34 34
BAB III METODE PENELITIAN
III.1. Rancangan Penelitian
Penelitian dilakukan secara deskriptif dengan menggunakan teknik Reverse Transcriptase-Polymerase Chain Reaction RT-PCR.
III.2. Tempat dan Waktu
Penelitian dilakukan di Laboratorium Klinik Mikrobiologi Rumah Sakit Haji Adam Malik Medan, dari bulan September 2008 sampai bulan Januari 2009.
III.3. Bahan dan Cara Kerja
Bahan penelitian adalah serum penderita Demam Dengue dan Demam Berdarah Dengue yang dirawat di Rumah Sakit Haji Adam Malik, Rumah Sakit
Pirngadi, dan Rumah Sakit Herna Medan. Darah penderita diambil dengan menggunakan syringe 3 ml. Pengambilan sampel serum penderita DDDBD dengan
gejala klinis lima hari pertama demam Singh K, et al, 2006 dan konfirmasi diagnosis DDDBD sesuai dengan kriteria WHO. Setelah itu, data masing-masing
sampel dimasukkan ke dalam lembar check list yang berisi mengenai informasi demografi pasien seperti nama, umur, jenis kelamin, alamat, dan pekerjaan, serta
hasil pemeriksaan laboratorium.
p d f Machine
A pdf w rit er t hat produces qualit y PDF files w it h ease
Produce quality PDF files in seconds and preserve the integrity of your original docum ents. Com patible across nearly all Windows platform s, sim ply open the docum ent you want to convert, click “print”, select the
“ Broadgun pdfMachine printer” and that’s it Get yours now
Universitas Sumatera Utara
28 Mengingat sampel yang kami ambil 100 seratus serum penderita yang
kemudian akan dihitung dengan rumus:
n
≥
Z
2
0,5 –
á 2
.ñ.q
e
2
n = jumlah sampel Z = nilai normal dari tabel Z yang besarnya tergantung dari nilai á yang ditentukan,
untuk á = 0,05; Z
c
= 1,96 p = proporsi penderita DDDBD di Sumatera Utara 2007 = 0,32
q = 1 – p e = tingkat ketepatan yang diinginkan = 10
p = 0,32 p = 1 – q
= 1 – 0,32 = 0,68
n = 1,96 – 0,68 . 0,32 10100
2
= 85 Keterangan: Sampel yang dibutuhkan minimal 85
p d f Machine
A pdf w rit er t hat produces qualit y PDF files w it h ease
Produce quality PDF files in seconds and preserve the integrity of your original docum ents. Com patible across nearly all Windows platform s, sim ply open the docum ent you want to convert, click “print”, select the
“ Broadgun pdfMachine printer” and that’s it Get yours now
Universitas Sumatera Utara
29 29
III.3.1. Kerangka Operasional
Pasien Kriteria DDDBD +
Kriteria DDDBD - Data Nama, Umur, Jenis Kelamin, Pekerjaan, Hasil Lab
Serum Penderita 0,5 cc Ekstraksi
RT-PCR menggunakan primers universal dan TS 3 ANALISIS Elektroforesis
Gel Imaging visualisasi Serotipe Virus Dengue
III.3.2. Ekstraksi RNA Serum penderita Demam DengueDemam Berdarah Dengue dan diletakkan
dalam tabung eppendorf dengan 1,5 growth medium. Diputar dengan kecepatan 14.000 rpm per menit pada suhu 4
o
C dan supernatannya akan digunakan untuk isolasi virus.
Virus RNA diekstraksi dari 200µl aliquots yang berasal dari supernatant sel yang terinfeksi dengan menggunakan QIAamp
®
Viral RNA Mini Kit dari Qiagen dengan mengikuti protokolnya. Untuk memeriksa sampel, diperlukan 140µl
homogenat dari setiap sampel. Untuk kontrol positif digunakan RNA virus yang
p d f Machine
A pdf w rit er t hat produces qualit y PDF files w it h ease
Produce quality PDF files in seconds and preserve the integrity of your original docum ents. Com patible across nearly all Windows platform s, sim ply open the docum ent you want to convert, click “print”, select the
“ Broadgun pdfMachine printer” and that’s it Get yours now
Universitas Sumatera Utara
30 30
mengandung DEN 1, DEN 2, DEN 3, dan DEN 4 dalam jumlah volume yang sama. Untuk kontrol negatif digunakan RNA virus tanpa virus Dengue.
III.3.2.1.Peralatan dan bahan 1.
QIAamp MinElute Virus Spint Kit, terdiri dari: QIAamp MinElute Columns, Collection Tubes, Buffer AL, Buffer AW1
concentrate, Buffer AW2 concentrate, Buffer AVE, Protease Resuspension Buffer, Carrier RNA, QIAGEN
®
Protease. 2.
Pipet tips 25 µl kuning. 3.
Pipet tips 200 µl biru. 4.
Mikropipet. 5.
Tabung eppendorf. 6.
Vortexer Maxi mix II. 7.
Block heater Barnstead International. 8.
Microcentrifuge Sorvall Biofuge Primo R Centrifuge. 9.
Etanol 96-100. 10.
Kulkas 4
o
C Sanyo. 11.
Freezer -20
o
C dan -70
o
C Sanyo. 12.
Alat elektroforesis. 13.
Gel imaging Bio Red. 14.
Mesin PCR Bio Red. 15.
Homogeniger. 16.
Disposable gloves.
p d f Machine
A pdf w rit er t hat produces qualit y PDF files w it h ease
Produce quality PDF files in seconds and preserve the integrity of your original docum ents. Com patible across nearly all Windows platform s, sim ply open the docum ent you want to convert, click “print”, select the
“ Broadgun pdfMachine printer” and that’s it Get yours now
Universitas Sumatera Utara
31 31
17. Agarosa.
18. SYBER safe-TM.
19. IX TAE buffer.
20. Primers DEN 3.
21. Aquades.
22. Blue juice 2X.
III.3.2.2.Persiapan 1.
Mempersiapkan Qiagen protease 1,4 buffer AVE di tambahkan ke dalam Qiagen protease, dicampur dan
dipisahkan ke dalam 5-6 tabung eppendrof, masing-masing 250 µl untuk 10 reaksi, lalu disimpan pada suhu -20
C. 2.
Mempersiapkan buffer AL- RNA Carrier 310 µl buffer AVE ditambahkan ke dalam tabung berisi carrier RNA.
Dicampurkan dan dipisahkan ke dalam 5 tabung eppendrof masing-masing berisi 62 µl untuk 10 reaksi, lalu disimpan pada suhu -20
C. 3.
Mempersiapkan Buffer AW-1 25 ml etanol 96-100 ditambahkan ke dalam buffer AW-1 dan disimpan pada
suhu ruangan. 4.
Mempersiapkan Buffer AW-2 30 ml etanol 96-100 ditambahkan ke dalam buffer AW-2 dan disimpan
pada suhu ruangan.
p d f Machine
A pdf w rit er t hat produces qualit y PDF files w it h ease
Produce quality PDF files in seconds and preserve the integrity of your original docum ents. Com patible across nearly all Windows platform s, sim ply open the docum ent you want to convert, click “print”, select the
“ Broadgun pdfMachine printer” and that’s it Get yours now
Universitas Sumatera Utara
32 32
III.3.2.3.Ekstraksi Serum penderita diambil dalam tabung eppendorf dimasukkan ke dalam
sentrifuse dan diputar dengan kecepatan 14.000 rpm selama 10 menit dengan suhu 4
o
C. Lalu 200 µl supernatant hasil sentrifuse diambil dengan menggunakan mikropipet dan dimasukkan ke dalam tabung eppendorf 1,5 ml yang berisi 25 µl
Qiagen protease. Setelah itu ditambahkan 200 µl buffer AL + Carrier RNA dan diinkubasi
selama 15 menit pada suhu 56
o
C. Lalu tabung eppendorf dimasukkan ke dalam sentrifuse dan diputar dengan kecepatan 8000 rpm selama 1 menit. Kemudian
ditambahkan 250 µl etanol ke dalam tabung eppendorf tersebut, ditutup dan dicampurkan dengan menggunakan vortexer selama 15 detik. Setelah di vortex,
diinkubasi selama 5 menit pada suhu ruangan, lalu dimasukkan lagi ke dalam sentrifuse dan diputar dengan kecepatan 8000 rpm selama 1 menit.
Setelah tabung eppendorf dikeluarkan dari sentrifuse, campuran tersebut dimasukkan ke dalam column dengan menggunakan mikropipet dan tutup capnya.
Lalu dimasukkan lagi ke dalam sentrifuse dan diputar dengan kecepatan 8000 rpm selama 1 menit. Setelah column dikeluarkan dari sentrifuse, collection tube yang
mengandung filtrate dibuang dan column dimasukkan ke dalam collection tube baru. Kemudian ditambahkan 500 µl buffer AW-1, lalu dimasukkan lagi ke dalam
sentrifuse dan diputar dengan kecepatan 8000 rpm selama 1 menit. Setelah column dikeluarkan dari sentrifuse, buang collection tube yang mengandung filtrate dan
column dimasukkan ke dalam collection tube baru. Kemudian ditambahkan 500 µl
p d f Machine
A pdf w rit er t hat produces qualit y PDF files w it h ease
Produce quality PDF files in seconds and preserve the integrity of your original docum ents. Com patible across nearly all Windows platform s, sim ply open the docum ent you want to convert, click “print”, select the
“ Broadgun pdfMachine printer” and that’s it Get yours now
Universitas Sumatera Utara
33 33
buffer AW-2. Lalu dimasukkan ke dalam sentrifuse dan diputar dengan kecepatan 8000 rpm selama 1 menit. Buang collection tube yang mengandung filtrat, masukkan
column ke dalam collection tube baru. Kemudian ditambahkan 500 µl etanol. Lalu dimasukkan kembali ke dalam sentrifuse dan diputar dengan kecepatan 8000 rpm
selama 1 menit. Setelah column dikeluarkan dari sentrifuse, buang collection tube yang mengandung filtrate dan column dimasukkan ke dalam collection tube baru.
Kemudian dimasukkan kembali ke dalam sentrifuse dan putar dengan kecepatan 14.000 rpm selama 3 menit untuk mengeringkan dry spin. Setelah
column dikeluarkan dari sentrifuse, buang collection tube yang mengandung filtrate dan column dimasukkan ke dalam collection tube baru, tutupnya dibuka dan
diinkubasi dalam 56
o
C selama 3 menit. Kemudian masukkan column ke dalam tabung microcentrifuge 1,5 ml, dimasukkan 100 µl buffer AVE atau RNA se-free water ke
tengah-tengah membrane, lalu ditutup dan diinkubasi selama 1 menit pada suhu ruangan. Kemudian dimasukkan ke dalam sentrifuse dan diputar dengan kecepatan
14.000 rpm selama 1 menit. Setelah itu column di buang, dan tabung microcentrifuge yang mengandung RNA yang telah di ekstraksi disimpan dalam suhu -70
o
C.
p d f Machine
A pdf w rit er t hat produces qualit y PDF files w it h ease
Produce quality PDF files in seconds and preserve the integrity of your original docum ents. Com patible across nearly all Windows platform s, sim ply open the docum ent you want to convert, click “print”, select the
“ Broadgun pdfMachine printer” and that’s it Get yours now
Universitas Sumatera Utara
34 34
Gambar 1. Proses Ekstraksi
p d f Machine
A pdf w rit er t hat produces qualit y PDF files w it h ease
Produce quality PDF files in seconds and preserve the integrity of your original docum ents. Com patible across nearly all Windows platform s, sim ply open the docum ent you want to convert, click “print”, select the
“ Broadgun pdfMachine printer” and that’s it Get yours now
Universitas Sumatera Utara
35 35
III.3.3. RT-PCR
Master mix dibuat dengan mencampurkan 25µl dari 2x reaksi mix buffer yang terdiri dari 0.4 mM dari dNTP, 3.2 mM MgSO
4
, 1 µl dari 10 µM primers universal, 1 µl dari 10 µM primers D3, 2 µl superscript III RT, 4 µl MGSO
4
ditambahkan aquades sampai 20 µl Haris, et al, 1998. Master mix ini dicampurkan dengan pipeting dan di spin down.
RNA hasil ekstraksi dipersiapkan dengan memanaskan tabung pada 65
o
C selama 5 menit dengan menggunakan block heater, kemudian ditempatkan di dalam
Es selama mempersiapkan master mix. Kemudian 5 µl RNA hasil ekstraksi ditambahkan ke dalam master mix, kemudian di sentrifuse dengan kecepatan 8000
rpm selama 1 menit. Langkah Reverse Transcriptase RT dilakukan selama 30 menit untuk
menghasilkan DNA, kemudian diamplikasi dengan langkah Polymerase Chain Reaction PCR berikut: 92
o
C selama 3 menit untuk initial denaturation, 82
o
C selama 30 detik untuk denaturation, 53
o
C selama 30 detik untuk annealing dan 72
o
C selama 1 menit untuk extension. Siklus ini diulangi sebanyak 40 kali sebelum final extension
72
o
C selama 5 menit. Produk PCR ini disimpan pada suhu 4
o
C sebelum digunakan.
III.3.4. Elektroforesis
Mula-mula dibuat agarose 1 dengan cara: 10 ml 1X TAE buffer dicampur dengan 100 ml aquades pengenceran 10x, lalu 50 ml larutan 1X TAE buffer
tersebut dicampurkan dengan 1 gram agarose. Lalu dipanaskan dalam microwave sampai mendidih, kemudian ditambahkan 1:1000 SYBER safe-TM dan tuang dalam
p d f Machine
A pdf w rit er t hat produces qualit y PDF files w it h ease
Produce quality PDF files in seconds and preserve the integrity of your original docum ents. Com patible across nearly all Windows platform s, sim ply open the docum ent you want to convert, click “print”, select the
“ Broadgun pdfMachine printer” and that’s it Get yours now
Universitas Sumatera Utara
36 36
cetakan agarose gel yang telah disediakan dengan jumlah sumuran well sesuai kebutuhan.
Setelah agarose gel mengeras, dimasukkan ke dalam tangki chamber elektroforesis yang berisi 1X TAE buffer. Kemudian 5-10µl hasil PCR, yang telah
dicampur dengan 1 µl blue juice 2X, dimasukkan ke dalam sumur pada pada agarose gel, lalu masukkan pula 10 µl Marker pada sumur terakhir.
Power supply kemudian dinyalakan pada posisi 80-100V, DNA akan bergerak dari kutub negatif ke kutub positif. Elektroforesis dihentikan jika tanda biru mencapai
¼ bagian bawah jangan sampai tanda biru hilang, karena kemungkinan hasil PCR ikut terlepas dari gel.
III.3.5. Gel Imaging
Buka file: gel doc, masukkan gel ke dalam alat foto. Kemudian tekan tombol: epi-white, sampai muncul di layar computer, kemudian matikan epi-white. Lalu
tekan: auto focus, lalu tekan tombol UV, setelah muncul gambaran band pada gel di layar computer, tekan: freezer, lalu tekan: analyze, tekan: transform, buka file
image, crop, save dan print.
p d f Machine
A pdf w rit er t hat produces qualit y PDF files w it h ease
Produce quality PDF files in seconds and preserve the integrity of your original docum ents. Com patible across nearly all Windows platform s, sim ply open the docum ent you want to convert, click “print”, select the
“ Broadgun pdfMachine printer” and that’s it Get yours now
Universitas Sumatera Utara
37 37
BAB IV HASIL PENELITIAN
Kategori