PENGARUH KONSENTRASI ISOPROPHYIL THIO D-GALACTOSIDE (IPTG) TERHADAP EKSPRESI PROTEIN REKOMBINAN GST-VP28 PADA ESCHERICIA COLI BL21 - Repository UNRAM

  

PENGARUH KONSENTRASI ISOPROPHYIL THIO D-GALACTOSIDE

(IPTG) TERHADAP EKSPRESI PROTEIN REKOMBINAN GST-VP28

PADA ESCHERICIA COLI BL21

PUBLIKASI ILMIAH

  

Diserahkan Guna Memenuhi Sebagian Syarat yang Diperlukan

Untuk Mendapatkan Derajat Sarjana Peternakan

pada Program Studi Peternakan

  

Oleh

MUH. HERU RESPADI

B1D 011 176

FAKULTAS PETERNAKAN

UNIVERSITAS MATARAM

MATARAM

  

2015

  

PENGARUH KONSENTRASI ISOPROPHYIL THIO D-GALACTOSIDE

(IPTG) TERHADAP EKSPRESI PROTEIN REKOMBINAN GST-VP28

PADA ESCHERICIA COLI BL21

PUBLIKASI ILMIAH

  

Oleh

MUH. HERU RESPADI

B1D 011 176

Diserahkan Guna Memenuhi Sebagian Syarat yang Diperlukan

  

Untuk Mendapatkan Derajat Sarjana Peternakan

pada Program Studi Peternakan

PROGRAM STUDI PETERNAKAN

Menyetujui,

  

Pada Tanggal : _______________

Pembimbing Utama,

Muhammad Ali, S.Pt, M.Si, Ph.D

NIP. 19720727 199903 1 002

  

PENGARUH KONSENTRASI ISOPROPHYIL THIO D-GALACTOSIDE

(IPTG) TERHADAP EKSPRESI PROTEIN REKOMBINAN GST-VP28

PADA ESCHERICIA COLI BL21

ABSTRAK

  

Muh. Heru Respadi / B1D 011 176 Fakultas Peternakan Universitas Mataram

  VP28 merupakan salah satu protein pembungkus virus White Spot (WSS) yang terlibat dalam infeksi sistemik udang dan banyak dipelajari

  Syndrome

  penggunaannya sebagai vaksin. Tujuan dari penelitian ini yaitu untuk mengetahui pengaruh tingkat IPTG terhadap ekspresi protein rekombinan GST-VP28 pada bakteri E. coli BL21. Pada penelitian ini dihasilkan protein VP28 yang difusi dengan GST menggunakan inang E. coli BL21 (DE3). Pada beberapa tingkat konsentrasi induser (IPTG), hasil SDS-PAGE menunjukan bahwa protein target yang berukuran sekitar 44.6 kDa dapat diekspresikan dengan menggunakan 0.25 mM IPTG. Uji solubilitas protein tersebut menunjukan bahwa protein GST-VP28 yang dihasilkan dengan konsentrasi IPTG sebagian besar diekspresikan dalam keadaan larut.

  

Kata kunci : Protein Rekombinan GST-VP28, IPTG, SDS-PAGE, E. coli BL21.

  

EFFECT OF CONCENTRATION ISOPROPYL THIO D-GALACTOSIDE

(IPTG) ON PROTEIN EXPRESSION OF RECOMBINANT GST-VP28

ESCHERICHIA COLI

ABSTRACT

  

Muh. Heru Respadi / B1D 011 176 / Fakultas Peternakan Universitas Mataram

  VP28 is a viral envelope proteins of White Spot Syndrome (WSS) which involved in the systemic infection of shrimp and much studied as a vaccine. The aim of this study is to determine the effect of IPTG level on the expression of recombinant GST-VP28 proteins in bacteria E. coli BL21. In this study, VP28 protein fused to using GST in host E. coli BL21 (DE3) at some level of concentration of inducer (IPTG). SDS-PAGE results showed that the protein target (about 44.6 kDa) can be expressed by using a 0,25 mM IPTG. The protein solubility test showed that the GST-VP28 protein produced by the concentration of IPTG mostly expressed in soluble form.

  

Keywords: Recombinant of GST-VP28 protein, IPTG, SDS-PAGE, E. coli BL21.

  

PENDAHULUAN

  Teknologi molekular merupakan disiplin ilmu yang berkembang sangat Disiplin ilmu tersebut menggunakan jasa teknologi DNA rekombinan untuk menghasilkan aneka produk yang dibutuhkan oleh manusia (Glick, 2003). Teknologi DNA rekombinan merupakan suatu metode untuk menyatukan DNA dari satu sumber atau lebih yang tergabung dalam satu molekul rekombinan (Barnum, 2005). Dengan teknologi ini aneka produk telah dihasilkan, diantaranya seperti vaksin, antibodi, hormon, enzim, dan aneka obat. Antibodi monoklonal, misalnya, dipergunakan sangat luas seperti untuk terapi medis, pembuatan kit maupun alat deteksi cepat untuk penyakit. Produk tersebut sangat diperlukan sehingga berbagai keperluan dapat dilakukan dengan lebih mudah dan lebih spesifik sesuai keinginan manusia (Muladno, 2002).

  Salah satu produk dari teknologi ini yaitu aneka protein rekombinan yang dipergunakan sebagai vaksin. Viral Protein-28 (VP28) merupakan salah satu protein struktural dari virus bercak putih (White Spot Syndrome Virus/WSSV) (Zuidema et al., 2004). VP28 terletak pada pembungkus virion (envelope) (van Hunten et al., 2001). Penemuan protein rekombinan VP28 sangat bermanfaat untuk pembuatan vaksin maupun deteksi penyakit infeksi sistemik pada udang yang disebabkan oleh virus WSS (van Hunten, 2001). Protein ini telah berhasil diproduksi pada bakteri Escherichia coli maupun mkroba lainnya sepert Bacillus

  

subtilis melalui proses rekayasa virulen protein yang diperoleh dari DNA virus

White Spot Syndrome (WSS) pada udang.

  Dalam proses rekayasanya, protein VP28 ini disisipkan pada vektor pGEX kemudian ditransformasikan kedalam sel inang. Sel inang yang biasa digunakan yaitu Escherichia coli (E. coli) (Caipang, 2008). E. coli memiliki kelebihan sebagai sel inang karena dapat memperbanyak diri dalam waktu yang cepat, singkat dan stabil, bersifat tidak pathogen, dapat diintroduksi sebagai gen asing pengkode protein target (Brock et al., 1994). E. coli juga memiliki tingkat ekspresi yang tinggi dalam sistem ekspresi karena mudah untuk melakukan manipulasi DNA rekombinan (mirip seperti kloning plasmid) (Sahdev et al., 2008).

  Protein VP28 juga diekspresikan dengan bantuan vektor plasmid, yang diantaranya dapat diinduksi dengan Isoprophyil Thio D-galactoside (IPTG). IPTG yang melepas represi promotor untuk mengasilkan ekspresi dalam jumlah tinggi sebelum kemudian dilekatkan. Melekatkan protein tertentu pada molekul lain misalnya

  β galaktosidase dapat lebih menstabilkan protein dan akan mudah

  terdegradasi dalam E. coli. Hal umum lain yang juga dilakukan adalah dengan menambahkan perunut (tag) yang diekspresikan untuk memudahkan menemukan/mengisolasi protein. Perunut yang banyak digunakan adalah Glutation

  

S-transferase (GST) yang dapat diisolasi menggunakan kolom glutation

(Marceline, 2008).

  Pada penelitian sebelumnya, pengklonan gen VP28 penyandi Viral Protein- 28 untuk Produksi Vaksin Rekombinan yang dilakukan oleh Mukhlis (2010) menggunakan perlakuan tanpa induksi IPTG. Begitu juga yang dilakukan oleh Ali

  

et al. (2010) pada produksi antigen permukaan virus White Spot Syndrome (WSS)

  untuk menghasilkan kandidat vaksin rekombinan udang dan Ashari et al. (2014) pada pengembangan kandidat vaksin rekombinan VP28 yang hanya menggunakan perlakuan IPTG dengan konsentrasi 1 mM untuk melihat ekspresi protein rekombinan VP28-nya.

  Berdasarkan uraian di atas, penelitian ini dilakukan untuk mengetahui tingkat ekspresi protein target dalam hal ini Viral Protein-28 (VP28). VP28 merupakan salah satu protein amplop White Spot Syndrome Virus (WSSV) yang terlibat dalam penempelan dan penetrasi virus ke dalam sel udang (penyebab kematian lobster secara mendadak). Di induksi IPTG dengan konsentrasi yang lebih rendah (< 1 mM). Akibat penggunaan IPTG ini selain dari harganya yang relatif mahal, dapat bersifat racun apabila digunakan dalam konsentrasi yang tinggi (Ashari et al., 2014). Berdasarkan referensi juga belum ada yang meneliti tentang optimalisasi IPTG (penggunaan IPTG dengan konsentrasi lebih rendah) pada GST-

  VP28 yang kemudian diperbanyak dalam inang (E. coli BL21).

TUJUAN DAN KEGUNAAN PENELITIAN

  Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui pengaruh tingkat IPTG terhadap ekspresi protein rekombinan GST-VP28 pada bakteri E. coli BL21 dan untuk mengumpulkan data yang diperlukan dalam menghasilkan protein rekombinan GST-VP28 dalam skala yang lebih besar.

METODOLOGI PENELTIAN

  Penelitian ini dilaksanakan dengan metode Kultur Bakteri E. coli Rekombinan Pembawa Plasmid pGEX-VP28 terlebih dahulu. Kemudian Ekspresi Plasmid pGEX-VP28 dengan induksi IPTG dengan berbagai konsentrasi (0.10 mM, 0.25 mM, 0.50 mM, 0.75 mM dan 1.00 mM). Uji Kelarutan (Solubility) Protein Rekombinan GST-VP28 dengan menggunakan sonikator untuk memecah dinding sel bakteri agar mengetahui larut atau tidaknya protein target (GST-VP28) yang dihasilkan.

  Analisa data

  Analisis data dari penelitian ini menggunakan analisa kualitatif melalui deskriptif visual yang ditunjukan dengan tebal atau tidaknya pita protein pada saat dilakukan proses SDS-PAGE.

HASIL PENELTIAN

  Pada penelitian ini digunakan isolat E.coli BL21 pembawa plasmid rekombinan pGEX-VP28 yang disimpan sebagai stok gliserol yang telah diketahui dapat mengekspresikan protein rekombinan ketika dikultur. Isolat tersebut kemudian digoreskan pada media LB menggunakan metode streak atau penggoresan menggunakan goresan kuadran untuk kemudian diinkubasi semalam

  o

  pada suhu 37 C.

  Stok gliserol yang digunakan diperoleh dari penelitian sebelumnya yang dilakukan oleh Ashari et al. (2014). Peremajaan (re-kultur) tersebut telah berhasil dilakukan yang dibuktikan dengan tumbuhnya koloni bakteri pada media LB padat

  o setelah melalui tahapan inkubasi dalam inkubator dengan suhu 37 C selama 24 jam.

  Penggunaan antibiotik pada media tumbuh dimaksudkan untuk mencegah tumbuhnya bakteri lain selain bakteri penghasil protein target (kontaminan). Kontaminasi tersebut dapat berasal dari lingkungan selama proses pembuatan stok gliserol. Ampisilin bekerja dengan menghambat dinding sel yaitu dengan menyerang peptidoglikan (Brander et al., 1991). Penggunaan ampisilin didasarkan pada jenis plasmid atau vektor yang digunakan dalam penelitian ini yaitu pGEX- saat proses pertumbuhan bakteri, tidak ada jenis bakteri lain yang dapat tumbuh selain E.coli BL21 VP28 yang disisipkan dengan vektor pGEX (Anonim, 2014).

  Kultur Bakteri E. coli Rekombinan Pembawa Plasmid pGEX-VP28

  Koloni hasil peremajaan kemudian digunakan sebagai inokulan dalam pembuatan starter untuk ditumbuhkan pada LB cair yang mengandung antibiotik ampisilin. Media yang digunakan adalah media LB karena merupakan media konvensional yang biasa dipergunakan untuk menghasilkan protein rekombinan.

  Hasil inokulasi menunjukan perubahan warna media setelah diinkubasi

  o

  selama 19 jam (over night) pada mesin shaker dengan suhu 37

  C. Tingkat kekeruhan pada media semakin meningkat yang menunjukan bahwa bakteri E. coli BL21 pembawa pGEX-VP28 berhasil tumbuh pada media tersebut.

  Hal tersebut sesuai dengan pendapat Wibowo (2012) yang menyatakan bahwa suatu bakteri memerlukan kondisi yang optimum agar dapat tumbuh dengan baik, antara lain mencakup faktor suhu dan pH, kemudian faktor kelengkapan nutrisi dari media yang digunakan. Nutrisi yang tersedia haruslah lengkap dan sesuai dengan kebutuhan bakteri yang dibiakan, sedangkan untuk kondisi suhu dan

  o pH, bakteri biasanya tumbuh baik pada suhu 37 C dan pH 7.

  Ekspresi Plasmid pGEX-VP28

  Ekspresi protein rekombinan GST-VP28 telah berhasil dilakukan dengan menggunakan inang E.coli BL21 (DE3). Berdasarkan hasil ekspresi yang diperoleh setelah induksi tampak adanya band protein sesuai dengan berat molekul protein target (GST-VP28) yang berukuran sekitar 44.6 kDa dan dilakukannya SDS-PAGE. Terlihat berbeda nyata sekali ekspresi antara perlakuan yang diinduksi IPTG dengan yang tidak. Pada kolom yang diberikan perlakuan tanpa IPTG yaitu pada kolom 3 (uninduced), kolom 5 (uninduced), kolom 7 (uninduced), dan kolom 9 (uninduced) tidak ada ekspresi (pita protein), sedangkan pada perlakuan dengan penambahan (induksi) IPTG terdapat perbedaan tebal pita protein (band) konsentrasi 0.25 mM dan 0.50 mM (band paling tebal) dengan 0.10 mM, 0.75 mM dan 1 mM, berat molekul 44.6 kDa.

   (kDa) 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 250 130 100

  70

  55

  35

  25

  15

  10 Gambar 1. Hasil ekspresi plasmid pGEX-VP28 setelah induksi IPTG, penambahan (induced) 0.1 mM (1) & tanpa penambahan (uninduce) 0.1 mM (2), penambahan (induced) 0.25 mM (3) & tanpa penambahan (uninduce) 0.25 mM (4), penambahan (induced) 0.50 mM (5) & tanpa penambahan (uninduce) 0.50 mM (6), penambahan (induced) 0.75 mM (7) & tanpa penambahan (uninduce) 0.75 mM (8), penambahan (induced) 1.00 mM (9), Marker (10).

  Hal tersebut terjadi karena terlalu rendah konsentrasi IPTG (0.10 mM) yang digunakan maka ekspresi pita-pita protein VP28 tidak terlalu bagus. Begitu pula apabila terlalu tinggi konsentrasi IPTG (1,00 mM) yang digunakan, maka dapat memberikan efek racun atau tidak akan dapat terekspresikannya protein rekombinan VP28, sedangkan berat molekulnya diperoleh dari penjumlahan antara berat molekul protein VP28 (19.9 kDa) dengan GST (24.7 kDa) serta dapat juga dihitung berdasarkan sumbu grafik.

  Snustad dan Simmons (2003) menyatakan bahwa penggunaan IPTG diawali dengan terikatnya IPTG pada situs pengikat induser pada protein represor. Penambahan induser (IPTG) represor mengakibatkan perubahan struktur pada situs pengikat protein represor dengan situs pengikat represor pada operator. Hal tersebut menimbulkan tidak adanya interaksi yang terjadi antara protein represor dan operator, sehingga memungkinkan RNA polimerase sel inang yang telah berikatan dengan promoter lac yang merupakan titik awal proses transkripsi dan translasi gen menjadi protein rekombinan (VP28). Kemudian dilanjutkan dengan induksi ekspresi protein yang dilakukan setelah nilai OD 600 tercapai satu pada fase log (Brock et al., 1994).

  Uji Kelarutan (Solubility) Protein Rekombinan GST-VP28

  E. coli dapat menghasilkan protein rekombinan dalam jumlah yang besar

  dengan sangat cepat dan biaya murah. Namun salah satu permasalahan yang dihadapi dalam produksi protein rekombinan dalam E. coli adalah terbentuknya

  

inclusion body yakni protein rekombinan beragregat dalam bentuk tidak larut dalam

  sitoplasma. Fenomena ini menjadi kendala dalam efisiensi produksi protein rekombinan (Juniarti, 2012). Menurut Glick dan Pasternak (2003) inclusion body yang terbentuk dapat disebabkan oleh beberapa hal meliputi ekspresi protein rekombinan yang berlebihan, tidak terjadinya perlipatan protein yang sesuai menjadi protein aktif dan ada kemungkinan terjadinya pengurangan ikatan disulfida dalam lingkungan intraseluler sel E. coli. Adanya proses ekspresi yang berlebihan dapat membebani dan menghambat sekresi protein rekombinan oleh sel. Hal tersebut menyebabkan banyak protein tidak dapat disekresikan ke bagian tempat terjadinya pembentukan ikatan disulfide, pelipatan protein menjadi protein aktif dan matang (prisplasmik) sehingga akan membentuk kumpulan atau agregat dari protein yang tidak dapat larut (inclusion body) (Sorenson dan Mortensen, 2004). Maka dari hal tersebut dilakukanlah uji kelarutan (Solubilisasi) untuk mengubah protein tidak terlarut (insoluble) atau yang disebut dengan inclusion body menjadi protein terlarut (soluble) pada sampel yang digunakan (protein rekombinan GST- VP28).

  Sonikasi merupakan metode pemecahan sel yang memanfaatkan getaran dari gelombang suara (energi ultrasuara) dengan frekuensi tinggi untuk melisiskan dinding sel bakteri. Sehingga pada saat dinding sel bakteri lisis, protein rekombinan

  a yang telah diekspresi diasumsikan dapat keluar dari sel inang (Anonim, 2009 ).

  Sonikasi dilakukan dengan menggunakan alat yang disebut sonikator. Di dalam sonikator, terdapat vibrating probe yang dapat menghasilkan gelombang suara. Gelombang suara tersebut dikirimkan melalui vibrating probe yang dicelupkan ke dalam suspensi sel. Kemudian menginisiasi pembentukan partikel uap air yang semakin menimbulkan shockwave dan meradiasi sampel sehingga suspensi sel lisis. Selama dilakukannya sonikasi, suspensi sel diletakkan di dalam es agar panas yang dihasilkan oleh sonikator tidak menyebabkan protein yang didapatkan tidak

  (Anonim, 2009

  1) Penggunaan IPTG dengan konsentrasi 0.25 mM dapat menginduksi ekspresi protein rekombinan GST-VP28 dengan kuantitas yang tidak berbeda dengan penggunaan konsentrasi yang lebih tinggi (0.5 mM, 0.75 mM dan 1.00 mM).

  15

  25

  35

  55

  70

  1 2 3 (kDa) 250 130 100

  2) Jumlah protein terlarut yang dihasilkan dengan induksi IPTG 0.25 mM lebih banyak dibandingkan protein tidak larut (inclusion body).

  

KESIMPULAN DAN SARAN

Kesimpulan

  b

  VP28 tersebut larut dalam air (supernatan). Dimana protein yang larut dalam air (supernatan) merupakan protein yang tergolong bagus untuk dimanfaatkan sebagai bahan dalam pembuatan vaksin rekombinan (Tsumoto, 2003).

  IPTG 0.25 mM yang telah melalui tahapan sonikasi menunjukan bahwa pita protein (band) paling tebal terdapat pada supernatan. Artinya bahwa protein rekombinan

  VP28. Pada hasil visualisasi SDS-PAGE sampel dengan perlakuan penambahan

  Setelah dilakukannya sonikasi dilanjutkan dengan tahapan karakterisasi menggunakan metode SDS-PAGE untuk melihat profil protein dari rekombinan

  

Gambar 2. Hasil sonikasi sampel. Marker (1), pellet setelah sonikasi (2), Supernatan

setelah sonikasi (3)

  o C selama 15 menit.

  ). Tahapan sonikasi dilakukan terhadap total pellet protein rekombinan VP28 yang diperoleh dari hasil induksi IPTG (0.25 mM) kemudian disentrifugasi 8000 rpm pada suhu 4

  10

  Saran

  1) Untuk keperluan lebih lanjut, konsentrasi IPTG yang akan digunakan adalah 0.25 mM.

  2) Untuk menghasilkan protein rekombinan GST-VP28 dalam skala yang lebih besar, diperlukan media yang murah dan tersedia secara kontinyu.

DAFTAR PUSTAKA

  Ali, M., Sulaiman ND., Mukhlis A., dan Amin M. 2010. Produksi Antigen Permukaan Virus White Spot Syndrome untuk Menghasilkan Kandidat Vaksin Rekombinan Udang. Laporan Penelitian. Pusat Penelitian Agribisnis Universitas Mataram, Mataram.

  a

  Anonim. 2009 . Cell lysis technical handbook: version 2. Thermo Fisher scientific, inc., United States: 50 hlm.

  b

  Anonim. 2009 . Thermo scientific Pierce Cell lysis technical handbook: Featuring cell lysis reagent and detergent. Thermo Fisher Scientific, Inc., United States: 50 hlm. Anonim. 2014. http://www.addgene.org/vector-database/2261/. Diakses tanggal 22

  April 2015 Ashari, M, M. Ali, Sulaiman ND. 2014. Pengembangan Kandidat Vaksin

  Rekombinan VP28 Strain Indonesia Untuk Udang Terhadap Virus White Spot Syndrome Dalam Rangka Komesialisasi. Laporan Penelitian. Pusat Penelitian Unggulan Strategis Nasional, Mataram.

  Barnum, SR. 2005. Biotechnology an introduction. International Student Edition.

  Ed ke-2. Belmont : Thmpson Brooks/Cole. Brander, G.C., Pugh, R.J., and Bywater, W.L. 1991. Veterinary Applied

  Pharmacology and Therapeutics. 5th ed. Bailliere Tindall ELBS. 436,467- 473. Brock, T.D., M. T. Madigan, J.M. Martinko & J. Parker. 1994. Biology of Microorganism . 7th ed. Prentice-Hall, Inc., New Jersey: xvii + 909 hlm. Caipang, C.M.A., Verjan, N., Ooi, E.L., Kondo, H., Hirono, I., Aoki, T., Kiyono,

  H., and Yuki, Y. 2008. Enhanced survival of shrimp, penaeus

  (Marsupenaeus) japonicas from white spot syndrome disease after oral administration of recombinant VP28 expressed in Brevibacillus brevis .

  Vol.25. P. 315-320 Glick, B.R. dan J.J. Pasternak. 2003. Molecular biotecnology principles and ASM Press, Washington DC: xxiii + 760 application of recombinant DNA. hlm.

  Juniarti, F., Doddy Irawan, Subintoro, Khayu Wahyunita, Aris Rudiyanto, Chaerul Malik dan Vanny Narita. 2012. Optimasi Produksi Protein Non Struktural

  1 (NS1) Virus Dengue Serotipe 3 (DENV-3) . Universitas Al Azhar,

  Indonesia Marceline, Faustine. 2008. Kloning Kerangka Baca Terbuka Gen Pengkode VP28 White Spot Syndrome Virus Pada Escherichia coli DH5a.

  Mukhlis, A. 2010. Pengklonan Gen VP28 Penyandi Viral Protein-28 dari Virus White Spot Syndrome Sebagai Langkah Awal Produksi Vaksin Rekombinan Udang Penaeid (TESIS). Institut Pertanian Bogor, Bogor

  Muladno. 2002. Teknologi Rekayasa Genetika. Bogor baru: Pustaka Wirausaha Muda. Bogor. Sahdev S., Khattar S. K., Saini K. S. (2008). Production of active eukaryotic proteins through bacterial expression systems: a review of the existing biotechnology strategies. Mol. Cell. Biochem . 307 249

• –264 10.1007/s11010-007-9603-6

  Snustad, D.P., and M.J., Simmons. 2003. Principles of Genetics. 3rd. en. Jhon Welly and Sons. Inc., Hoboken: xix+ 840 hlm. Sorensen, H.P. dan K.K. Mortensen. 2004. Advance genetic strategies for recombinant protein expression in Escherichia coli. Journal of Biotecnology

  115: 113-128. Tsumoto, K., E. Daijima, I. Kumagai, and T. Arakawa.2003. Practical consideration in refolding proteins from inclusion bodies. Academic. 28: 1--8 van Hunten MCW, Vlak JM. 2001. Identification and Phylogeny of a protein kinase gene of white spot syndrome virus. Virus Genes 22:201-207.

  Wibowo, M.S. 2012. Pertumbuhan dan kontrol bakteri. Jurnal-Pertumbuhan- bakteri-c070205.PDF. Diakses 11 November 2014. Zuidema D, van Hunten MCW, Marks H, Witteveltd J, Vlak JM. 2004. Virus host interactions of White Spot Syndrome Virus. Di dalam: Leung KY, editor.

  Current Trends in the Studi of Bacterial and Viral Fish and Shrimp Diseases. Molecular Aspects of Fish and Marine Biology ; volume ke-3.

  Singapore: World Scientific Publishing. Hlm 237-255.