SINTESIS DAN KARAKTERISASI KONYUGAT DENDRIMER PAMAM G4-NIMOTUZUMAB
Jurnal Radioisotop
dal1Radiofarmaka
JOttmalof RAdloisot~
M\d ~rmMPUttt~t5
SINTESIS DAN KARAKTERISASI KONYUGAT
PAMAM G4-NIMOTUZUMAB
Adang H. Gunawan.\
'Pusat Teknologi
'Fakultas
Farmasi
Radioisotop
Universitas
Widyastuti
dan Radiofarmaka
Widjaksana.\
-
DENDRIMER
Lucky A. Paune
2
BAT AN Serpong
Indonesia
Abstrak
Key words:
konjugosi,
nimotuzumob,
dendrimer,
PAMAM G4,
NolO.
SINTESIS DAN KARAKTERISASI KONYUGAT DENDRIMER PAMAM G4-NIMOTUZUMAB.
Dendrimer
Poliamidoamin (PAMAM) merupakan suatu senyawa polimer globular yang dapat digunakan untuk
membawa obat/senyawa ke organ, jaringan, tumor atau kanker. Nimotuzumab merupakan antibodi
monoklonal yang sangat spesifik dapat mengenali domain eksternal epidermal growth factor
receptor (EGFR). Pengkonyugasian dendrimer PAMAM dengan antibodi monoklonal Nimotuzumab
sebagai homing device akan menghasilkan suatu sistem pembawa obat yang tertarget pada EGFR
sehingga dapat mengurangi efek samping yang tidak diinginkan. Pada penelitian ini, Nimotuzumab
diaktivasi dengan NaIO. dengan rasio 1:1, lalu dimurnikan dengan menggunakan ultrafiltrasi
sentrifugasi dan dikarakterisasi dengan spektrofotometer
UV (Ultra Violet) dan Fourier Transform
Infra Red (FTIR). Hasil aktivasi Nimotuzumab (CHO-Nimotuzumab) dikonjugasikan dengan dendrimer
PAMAM G4 dengan rasio mol 1:4, kemudian dimurnikan menggunakan ultrafiltrasi sentrifugasi.
Konyugat
dendrimer
PAMAM
G4-Nimotuzumab
dikarakterisasi
dengan
menggunakan
spektrofotometer
UV, Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT), Particle Size Analyzer (PSA) dan
elektroforesis gel Sodium· Dodecyl SulphatePolyacrilamide
Gel Electrophoresis (SDS) page. Hasil
karakterisasi CHO-Nimotuzumab menunjukkan bahwa gugus diol pad a Nimotuzumab telah berhasil
dioksidasi menjadi gugus aldehid. Dan hasil karakterisasi konjugat dendrimer
PAMAM G4Nimotuzumab menunjukkan bahwa konyugat dendrimer PAMAM G4-Nimotuzumab telah berhasil
dibuat dan dimurnikan dengan ukuran partikel rata-rata 12,29 nm.
SYNTHESIS
AND
CHARACTERIZATION
OF
PAMAM
G4-NIMOTUZUMAB
CONJUGATE.
Polyamidoamine dendrimer( PAMAM ) is a globular polymer compound that can be used to carry
drugs / compounds to organ, tissue, tumor or cancer. Nimotuzumab is a specific monoclonal
antibody which can recognize the external domain of epidermal growth factor receptor ( EGFR).
Conjugation of PAMAM dendrimer with Nimotuzumab monoclonal antibody as a homing device will
produce a drugs targeted carrier system on EGFR in order to reduce unwanted side effects. In this
study, Nimotuzumab was activated with NaIO. with ratio mole of 1:1, which then purified using
ultrafiltration centrifugation and characterized by UV (Ultra violet) and Fourier Transform Infra Red
(FTIR) spectrophotometer.
CHO-Nimotuzumab as a results an activation of Nimotuzumab, was then
conjugated to G4 PAMAM dendrimer with mole ratio of 1:4 , and then purified using ultrafiltration
centrifugation.
G4 PAMAM dendrimer
- Nimotuzumab
conjugates characterized
using UV
spectrophotometer,
High Performance Liquid Chromatography (HPLC) , Particle Size Analyzer (PSA)
and Sodium Dodecyl Sulphate Polyacrilamide Gel Electrophoresis (SDS) page gel electrophoresis.
Characterization results of CHO-Nimotuzumab indicated that diol groups on Nimotuzumab has been
successfully oxidized to aldehyde. Characterization
results of the PAMAM dendrimer
G4Nimotuzumab
conjugate indicated that PAMAM G4 - Nimotuzumab
has been successfully
synthesized and purified with an average particle size of 12.29 nm.
Penulis Korespondensi
e-mail: adang~§.@yahoo.com
1
diagnosa, terapi, atau molekul biologi aktif
PENDAHULUAN
lainnya pada molekul
Kanker
merupakan
abnormal yang terbentuk
kumpulan
sel
dendrimer
Dendrimer poliamidoamin
oleh sel-sel yang
tersebut.
(PAMAM) adalah
salah satu dendrimer dengan inti etilendiamin
tumbuh secara terus-menerus, tidak terbatas,
yang aman,
tidak terkoordinasi dengan jaringan sekitarnya
minimum, berukuran 1-100 nm, monodispers,
dan tidak berfungsi fisiologis. Kanker terjadi
dan memiliki rongga internal yang
karena
menjerap obat ke dalamnya. Sifat unik yang
dimiliki
oleh
dendrimer
PAMAM
ini
timbul
jaringan
dan
berkembang
biaknya
{infi/troti!}
sambil
sekitarnya
merusaknya
dapat
(dekstrutij),
menyebar
mendorong
kebagian lain tubuh, dan umumnya fatal jika
dalam
dibiarkan.
Saat ini telah
non-imunogenik,
sitotoksisitas
penggunaannya
biomedikasi,
mampu
secara
terutama
luas
dalam
hal
dicapai kemajuan
penghantaran obat, terapi gen, terapi tumor,
yang pesat dalam bidang biologi molekuler,
kemoterapi, dan diagnostik. Pengkonjugasian
radioterapi,
dan
dendrimer
dapat dilakukan dengan molekul
kemoterapi, namun semua itu sampai saat ini
pembawa
yang spesifik ke target
masih belum mampu memperbaiki
peptida, asam folat, dan antibodi monoklonal
biomarker
rate penderita
kanker
survival
kanker secara keseluruhan.
seperti
[3-6].
Sebagian besar senyawa antikanker yang ada
saat ini, tidak dapat membedakan secara jelas
Nimotuzumab
merupakan
obat
antara sel kanker dan sel normal, sehingga
kanker yang masuk golongan "terapi target".
dapat
Berbeda dengan obat kanker konvensional
menimbulkan
toksisitas
yang
disekitarnya.
diperlukan
efek
samping
dan
bagi
sel
yang dikenal
ini
target"
berbahaya
Oleh
suatu
karena
itu,
rancangan
saat
obat
dengan
sebagai kemoterapi,
zat- zat spesifik dalam tubuh yang berperan
sistem penghantaran yang spesifik ke target
dalam proses pertumbuhan
dan
"target"
seminimal
mungkin
masuk
"terapi
bekerja selektif dengan menjadikan
ke
organ/jaringan yang bukan target [1-2].
kanker sebagai
pengobatan. Dengan demikian, efek
samping yang muncul dari pemberian
obat
"terapi target" jauh lebih ringan dibandingkan
Untuk
memperoleh
sistem
obat
penghantaran obat yang dapat bekerja secara
tertarget
dapat
dendrimer
digunakan
dengan
sebagai
homing
merupakan
polimer
konjugat
antibodi
monoklonal
device.
Dendrimer
bercabang
kanker
"target"
Yang menjadi
suatu antibodi
monoklonal,
growth
adalah
factor
reseptor
(Epidermal
epidermal
Growth
Factor
Receptor, EGFR).Adanya EFGRdalam jumlah
yang
berlebih pada jaringan kanker seorang pasien
berstruktur unik tiga dimensi, memiliki gugus-
menjadi
gugus fungsi yang dapat dimodifikasi
tersebut
permukaannya
konvensional.
dari Nimotuzumab,
pada
dan dapat membawa bahan
lebih
indikasi
bahwa
kanker
pasien
adalah jenis kanker yang menjadi
cepat
memburuk,
pemberian
obat
aktif secara selektif langsung ke sasaran dan
kemoterapi
tidak menyebar ke organ/ jaringan lain yang
tidak
tidak
pasien menjadi lebih pendek. Ditemukannya
sebagai
delivery
diinginkan.
sistem
system)
molekulnya
Keunggulan
penghantaran
terdapat
dendrimer
obat
pada
efektif
terapi
(drug
yang bercabang-cabang dengan
disertai
sering menjadi
sehingga usia harapan
target terhadap
peluang
struktur
dan radioterapi
lebih
EGFR ini membuka
berhasilnya
peningkatan
hidup
terapi
kanker
harapan dan kualitas
permukaannya yang sangat banyak, sehingga
hidup
memungkinkan
satunya terapi target yang bekerja terhadap
penyisipan
zat
untuk
2
pasien.
Nimotuzumab
bukan
satu
EGFR, tetapi yang membedakannya dengan
dari
hasil
obat-obat serupa pendahulunya adalah aspek
dengan
keamanannya.
Dari berbagai
penelitian
diketahui bahwa EGFR ini banyak dijumpai
merupakan
obat
konyugasi
antara
Nimotuzumab.
PAMAM
Senyawa ini
G4
akan
prekursor sistem penghantaran
tertarget
baik
sebagai
sediaan
radiofarmaka (diagnosis dan terapi) ataupun
pada penderita kanker kepala dan leher,
kanker usus, kanker paru, glioma (salah satu
sebagai media kontras untuk MRI dan CT
Scan.
jenis kanker otak), kanker esophagus, kanker
pankreas, kanker prostat, kanker leher rahim,
TATA KERJA
kanker payudara dan beberapa jenis kanker
padat yang lain [7-10].
Bahan
Pada
PAMAM
penelitian
Generasi
dengan antibodi
4
ini,
digunakan
adalah
Nimotuzumab
(TheraCIM, Kalbe Farma),
larutan dendrimer PAMAM G4 10% dalam
dendrimer
(G4) dikonjugasikan
monoklonal
yang
metanol (Sigma-Aldrich), NaI04, etilen glikol,
Nimotuzumab
sebagai homing device. Nimotuzumab bekerja
ammonium asetat, asam asetat glasial, asam
sebagai inhibitor
factor
asetat, NaH2P04, CUS04, NaOH, ammonium
protein
bikarbonat (E.Merck}, bovine serum albumin
receptor
epidermal
growth
(EGFR) yaitu menghambat
reseptor epidermal
growth factor
(Sigma Aldrich), aqua bidestilata steril (PT.
(EGF) yang
Ikapharmindo
banyak terdapat pada permukaan sel kanker,
sehingga konjugat
Nimotuzumab
dendrimer
dapat
Indonesia),
dan
NaBH4 (Fluka). Alat yang digunakan adalah
PAMAM G4-
digunakan
Putramas,
Spektrofotometer
sebagai
Jasco
UV-550,
KCKT
sistem pembawa obat yang tertarget pada
EGFR [8-9]. Sebelum tahap pengkonjugasian,
Nimotuzumab
diaktivasi terlebih
dahulu
(Shimadzu SCL-10A) yang dilengkapi dengan
kolom SEC 250, Particle Size Analyzer (PSA),
protein
filter
dengan
Weight
Cut Off
menggunakan
natriumperiodat
Vivaspin
dengan
Molecular
(MWCO) 30 dan 10 KD,
(NaI04)
sehingga
gugus
diol
pada
Nimotuzumab akan teroksidasi menjadi gugus
kromatografi filtrasi gel kolom PD-10 dengan
aldehid yang dapat digunakan untuk konjugasi
(Hettich EBA 8S), Vortex/
dengan gugus amin pada dendrimer PAMAM
(Seveneasy
G4 [11-12].
analitik
yang
Beberapa teknik
dilakukan
terbentuknya
untuk
matriks Sephadex G-25 medium, Centrifuge
karakterisasi
(Thermo
memverifikasi
dalam
menggunakan
beberapa
mencakup
analisis
penentuan
ukuran
penelitian
teknik
spektrum
dan
distribusi
timbangan
mikropipet
Corporation,
Biohit
dan
dan alat-alat gelas yang umum digunakan
dalam labotatorium.
ini
analisis
UV,
Electron
Toledo),
Instrument),
Proline), aluminium foil, syringe, syringe filter,
komplek senyawa PAMAM G4-
Nimotuzumab
Mettler
(Denver
mixer, pH meter
FTIR,
Pemurnian dendrimer PAMAM G4.
ukuran
partikel konjugat serta pemeriksaan dengan
teknik
gel
elektroforesis
Dendrimer
menggunakan
dihilangkan
melakukan
karakterisasi
G4
10
%
disimpan dalam methanol. Pelarut methanol
akrilamida [12].
Tujuan
PAMAM
dari
sintesis
penelitian
yang
dan pemastian
ini
diikuti
dari
dendrimer
PAMAM
G4
adalah
dengan cara penguapan dengan mengalirkan
dengan
gas nitrogen.
Residu hasil penguapan
kemudian dilarutkan dalam air bebas mineral.
terbentuknya
senyawa konyugat PAMAM G4-nimotuzumab
3
Aktivasi Antibodi Monoklonal
Nimotuzumab
Konjugat
Nimotuzumab
(pembuatan CHO Nimotuzumab)
dendrimer
dibuat
PAMAM
dengan
rasio
G4molar
nimotuzumab pada dendrimer 1 : 4. Sebanyak
Aktivasi
Nimotuzumab
dilakukan
20lll
larutan
dendrimer
PAMAM
G4 10%
hingga kering.
dengan mol rasio Nimotuzumab : Nal04 yaitu
dalam metanol dialiri gas
1:230 (1,6 mg : 1,6 mg). Sejumlah dapar
PAMAM G4 kemudian direkonsitusi
asetat pH 5,5 (0,4 ml) ditambahkan kedalam
dengan 20lll dapar bikarbonat 50 mM pH 9.
Ke dalam larutan ini kemudian ditambahkan
320
III
larutan
nimotuzumab
5
mg/mL.
N2
Campuran kemudian diaduk dengan vortex
larutan
dan didinginkan pada suhu 2-g°C. Sejumlah
kemudian diinkubasi
Nal04 (1,6 mg) yang dilarutkan dalam 0,4 ml
suhu 2-g0C dalam keadaan terlindung
dapar
eahaya.
asetat
pH 5,5 di vortex
kemudian
CHO-Nimotuzumab.
dengan
Kedalam
Campuran
selama 20 jam
konjugat
ini
pada
dari
kemudian
didiamkan pada suhu 2-g0C serta dilindungi
ditambahkan sejumlah NaBH4 (42 Ill) dalam
dari eahaya. Kedua larutan diatas kemudian
air dengan konsentrasi 4 mg/mL. Campuran
dieampurkan dan iinkubasi selama 2 jam pada
diinkubasi kembali selama 3 jam pada suhu 2-
suhu 2-g0C dalam keadaan gelap. Sejumlah
gOCdan terlindung dari eahaya.
etilen
glikol
eampuran,
(g Ill)
yang
ditambahkan
diikuti
selama 30 menit
dengan
kedalam
Pemurnian Konjugat Dendrimer PAMAM G4 Nimotuzumab
inkubasi
pada suhu 2-g0C dalam
keadaan gelap. Pada proses ini akan diperoleh
larutan
Nimotuzumab
Nimotuzumab).
dimurnikan
Vivaspin
larutan
teroksidasi
KD
Pemurnian
CHO-Nimotuzumab
menggunakan
30
(CHO-
filter
MWCO
protein
dengan
eara
konjugat
dengan
menggunakan
dengan
metode
2
dilakukan
metode,
ultrafiltrasi
yaitu
sentrifugasi
menggunakan filter protein Vivaspin 10 KD
disentrifugasi beberapa kali pada keeepatan
MWCO
dan
4000 rpm. Hasil pemurnian dilarutkan dalam
kromatografi filtrasi gel kolom PD-10 dengan
larutan dapar fosfat 0,1 M pH 6,5 dengan
matriks
volume akhir 500 ilL.
ultrafiltrasi
menggunakan
Sephadex G-25 medium.
200 III
Analisis CHO-Nimotuzumab dengan FTIR
dengan
Metode
dilakukan dengan eara memipet
larutan
konjugat
ke dalam
filter
protein Vivaspin 10 KD MWCO dan volume
nya dieukupkan hingga 2 ml dengan dapar
Untuk
aktivasi
memastikan
Nimotuzumab
bahwa tahapan
telah
fosfat
berhasil,
pH
6,5.
disentrifugasi
Filter
selama
protein
15
kemudian
menit
dengan
dilakukan analisa dengan menggunakan FTIR.
keeepatan 4000 rpm. Sentrifugasi dilakukan 4
Sebanyak 150 III larutan CHO-Nimotuzumab
kali sehingga diperoleh volume akhir 150 ilL.
dan dimasukkan kedalam vial. lalu dialiri gas
Tabung dibalik dan disentrifugasi
selama 5
hingga kering dan serbuk di dalam vial
menit dengan keeepatan 4000 rpm. Kemudian
diambil untuk analisis. Kemudian sebanyak ~
tabung dibilas dengan menambahkan 50 III
50 mg sampel kering diukur dengan alat FTIR.
dapar fosfat pH 6,5 yang diikuti sentrifugasi
Pemeriksaan
selama 5 menit dengan keeepatan 4000 rpm.
N2
spektrum
IR dilakukan
pada
bilangan gelombang 400 sampai 4000 em,l.
Konjugat
Konjugasi Nimotuzumab
PAMAM G4
dianalisis menggunakan spektrofotometer
Nimotuzumab
dengan Dendrimer
4
dendrimer
yang
PAMAM
diperoleh
G4-
selanjutnya
UV.
Analisis Konyugat
Dendrimer
(Shimadzu SCl-10A) yang dilengkapi dengan
PAMAM G4-
Nimotuzumab dengan Spektrofotometer
kolom SEC250 (7,5 x 300 mm), detektor UV-
UV
VIS (280 nm) dengan fase gerak dapar fosfat
Hasil
ultrafiltrasi
pemurnian
dan kolom
menggunakan
dari
O,OlN pH 7,5, volume injeksi contoh 50 ~l,
metode
dan kecepatan alir 1 mljmenit.
PD-10 diuji dengan
Spektrofotometer
Jasco UV-
550, dengan cara membuat baseline terlebih
Analisis Konjugat
dahulu dengan dapar fosfat 0,1 M pH 6,5. lalu
Nimotuzumab dengan Particle Size Analyzer
masing-masing fraksi dianalisis.
(PSA)
Analisis
Fraksi
Pemurnian
Konjugat
Dendrimer
PAMAM
G4-Nimotuzumab
konjugat
dengan Pereaksi Biuret
Nimotuzumab
Dendrimer
PAMAM
G4-
Ukuran dan distribusi ukuran partikel
dendrimer
PAMAM
G4
ditentukan
dengan
menggunakan alat PSA Delsa Nano C dengan
Fraksi-fraksi
konjugat
PAMAM G4-Nimotuzumab
dendrimer
metode photon correlation spectroscopy (PCS)
hasil pemurnian
Malvern dengan scattering angle 15°, 30°, dan
dengan menggunakan kromatografi filtrasi gel
60°. Sejumlah
kolom PD-10 matriks Sephadex G-25 medium
diuji secara kualitatif dengan pereaksi Biuret
PAMAM G4 - Nimotuzumab didispersikan
dalam metanol dan kemudian dimasukkan ke
untuk
dalam kuvet analisis. Analisis ukuran partikel
mengetahui
terdapat
pada fraksi
kandungan protein.
mana saja
(2ml)
konjugat
dendrimer
dilakukan pada suhu 25°(,
Uji dilakukan
dengan menggunakan NaOH 40% yang dibuat
dengan
cara melarutkan
dalam 10 ml
H20
4000 mg NaOH
Analisis Konjugat
dan CuS04 0,5% yang dibuat
Dendrimer
PAMAM
G4-
Nimotuzumab dengan Elektroforesis Gel
dengan cara melarutkan 50 mg CuS04 dalam
10 ml H20. Kemudian sebanyak 150 ~llarutan
Pemastian
sampel ditambah dengan 40 ~l NaOH 40%
dendimer
dan
menggunakan
40
~l
CUS04 0,5%.
Contoh
yang
PAMAM
terbentuknya
konjugat
G4-Nimotuzumab
metode
elektroforesis
mengandung protein akan memberikan warna
dengan
biru ungu.
PAMAM G4-nimotuzumab,
akrilamida.
diuji
Konyugat
gel
dendimer
standar
protein
(10 - 250 KD), PAMAM G4, nimotuzumab dan
Analisis Konyugat
Nimotuzumab
Dendrimer
dengan
PAMAM
Kromatografi
G4Cair
Kinerja Tinggi (KCKT)
CHO-nimotuzumab
didestruksi
pemanasan
10
selama
dilakukan elektroforesis
menit,
dengan
kemudian
gel pada tegangan
250 volt selama 30 menit. Pelat gel akrilamida
Standar Nimotuzumab murni, standar
dendrimer
PAMAM
G4,
PAMAM G4-Nimotuzumab
dengan filter
protein
dan
kemudian dicuci dengan larutan Coomassie
dendrimer
blue sampai noda dari tiap sampel terlihat.
hasil pemurnian
Noda pada sampel dan standar dibandingkan,
kemudian diidentifikasi berdasarkan berat
Vivaspin
dan PD-10
(Fraksi 4) diuji dengan menggunakan KCKT
molekul yang terdapat pada standar.
5
HASIL DAN PEMBAHASAN
IOpLS •••••
~+O.1
••••.
1bpa_pB
s,s
Gambar 1. Aktivasi Nimotuzumab dengan Nal04
Aktivasi
Nimotuzumab
dilakukan
etilenglikol. Penghentian reaksi ini dilakukan
dengan
untuk mencegah terjadinya oksidasi lanjutan
dengan mereaksikan Nimotuzumab
larutan Nal04 dalam keadaan segar di dalam
pada
vial dengan rasio Nimotuzumab : Nal04 (1:1)
diinginkan dari Nimotuzumab.
(Gambar 1). Nal04 akan mengoksidasi gugus
Nimotuzumab dengan Nal04 berupa larutan
diol
gugus
jernih dan tidak memiliki perbedaan warna
yang
larutan
dengan
larutan
standar
Nimotuzumab. Pemurnian CHO-Nimotuzumab
pada
aldehid
Nimotuzumab
menjadi
(CHO), gugus aldehid
digunakan
untuk
Nimotuzumab
dengan
inilah
mengkonjugasikan
gugus
amin
bagian
dilakukan
pada
dendrimer PAMAM G4 [12].
asam
secara
amino
ultrafiltrasi
yang
tidak
Hasil aktivasi
sentrifugasi
dengan menggunakan tabung vivaspin 30.000
harus disimpan
MWCO
(Molecular
Weight
Cut
Off).
Nimotuzumab
memiliki
bobot
molekul
pada suhu 2-8°C dan terlindung dari cahaya
-160.000 g/mol sehingga akan tertahan dan
Larutan
campuran
karena sifat antibodi Nimotuzumab yang tidak
tidak dapat melewati filter vivaspin sedangkan
stabil. Selama proses pengoksidasian, dapar
molekul lainnya seperti Nal04 dengan bobot
yang digunakan yaitu dapar asetat pH 5,5
molekul 213,89 g/mol dan etilenglikol dengan
karena oksidasi dengan menggunakan Nal04
bobot molekul 62,07 g/mol akan melewati
dalam dapar asetat memiliki efisiensi yang
filter vivaspin 30KD, dengan demikian dapat
lebih baik dibandingkan dengan dapar fosfat.
diperoleh larutan yang mengandung
Nimotuzumab murni.
Pengoksidasian Nimotuzumab dengan
Nal04
dihentikan
dengan
menggunakan
6
CHO-
Nimoluzt.n1ab
CHO-Nimoluzt.n1ab
Gambar 2. Spektrogram
dari Spektrofotometer
UV/Vis Nimotuzumab
dan CHO - nimotuzumab
C-H aldehid
III \ I II II\~
25DO
1\
200D
W~CJD...1
Gambar 3. Spektrum
Spektrogram
dari
hasil analisa dengan FTIR CHO-Nimotuzumab
hasil analisis
dengan
UV/Vis (Gambar
2) tidak dapat membedakan
antara
Nimotuzumab
Nimotuzumab,
dapat
digunakan
sehingga
untuk
senyawa
CHO-
Nimotuzumab
dengan
metode
ini
karakterisasi
terse but.
dilakukan
Spektrofotometer
fungsi
untuk
spesifik
CHO-
Nimotuzumab
tidak
Aldehid
terdapat
ke 2
7
Analisis
melihat
yang
dengan
keberadaan
terdapat
pada
FTIR ini
gugus
CHO-
khususnya gugus OH dan gugus
(CHO). Hasil spektrum
pad a Gambar 3 .
yang diperoleh
~"'--
Dendrimer pamam64
pH 9
~
~
---U'C~
...,
J;,
{.
r
1/
Jj••••paa•••••••
HaJIn.~..-,.un.o
-(22.SJ.'.)
fIfiiJ'
dmabayo
~
_
-¥
•••
10\
i-
I
nimotnzmnal:HJcodrimerpamamG4
Kon~
Gambar 4. Konjugasi Nimotuzumab dengan PAMAM G4
Dari hasil spektrum
yang diperoleh
dilakukan dengan rasio moll:
4 dalam dapar
dapat diketahui
bahwa pada sampel CHO-
bikarbonat
Nimotuzumab,
terdapat
untuk mengoptimalkan reaksi konyugasi yang
frekuensi
1820-1600
spektrum
cm-1
pada
menunjukkan
terjadi.
50 mM pH 9, hal ini bertujuan
Konyugasi Dendrimer
adanya ikatan C=O aldehid, sedangkan apada
Nimotuzumab
berlangsung
2850 dan 2750 cm-1 menunjukkan
basa (pH 9-
10) sehingga
adanya
dalam
ikatan CH aldehid, hal ini menunjukkan bahwa
nimotuzumab
terdapat
amin sekunder pada dendrimer
gugus aldehid pada sampel CHO-
Nimotuzumab.
Oleh
karena
itu,
dapat
tidak
(OH) menjadi Aldehid (CHO) telah berhasil
dilakukan.
yaitu Natrium
Pengkonyugasian
dengan dendrimer
stabil,
PAMAM G4 (Gambar 4)
8
pada
basa Schiff
PAMAM G4
yang bersifat
sehingga diperlukan
Borohidrida
(NaBH4)
reaksi yang terjadi sebagai berikut:
Nimotuzumab
suasana
aldehid
akan bereaksi dengan gugus
dan membentuk
disimpulkan bahwa reaksi oksidasi gugus Diol
PAMAM G4-
penstabil
dengan
04
Dcndrim~r PAMAM
+
-
Bas,1 S"hiff
1
CHO-Nimotuzunmb
NaHlfa
Gambar 5. Reaksi Konyugasi Nimotuzumab
dengan Oendrimer
PAMAM G4 (Hermanson,
G. T., telah diolah kembali).
4.~H'a1:~.R__",5"J-" ~
""'~~_*":t,':U::~
~"':~!lI:'q_t:J>:I'\,*~,,t
~,'1_.
A
_u_.\.
"'~""',"P"5-::Sa~'" ~~
~"'''";':::f4..,
J!:w,",'
•.• t~%~"'cQ.C~",~,f
_.,,,,-
B
"""
(Malvern)
lVIarkelr/standalr
N irnot:uzurnab
CHO-nirnot:uzurnab
PA.IVIAIVIG4-nirnot:uzurnab
PAIVIAIVIG4
SOKD
20KD
10KD
2
3
Gambar 9. Hasil analisis Nimotuzumab,
PAMAM G4-nimotuzumab
5
4
CHO-nimotuzumab,
DTPA-nimotuzumab,
dan PAMAM G4 dengan SDS page elektroforesis.
11
G4-
Visualisasi
keberadaan
unsur-unsur
177lu-dota-nimotuzumab
yang terdapat dalam reaksi pembentukan
senyawa PAMAM G4-Nimotuzumab dilakukan
sebagai
radiofarmaka terapi kanker, (November),
2010, pp. 663-670.
dengan menggunakan metode elektroforesis
gel (SDSpage), diperlihatkan pada Gambar 9.
Dari
hasil
analisis
dengan
3.
metode
Ciolkowski, M., Petersen, J. F., Ficker, M.,
Janaszewska, A.,
elektroforesis gel (SDS page), dimana sampel
Christensen,
J.
B.,
terlebih dahulu didestruksi yaitu dipanaskan
Klajnert, B., & Bryszewska, M., Surface
modification
of PAMAM dendrimer
pada air mendidih selama 10 menit, terlihat
improves
bahwa pada senyawa nomor 4 (PAMAM G4-
Nanomedicine:
nimotuzumab) masih terlihat adanya fraksi
dari nimotuzumab dan PAMAM dari hasil
815-817.
destruksi
tersebut.
elektroforesis
Dari
data
Biology,
its
4.
Tomalia
D.A., Reyna L.A, Svenson 5.,
Dendrimers
puncak pada waktu
oncology
dapat disimpulkan
sintesis tersebut
bahwa
adalah
8(6), 2012, pp.
and Medicine,
dengan hasil KCKT dimana hanya terdapat 1
6,967
Nanotechnology,
hasil
gel (SDS page) dan diperkuat
retensi
biocompatibility.
menit,
senyawa
PAMAM
hasil
G4-
as multi-purpose
drug
delivery
and
devices for
diagnostic
Biochemical
imaging,
Transactions 35, part
Society
I, 2007, pp.61-67.
nimotuzumab.
5.
KESIMPULAN
Svenson 5., Tomalia D.A., Dendrimers in
biomedical applications -reflections
on
the field. Advanced Drug Delvery Reviews
Berdasarkan
analisa
hasil
dengan
Spektrofotometer
Nal04
PAMAM
berhasil
Dendrimer
terbentuk
57., 2215-1137,
03-2007
KCKT,
PSA
dan
dan
konyugasi
6.
Drabu 5., Khatri 5., Babu 5., Dendrimers:
Dendrimer
Nanopharmaceuticals
Nimotuzumab telah
Hasil
karakterisasi
Research Journal
bahwa
larutan
for
of
Drug Delivery,
Pharmaceutical,
Biological and Chemical Sciences, Vol. 1
konyugat
PAMAM G4-Nimotuzumab
2005, Diunduh tgl 18dari
http://www.sciencedirect.com.
(SDS page)
dapat
aktivasi Nimotuzumab
G4 dengan
dilakukan.
menunjukkan
dan
menggunakan
UV,
elektroforesis
gel
disimpulkan bahwa
dengan
identifikasi
Issue 2, 2010.
yang
berupa larutan jernih, murni dan
7.
memiliki ukuran partikel rata-rata 12,29 nm.
Press,
D.,
Nimotuzumab,
a
novel
monoclonal antibody to the epidermal
growth factor receptor, in the treatment
DAFTAR PUSTAKA
1.
of non-small cell lung cancer, 2011, pp.
59-67.
Lucky A. Paune, Pembuatan
Dendrimer
PAMAM
Skripsi Sarjana Farmasi,
Program
51
Indonesia, 2013.
2.
Konjugat
G4-Nimotuzumab,
8.
Fakultas Farmasi
Reguler
Takeda M., Isamu Okamoto I., Vasumasa
Nishima
Universitas
V., Kazuhiko
Nimotuzumab,
a
Nakagawa
N..
novelmonoclonal
antibody to the epidermal growth factor
receptor, in the treatment of non-small
Humani, T. 5., Ramli, M., Rustendi, C. T.,
cell lung cancer, Lung cancer : Targets
& Subur, M., Preparasi dan uji stabilitas
and Therapy, 2,2011, pp. 59-67.
12
9.
Fischer-durand, N., Salmain M., Rudolf
B.,
Dai
L., Juge
Laprevote
0.,
L., Guerineau
et
aI.,
11. Hens M., Vaidyanathan G., Zhao X.G.,.
V.,
Bigner D.O., Zalutsky M.R., Anti EGFRvl1i
Site-specific
monoclonal antibody armed with
177Lu
:
conjugation of metal carbonyl dendrimer
in vivo comparison of macrocyclic and
to antibody
acyclic ligands, Nuclear
reagent
in
Biochemistry,
and its use as detection
immunoassay.
407
Medicine
and
Biology, 37, 2010, pp. 741-750.
Analytical
(2), 2010, pp. 211-
219.
12.
Hermanson
G.T.,
"Bioconjugate
Technique", second ed., Elsivier, 2008,
10. Vin Z., Liu N., Ma M., Wang L., Hao V.,
pp.130.
Zang X, A novel EGFR-targeted gene
delivery system based on complexes selfassembled by EGF, DNA and activated
PAMAM
Journal
dendrimer,
of Nanomedicine,
International
7, 2012,
pp.
4625-4635.
13
dal1Radiofarmaka
JOttmalof RAdloisot~
M\d ~rmMPUttt~t5
SINTESIS DAN KARAKTERISASI KONYUGAT
PAMAM G4-NIMOTUZUMAB
Adang H. Gunawan.\
'Pusat Teknologi
'Fakultas
Farmasi
Radioisotop
Universitas
Widyastuti
dan Radiofarmaka
Widjaksana.\
-
DENDRIMER
Lucky A. Paune
2
BAT AN Serpong
Indonesia
Abstrak
Key words:
konjugosi,
nimotuzumob,
dendrimer,
PAMAM G4,
NolO.
SINTESIS DAN KARAKTERISASI KONYUGAT DENDRIMER PAMAM G4-NIMOTUZUMAB.
Dendrimer
Poliamidoamin (PAMAM) merupakan suatu senyawa polimer globular yang dapat digunakan untuk
membawa obat/senyawa ke organ, jaringan, tumor atau kanker. Nimotuzumab merupakan antibodi
monoklonal yang sangat spesifik dapat mengenali domain eksternal epidermal growth factor
receptor (EGFR). Pengkonyugasian dendrimer PAMAM dengan antibodi monoklonal Nimotuzumab
sebagai homing device akan menghasilkan suatu sistem pembawa obat yang tertarget pada EGFR
sehingga dapat mengurangi efek samping yang tidak diinginkan. Pada penelitian ini, Nimotuzumab
diaktivasi dengan NaIO. dengan rasio 1:1, lalu dimurnikan dengan menggunakan ultrafiltrasi
sentrifugasi dan dikarakterisasi dengan spektrofotometer
UV (Ultra Violet) dan Fourier Transform
Infra Red (FTIR). Hasil aktivasi Nimotuzumab (CHO-Nimotuzumab) dikonjugasikan dengan dendrimer
PAMAM G4 dengan rasio mol 1:4, kemudian dimurnikan menggunakan ultrafiltrasi sentrifugasi.
Konyugat
dendrimer
PAMAM
G4-Nimotuzumab
dikarakterisasi
dengan
menggunakan
spektrofotometer
UV, Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT), Particle Size Analyzer (PSA) dan
elektroforesis gel Sodium· Dodecyl SulphatePolyacrilamide
Gel Electrophoresis (SDS) page. Hasil
karakterisasi CHO-Nimotuzumab menunjukkan bahwa gugus diol pad a Nimotuzumab telah berhasil
dioksidasi menjadi gugus aldehid. Dan hasil karakterisasi konjugat dendrimer
PAMAM G4Nimotuzumab menunjukkan bahwa konyugat dendrimer PAMAM G4-Nimotuzumab telah berhasil
dibuat dan dimurnikan dengan ukuran partikel rata-rata 12,29 nm.
SYNTHESIS
AND
CHARACTERIZATION
OF
PAMAM
G4-NIMOTUZUMAB
CONJUGATE.
Polyamidoamine dendrimer( PAMAM ) is a globular polymer compound that can be used to carry
drugs / compounds to organ, tissue, tumor or cancer. Nimotuzumab is a specific monoclonal
antibody which can recognize the external domain of epidermal growth factor receptor ( EGFR).
Conjugation of PAMAM dendrimer with Nimotuzumab monoclonal antibody as a homing device will
produce a drugs targeted carrier system on EGFR in order to reduce unwanted side effects. In this
study, Nimotuzumab was activated with NaIO. with ratio mole of 1:1, which then purified using
ultrafiltration centrifugation and characterized by UV (Ultra violet) and Fourier Transform Infra Red
(FTIR) spectrophotometer.
CHO-Nimotuzumab as a results an activation of Nimotuzumab, was then
conjugated to G4 PAMAM dendrimer with mole ratio of 1:4 , and then purified using ultrafiltration
centrifugation.
G4 PAMAM dendrimer
- Nimotuzumab
conjugates characterized
using UV
spectrophotometer,
High Performance Liquid Chromatography (HPLC) , Particle Size Analyzer (PSA)
and Sodium Dodecyl Sulphate Polyacrilamide Gel Electrophoresis (SDS) page gel electrophoresis.
Characterization results of CHO-Nimotuzumab indicated that diol groups on Nimotuzumab has been
successfully oxidized to aldehyde. Characterization
results of the PAMAM dendrimer
G4Nimotuzumab
conjugate indicated that PAMAM G4 - Nimotuzumab
has been successfully
synthesized and purified with an average particle size of 12.29 nm.
Penulis Korespondensi
e-mail: adang~§.@yahoo.com
1
diagnosa, terapi, atau molekul biologi aktif
PENDAHULUAN
lainnya pada molekul
Kanker
merupakan
abnormal yang terbentuk
kumpulan
sel
dendrimer
Dendrimer poliamidoamin
oleh sel-sel yang
tersebut.
(PAMAM) adalah
salah satu dendrimer dengan inti etilendiamin
tumbuh secara terus-menerus, tidak terbatas,
yang aman,
tidak terkoordinasi dengan jaringan sekitarnya
minimum, berukuran 1-100 nm, monodispers,
dan tidak berfungsi fisiologis. Kanker terjadi
dan memiliki rongga internal yang
karena
menjerap obat ke dalamnya. Sifat unik yang
dimiliki
oleh
dendrimer
PAMAM
ini
timbul
jaringan
dan
berkembang
biaknya
{infi/troti!}
sambil
sekitarnya
merusaknya
dapat
(dekstrutij),
menyebar
mendorong
kebagian lain tubuh, dan umumnya fatal jika
dalam
dibiarkan.
Saat ini telah
non-imunogenik,
sitotoksisitas
penggunaannya
biomedikasi,
mampu
secara
terutama
luas
dalam
hal
dicapai kemajuan
penghantaran obat, terapi gen, terapi tumor,
yang pesat dalam bidang biologi molekuler,
kemoterapi, dan diagnostik. Pengkonjugasian
radioterapi,
dan
dendrimer
dapat dilakukan dengan molekul
kemoterapi, namun semua itu sampai saat ini
pembawa
yang spesifik ke target
masih belum mampu memperbaiki
peptida, asam folat, dan antibodi monoklonal
biomarker
rate penderita
kanker
survival
kanker secara keseluruhan.
seperti
[3-6].
Sebagian besar senyawa antikanker yang ada
saat ini, tidak dapat membedakan secara jelas
Nimotuzumab
merupakan
obat
antara sel kanker dan sel normal, sehingga
kanker yang masuk golongan "terapi target".
dapat
Berbeda dengan obat kanker konvensional
menimbulkan
toksisitas
yang
disekitarnya.
diperlukan
efek
samping
dan
bagi
sel
yang dikenal
ini
target"
berbahaya
Oleh
suatu
karena
itu,
rancangan
saat
obat
dengan
sebagai kemoterapi,
zat- zat spesifik dalam tubuh yang berperan
sistem penghantaran yang spesifik ke target
dalam proses pertumbuhan
dan
"target"
seminimal
mungkin
masuk
"terapi
bekerja selektif dengan menjadikan
ke
organ/jaringan yang bukan target [1-2].
kanker sebagai
pengobatan. Dengan demikian, efek
samping yang muncul dari pemberian
obat
"terapi target" jauh lebih ringan dibandingkan
Untuk
memperoleh
sistem
obat
penghantaran obat yang dapat bekerja secara
tertarget
dapat
dendrimer
digunakan
dengan
sebagai
homing
merupakan
polimer
konjugat
antibodi
monoklonal
device.
Dendrimer
bercabang
kanker
"target"
Yang menjadi
suatu antibodi
monoklonal,
growth
adalah
factor
reseptor
(Epidermal
epidermal
Growth
Factor
Receptor, EGFR).Adanya EFGRdalam jumlah
yang
berlebih pada jaringan kanker seorang pasien
berstruktur unik tiga dimensi, memiliki gugus-
menjadi
gugus fungsi yang dapat dimodifikasi
tersebut
permukaannya
konvensional.
dari Nimotuzumab,
pada
dan dapat membawa bahan
lebih
indikasi
bahwa
kanker
pasien
adalah jenis kanker yang menjadi
cepat
memburuk,
pemberian
obat
aktif secara selektif langsung ke sasaran dan
kemoterapi
tidak menyebar ke organ/ jaringan lain yang
tidak
tidak
pasien menjadi lebih pendek. Ditemukannya
sebagai
delivery
diinginkan.
sistem
system)
molekulnya
Keunggulan
penghantaran
terdapat
dendrimer
obat
pada
efektif
terapi
(drug
yang bercabang-cabang dengan
disertai
sering menjadi
sehingga usia harapan
target terhadap
peluang
struktur
dan radioterapi
lebih
EGFR ini membuka
berhasilnya
peningkatan
hidup
terapi
kanker
harapan dan kualitas
permukaannya yang sangat banyak, sehingga
hidup
memungkinkan
satunya terapi target yang bekerja terhadap
penyisipan
zat
untuk
2
pasien.
Nimotuzumab
bukan
satu
EGFR, tetapi yang membedakannya dengan
dari
hasil
obat-obat serupa pendahulunya adalah aspek
dengan
keamanannya.
Dari berbagai
penelitian
diketahui bahwa EGFR ini banyak dijumpai
merupakan
obat
konyugasi
antara
Nimotuzumab.
PAMAM
Senyawa ini
G4
akan
prekursor sistem penghantaran
tertarget
baik
sebagai
sediaan
radiofarmaka (diagnosis dan terapi) ataupun
pada penderita kanker kepala dan leher,
kanker usus, kanker paru, glioma (salah satu
sebagai media kontras untuk MRI dan CT
Scan.
jenis kanker otak), kanker esophagus, kanker
pankreas, kanker prostat, kanker leher rahim,
TATA KERJA
kanker payudara dan beberapa jenis kanker
padat yang lain [7-10].
Bahan
Pada
PAMAM
penelitian
Generasi
dengan antibodi
4
ini,
digunakan
adalah
Nimotuzumab
(TheraCIM, Kalbe Farma),
larutan dendrimer PAMAM G4 10% dalam
dendrimer
(G4) dikonjugasikan
monoklonal
yang
metanol (Sigma-Aldrich), NaI04, etilen glikol,
Nimotuzumab
sebagai homing device. Nimotuzumab bekerja
ammonium asetat, asam asetat glasial, asam
sebagai inhibitor
factor
asetat, NaH2P04, CUS04, NaOH, ammonium
protein
bikarbonat (E.Merck}, bovine serum albumin
receptor
epidermal
growth
(EGFR) yaitu menghambat
reseptor epidermal
growth factor
(Sigma Aldrich), aqua bidestilata steril (PT.
(EGF) yang
Ikapharmindo
banyak terdapat pada permukaan sel kanker,
sehingga konjugat
Nimotuzumab
dendrimer
dapat
Indonesia),
dan
NaBH4 (Fluka). Alat yang digunakan adalah
PAMAM G4-
digunakan
Putramas,
Spektrofotometer
sebagai
Jasco
UV-550,
KCKT
sistem pembawa obat yang tertarget pada
EGFR [8-9]. Sebelum tahap pengkonjugasian,
Nimotuzumab
diaktivasi terlebih
dahulu
(Shimadzu SCL-10A) yang dilengkapi dengan
kolom SEC 250, Particle Size Analyzer (PSA),
protein
filter
dengan
Weight
Cut Off
menggunakan
natriumperiodat
Vivaspin
dengan
Molecular
(MWCO) 30 dan 10 KD,
(NaI04)
sehingga
gugus
diol
pada
Nimotuzumab akan teroksidasi menjadi gugus
kromatografi filtrasi gel kolom PD-10 dengan
aldehid yang dapat digunakan untuk konjugasi
(Hettich EBA 8S), Vortex/
dengan gugus amin pada dendrimer PAMAM
(Seveneasy
G4 [11-12].
analitik
yang
Beberapa teknik
dilakukan
terbentuknya
untuk
matriks Sephadex G-25 medium, Centrifuge
karakterisasi
(Thermo
memverifikasi
dalam
menggunakan
beberapa
mencakup
analisis
penentuan
ukuran
penelitian
teknik
spektrum
dan
distribusi
timbangan
mikropipet
Corporation,
Biohit
dan
dan alat-alat gelas yang umum digunakan
dalam labotatorium.
ini
analisis
UV,
Electron
Toledo),
Instrument),
Proline), aluminium foil, syringe, syringe filter,
komplek senyawa PAMAM G4-
Nimotuzumab
Mettler
(Denver
mixer, pH meter
FTIR,
Pemurnian dendrimer PAMAM G4.
ukuran
partikel konjugat serta pemeriksaan dengan
teknik
gel
elektroforesis
Dendrimer
menggunakan
dihilangkan
melakukan
karakterisasi
G4
10
%
disimpan dalam methanol. Pelarut methanol
akrilamida [12].
Tujuan
PAMAM
dari
sintesis
penelitian
yang
dan pemastian
ini
diikuti
dari
dendrimer
PAMAM
G4
adalah
dengan cara penguapan dengan mengalirkan
dengan
gas nitrogen.
Residu hasil penguapan
kemudian dilarutkan dalam air bebas mineral.
terbentuknya
senyawa konyugat PAMAM G4-nimotuzumab
3
Aktivasi Antibodi Monoklonal
Nimotuzumab
Konjugat
Nimotuzumab
(pembuatan CHO Nimotuzumab)
dendrimer
dibuat
PAMAM
dengan
rasio
G4molar
nimotuzumab pada dendrimer 1 : 4. Sebanyak
Aktivasi
Nimotuzumab
dilakukan
20lll
larutan
dendrimer
PAMAM
G4 10%
hingga kering.
dengan mol rasio Nimotuzumab : Nal04 yaitu
dalam metanol dialiri gas
1:230 (1,6 mg : 1,6 mg). Sejumlah dapar
PAMAM G4 kemudian direkonsitusi
asetat pH 5,5 (0,4 ml) ditambahkan kedalam
dengan 20lll dapar bikarbonat 50 mM pH 9.
Ke dalam larutan ini kemudian ditambahkan
320
III
larutan
nimotuzumab
5
mg/mL.
N2
Campuran kemudian diaduk dengan vortex
larutan
dan didinginkan pada suhu 2-g°C. Sejumlah
kemudian diinkubasi
Nal04 (1,6 mg) yang dilarutkan dalam 0,4 ml
suhu 2-g0C dalam keadaan terlindung
dapar
eahaya.
asetat
pH 5,5 di vortex
kemudian
CHO-Nimotuzumab.
dengan
Kedalam
Campuran
selama 20 jam
konjugat
ini
pada
dari
kemudian
didiamkan pada suhu 2-g0C serta dilindungi
ditambahkan sejumlah NaBH4 (42 Ill) dalam
dari eahaya. Kedua larutan diatas kemudian
air dengan konsentrasi 4 mg/mL. Campuran
dieampurkan dan iinkubasi selama 2 jam pada
diinkubasi kembali selama 3 jam pada suhu 2-
suhu 2-g0C dalam keadaan gelap. Sejumlah
gOCdan terlindung dari eahaya.
etilen
glikol
eampuran,
(g Ill)
yang
ditambahkan
diikuti
selama 30 menit
dengan
kedalam
Pemurnian Konjugat Dendrimer PAMAM G4 Nimotuzumab
inkubasi
pada suhu 2-g0C dalam
keadaan gelap. Pada proses ini akan diperoleh
larutan
Nimotuzumab
Nimotuzumab).
dimurnikan
Vivaspin
larutan
teroksidasi
KD
Pemurnian
CHO-Nimotuzumab
menggunakan
30
(CHO-
filter
MWCO
protein
dengan
eara
konjugat
dengan
menggunakan
dengan
metode
2
dilakukan
metode,
ultrafiltrasi
yaitu
sentrifugasi
menggunakan filter protein Vivaspin 10 KD
disentrifugasi beberapa kali pada keeepatan
MWCO
dan
4000 rpm. Hasil pemurnian dilarutkan dalam
kromatografi filtrasi gel kolom PD-10 dengan
larutan dapar fosfat 0,1 M pH 6,5 dengan
matriks
volume akhir 500 ilL.
ultrafiltrasi
menggunakan
Sephadex G-25 medium.
200 III
Analisis CHO-Nimotuzumab dengan FTIR
dengan
Metode
dilakukan dengan eara memipet
larutan
konjugat
ke dalam
filter
protein Vivaspin 10 KD MWCO dan volume
nya dieukupkan hingga 2 ml dengan dapar
Untuk
aktivasi
memastikan
Nimotuzumab
bahwa tahapan
telah
fosfat
berhasil,
pH
6,5.
disentrifugasi
Filter
selama
protein
15
kemudian
menit
dengan
dilakukan analisa dengan menggunakan FTIR.
keeepatan 4000 rpm. Sentrifugasi dilakukan 4
Sebanyak 150 III larutan CHO-Nimotuzumab
kali sehingga diperoleh volume akhir 150 ilL.
dan dimasukkan kedalam vial. lalu dialiri gas
Tabung dibalik dan disentrifugasi
selama 5
hingga kering dan serbuk di dalam vial
menit dengan keeepatan 4000 rpm. Kemudian
diambil untuk analisis. Kemudian sebanyak ~
tabung dibilas dengan menambahkan 50 III
50 mg sampel kering diukur dengan alat FTIR.
dapar fosfat pH 6,5 yang diikuti sentrifugasi
Pemeriksaan
selama 5 menit dengan keeepatan 4000 rpm.
N2
spektrum
IR dilakukan
pada
bilangan gelombang 400 sampai 4000 em,l.
Konjugat
Konjugasi Nimotuzumab
PAMAM G4
dianalisis menggunakan spektrofotometer
Nimotuzumab
dengan Dendrimer
4
dendrimer
yang
PAMAM
diperoleh
G4-
selanjutnya
UV.
Analisis Konyugat
Dendrimer
(Shimadzu SCl-10A) yang dilengkapi dengan
PAMAM G4-
Nimotuzumab dengan Spektrofotometer
kolom SEC250 (7,5 x 300 mm), detektor UV-
UV
VIS (280 nm) dengan fase gerak dapar fosfat
Hasil
ultrafiltrasi
pemurnian
dan kolom
menggunakan
dari
O,OlN pH 7,5, volume injeksi contoh 50 ~l,
metode
dan kecepatan alir 1 mljmenit.
PD-10 diuji dengan
Spektrofotometer
Jasco UV-
550, dengan cara membuat baseline terlebih
Analisis Konjugat
dahulu dengan dapar fosfat 0,1 M pH 6,5. lalu
Nimotuzumab dengan Particle Size Analyzer
masing-masing fraksi dianalisis.
(PSA)
Analisis
Fraksi
Pemurnian
Konjugat
Dendrimer
PAMAM
G4-Nimotuzumab
konjugat
dengan Pereaksi Biuret
Nimotuzumab
Dendrimer
PAMAM
G4-
Ukuran dan distribusi ukuran partikel
dendrimer
PAMAM
G4
ditentukan
dengan
menggunakan alat PSA Delsa Nano C dengan
Fraksi-fraksi
konjugat
PAMAM G4-Nimotuzumab
dendrimer
metode photon correlation spectroscopy (PCS)
hasil pemurnian
Malvern dengan scattering angle 15°, 30°, dan
dengan menggunakan kromatografi filtrasi gel
60°. Sejumlah
kolom PD-10 matriks Sephadex G-25 medium
diuji secara kualitatif dengan pereaksi Biuret
PAMAM G4 - Nimotuzumab didispersikan
dalam metanol dan kemudian dimasukkan ke
untuk
dalam kuvet analisis. Analisis ukuran partikel
mengetahui
terdapat
pada fraksi
kandungan protein.
mana saja
(2ml)
konjugat
dendrimer
dilakukan pada suhu 25°(,
Uji dilakukan
dengan menggunakan NaOH 40% yang dibuat
dengan
cara melarutkan
dalam 10 ml
H20
4000 mg NaOH
Analisis Konjugat
dan CuS04 0,5% yang dibuat
Dendrimer
PAMAM
G4-
Nimotuzumab dengan Elektroforesis Gel
dengan cara melarutkan 50 mg CuS04 dalam
10 ml H20. Kemudian sebanyak 150 ~llarutan
Pemastian
sampel ditambah dengan 40 ~l NaOH 40%
dendimer
dan
menggunakan
40
~l
CUS04 0,5%.
Contoh
yang
PAMAM
terbentuknya
konjugat
G4-Nimotuzumab
metode
elektroforesis
mengandung protein akan memberikan warna
dengan
biru ungu.
PAMAM G4-nimotuzumab,
akrilamida.
diuji
Konyugat
gel
dendimer
standar
protein
(10 - 250 KD), PAMAM G4, nimotuzumab dan
Analisis Konyugat
Nimotuzumab
Dendrimer
dengan
PAMAM
Kromatografi
G4Cair
Kinerja Tinggi (KCKT)
CHO-nimotuzumab
didestruksi
pemanasan
10
selama
dilakukan elektroforesis
menit,
dengan
kemudian
gel pada tegangan
250 volt selama 30 menit. Pelat gel akrilamida
Standar Nimotuzumab murni, standar
dendrimer
PAMAM
G4,
PAMAM G4-Nimotuzumab
dengan filter
protein
dan
kemudian dicuci dengan larutan Coomassie
dendrimer
blue sampai noda dari tiap sampel terlihat.
hasil pemurnian
Noda pada sampel dan standar dibandingkan,
kemudian diidentifikasi berdasarkan berat
Vivaspin
dan PD-10
(Fraksi 4) diuji dengan menggunakan KCKT
molekul yang terdapat pada standar.
5
HASIL DAN PEMBAHASAN
IOpLS •••••
~+O.1
••••.
1bpa_pB
s,s
Gambar 1. Aktivasi Nimotuzumab dengan Nal04
Aktivasi
Nimotuzumab
dilakukan
etilenglikol. Penghentian reaksi ini dilakukan
dengan
untuk mencegah terjadinya oksidasi lanjutan
dengan mereaksikan Nimotuzumab
larutan Nal04 dalam keadaan segar di dalam
pada
vial dengan rasio Nimotuzumab : Nal04 (1:1)
diinginkan dari Nimotuzumab.
(Gambar 1). Nal04 akan mengoksidasi gugus
Nimotuzumab dengan Nal04 berupa larutan
diol
gugus
jernih dan tidak memiliki perbedaan warna
yang
larutan
dengan
larutan
standar
Nimotuzumab. Pemurnian CHO-Nimotuzumab
pada
aldehid
Nimotuzumab
menjadi
(CHO), gugus aldehid
digunakan
untuk
Nimotuzumab
dengan
inilah
mengkonjugasikan
gugus
amin
bagian
dilakukan
pada
dendrimer PAMAM G4 [12].
asam
secara
amino
ultrafiltrasi
yang
tidak
Hasil aktivasi
sentrifugasi
dengan menggunakan tabung vivaspin 30.000
harus disimpan
MWCO
(Molecular
Weight
Cut
Off).
Nimotuzumab
memiliki
bobot
molekul
pada suhu 2-8°C dan terlindung dari cahaya
-160.000 g/mol sehingga akan tertahan dan
Larutan
campuran
karena sifat antibodi Nimotuzumab yang tidak
tidak dapat melewati filter vivaspin sedangkan
stabil. Selama proses pengoksidasian, dapar
molekul lainnya seperti Nal04 dengan bobot
yang digunakan yaitu dapar asetat pH 5,5
molekul 213,89 g/mol dan etilenglikol dengan
karena oksidasi dengan menggunakan Nal04
bobot molekul 62,07 g/mol akan melewati
dalam dapar asetat memiliki efisiensi yang
filter vivaspin 30KD, dengan demikian dapat
lebih baik dibandingkan dengan dapar fosfat.
diperoleh larutan yang mengandung
Nimotuzumab murni.
Pengoksidasian Nimotuzumab dengan
Nal04
dihentikan
dengan
menggunakan
6
CHO-
Nimoluzt.n1ab
CHO-Nimoluzt.n1ab
Gambar 2. Spektrogram
dari Spektrofotometer
UV/Vis Nimotuzumab
dan CHO - nimotuzumab
C-H aldehid
III \ I II II\~
25DO
1\
200D
W~CJD...1
Gambar 3. Spektrum
Spektrogram
dari
hasil analisa dengan FTIR CHO-Nimotuzumab
hasil analisis
dengan
UV/Vis (Gambar
2) tidak dapat membedakan
antara
Nimotuzumab
Nimotuzumab,
dapat
digunakan
sehingga
untuk
senyawa
CHO-
Nimotuzumab
dengan
metode
ini
karakterisasi
terse but.
dilakukan
Spektrofotometer
fungsi
untuk
spesifik
CHO-
Nimotuzumab
tidak
Aldehid
terdapat
ke 2
7
Analisis
melihat
yang
dengan
keberadaan
terdapat
pada
FTIR ini
gugus
CHO-
khususnya gugus OH dan gugus
(CHO). Hasil spektrum
pad a Gambar 3 .
yang diperoleh
~"'--
Dendrimer pamam64
pH 9
~
~
---U'C~
...,
J;,
{.
r
1/
Jj••••paa•••••••
HaJIn.~..-,.un.o
-(22.SJ.'.)
fIfiiJ'
dmabayo
~
_
-¥
•••
10\
i-
I
nimotnzmnal:HJcodrimerpamamG4
Kon~
Gambar 4. Konjugasi Nimotuzumab dengan PAMAM G4
Dari hasil spektrum
yang diperoleh
dilakukan dengan rasio moll:
4 dalam dapar
dapat diketahui
bahwa pada sampel CHO-
bikarbonat
Nimotuzumab,
terdapat
untuk mengoptimalkan reaksi konyugasi yang
frekuensi
1820-1600
spektrum
cm-1
pada
menunjukkan
terjadi.
50 mM pH 9, hal ini bertujuan
Konyugasi Dendrimer
adanya ikatan C=O aldehid, sedangkan apada
Nimotuzumab
berlangsung
2850 dan 2750 cm-1 menunjukkan
basa (pH 9-
10) sehingga
adanya
dalam
ikatan CH aldehid, hal ini menunjukkan bahwa
nimotuzumab
terdapat
amin sekunder pada dendrimer
gugus aldehid pada sampel CHO-
Nimotuzumab.
Oleh
karena
itu,
dapat
tidak
(OH) menjadi Aldehid (CHO) telah berhasil
dilakukan.
yaitu Natrium
Pengkonyugasian
dengan dendrimer
stabil,
PAMAM G4 (Gambar 4)
8
pada
basa Schiff
PAMAM G4
yang bersifat
sehingga diperlukan
Borohidrida
(NaBH4)
reaksi yang terjadi sebagai berikut:
Nimotuzumab
suasana
aldehid
akan bereaksi dengan gugus
dan membentuk
disimpulkan bahwa reaksi oksidasi gugus Diol
PAMAM G4-
penstabil
dengan
04
Dcndrim~r PAMAM
+
-
Bas,1 S"hiff
1
CHO-Nimotuzunmb
NaHlfa
Gambar 5. Reaksi Konyugasi Nimotuzumab
dengan Oendrimer
PAMAM G4 (Hermanson,
G. T., telah diolah kembali).
4.~H'a1:~.R__",5"J-" ~
""'~~_*":t,':U::~
~"':~!lI:'q_t:J>:I'\,*~,,t
~,'1_.
A
_u_.\.
"'~""',"P"5-::Sa~'" ~~
~"'''";':::f4..,
J!:w,",'
•.• t~%~"'cQ.C~",~,f
_.,,,,-
B
"""
(Malvern)
lVIarkelr/standalr
N irnot:uzurnab
CHO-nirnot:uzurnab
PA.IVIAIVIG4-nirnot:uzurnab
PAIVIAIVIG4
SOKD
20KD
10KD
2
3
Gambar 9. Hasil analisis Nimotuzumab,
PAMAM G4-nimotuzumab
5
4
CHO-nimotuzumab,
DTPA-nimotuzumab,
dan PAMAM G4 dengan SDS page elektroforesis.
11
G4-
Visualisasi
keberadaan
unsur-unsur
177lu-dota-nimotuzumab
yang terdapat dalam reaksi pembentukan
senyawa PAMAM G4-Nimotuzumab dilakukan
sebagai
radiofarmaka terapi kanker, (November),
2010, pp. 663-670.
dengan menggunakan metode elektroforesis
gel (SDSpage), diperlihatkan pada Gambar 9.
Dari
hasil
analisis
dengan
3.
metode
Ciolkowski, M., Petersen, J. F., Ficker, M.,
Janaszewska, A.,
elektroforesis gel (SDS page), dimana sampel
Christensen,
J.
B.,
terlebih dahulu didestruksi yaitu dipanaskan
Klajnert, B., & Bryszewska, M., Surface
modification
of PAMAM dendrimer
pada air mendidih selama 10 menit, terlihat
improves
bahwa pada senyawa nomor 4 (PAMAM G4-
Nanomedicine:
nimotuzumab) masih terlihat adanya fraksi
dari nimotuzumab dan PAMAM dari hasil
815-817.
destruksi
tersebut.
elektroforesis
Dari
data
Biology,
its
4.
Tomalia
D.A., Reyna L.A, Svenson 5.,
Dendrimers
puncak pada waktu
oncology
dapat disimpulkan
sintesis tersebut
bahwa
adalah
8(6), 2012, pp.
and Medicine,
dengan hasil KCKT dimana hanya terdapat 1
6,967
Nanotechnology,
hasil
gel (SDS page) dan diperkuat
retensi
biocompatibility.
menit,
senyawa
PAMAM
hasil
G4-
as multi-purpose
drug
delivery
and
devices for
diagnostic
Biochemical
imaging,
Transactions 35, part
Society
I, 2007, pp.61-67.
nimotuzumab.
5.
KESIMPULAN
Svenson 5., Tomalia D.A., Dendrimers in
biomedical applications -reflections
on
the field. Advanced Drug Delvery Reviews
Berdasarkan
analisa
hasil
dengan
Spektrofotometer
Nal04
PAMAM
berhasil
Dendrimer
terbentuk
57., 2215-1137,
03-2007
KCKT,
PSA
dan
dan
konyugasi
6.
Drabu 5., Khatri 5., Babu 5., Dendrimers:
Dendrimer
Nanopharmaceuticals
Nimotuzumab telah
Hasil
karakterisasi
Research Journal
bahwa
larutan
for
of
Drug Delivery,
Pharmaceutical,
Biological and Chemical Sciences, Vol. 1
konyugat
PAMAM G4-Nimotuzumab
2005, Diunduh tgl 18dari
http://www.sciencedirect.com.
(SDS page)
dapat
aktivasi Nimotuzumab
G4 dengan
dilakukan.
menunjukkan
dan
menggunakan
UV,
elektroforesis
gel
disimpulkan bahwa
dengan
identifikasi
Issue 2, 2010.
yang
berupa larutan jernih, murni dan
7.
memiliki ukuran partikel rata-rata 12,29 nm.
Press,
D.,
Nimotuzumab,
a
novel
monoclonal antibody to the epidermal
growth factor receptor, in the treatment
DAFTAR PUSTAKA
1.
of non-small cell lung cancer, 2011, pp.
59-67.
Lucky A. Paune, Pembuatan
Dendrimer
PAMAM
Skripsi Sarjana Farmasi,
Program
51
Indonesia, 2013.
2.
Konjugat
G4-Nimotuzumab,
8.
Fakultas Farmasi
Reguler
Takeda M., Isamu Okamoto I., Vasumasa
Nishima
Universitas
V., Kazuhiko
Nimotuzumab,
a
Nakagawa
N..
novelmonoclonal
antibody to the epidermal growth factor
receptor, in the treatment of non-small
Humani, T. 5., Ramli, M., Rustendi, C. T.,
cell lung cancer, Lung cancer : Targets
& Subur, M., Preparasi dan uji stabilitas
and Therapy, 2,2011, pp. 59-67.
12
9.
Fischer-durand, N., Salmain M., Rudolf
B.,
Dai
L., Juge
Laprevote
0.,
L., Guerineau
et
aI.,
11. Hens M., Vaidyanathan G., Zhao X.G.,.
V.,
Bigner D.O., Zalutsky M.R., Anti EGFRvl1i
Site-specific
monoclonal antibody armed with
177Lu
:
conjugation of metal carbonyl dendrimer
in vivo comparison of macrocyclic and
to antibody
acyclic ligands, Nuclear
reagent
in
Biochemistry,
and its use as detection
immunoassay.
407
Medicine
and
Biology, 37, 2010, pp. 741-750.
Analytical
(2), 2010, pp. 211-
219.
12.
Hermanson
G.T.,
"Bioconjugate
Technique", second ed., Elsivier, 2008,
10. Vin Z., Liu N., Ma M., Wang L., Hao V.,
pp.130.
Zang X, A novel EGFR-targeted gene
delivery system based on complexes selfassembled by EGF, DNA and activated
PAMAM
Journal
dendrimer,
of Nanomedicine,
International
7, 2012,
pp.
4625-4635.
13