemudian, lubang optik
dibersihkan kembali dan sampel DNA sebanyak 2 μL dimasukkan ke dalam
lubang optik. Setelah itu, hasil pengukuran akan muncul dalam konsentrasi ng/μL
dan kemurnian DNA dapat dilihat langsung dalam A260/A280 dan A260/A230.
Perancangan Primer (Drenkard et al. 2000)
Database SNP kedelai untuk varietas Wilis, Tanggamus dan Anjasmoro
digunakan untuk perancangan primer yang didapatkan di situs iaardgc.or.id.
Database tersebut berupa sekuen DNA yang mengandung SNP. Sekuen tersebut
dijadikan bahan untuk desain primer menggunakan progam SNAPER yang dapat
diakses di ausubellab.mgh.harvard.edu. Pilihan sekuen primer yang dapat
digunakan akan diberikan oleh SNAPER melalui surat elektronik yang
sebelumnya sudah didaftarkan. Salah satu pasangan primer dari sekian pilihan
dipilih dan dikirim ke perusahaan pembuat primer, yaitu Genetica Science untuk
disintesis sesuai sekuen primer yang mengapit SNP.
Validasi SNP (Lestari dan Koh 2013)
Validasi SNP pada genom varietas Tanggamus, Anjasmoro dan Wilis.
DNA genom kedelai varietas Tanggamus, Wilis dan Anjasmoro diamplifikasi
menggunakan primer SNAP yang berjumlah 19 pasang. PCR dilakukan dengan
volume 10 µL dalam tabung PCR dengan komponen 40 ng/µL DNA genom
sebanyak 1 µL, 10 µM primer forward dan reverse masing-masing sebanyak 0.5
µL, 5 µL KAPA2G dan sebanyak 3 µL ddH2O. Setiap tabung PCR berisi
komponen reaksi PCR dimasukkan dalam mesin PCR dan reaksi PCR dilakukan
dengan progam sebagai berikut: denaturasi awal pada suhu 94 oC selama 5 menit,
amplifikasi DNA sebanyak 28 siklus atau 38 siklus (denaturasi pada suhu 94 oC
selama 30 detik, annealing pada suhu 57 oC selama 1 menit) dan tahap terakhir
adalah ekstensi pada suhu 72 oC selama 10 menit.
Hasil amplifikasi dipisahkan menggunakan elektroforesis gel agarosa 1.5
% dengan tegangan listrik 100 volt selama 1 jam. Hasil elektroforesis berupa ada
dan tidaknya adanya pita DNA dibandingkan dengan hasil elektroforesis yang
diharapkan berdasarkan rancangan primer. Hasil elektroforesis yang menunjukkan
hasil yang sama dengan hasil yang diharapkan dinyatakan valid, sedangkan
adanya perbedaan dengan hasil yang diharapkan dinyatakan tidak valid.
Validasi SNP pada genom 50 aksesi kedelai. DNA genom 50 aksesi
kedelai diamplifikasi menggunakan primer yang sudah valid berdasarkan hasil
amplifikasi DNA genomik Tanggamus, Anjasmoro dan Wilis. PCR dilakukan
dengan volume 10 µL dalam tabung PCR dengan komponen 40 ng/µL DNA
genom sebanyak 1 µL, 10 µM primer forward dan reverse masing-masing
sebanyak 0.5 µL, 5 µL KAPA2G dan sebanyak 3 µL ddH2O. Setiap tabung PCR
berisi komponen reaksi PCR dimasukkan dalam mesin PCR dan reaksi PCR
dilakukan dengan progam sebagai berikut: denaturasi awal pada suhu 94 oC
selama 5 menit, amplifikasi DNA sebanyak 28 atau 38 siklus (denaturasi pada

5

suhu 94 oC selama 30 detik, annealing pada suhu 57 oC selama 1 menit) dan tahap
terakhir adalah ekstensi pada suhu 72 oC selama 10 menit.
Hasil amplifikasi dipisahkan menggunakan elektroforesis gel agarosa 1.5
% dengan tegangan listrik 100 volt selama 1 jam. Selanjutnya hasil elektroforesis
diamati dengan bantuan lampu UV. Setiap pita amplikon yang terbentuk atau
tidak terbentuk amplikon dikonversi menjadi data alel SNP. Konversi tersebut
disesuaikan dengan rancangan primer dan database SNP pada IARRD GC.
Primer yang menunjukkan pola monomorfik alel SNP untuk 50 aksesi kedelai
tidak dapat digunakan untuk uji kekerabatan. Tingkat validitas SNP dapat
dihitung menggunakan rumus yang dikembangkan oleh Chagne et al. (2012),
sebagai berikut:
Tingkat validitas =

Jumlah SN Valid

Total SN yang Diuji

x 100%

Uji Kekerabatan 50 Aksesi Kedelai Menggunakan SNP Tervalidasi
Analisis tingkat polimorfisme dan heterozigositas (Liu dan Muse
2005). Hasil elektroforesis amplikon 50 aksesi kedelai menggunakan primer yang
sudah valid diskoring berdasarkan ada dan tidak adanya pita DNA. Nilai 1/1 untuk
keberadaan pita dan 2/2 untuk ketidakberadaan pita. Hasil skoring disimpan dalam
format txt. Format tersebut dimasukkan dalam program PowerMarker V3.25
melalui menu File – Import – Dataset. Analisis statistika berupa heterozigositas,
diversitas gen (heterozigositas harapan) dan Polymorphisms Information Content
(PIC) didapatkan melalui menu Analysis – Summary – Summary Statistics.
Jarak genetik antar daerah aksesi kedelai (Liu dan Muse 2005).
PowerMarker juga digunakan untuk mendapatkan jarak genetik antar daerah asal
aksesi kedelai. Menu yang digunakan adalah Analysis – Phylogeny – Frequency
Based Distance.
Konstruksi filogenetik (Tamura et al. 2011). Hasil elektroforesis
amplikon 50 aksesi kedelai menggunakan primer yang sudah valid dikonversi
menjadi data alel SNP yang disimpan dalam format Fasta. Selanjutnya, data
tersebut diolah dalam program MEGA5 yang sebelumnya diubah terlebih dahulu
menjadi format MEGA. Pohon filogenetik didapatkan melalui menu Analysis –
Phylogeny – Construct/Test Unweighted Pair Group Method with Arithmetic
Mean (UPGMA) Tree.

HASIL
DNA Genom Kedelai
DNA genom kedelai hasil isolasi diuji kualitasnya menggunakan
elektroforesis gel agarosa 1.5 %. Berdasarkan hasil elektroforesis, semua DNA
genom kedelai mempunyai kualitas yang baik dengan pita DNA yang terlihat
tebal. Pita DNA genom berada dekat sumur gel agarosa yang menunjukkan bahwa
DNA berukuran besar. Namun, hasil isolasi DNA masih mengalami degradasi
yang terlihat smear pada pita DNA hasil elektroforesis (Gambar 1 dan 2).

6

DNA genom kedelai hasil isolasi diuji kuantitasnya menggunakan
spektrofotometer nanodrop dengan panjang gelombang 260, 280 dan 230 nm
(Tabel 1). Panjang gelombang 260 nm untuk pengukuran konsentrasi DNA.
Perbandingan nilai absorbansi pada 260 dan 280 nm untuk menentukan tingkat
kemurnian DNA terhadap kontaminan protein, sedangkan perbandingan nilai
absorbansi pada 260 dan 230 nm untuk menentukan tingkat kemurnian terhadap
kontaminan metabolit sekunder dan polisakarida. Konsentrasi DNA genom
kedelai berkisar 1050.700 sampai 10777.800 ng/µL. Nilai A260/A280 berkisar 1.860
sampai 1.980, sedangkan nilai A260/A230 berkisar 1.820 sampai 2.230. Tingkat
kemurnian DNA yang tinggi terhadap protein mempunyai rasio A260/A280 sebesar
1.8 sampai 2, sedangkan terhadap metabolit sekunder dan polisakarida
mempunyai rasio A260/A230 sebesar 1.8 sampai 2.2. Hal tersebut menunjukkan
bahwa DNA genom hasil isolasi mempunyai kontaminan protein, polisakarida,
metabolit sekunder dan kontaminan lain yang mempunyai panjang gelombang
maksimum sebesar 280 dan 230 nm sangat rendah.
M

1

2

3

100 bp

Gambar 1

Elektroforegram DNA genom tiga varietas kedelai. Keterangan:
M=DNA marker, 1=Wilis, 2=Tanggamus, 3=Anjasmoro

100 bp

Gambar 2 Elektroforegram DNA genom 50 aksesi kedelai. Keterangan: M=DNA
marker, 1=F.130, 2=Lokal Aceh, 3=Jackson, 4=871/4179,
5=Americana, 6=Samarinda, 7=Clarck 63, 8=TGM 256-1-6, 9=Presi
Pendek, 10=G.8216, 11=Hitam Lokal, 12=Kedele Susu, 13=Lokal
Brebes, 14=GM.915 Si, 15=Lokal Trenggalek, 16=AVRDC G.2120
M6, 17=G.2120-Mb, 18=Lokal Karangasem, 19=Otok, 20=Lokal
Mojokerto, 21=MLG.2981, 22=MLG.2986, 23=M.3031, 24=M.3289,
25=GM.3079 Si, 26=CRB-8, 27=G.3122, 28=Genjah Kuning,
29=Taichung, 30=Lokal Garut-B, 31=928 Bilomil, 32=GM.216 Si,
33=GM.425 Si, 34=GM.796 Si, 35=MLG.2768, 36=Lokal Tegal,
37=Mutiara, 38=Lokal Jonggat, 39=LEE, 40=G.7970, 41=KEDELE
SUSU, 42=Lokal Jatim, 43=7702(CK-I-11-34/2295), 44=MLG.2995,
45=Kipas Putih, 46=19/34/7/6/0, 47=GM.791 Si, 48=6/3/22/3/0,
49=Amog 13 dan 50=G.12936

7

Tabel 1 Kuantitas dan kemurnian DNA genom kedelai
Genotipe

[DNA] (ng/µL)

A260

A280

A260/A280

A260/A230

Wilis

3487.700

69.753

36.144

1.930

2.130

Tanggamus

1628.700

32.575

16.842

1.930

1.840

Anjasmoro

1266.800

25.337

13.145

1.930

1.820

F.130

3272.900

65.458

33.733

1.940

2.050

Lokal Aceh

5657.100

113.142

57.429

1.970

2.080

Jackson

1211.300

24.227

12.314

1.970

2.150

871/4179

1681.300

33.627

17.244

1.950

2.100

Americana

3344.800

66.896

34.687

1.930

2.040

Samarinda

3894.700

77.894

40.578

1.920

1.990

Clarck 63

2123.200

42.464

22.419

1.890

1.990

TGM 256-1-6

3167.900

63.358

32.280

1.960

2.130

Presi Pendek

1050.700

21.013

11.028

1.910

2.010

G.8216

1052.000

21.040

10.630

1.980

2.190

Hitam Lokal

2484.000

49.681

25.681

1.930

2.110

Kedele Susu

1472.100

29.442

14.987

1.960

2.160

Lokal Brebes

10777.800

215.556

112.883

1.910

2.020

GM.915 Si

1683.600

33.672

17.430

1.930

2.020

Lokal Trenggalek

1507.100

30.142

15.541

1.940

2.150

AVRDC G.2120 M6

1369.000

27.381

14.076

1.950

2.210

G.2120-Mb

2466.800

49.336

25.615

1.930

2.220

Lokal Karangasem

2468.400

49.369

25.415

1.940

2.190

Otok

8705.800

174.117

90.227

1.930

1.990

Lokal Mojokerto

1660.800

33.217

17.320

1.920

2.150

MLG.2981

2363.400

47.268

24.588

1.920

2.070

MLG.2986

2238.100

44.762

23.122

1.940

2.130

M.3031

2822.600

56.453

30.086

1.880

2.090

M.3289

2810.200

56.204

30.166

1.860

2.070

GM.3079 Si

2811.400

56.228

29.473

1.910

2.070

CRB-8

2970.500

59.409

31.494

1.890

2.040

G.3122

2239.800

44.796

23.012

1.950

2.230

Genjah Kuning

2097.200

41.945

21.799

1.920

2.150

Taichung

3386.300

67.726

35.011

1.930

2.010

Lokal Garut-B

2071.000

41.421

21.121

1.960

2.110

928 Bilomil

1243.900

24.878

12.757

1.950

2.200

GM.216 Si

1824.400

36.488

18.658

1.960

2.030

GM.425 Si

1942.000

38.840

19.955

1.950

2.060

GM.796 Si

2210.400

44.208

22.828

1.940

2.070

MLG.2768

1864.400

37.287

19.046

1.960

2.180

Lokal Tegal

4511.800

90.236

47.837

1.890

2.070

Mutiara

2498.900

49.977

26.117

1.910

2.090

Lokal Jonggat

4339.100

86.782

45.374

1.910

2.040

LEE

2597.100

51.942

27.097

1.920

2.060

8

Tabel 1 Kuantitas dan kemurnian DNA genom kedelai (lanjutan)
Genotipe

[DNA] (ng/µL)

A260

A280

A260/A280

A260/A230

G.7970

1802.700

36.054

18.291

1.970

2.060

KEDELE SUSU

4240.700

84.813

44.279

1.920

2.130

Lokal Jatim

4741.200

94.824

50.000

1.900

2.040

7702(CK-I-11-34/2295)

2100.700

42.014

21.791

1.930

2.000

MLG.2995

1821.300

36.426

18.627

1.960

2.170

Kipas Putih

1902.000

38.041

19.678

1.930

2.190

19/34/7/6/0

3588.500

71.770

37.782

1.900

2.020

GM.791 Si

2528.100

50.561

26.628

1.900

2.050

6/3/22/3/0

1953.700

39.074

20.040

1.950

2.110

Amog 13

3935.200

78.704

40.744

1.930

2.000

G.12936

2623.600

52.472

27.856

1.880

2.070

Primer SNAP
Sebanyak 19 pasang primer SNAP dirancang untuk mendeteksi
keberadaan SNP pada 19 posisi yang berbeda dalam genom. Sebagai contoh,
SOY-SNPR1 untuk mendeteksi SNP (C/T) pada gen Glyma07g03920, posisi
2756750 bp dalam kromosom nomor 7 (Tabel 2). SOY-SNPR1, SOY-SNPR6,
SOY-SNPR7, SOY-SNPR11 dan SOY-SNPR18 dirancang spesifik terhadap alel
yang dimiliki William 82 dan tidak spesifik terhadap alel yang dimiliki
Anjasmoro, Tanggamus dan Wilis. Sebanyak 14 pasang primer lainnya dirancang
spesifik terhadap alel yang dimiliki Anjasmoro, Tanggamus dan Wilis dan tidak
spesifik terhadap alel yang dimiliki William 82. Primer SNAP yang digunakan
mempunyai Melting Temperature (Tm) sebesar 56.992 sampai 63.305 oC
(Lampiran 3). Panjang sekuen primer dan amplikon sekitar 22 sampai 36 bp dan
325 sampai 375 bp (Lampiran 4).
Tabel 2 Posisi dan SNP target 19 pasang primer SNAP
Primer

Gen

Kromosom

Posisi (bp)

Alel spesifik

Alel non-spesifik

a

Glyma07g03920

Gm07

2756750

C

T

SOY-SNPR2

b

Glyma08g20230

Gm08

15305961

C

T

SOY-SNPR3

b

Glyma15g03050

Gm15

2145320

G

A

SOY-SNPR4b

Glyma10g30820

Gm10

39409513

C

T

b

Glyma04g05280

Gm04

4030106

C

A

SOY-SNPR6

a

Glyma10g30090

Gm10

38802168

G

C

SOY-SNPR7

a

Glyma06g18480

Gm06

14803147

C

T

SOY-SNPR8b

Glyma06g18890

Gm06

15181075

C

G

SOY-SNPR9b

SOY-SNPR1

SOY-SNPR5

Glyma17g11970

Gm17

9016561

G

A

b

Glyma15g05770

Gm15

4096214

C

T

a

Glyma03g04910

Gm03

5106501

G

A

SOY-SNPR12b

Glyma05g04380

Gm05

3560119

T

C

SOY-SNPR10

SOY-SNPR11

9

Tabel 2 Posisi dan SNP target 19 Primer SNAP (lanjutan)
Primer

Gen

Kromosom

Posisi (bp)

Alel spesifik

Alel non-spesifik

SOY-SNPR13

b

Glyma01g32160

Gm01

43606825

T

C

SOY-SNPR14

b

Glyma18g09550

Gm18

8455691

G

A

SOY-SNPR15b

Glyma04g38770

Gm04

45105095

T

C

SOY-SNPR16

b

Glyma15g15080

Gm15

11527938

T

A

SOY-SNPR17

b

Glyma14g40320

Gm14

49289270

A

G

a

Glyma03g04670

Gm03

4853774

C

T

SOY-SNPR18

SOY-SNPR19b Glyma03g30180
Gm03
38132996
A
G
a
Primer dirancang spesifik terhadap alel yang dimiliki varietas William 82 dan tidak spesifik
terhadap alel yang dimiliki varietas Anjasmoro, Wilis dan Tanggamus. bPrimer dirancang spesifik
terhadap alel yang dimiliki varietas Anjasmoro, Wilis dan Tanggamus dan tidak spesifik terhadap
alel yang dimiliki varietas William 82.

Validasi SNP
Validasi SNP Pada Genom Varietas Tanggamus, Anjasmoro dan Wilis
Primer SNAP yang berjumlah 19 pasang mayoritas berhasil
mengamplifikasi DNA varietas Wilis, Tanggamus dan Anjasmoro dengan 28
siklus PCR (Gambar 3). Namun, SOY-SNPR4, SOY-SNPR10 dan SOY-SNPR17
tidak berhasil membentuk amplikon menggunakan siklus 28 dan berhasil
menghasilkan amplikon jika menggunakan siklus 38 (Gambar 4). SOY-SNPR1,
SOY-SNPR6, SOY-SNPR7, SOY-SNPR11 dan SOY-SNPR18 dirancang sebagai
primer yang spesifik terhadap alel yang dimiliki varietas William 82 sehingga
seharusnya tidak berhasil mengamplifikasi DNA varietas Wilis, Tanggamus dan
Anjasmoro. Namun, elektroforegram menunjukkan adanya amplikon pada ketiga
varietas, sehingga SNP pada lokasi yang sesuai target primer tersebut tidak valid
(Tabel 3). SNP pada lokasi yang sesuai target primer SOY-SNPR8 dan SOYSNPR19 juga belum valid keberadaanya karena amplikon tidak terbentuk pada
penggunaan 28 dan 38 siklus PCR. SOY-SNPR8 dan SOY-SNPR19 dirancang
spesifik terhadap alel Wilis, Tanggamus dan Anjasmoro sehingga seharusnya
terbentuk amplikon pada varietas tersebut. SNP yang valid berdasarkan primer
SNAP hanya 12 dari 19 SNP dengan tingkat validitas sebesar 63% (Lampiran 5).
Tabel 3 Perbandingan hasil PCR observasi berdasarkan 19 pasang primer SNAP
dengan hasil PCR yang diharapkan
Primer

Hasil Harapan

Hasil Observasi

Anjasmoro

Tanggamus

Wilis

Anjasmoro

Tanggamus

Wilis

SOY-SNPR1

-

-

-

+

+

+

SOY-SNPR2

+

+

+

+

+

+

SOY-SNPR3

+

+

+

+

+

+

SOY-SNPR4a

+

+

+

+

+

+

SOY-SNPR5

+

+

+

+

+

+

SOY-SNPR6

-

-

-

+

+

+

SOY-SNPR7

-

-

-

+

+

+

10

Tabel 3

Perbandingan hasil PCR sebenarnya berdasarkan 19 primer SNAP
dengan hasil PCR yang diharapkan (lanjutan)
Hasil Harapan

Primer

Hasil Observasi

Anjasmoro

Tanggamus

Wilis

Anjasmoro

Tanggamus

Wilis

SOY-SNPR8

+

+

+

-

-

-

SOY-SNPR9

+

+

+

+

+

+

SOY-SNPR10a

+

+

+

+

+

+

SOY-SNPR11

-

-

-

+

+

+

SOY-SNPR12

+

+

+

+

+

+

SOY-SNPR13

+

+

+

+

+

+

SOY-SNPR14

+

+

+

+

+

+

SOY-SNPR15

+

+

+

+

+

+

SOY-SNPR16

+

+

+

+

+

+

SOY-SNPR17a

+

+

+

+

+

+

SOY-SNPR18

-

-

-

+

+

+

-

-

SOY-SNPR19
+
+
+
Primer yang optimal menggunakan siklus 38
Keterangan: (+)=Terbentuk amplikon, (-)=tidak terbentuk amplikon
a

SOY-SNPR 1

2

4

5

6

7

8

9

10

11

12

13

14 15

16 17

Produk
400 bp
300 bp

M a b c a b c ab c a b c a bc a b c a b c a b c a bc a b c a bc a b c a b c a bc a b c a
SOY-SNPR17

18

3

19

produk
400 bp
300 bp

400 bp
300 bp

400 bp
300 bp

.

produk

M a b a b c

M a

b c

M a b c

Gambar 3 Elektroforegram hasil PCR menggunakan primer SOY-SNPR1 sampai
SOY-SNPR19 dengan 28 siklus PCR. Keterangan: M=DNA Marker,
a=Wilis b=Anjasmoro, c=Tanggamus

11

SOY-SNPR4

8

10

17

19

produk
400 bp
300 bp
a

b

c a

b

c

a

b

c M

M a

b

c

a

b

c

Gambar 4 Elektroforegram hasil PCR menggunakan primer SOY-SNPR4, SOYSNPR8, SOY-SNPR10, SOY-SNPR17, dan SOYSNPR-19 den gan 38
siklus PCR. Keterangan: M=DNA Marker, a=Wilis b=Anjasmoro,
c=Tanggamus
Validasi SNP Pada Genom 50 Aksesi Kedelai
Primer yang sudah valid pada uji validasi SNP menggunakan varietas
Anjasmoro, Tanggamus dan Wilis berjumlah 12 digunakan untuk
mengamplifikasi DNA genomik 50 aksesi kedelai. Salah satu pasang primer yang
digunakan adalah SOY-SNPR16. Tidak semua aksesi menghasilkan amplikon
ketika diamplifikasi dengan SOY-SNPR16, seperti aksesi F.130, Lokal Aceh,
Jackson, Clark 63, GM.915 Si, G.2120-Mb, Otok, MLG.2986, M.3031, GM.3079
Si, Lokal Jatim, MLG.2995, 6/3/22/3/0 dan G.12936 (Gambar 5). Aksesi tersebut
mempunyai alel yang sama dengan varietas Williams 82, yaitu alel A pada posisi
11527938 bp dalam kromosom nomor 15 berdasarkan rancangan primer.
Sedangkan aksesi lain mempunyai alel yang sama dengan varietas Tanggamus,
Anjasmoro dan Wilis, yaitu alel T (Tabel 4).

400 bp
300 bp

Gambar 5

Elektroforegram hasil PCR menggunakan primer SOY-SNPR16.
Keterangan: M=DNA marker, 1=F.130, 2=Lokal Aceh, 3=Jackson,
4=871/4179, 5=Americana, 6=Samarinda, 7=Clarck 63, 8=TGM
256-1-6, 9=Presi Pendek, 10=G.8216, 11=Hitam Lokal, 12=Kedele
Susu, 13=Lokal Brebes, 14=GM.915 Si, 15=Lokal Trenggalek,
16=AVRDC G.2120 M6, 17=G.2120-Mb, 18=Lokal Karangasem,
19=Otok, 20=Lokal Mojokerto, 21=MLG.2981, 22=MLG.2986,
23=M.3031, 24=M.3289, 25=GM.3079 Si, 26=CRB-8, 27=G.3122,
28=Genjah Kuning, 29=Taichung, 30=Lokal Garut-B, 31=928
Bilomil, 32=GM.216 Si, 33=GM.425 Si, 34=GM.796 Si,
35=MLG.2768, 36=Lokal Tegal, 37=Mutiara, 38=Lokal Jonggat,
39=LEE, 40=G.7970, 41=KEDELE SUSU, 42=Lokal Jatim,
43=7702(CK-I-11-34/2295), 44=MLG.2995, 45=Kipas Putih,
46=19/34/7/6/0, 47=GM.791 Si, 48=6/3/22/3/0, 49=Amog 13 dan
50=G.12936

12

Primer SNAP lain juga dapat membuktikan tersebarnya SNP pada 50
aksesi kedelai (Tabel 4). Namun primer SOY-SNPR9, SOY-SNPR13 dan SOYSNPR15 tidak dapat membuktikan bahwa SNP terjadi pada posisi 9016561 bp
kromosom 17, 43606825 bp kromosom satu dan 45105095 bp kromosom empat.
Aksesi tersebut mempunyai alel yang sama dengan Tanggamus, Wilis dan
Anjasmoro. Tidak ada yang sama dengan William 82. Pola yang ditunjukkan
monomorfik sehingga SNP pada posisi tersebut tidak valid. Jumlah SNP yang
valid menurun dari 12 menjadi 9 SNP dengan tingkat validitas sebesar 47%
(Lampiran 5). Sembilan SNP yang valid berada pada posisi 15305961 bp
kromosom 8, 2145320 bp kromosom 15, 39409513 bp kromosom 10, 4030106 bp
kromosom 4, 4096214 bp kromosom 15, 3560119 bp kromosom 5, 8455691 bp
kromosom 18, 11527938 kromosom 15 dan 49289270 bp kromosom 14.
Tabel 4 SNP pada 50 aksesi kedelai berdasarkan kinerja 12 pasang primer SNAP
dengan rujukan SNP pada varietas William 82, Wilis, Tanggamus dan
Anjasmoro dari database di IAARD GC
SOY-SNPR

Genotipe
2

a

3

b

4

c

5

d

9

e

10f

12g

13h

14i

15j

16k

17l

William 82
Wilis

T

A

T

A

A

T

C

C

A

C

A

G

C

G

C

C

G

C

T

T

G

T

T

A

Tanggamus

C

G

C

C

G

C

T

T

G

T

T

A

Anjasmoro

C

G

C

C

G

C

T

T

G

T

T

A

F.130

T

G

T

C

G

T

T

T

G

T

A

A

Lokal Aceh

T

A

T

C

G

T

T

T

G

T

A

G

Jackson

C

G

C

C

G

C

T

T

G

T

A

A

871/4179

C

G

C

C

G

C

T

T

G

T

T

G

Americana

T

A

C

C

G

C

T

T

G

T

T

A

Samarinda

C

G

C

C

G

C

T

T

G

T

T

G

Clarck 63

T

G

C

A

G

C

T

T

G

T

A

A

TGM 256-1-6

T

A

C

A

G

C

T

T

G

T

T

G

Presi Pendek

C

G

C

C

G

T

T

T

G

T

T

G

G.8216

T

G

C

C

G

T

T

T

G

T

T

G

Hitam Lokal

C

G

C

C

G

C

T

T

G

T

T

A

Kedele Susu

C

G

C

C

G

T

T

T

G

T

T

G

Lokal Brebes

T

G

T

A

G

C

T

T

G

T

T

A

GM.915 Si

T

G

C

C

G

T

T

T

G

T

A

G

C

G

C

T

T

G

T

T

A

Lokal Trenggalek

T

G

C

AVRDC G.2120 M6

T

G

C

C

G

C

T

T

G

T

T

A

G.2120-Mb

T

G

T

A

G

T

T

T

A

T

A

A

Lokal Karangasem

T

G

C

C

G

C

T

T

G

T

T

G

C

T

T

G

T

A

G

Otok

T

A

C

A

G

Lokal Mojokerto

T

A

C

A

G

T

T

T

G

T

T

G

MLG.2981

T

G

C

A

G

C

T

T

G

T

T

G

MLG.2986

T

A

T

A

G

C

T

T

G

T

A

G

M.3031

C

A

C

A

G

C

T

T

G

T

A

A

13

Tabel 4 SNP pada 50 aksesi kedelai berdasarkan kinerja 12 pasang primer SNAP
dengan rujukan SNP pada varietas William 82, Wilis, Tanggamus dan
Anjasmoro dari database di IAARD GC (lanjutan)
SOY-SNPR

Genotipe
2

a

3

b

M.3289

T

G

GM.3079 Si
CRB-8

T
T

G.3122

4

c

5

d

9

e

10f

12g

13h

14i

15j

16k

17l

T

A

G

C

T

T

G

T

T

A

G

T

A

G

C

C

T

G

T

A

A

G

C

C

G

T

T

T

G

T

T

A

C

G

C

C

G

T

T

T

G

T

T

G

Genjah Kuning

C

G

C

C

G

C

T

T

G

T

T

G

Taichung

C

G

C

C

G

C

T

T

G

T

T

A

Lokal Garut-B

C

G

T

C

G

T

C

T

G

T

T

A

928 Bilomil

C

G

C

C

G

C

T

T

G

T

T

G

GM.216 Si

C

G

C

C

G

T

T

T

G

T

T

G

GM.425 Si

C

G

C

C

G

T

T

T

G

T

T

A

GM.796 Si

C

G

C

A

G

C

T

T

G

T

T

A

MLG.2768

C

G

C

C

G

C

T

T

G

T

T

G

Lokal Tegal

C

G

C

C

G

T

T

T

G

T

T

A

Mutiara

C

G

C

C

G

C

T

T

G

T

T

G

Lokal Jonggat

C

G

C

C

G

T

T

T

G

T

T

G

LEE

C

G

C

C

G

C

T

T

G

T

T

G

C

G

T

T

T

G

T

T

A

G.7970

C

G

C

KEDELE SUSU

C

G

C

C

G

T

C

T

G

T

T

A

Lokal Jatim

C

G

T

A

G

T

T

T

G

T

A

G

7702(CK-I-11-34/2295)

C

G

C

C

G

C

T

T

G

T

T

A

MLG.2995

C

G

C

C

G

C

C

T

G

T

A

A

Kipas Putih

C

G

C

C

G

T

T

T

G

T

T

A

19/34/7/6/0

C

G

C

C

G

T

T

T

G

T

T

A

GM.791 Si

C

G

C

C

G

C

T

T

G

T

T

A

6/3/22/3/0

C

G

T

A

G

C

T

T

G

T

A

A

Amog 13

C
G
C
A
G
T
T
T
G
T
T
A
G.12936
C
G
T
A
G
T
T
T
G
T
A
A
a
terdapat pada posisi 15305961 bp kromosom 8. bPosisi 2145320 bp kromosom 15. cPosisi
39409513 bp kromosom 10. dPosisi 4030106 bp kromosom 4. ePosisi 9016561 bp kromosom 17.
f
Posisi 4096214 bp kromosom 15. gPosisi 3560119 bp kromosom 5. hPosisi 43606825 bp
kromosom 1. iPosisi 8455691 bp kromosom 18. jPosisi 45105095 bp kromosom 4. kPosisi
11527938 bp kromosom 15. lPosisi 49289270 bp kromosom 14.

Kekerabatan 50 Aksesi Kedelai Menggunakan SNP Tervalidasi
Tingkat Polimorfisme dan Heterozigositas
PowerMarker digunakan untuk menganalisis tingkat polimorfisme,
heterozigositas dan diversitas gen berdasarkan kemampuan marka (Tabel 5).
Berdasarkan hasil analisis statistika, sembilan pasang marka SNAP mempunyai
nilai rerata Polymorphism Information Content (PIC) sebesar 0.271. Primer SOY-

14

SNPR10 dan SOY-SNPR17 mempunyai nilai PIC tertinggi, yaitu 0.371. SOYSNPR14 mempunyai nilai PIC terendah, yaitu 0.038. Nilai heterozigositas untuk
semua marka sebesar nol, berarti tidak ada individu yang bersifat heterozigot.
Rerata nilai diversitas gen atau heterozigositas harapan untuk semua marka, yaitu
0.341. SOY-SNPR10 dan SOY-SNPR17 mempunyai nilai diversitas gen tertinggi,
yaitu 0.493. SOY-SNPR14 mempunyai nilai diversitas gen yang rendah, yaitu
0.039. Alel yang terlibat dalam marka sebanyak dua karena SNP hanya
melibatkan dua alel. Rerata frekuensi alel utama, yaitu alel yang dimiliki varietas
Wilis, Tanggamus dan Anjasmoro sebesar 0.742.
Tabel 5 Tingkat polimorfisme dan heterozigositas sembilan marka SNAP melalui
50 aksesi kedelai

SOY-SNPR2

Frekuensi Alel
Utama
0.620

2.000

Diversitas
Gen
0.471

SOY-SNPR3
SOY-SNPR4

0.860

2.000

0.241

0.000

0.212

0.780

2.000

0.343

0.000

0.284

SOY-SNPR5

0.680

2.000

0.435

0.000

0.341

SOY-SNPR10

0.560

2.000

0.493

0.000

0.371

SOY-SNPR12

0.920

2.000

0.147

0.000

0.136

SOY-SNPR14

0.980

2.000

0.039

0.000

0.038

SOY-SNPR16

0.720

2.000

0.403

0.000

0.322

SOY-SNPR17

0.560

2.000

0.493

0.000

0.371

Rerata

0.742

2.000

0.341

0.000

0.271

Primer

Jumlah Alel

Heterozigositas

PIC

0.000

0.360

Filogenetik dan Koefisien Jarak Genetik
Penyebaran SNP pada 50 aksesi kedelai berdasarkan sembilan pasang
primer SNAP yang sudah valid dapat dikembangkan untuk mencari nilai
kekerabatan antar aksesi. Besarnya koefisien jarak genetik antar aksesi kedelai
berkisar 0 sampai 0.3 yang tergambar dalam filogenetik (Gambar 6). Aksesi
kedelai berjumlah 50 dapat dibedakan menjadi dua kelompok besar berdasarkan
nilai koefisien jarak genetik sebesar 0.3. Kelompok pertama terdiri atas 38 aksesi,
sedangkan kelompok kedua hanya terdiri atas 12 aksesi. Dendogram tersebut
mempunyai enam kelompok yang mempunyai koefisien kesamaan jarak genetik
sebesar nol atau sangat identik. Salah satu kelompok yang mempunyai jarak
genetik sebesar nol, yaitu kelompok yang terdiri atas 871/4179, 928 Bilomil,
Genjah Kuning, Lee, MLG.2768, Mutiara dan Samarinda.
Rerata jarak genetik antara daerah asal aksesi kedelai dapat diketahui
menggunakan progam PowerMarker (Tabel 6). Berdasarkan hasil analisis, rerata
jarak genetik antar daerah asal berkisar 0.101 sampai 0.500. Jarak genetik
tertinggi sebesar 0.500 antara Filipina dan Aceh, sedangkan jarak genetik terendah
sebesar 0.101 antara Admixture dan Jawa Barat.

15

Kipas Putih
Lokal Tegal
GM.425 Si
G.7970
19/34/7/6/0
G.3122
GM.216 Si
Kedele Susu
Lokal Jonggat
Presi Pendek
CRB-8
G.8216
Hitam Lokal
Taichung
GM.791 Si
7702(CK-I-11-34/2295)
871/4179
928 Bilomil
Genjah Kuning
LEE
MLG.2768
Mutiara
Samarinda
Americana
Lokal Karangasem
AVRDC G.2120 M6
Lokal Trenggalek
Amog 13
GM.796 Si
KEDELE SUSU.
Lokal Garut-B
Clarck 63
M.3031
Jackson
MLG.2995
GM.915 Si
F.130
Lokal Aceh
MLG.2981
TGM 256-1-6
Lokal Mojokerto
MLG.2986
Otok
Lokal Brebes
M.3289
GM.3079 Si
G.2120-Mb
6/3/22/3/0
G.12936
Lokal Jatim
0.30

0.25

0.20

0.15

0.10

0.05

0.00

koefisien jarak genetik
Gambar 6 Dendogram 50 aksesi kedelai berdasarkan sembilan marka SNAP

16

Tabel 6 Matriks rerata jarak genetik antar daerah asal 50 aksesi kedelai

a

Daerah

I

Aceh (I)
Admixturea
(II)
Bali (III)

0.000

II

III

IV

V

VI

VII

VIII

IX

0.217

0.000

0.389

0.313

0.000

Filipina
Jawa Barat
(IV)
Jawa Tengah
(V)
Jawa Timur
(VI)
NTT (VII)

0.500

0.384

0.333

0.000

0.258

0.101

0.273

0.424

0.000

0.315

0.162

0.259

0.296

0.202

0.000

0.217

0.131

0.323

0.354

0.232

0.185

0.000

0.278

0.273

0.222

0.556

0.212

0.333

0.364

0.000

Taiwan (IX)

0.278

0.125

0.289

0.356

0.137

0.163

0.216

0.289

0.000

USA (X)
0.278 0.157 0.333 0.333 0.187
Aksesi kedelai yang daerah asalnya belum diketahui

0.204

0.187

0.278

0.133

X

0.000

PEMBAHASAN
DNA Genom Kedelai
Daun kedelai seperti tanaman lain mengandung polisakarida dan metabolit
sekunder yang dapat menurunkan kemurnian hasil isolasi DNA. Kontaminan
seperti polisakarida dapat mengganggu studi genetik karena menghambat aktivitas
enzim, seperti DNA polimerase dalam proses PCR (Fang et al. 1992). Polifenol
merupakan salah satu metabolit sekunder yang juga dapat menghambat studi
genetik dengan merusak DNA. Senyawa tersebut akan teroksidasi dan berikatan
secara kovalen dengan DNA dan protein. DNA akan tampak berwarna coklat
ketika berikatan dengan polifenol yang teroksidasi dan DNA tidak dapat
digunakan untuk proses selanjutnya (Hussain et al. 2015).
Isolasi DNA menggunakan bufer CTAB pada metode Doyle & Doyle
merupakan pilihan yang tepat untuk isolasi DNA tanaman. Menurut Varma et al.
(2007), CTAB akan mengendapkan protein dan karbohidrat dengan membentuk
kompleks, namun tidak mengendapkan DNA pada kondisi kekuatan ionik yang
tinggi. Senyawa metabolit sekunder, seperti polifenol dapat diatasi dengan PVP,
β-merkaptoetanol dan natrium bisulfit. PVP membentuk kompleks dengan
polifenol melalui ikatan hidrogen sehingga polifenol akan terpisah dengan DNA.
Natrium bisulfit dan β-merkaptoetanol berperan sebagai agen pereduksi untuk
mencegah oksidasi polifenol (Choundhary et al. 2008). Menurut Varma et al.
(2007), kontaminan polisakarida dan metabolit sekunder dapat dikurangi dengan
menggunakan daun yang segar dan muda. Semakin tua umur daun maka kadar
polisakarida dan metabolit sekunder semakin tinggi.
Hasil isolasi DNA dapat diuji secara kualitatif dan kuantitatif. Pengujian
secara kualitatif menggunakan elektroforesis gel agarosa. Elektroforesis gel
agarosa dapat memisahkan DNA berdasarkan ukuran. Semakin besar ukuran

17

DNA semakin lambat kecepatan migrasinya (Gusmiaty et al. 2012). DNA genom
50 aksesi dan tiga varietas kedelai bermigrasi sangat lambat (Gambar 1 dan 2).
Berdasarkan perbandingan dengan DNA marker, ukuran DNA genom sangat
besar terletak dekat sumur gel. Hal tersebut disebabkan bahwa ukuran genom
kedelai sebesar 1.1-1.15 gb (Shultz et al. 2006). Elektroforegram menunjukkan
pita DNA yang tebal dengan sedikit smear. DNA diduga mengalami degradasi
sehingga terbentuk smear yang diakibatkan aktivitas nuklease. Enzim nuklease
dapat bersumber dari dalam sel yang gagal dihilangkan dan lingkungan
(Karimnasab et al. 2013). Namun, degradasi pada level rendah masih dapat
ditolerir dalam tahap selanjutnya.
Uji kuantitatif hasil isolasi DNA dilakukan menggunakan
spektrofotometer nanodrop. DNA genom untuk semua genotipe mengandung
kontaminan protein, polisakarida dan polifenol yang rendah. Hal tersebut
ditunjukkan oleh A260/280 dan A260/230 berada pada nilai optimum (Tabel 1).
Menurut Al-Ashwal dan Hamdan (2013), tingkat kemurnian DNA sangat tinggi
jika A260/280 dan A260/230 sebesar 1.8 sampai 2 dan 1.7 sampai 2.2. Nilai absorbansi
pada panjang gelombang 280 dan 230 nm lebih kecil dibandingkan 260 nm yang
berbanding lurus dengan konsentrasi kontaminan yang sangat sedikit
dibandingkan DNA. Nilai A260/230 juga dapat menunjukkan rendahnya kontaminan
pereaksi-pereaksi isolasi DNA yang tertinggal, seperti EDTA dan senyawa
organik (Bhandari et al. 2014).
Rendahnya kontaminan yang berada pada hasil isolasi DNA genom
kedelai dipengaruhi oleh ketepatan metode isolasi DNA. Selain karbohidrat dan
polifenol yang berhasil dipisahkan dari DNA, kontaminan protein juga dapat
dengan mudah untuk dipisahkan karena penggunaan metode yang tepat.
Penggunaan kloroform isoamilalkohol sangat berperan penting untuk memisahkan
protein dari DNA. Protein didenaturasi oleh kloroforom dan larut dalam fase
organik atau interfase, sedangkan DNA larut dalam fase air sehingga protein
mudah untuk dipisahkan dari DNA. Sedangkan, isoamilalkohol meningkatkan
pemisahan antara fase organik dan fase air (Susanti dan Ariani 2004). Kualitas
dan kuantitas DNA hasil isolasi menunjukkan bahwa DNA genom dapat
digunakan untuk tahap selanjutnya, yaitu PCR untuk validasi SNP.

Primer SNAP
Program SNAPER memberikan sekitar 32 alternatif sekuen primer SNAP
untuk membuktikan SNP pada posisi yang sama. Hanya satu pasang primer yang
digunakan dalam penelitian dari 32 pasang primer. Sebanyak 19 primer SNAP
digunakan untuk membuktikan SNP terjadi pada 19 posisi pilihan (Tabel 2).
Pemilihan dilakukan secara acak dengan memperhatikan keterangan “high end
self complementary”. rimer dengan keterangan tersebut tidak boleh digunakan
karena dapat mengganggu proses PCR. Menurut Singh et al. (2000), sekuen
primer yang komplemen terhadap sekuennya sendiri mengakibatkan terbentuknya
struktur “hairpin loop”. Struktur tersebut sangat mengganggu reaksi CR karena
primer tidak dapat menempel dengan DNA. Pasangan primer yang terdiri atas
reverse dan forward yang saling komplemen juga akan membentuk struktur
dimer.

18

Setiap sekuen primer SNAP pada ujung 3 OH akan komplemen terhadap
nukleotida spesifik dalam DNA cetakan. Jika pada ujung 3 OH SOY-SNPR2
mempunyai basa C maka primer hanya menempel pada DNA cetakan yang
mempunyai basa C pada lokasi sesuai target primer tersebut. DNA cetakan yang
mempunyai basa lain selain C akan menyebabkan primer tidak akan menempel
dan gagal mengamplifikasi DNA cetakan. Hal tersebut sesuai dengan Lestari dan
Koh (2013), bahwa primer SNAP dapat membedakan individu yang mempunyai
perbedaan basa tunggal di lokasi spesifik dalam genom.
Modifikasi primer juga dilakukan pada salah satu dari tiga nukleotida
dekat ujung 3 OH. Nukleotida pada posisi pertama dari ujung 3 OH pada SOYSNPR2 dibuat tidak komplemen (mismatch) dengan cetakan DNA. Hal tersebut
meningkatkan kegagalan penempelan primer pada DNA yang membawa
nukleotida tidak spesifik karena mengandung dua mismatch, yaitu pada ujung 3
OH primer dan posisi satu dari ujung 3 OH primer. Sedangkan cetakan DNA yang
membawa nukleotida spesifik hanya mengalami mismatch pada satu posisi antara
posisi dekat dari ujung 3 OH primer dengan cetakan DNA sehingga primer tetap
berhasil mengamplifikasi DNA. Hal tersebut disebabkan karena primer masih
mempunyai kemampuan untuk menempel pada cetakan DNA dengan satu posisi
mismatch yang berada di dalam (Kwok et al. 1990). Modifikasi tersebut bertujuan
meningkatkan spesifisitas primer dalam membedakan individu yang mempunyai
basa tunggal berbeda karena jika hanya mengandalkan satu posisi mismatch
menyebabkan spesifisitas sangat rendah (Drenkard et al. 2000).
Primer SNAP yang digunakan dalam penelitian mempunyai panjang
sekuen sebesar 22 sampai 36 bp dan Tm sebesar 56.992 sampai 63.305 oC.
Menurut Borah (2011), secara umum panjang sekuen dan Tm untuk primer
sebesar 18 sampai 22 bp dan 52 sampai 58 oC. Primer yang terlalu panjang
mengakibatkan sulitnya penempelan primer terhadap DNA. Tm yang terlalu
tinggi berpotensi terjadi secondary annealing atau penempelan primer secara t