Effect of Various Inductors on Acetonitrile Degradation Rate by Corynebacterium UBT 9

Prosiding Seminar Hasil-Hasil Penelitian Bidang //mu Hayaf

PENGARUW BERBAGAI INDUKTOR TERIZADAB EAJU DEGltaADASl
OLEN Corynebacterium UBT 9
EFFECT OF VARIOUS mDUCTORS ON ACETONITRllLE DEGRADATION
M T E BY Goyp1ebactehum UBT 9
Bambang Sunarko
iologi, Puslitbang Biologi, LIP1

ABSTRACT
Various nitrile substances were selected to find out the best inductor for biosynthesis of enzyme
nitrile hydratase of Co~y~lebncferizcm
UBT 9. This work showed that Corynebacierizci~~
UBT 9
could grow on eight of examined sixteen nitrile substances, as inductors. The bacterial colony
attained the highest cell biomass, as it grew on acetonitrile, allylcyanide, butyronitrile, and
propionitrile. However, the highest nitrile-fnydratase activity was shown by Cloynebacteriunz
UI3T grown on 2-pentenitrile. The acetonitrile degradation rate by 2-pentenitrile induced cells
was five times higher than those by acetonitrile induced cells. The needed cell biomass for the
total 10 ( 5 (vlv) acetonitrile degadation by 2-pentenitrile induced cells was 25 % smaller than
those by acetonitrile induced cells.

Keywords:

nitriles, nitrile-hydratase, inductor, degradation

Dalam penelitian ini diperlihatkan, bahwa Cc1yrebncter7'mUBT 9 mampu tumbuh pada delapm
dari enambelas senyawa nitril yang diuji sebagai indukqor. Biomassa tertinggl diperoleh bila
Col-yr2ebacter.zlimUBT 9 ditumbuhkan pada asetonitril, allilsianida, butironitril, dan propionitd.
Namun aktivitas enzirn nitril-hidratase tertinggi diperoleh apabila sel ditumbuhkan pada 2pentenitril. Dapat diperlihatkan pula, bahwa laju degradasi asetonitril oleh sel yang diinduksi 2pentenitril berlangsung sekitar lima kali lebih cepat dibandingkan dengan laju degradasi oleh sel
yang diinduksi asetonitril. Selain itu, untuk mendegradasi 10 (v/v) asetonitril secara total dengan
menggunakan sel yang diinduksi oleh 2-pentenitril diperlukan biomassa yang Iebih kecil, yaitu
hanya 25 % dari biomassa yang diinduksi oleh asetonitril.
Kata kunci: senyawa nitril, nitril-hidratase, induktor, degradasi

Asetonitril (CH3CN) adalah senyawa toksik, tetapi secara komersial mempp~lyaiarti
pentins. Senyawa tersebut banyak diproduksi dan dimanfaatkan ole11 industri kimia dan f m a s i ,
terutama sebagai pelarut dan pengekstrak. Asetonitril juga diguilakan dalam i1ldust1-iplastik,
Pusat Antar Universitas I l m u Wayat I P B

Bogor, 16 September 1999

Prosidina Seminar Hasil-Hasil Penelitian Bidana //mu Havat

fotografi, pewarna tekstil, pewangi dan dalam produksi senyawa-senyawa organik yang
mengandung nitrogen seperti arnida, amina, mono- dan dinitril. Disamping itu, asetonitril juga
mempakan produk sarnping dari berbagai proses produksi, misalnya produksi bensol kasar dari
ter batubara, dan produksi akrilonitril dari propilen.
Toksisitas asetonitril temtma disebabkan oleh produk urainya, a s m sianida (IICN) yang
sulit temrai dan sangat berbahaya bagi manusia. Asetonitril juga m d a h terserap kulit, sehingga
dapat mengakibatkan ganggum pada kulit dan selaput pelindung Iainnya (Hagedom & Gelbke,
1979). Untuk mengantisipasi masalah pencemaran Iingkungan akibat peningkatan produksi dan
penggunaan asetonitril dalam industri, maka perlu dikernbangkm suatu sistem biologls yang
dapat menghidrolisis senyawa tersebut menjadi senyawa-senyawa BOB-toksik.
Corynebacteui2m gTBT 9 dilaporkan marnpu tumbuh pada asetonitril dan
memanfaatkmya sebagai surnber energi, karbon dan nitrogen untuk tumbuhnya (Sunarko,
1995). Telah diketahui, bahwa nitril-hiduafase (E.C. 4.3.2.84) dan amidase ( E.C. 3.5.1.4)
adalah enzirn yang terlibat d a l m hidrolisis asetonitril menjadi asam asetat dan amonia pada
berbagal jasad renik Pagasawa et al., 1987; Wyatt & Linton, 1988, Sander, 1991; Sunarko,

UBT 9 terbukti masih
1995). N a m n , aktivitas kedua enzim tersebut pada Co~~zebacteri?mf

relatif rendah (Sunarko & Meyer, 1989; Sunarko, 1995; Sunarko, 1996). Oleh karena itu, untuk
dapat memanfaatkan jasad renik tersebut sebagai biokatalisator yang efektif untuk
mendetoksifikasi air buangan yang mengandung asetonitril diperlukm upaya untuk nleningkatkm
aktivitas kedua enzim tersebut. Tujuan penelitian ini adalah untuk menguji pengaruh berbagai
induktor (berbagai senyawa nitril) terhadap aktivitas enzim nitril hidratase dari Corylehncterizr~n

UBT 9 dan terhadap proses degradasi asetonitril oleh isolat yang ditumbuhkan pada induktor
terbaik.

BAILaN DAN METODE

Mikrot)rgan1'sm~
Coryrlebncferiml UBT 9 diperoleh dari koleksi biak Lehrstuhl h e r
Mikrobiologie, Universitaet Bayreuth, Jerman.

Medium tgmbult &buymebacterium UBT 9. Komposisi medium mineral untuk
menurnbuhkan Cozyt~ebacterirmlUBT 9 adalah sebagai berikut : Na211P04.2&0 (0,4475 g),
KN2P04 (0,l g), MgS04.7H20 (0,1 g), CaCl2.2H20 (0,Ol g), FeS04.7W20 (0,001 g), ekstrak
khamir (0,01 g), yang dilamtkan dalam H20 dest.(1000 ml) (Meyer & Sehlegel 1983) dan
Pusat Aniar Universitas Ilmu Wayat IPB

Bogor, 16 September 1999

172

Pros~dingSeminar Hasil-Hasil Peneljfjan Bjdang ]/mu Hayaf
I

ditmbah dengan 1 rnl mikroelemen. Sedangkan, komposisi mikroelemen tersebut adalah sebagai
berikut: ZnS04.7H20 (0,1 g), R/InC12.4H20(0,03 g), HjBOj (0,3 g), GoC12.6H2O (0,2 g),
GuS04.5W20 (0,015 g), NiCI2.6H20(0,02 g), Na2M04.2H20 (0,9 g), Na2Se03 (0,02 g) dalam
H20 dest. (1000 ml) (Pfennig 1974). Sebagai sumber energi, karbon, dan nitrogen dipnakm
asetonitril dan senyawa-senyawa nitril lainnya dengan konsentrasi 10 mNI.

Prolhuksi biomassa Coqaebacterz'um UBT 8. Biomassa Cov~ebacferiun?UBT 9
diproduksi dengan cam menumbuhkan isolat tersebut pada asetonitd dan senyawa-senyawa nitril
lainnya sebagai satu-satunya sumber energi, karbon, dan nitrogen daIam fernentor (3 1) yang
berisi 2 1 medium mmbuh dengan aerasi dan pengadukan dengan kecepatan 100 rpm. Aerasi
diberikan secara tetap dengan laju 0,1 Vmin. Ihntibuih @olipropilenglikol50 % v/v) ditambahkan

UBT 9 yang

secara manual blla diperlukan. Sebagai inohIan digunakan C~iyr~ebacteriun?
tumbuh pada fase eksponensial. Sel dipanen pada

fase eksponensial dengan sentrihs (6.000

rpm) selma 1jam. Sebelurn digunakan untuk analisis; sel-sel tersebut disimpm pada suhu -4 "C.

Pengukgmn pemmbuhan CoynebaefePr'umUBT 3. Pertumbuhan Couyrlebacteriun?
UE?T 9 selama proses fermentasi ditentukan dengm menggunakm satuan keqatan optis (optic&
deizsitylOD) pada panjang gelompang 436 m.

Peagukurm koatsemtrmr' asetmitrr'l dan prcPduk-prod~kdeg~adasi~yur.
Konsentrasi
asesetonitd, asetamida, dm asam asetat diukur dengan menggunakan kromatogafi gas (Packard
Model 430) yang ddengkapi dengan .flanle ioniznfiorl defecfor dan kolom berisi Porapak Q. Suhu
oven adalah 200°C, suhu injektor dan detektor masing-masing 240°C. Sebagai gas pembawa
adalah N2 dan sebagai gas detektor Hz dan masing-masing dipompakan dengan laju sebesar 11
ml/min. Untuk analisis, sebmyak 2 pl sampel diinjeksikm pada kolorn kromatografi. Konsentrasi
masing-masing senyawa dihitung berdasarkan h w a standar.

Pemgukuraat aktir)i$gse ~ z i mniM-hidrurtrese sel Co~meburcterk'i~m
dlBT 9. Aktivitas
enzim nitril-hidratase ditentukan dengan menguhr penurunan konsentrasi asetonitril dan
kenaikan konsentrasi asetamida, asam asetat dan ammonium sebagai produk hidrolisis asetonitril.
Substrat yang digunakan dalam pengujjian aktivitas ini adalah 100 mn/I asetonitril yang dilarutkan
dalam 50 nib9 KK2PB4-NaOH,pH 7,2. Suspensi sel (0,1 ml) ditambahkan ke dalam substrat (0,9
ml) pada tabung reaksi dan diinkubasi selarna 30 menit pada suhu 30°C. Dalam selang wakcu 5
menit, 0,1 ml sampel diambil, kemudian dipusing dengan sentrihs (kecepatan 5000 rpm) selama
10 menit. Supematannya diinjeksikan pada kolom loomatogafi afiga Saatu unit aktivitas enzi~n(U)
Pusat Antar Universita~Ilrnu Hayat I P B
Bogor, 16 September 1999

1 73

Prosiding Seminar Hasil-Hasil Penelifian Bidang llmu Hayat

Tabel 1. Pengamh berbagai senyawa nitril terhadap pertumbuhan dan aktivitas nitril-hidratase
sel Covynebacterium UBT 9
Substrat

Biomassa sel
%
I
(~'1)"'
100
0,40

Aktivitas Nitril-Kidratase
%
(pmol.min-'. mg-')
21
0,92

Asetonitril
- c/
-0)
- c)
Akrilonitril
- c) '
c/

_cl
Adiponitril
0,10
100
0,40
Milsianida
- cl
c/
c)
Allil-isothiosianat
- c)
Bemonitril
cl
- c)
- C)
Benzilsia~da
0,75
0,34
85
Butironitril

0,52
9
Iso-butironitril
0,04
3,30
35
0,14
Gotonitril
C/
c)
- c;r
Etil-isothiosianat
C/
- C)
- C/
Lauronitril
4,40
0,17
43
2-Pentenitril

50
0,20
0,26
Pirnelonitril
0,39
0,72
98
Propionitril
0,10
1 50C,
SuberonitriI
0,20
- cl
- cl
m-tolu~tril
I
Valeronitril
1,41
0,39
98

a) g sel bobot kering per liter medium turnbuh
b) pmoI asetonitril per min. per mg sel bobot kering
6) tidak tumbuh

cl

P

- c)

P

2

- c)
- cI
C)

17
12
75

- c)
C)

100
6
16
2

-c

j

32 ,

Selain itu Gambar 1A dan 2Ajuga memperlihatkan, bahwa waktu yang diperlukm untuk
mendegradasi asetonitril secara total dengan meng~nakansel yang diinduksi dengan 2-pentenitd
lebih cepat dlbandingkan dengan menggurrakan asetonitril. Dengan menggunakan sel yang
diinduksi dengan 2-pentenitril, keselumhan asetonitril (10 % d v ) sudah terdegradasi hanya
dalarn waktu 8 - 10 jam massa inkubasi, sedangkan dengan rnenggunakan sel yang diinduksi
dengan asetonitril diperlukm waktu mtara 16-20 jam. Dengan dernikian, penggunaan sel yang
diinduksi dengan 2-pentenitril dapat menghemat waktu proses degradasi sekitar 8 - 10jam.
Seperti juga diperllhatkan pada Garnbar 1A dan 2 A, secara keselumhan, laju degradasi
asetonitril tertinggl terJadi pada dua jam pertama nlasa inkubasi, dan setelah itu itu Iaju
degradasinya menumn secara drastis. Narnpahya, stabilitas enzirn sel yang diinduksi oleh 2pentenitril tidak Iebih baik daripada sel yang diinduksi dengan asetonitril. Berdasarkan
Pusat Antar Universitas Ilmu I-layat I P B

Bogor, 16 September 1999

175

Tingkat Degradasi (%)
0

*

0

\

,

0

P

,

0

r

0

n

-

O

0

Laju degradasi (rnmol/rng.jam)

?
0

0

?
N

P

GI

.~yruolas-eu-e'a'uap ~ s y n p u ~SUVA
~ p las u~sun88uad
. rley
. 5 ‘ Jlelgas
~
Iyruo4as-e ~ s c p e d a pn[q u~y~eySufuaw
~edlep~pl~ualuad
u~'a'rrapu-eySu!pu-eqrp

w~~'a'w/[p~ruo~ase
ue'a'uap Isynpurrp 'a'uelZ ps-las u~sun88uad'u-eni[!wap u-e'a'rraa ' ( 3 2~~qure;3)
lo

~ ~ ' 0 - nveA
t
'vss~worq las 'a'w 02- %I

51 u-eyzqw-euad u-e8uap ~p-eQalr88urpa~
. .

p3molas"e
. .
r s ~ p e d a pnCe~'p~!ualuad u-e8uap isynpuIrp SueA p s m8uap m@uepas .(31 reqmg)
w ~ ~ ~ / I ~ ~ Jo w~ w~PO'O
o ~ maqas
~ s B W!EA '8uvay ~oqoqjas 8w 001 wqeqwauad u-e%uaprp~h~al
. .
Iy$ruo$as-F!u-e'a'uap Isynpuffp8u-eh ias ~ ~ ' a ' u a@%u!~al
p
1ul1uolas-e~s-ep-efiapnfq 'ule8unlry~ad

;

Prosiding Seminar Hasii-Hasil Peneiifian Bidang //mu Hayat

.. .. .. .. .. .. .... 0 4 a

tan

,o

Dalarn penelitian ini dapat diperlihatkan, bahvva Coy~~ebacteritlm
UBT 9 rnampu tumbuh
pada delapan dari enambelas senyawa nitril ymg diuji. Perolehm biomassa teeing@ diperlihatkan,
bila Cory1.7ebncterilrmIWT 9 ditumbuhkan pada asetonitril, allilsianida, butironitrii, dan
Pusat Antar Universitas Ilmu k y a t I P B
Bogor, 16 September 1999

1 77

Prosiding Seminar Hasil-Hasil Penelitian Bidang llmu Hayat

propionitril. Namun akivitas enzim nitril-hidratase tertinggi diperoleh dari sel yang ditumbuhkan
pada 2-pentenitril sebagai induktor. Dapat diperlihatkan pula, bahwa laju degradasi asetonitril
oleh sel yang diinduksi 2-pentenitd berlangsung sekitar l i a kali lebih cepat dibandingkm dengan
Iaju degradasi oleh sel yang diinduksi asetonitril. Selain itu, untuk mendegradasi 10 (vlv)
asetonitril secara total dengan menggunakan sel yang diinduksi dengan 2-pentenitril diperlukan
biomassa lebih kecil, yaitu hanya 25 % dari biomassa sel yang diinduksi oleh asetonitril, dan
proses degradasinya berlangsung dua kali lebih cepat.

Hagedorn, F & H. P. Gelbke. 1979. Aliphatische Nitrile. Dalm: Bartolomd, E., E. Biekert, H.
Hellmam, H. Ley, W. M. Weigert, E. Weise (Eds.), Ullmms EnzyMopadie der
technischen Chernie, Verlag Chemie, Weinheim, Band 17,323- 338
Meyer, 0.& H. 6.Schlegel. 1983. Biology of aerobic carbon monoxide oxidizing bacteria. Ann.
Rev. Mcrobiol., 37, 277-3 10
Nagasawa, T., H. Nanaba, K. Ryuno, K. Takeuchi, H. Uamada. 1987. Nitrile hydratase of
Pseudontofiras chlororaphis B23. Eur. J. Biochem., 162, 1305- 1312
Pfennig, N. 1974. Rhodopsezcdomoilas globiformis sp. n., a new species of the
Rhodosspirill~ceae.k c h . Mhobiol., 100, 197-206
Sander, A. 1991. Charakerisiemng Taxonomisch Diverser Nitril-Abbauender Bakterien und
Untersuchung der Am Nitrilabbau Beteilegten Enzyme. Doktcrrarbeit, Universitat
Bayreuth. Jerman.
Sanarko, B. & (9. Meyer. 1989. -4 Microbial System for the DetoGfication of Acetonitrile in
HPLC-Waste. p. 859-862. IF?: Behren, D. and A. J. Driesel (Eds.) Dechema
BiotechnoIogy Conf , 3 . Verlag Chernie, 'bVeinheim.
Sunarko, B. 1995. Mkrobieller Abbau von Acetonitril und Vinylacetat, und Charakterisiemng
von Vinylacetatesterase. p. 174. Dokforarbeit. Universitaet Bayreuth.
Sunarko, B. 1996. Kemampuan Berbagai Islat Bakteri Dalam Mendegradasi Asetonitril. J.
Mikr-obiol. Dopika, 1: 13- 19.
Wyatt, J. M., E. A. Linton. 1988. The industrial potensial of microbial nitrile biochemistry.
Dalam: Mehnert, J., L. Brimer (eds.), Cyanide Compounds in Biology, John Wiley &
Sons, Chichester, 32-42

Pusat Antar Universitas Ilmu Hayat IPB
Bogor, 16 September 1999

1 78