M01698
!
"
$
% &
)*+,$
% &
)*+,"
//
#
'(
"
'(
!.
.
01
!
"
!
!
% &
23
4
!
33
!
"
#
$
$
#
&
'()'*
%
&
+
$
),
+
&
),.
). '*
,-*
#
+
,/
!
!
0
1
#
+
#
#
#
#
#
#
#
#
#
#
#
#
3
#
#
5
#
3
# 3
#
#
3
# /
#
&
#
#
3
# ,3
# #
&
#
#
1
&
#
#
#
4
# #
3 #
3
#
#
3
#
3
#
#
#
# #
#
+ # ( #
#
#
#
#
#
#
#
3
#
# #
# #
#
#
#
#
2
#
#
#
#
#
#
'()'*
#
,-*
#
#
(
# #
#
#
#
#
&
#
),
# ),.
). 6'*
#
#
7
(
#
#
#
#
#
#
#
0#
#
(
(
+
5
.
3
7
6
(
&
(
3
1
(
( (
(
3
.
3
3
(
5
(
(
(
(
! (
! ( 68 /99-7
(
1
(
(
3
+
+3
/9;,7
(
(
5
(
(
3
(
(
(
3
(
(
6 3
(
! ! 7
! (
(
3
3
(
(
(
$
(
5
(
(
(
(
(
(
(
5
(
5
( + (
3
(
( (
'
(
(
+
(
!
.
(
/)+/=< 6 !
+
5
6
(
+
(
+
(
(
!
6/99)7
(
5
(
(
(
&
(
3
(
(
*-->7
(
&
3
6:
(
;+/*<
(
(
(
(
(
(
*---7
(
(
(
(
(
(
(
3
3
(
(
3
(
(
(
(
5
(
(
+
3
(
(
&
(
(
Sampel diambil dari tiga (3) spesies
, yaitu kelapa, aren dan lontar. Sampel
diambil dua kali, pada pagi hari (07.00 – 09.00) dan sore hari (15.00 – 17.00). Sebanyak 0.2!
20 ml nira segar diambil secara aseptik dan disimpan dalam suhu 4°C sampai proses
selanjutnya. Lokasi pengambilan yaitu di :
• Nira kelapa: Kecamatan Tuntang, Pabelan, Suruh (Kabupaten Semarang) dan
Kecamatan Wonosegoro (Kabupaten Boyolali) sebanyak 48 sampel.
• Nira aren: Desa Karangnongko (Kecamatan Tuntang), Desa Wonosari, Karang
Bawang, dan Kemambang (Kecamatan Banyubiru), Desa Lanjan, Jambe, Trayu,
Candi Garon, Mitir, Ngoho dan Kebun Agung (Kecamatan Sumowono) di Kabupaten
Semarang sebanyak 45 sampel.
• Nira lontar: Kabupaten Pati, Lasem, Tuban, Gresik, Paciran dan Kupang sebanyak
31 sampel.
Khamir diisolasi menggunakan media YPD (1% Bacto yeast extract, 2% Bacto
pepton, 2% glukosa, pH 5) cair yang mengandung etanol 5%. Sebanyak 0.2 ml nira
diinokulasikan dan diinkubasi selama 24!48 jam pada suhu 30°C. Isolat dipisahkan dan
dimurnikan menggunakan medium agar YPD dengan prosedur mikrobiologi standar.
Pengamatan morfologi koloni dan sel dilakukan terhadap isolat murni.
Isolat ditumbuhkan secara aseptis pada 2 ml medium YPD cair mengandung etanol
dengan konsentrasi 10; 12.5; 13.5; 14; 14.25; 14.5; 14.75 dan 15% selama 24!48 jam pada
suhu 30°C.
Isolat ditumbuhkan secara aseptis pada medium YPD cair yang mengandung etanol
5% dan indicator BCP (
) 1.6% selama 24!72 jam pada suhu 30°C.
Kemampuan fermentasi ditandai dengan perubahan warna menjadi kuning dalam waktu ≤
24 jam.
Isolat ditumbuhkan secara aseptis pada medium YPD cair yang mengandung 2%
sumber karbon yang berbeda!beda, yaitu xilosa, fruktosa, glukosa, maltosa, dan sukrosa.
Kultur ditumbuhkan secara sistem
pada kecepatan 130 rpm pada suhu ruang sampai
mencapai fase stasioner (18!48 jam). Sampel kultur diambil secara periodik tiap 3!5 jam dan
diukur kandungan gulanya dengan metode DNSA (dijelaskan selanjutnya) dan biomassa sel
menggunakan spektofotometer pada panjang gelombang 660 nm.
Isolat ditumbuhkan secara aseptis pada medium YPD cair dengan sumber karbon
glukosa 20% secara anaerob fakultatif. Inkubasi dilakukan selama 12!15 hari pada
kecepatan 130 rpm di suhu ruang. Pengamatan konsentrasi etanol, biomassa dan glukosa
dilakukan 3 hari sekali.
Pengukuran kadar glukosa dilakukan sesuai James (1995). Secara ringkas,
pengukuran kadar glukosa dilakukan sebagai berikut: Sebanyak 0.5 ml supernatant dari
sampel ditambahkan 1 ml air dan 0.5 ml reagen DNS (1% asam 3,5!dinitrosalisilat, 30%
natrium kalium tartrat, 0.4 M NaOH) lalu dipanaskan dalam suhu 100°C selama 5 menit
dalam tabung tertutup untuk menghindari penguapan. Reagen DNS akan bereaksi spesifik
terhadap glukosa dan membentuk asam 3!amino!5!nitrosalisilat yang berwarna merah
kecoklatan. Sampel lalu ditambahkan air sampai 10 ml dan diukur adsorbansinya pada
panjang gelombang 540 nm. Konsentrasi glukosa diukur dengan membuat kurva standar
glukosa.
Kadar etanol diukur berdasarkan jumlah NADH yang terbentuk dari hasil oksidasi
etanol menjadi asetaldehid oleh enzim ADH (alcohol dehydrogenase) dalam suatu reaksi
yang membutuhkan NAD. Jumlah NADH yang terbentuk setara dengan banyaknya etanol ini
kemudian diukur dengan spektrofotometer pada panjang gelombang 340 nm. Prosedur kerja
yang dilakukan adalah sebagai berikut:
4.8 ml buffer (0.1 M Na4P2O7.10H2O, 0.02 M glisin, pH 8.7) ditambah dengan 0.1 ml sampel,
0.1 ml NAD, dan ADH 0.02 ml lalu diinkubasi pada suhu 25°C selama 70 menit. Setelah
inkubasi, adsorbansi diukur pada panjang gelombang 340 nm dengan blanko H2O.
Konsentrasi etanol dihitung dengan menggunakan rumus (Boehringer, 1989):
V x MW
Konsentrasi etanol (g/l)
= _________________x 340 (sampel!blanko) x fp
ε x d x v x 1000
Keterangan:
V
: volume total akhir (ml)
v
: volume sampel (ml)
MW : berat molekul etanol (g/l)
d
: diameter kuvet
ε
: koefisien serapan NADH pada 340 nm (6,31 mol!1cm!1)
fp
: factor pengenceran
Data dianalisis menggunakan ANOVA Satu arah yang dilanjutkan dengan uji Tukey.
Perhitungan dilakukan dengan menggunakan program SPSS versi 12.0.
Pengambilan nira kelapa dilakukan secara acak pada penyadap nira kelapa di 48 titik
lokasi yang tersebar di desa Gedangan, Ujung!Ujung, Krandon lor, Suruh, Plumbon,
Medayu, Bonomerto (Kabupaten Semarang) dan Desa Garangan, Bandung, Gosono, dan
Wonosegoro (Kabupaten Boyolali). Hasil isolasi khamir dari sampel!sampel tersebut
menghasilkan total 48 isolat dengan perincian dan kode nomor sebagai berikut: 10 isolat
dari Desa Gedangan (no. 1!10), 8 isolat dari Ujung!Ujung (no.11!18), 5 isolat dari Krandon
lor (no.19!23), 4 isolat dari Suruh (no.24!27), 2 isolat dari Plumbon (no.28!29), 4 isolat dari
Medayu (no.30!33), 2 isolat dari Bonomerto (no.34!35), 2 isolat dari Gosono (no.36!37), 4
isolat dari Bandung (no.38!41), 2 isolat dari Bedoyo (no.42!43), 2 isolat dari Wonosegoro
(no.44!45), dan 3 isolat dari Garangan (no. 46!48).
Uji toleransi terhadap etanol menunjukkan bahwa isolat dari Gedangan dan Ujung!
Ujung, yaitu no. 1, 5, dan 11, mempunyai toleransi tertinggi, yaitu mampu hidup pada
konsentrasi etanol 14.75% (Tabel 1). Berdasarkan kecepatan fermentasi, sebanyak 9 isolat
mampu melakukan fermentasi dalam waktu ≤24 jam dan menyebabkan perubahan warna
BCP menjadi kuning. Isolat!isolat tersebut yaitu no. 1!2, 4!5, 11, 19, 26, 42, dan 45. Di
antara 9 kultur tersebut, no. 42 mempunyai performa fermentasi terbaik, ditandai dengan
warna kuning yang lebih pekat dibandingkan isolat!isolat lain.
Berdasarkan hasil uji toleransi etanol dan kecepatan fermentasi, isolat no. 1, 5, dan
42 dipilih untuk eksperimen selanjutnya. Berdasarkan pengamatan, semua isolat
menunjukkan morfologi koloni berwarna putih dengan tepi rata dengan bentuk sel sub
globuse. Panjang sel isolat no. 1, 5 dan 42 berturut!turut yaitu 5!7.5, 5!6.25 dan 3.75!5 Fm.
!
%
Gedangan
10
Ujung!Ujung 8
Krandon Lor 5
Suruh
4
Plumbon
2
medayu
4
Bonomerto
2
Garangan
3
Bandung
4
Gosono
4
Wonosegoro 2
&
6
3
2
'%
5
2
1
1
2
1
2
1
(%
5
2
( )%
3
2
*
2
1
"#$
* '%
2
1
*%
2
1
* )%
2
1
Ketiga kultur tersebut menunjukkan respon berbeda dalam adaptasi berbagai
sumber karbon (Gambar 1). Isolat no.1 menunjukkan adaptasi terbaik terhadap glukosa,
sedangkan isolat lainnya pada fruktosa. Berdasarkan peningkatan biomassa, fruktosa dan
glukosa merupakan sumber karbon yang mendukung perkembangbiakan sel. Xilosa
merupakan karbon yang paling sulit diutilisasi oleh khamir. Isolat no. 5 tidak dapat tumbuh,
sedangkan isolat no. 1 dan 42 menunjukkan kecepatan tumbuh yang lambat. Dengan
demikian, glukosa dipilih sebagai sumber karbon dalam uji produktivitas etanol.
Parameter yang diamati pada uji produktivitas etanol yaitu kadar etanol, penggunaan
glukosa dan peningkatan biomassa.
digunakan sebagai control
dalam eksperimen tersebut. Gambar 2 menunjukkan bahwa hampir semua (99%) dari total
glukosa dapat dimanfaatkan oleh semua isolat khamir.
mampu
menggunakan glukosa secara cepat, ditandai dengan penurunan sebanyak 165.6 g/l
(82.8%) sampai hari ketiga. Pada hari ketiga, isolat no. 1, 5, dan 42 menggunakan glukosa
berturut!turut sebanyak 37.57%, 50.15%, dan 62.79% dari konsentrasi glukosa awal.
!
-
" $+
" $+ % " $+
".$+ /
*' " $
"0$+
,
" $+
" $
Dari segi pertumbuhan sel, isolat no.42 menunjukkan fase pertumbuhan yang
relative lebih cepat dibanding isolat lain. Sebagai akibatnya, fase kematian isolat ini lebih
cepat terdeteksi dibanding isolat lain, yaitu pada hari ke 12. Isolat no. 1 dan 5 serta
memasuki fase stationer mulai hari ke 6!12, namun mampu
bertahan sampai pada akhir eksperimen.
Produksi etanol baru tampak jelas setelah hari ke!6 untuk semua isolat. Kadar etanol
tertinggi dihasilkan oleh isolat no.42 pada hari ke!12, yaitu sebesar 82 g/l. Namun demikian,
kadar etanol ini menurun pada hari ke 15, sehingga hampir sama dengan kadar etanol isolat
lain, yaitu 75.3 g/l (isolat no.5), 66.8 g/l (isolat no.1) dan 68.3 g/l (
). Tingginya kadar etanol yang dihasilkan suatu isolat bukanlah jaminan bahwa
isolat tersebut unggul, karena tingkat konversi glukosa ke etanol (produktivitas etanol) juga
harus diperhitungkan. Berdasarkan tingkat konversi substrat, maka isolat no. 1 adalah yang
terunggul.
Hasil eksperimen di atas menunjukkan bahwa di antara 48 isolat yang berhasil
diisolasi dari sampel nira kelapa, isolat no. 42 unggul dalam hal adaptasi terhadap sumber
karbon dan mampu memproduksi etanol dalam jumlah besar. Namun dari segi efektivitas
produksi etanol, maka isolat no. 1 mempunyai produktivitas etanol yang paling tinggi.
'
"2
33&$
" $
!
" 1 $ " $+
% " $+ *' ".$+ "0$
" 1$" $
" $
Sampel nira aren diambil dari titik!titik lokasi yang tersebar di 11 desa di Kabupaten
Semarang. Sebanyak 45 isolat berhasil dimurnikan dari sampel nira tersebut yaitu sebagai
berikut: 4 isolat dari Desa Karangnongko (Kecamatan Tuntang) (no.49!52), 3 isolat dari
Desa Wonosari (no.53!55), 3 isolat dari Desa Tegaron (no.56!58), dan 9 isolat dari Desa
Kemambang (Kecamatan Banyubiru) (no.59!67), 4 isolat dari Desa Lanjan (no.68!71), 3
isolat dari Desa Jambe (no.72!74), 3 isolat dari Desa Candi Garon (no.75!77), 4 isolat dari
Desa Mitir (no.78!81), 3 isolat dari Desa Ngoho (no.82!84), 4 isolat dari Desa Trayu (no.85!
88), dan 5 isolat dari Desa Kebun Agung (Kecamatan Sumowono) (no.89!93). Dari total 45
isolat, 8 isolat yang berasal dari Desa Karangnongko, Kemambang, Kebun Agung dan
Lanjan mampu tumbuh pada medium yang mengandung konsentrasi etanol 14.75% (Tabel
2).
'
!
"#$
%
&
'%
(%
( )%
*
* '%
*%
* )%
Karangnongko 4
3
3
3
3
3
3
3
3
Kemambang
9
4
3
3
3
3
2
2
2
Tegaron
4
2
1
1
Wonosari
3
1
1
1
Kebun Agung
5
3
1
1
1
1
1
1
1
Mitir
4
4
1
1
1
1
1
Trayu
4
3
1
1
Candi Garon
3
2
2
2
Jambe
3
2
2
2
1
1
1
Lanjan
4
3
3
3
2
2
2
Ngoho
2
2
2
Selanjutnya dilakukan uji kecepatan fermentasi dengan menggunakan indicator BCP.
Jumlah isolat khamir yang mampu melakukan fermentasi dalam waktu ≤24 jam, 24!48, dan
≥48 jam yaitu berturut!turut sebanyak 13, 2, dan 27 isolat. Sebanyak 3 isolat (7%) tidak
dapat melakukan fermentasi. Berdasarkan hasil seleksi toleransi terhadap etanol dan
kecepatan fermentasi, maka dipilih 3 isolat terbaik untuk eksperimen selanjutnya yaitu isolat
no.50 (toleran terhadap 14.75% etanol dan mampu memfermentasi ≤24 jam), no.55 (toleran
terhadap 13.75% etanol dan mampu memfermentasi ≤24 jam) dan no.93 (toleran terhadap
14.75% etanol dan mampu memfermentasi ≤24 jam). Berdasarkan morfologi koloni dan sel,
koloni isolat no. 50, 55 dan 93 mempunyai penampakan putih dengan tepi halus dan
mempunyai sel berbentuk sub globuse dengan ukuran sebagai berikut : no.50 (2!4 x 5!10
Fm), no. 55 (2!4 x 4!9 Fm), dan no. 93 (2!8 x 7!10 Fm).
(
!
-
,
%& " $+ %% " $+
" $+
".$+ /
4( " $
"0$+
" $+
" $
Ketiga isolat tersebut ditumbuhkan pada medium YPD yang mengandung sumber
karbon berbeda!beda seperti pada isolat nira kelapa untuk mengetahui sumber karbon yang
cocok dalam produksi etanol. Gambar 3 menunjukkan bahwa masing!masing isolat
memberikan respon berbeda terhadap variasi sumber karbon. Sama halnya dengan isolat
yang diperoleh dari nira kelapa, isolat dari nira aren mampu beradaptasi dan menunjukkan
pertambahan sel secara cepat pada medium yang mengandung glukosa dan fruktosa. Nilai
pertumbuhan eksponensial (F) untuk medium xilosa, glukosa, fruktosa, maltosa, dan
sukrosa ditampilkan di Tabel 3. Berdasarkan lama fase adaptasi dan sudut kemiringan
kurva, isolat khamir dari nira aren memberikan respon pertumbuhan yang baik pada sumber
karbon glukosa, fruktosa dan xilosa, sedangkan pada disakarida maltosa dan sukrosa
responnya lebih lambat dibanding respon di sumber karbon monosakarida sederhana.
(
!
xilosa
glukosa
fruktosa
maltosa
sukrosa
%&
0.225
0.366
0.439
0.084
0.131
%%
0.305
0.209
0.226
0.071
0.091
4(
0.214
0.251
0.416
0.060
0.122
Selanjutnya, ketiga isolat khamir tersebut diuji produktivitas etanolnya pada sumber
karbon glukosa (Gambar 4). Seperti sebelumnya,
digunakan
sebagai kontrol. Seperti halnya isolat nira kelapa, produksi etanol baru mulai meningkat
setelah hari ke!6, sedangkan biomassa cenderung stationer. Pada akhir eksperimen (hari
ke!15), kadar etanol untuk
, isolat no. 50, 55, dan 93 berturut!
turut adalah 68.3, 87.35, 90.3, dan 71.4 g/l. Hampir semua substrat digunakan oleh tiap
isolat (≥99%). Menurut uji statistika, produksi etanol ketiga isolat khamir berbeda nyata dari
. Dengan demikian, isolat khamir lokal dari nira aren
menunjukkan potensi produksi etanol yang lebih tinggi dibanding strain khamir tradisional
yang telah banyak dikenal dan dimanfaatkan manusia.
5
*
"2
33&$ " $
" 1 $ " $+
" $+
!
" 1$" $
%& ".$+ %% "0$+ 4( " $
Nira lontar diambil dari beberapa daerah di Jawa dan Nusa Tenggara Timur. Total
isolat yang diperoleh dari nira lontar yaitu 31 isolat, dengan perincian sebagai berikut: 5
isolat dari NTT (no.94!98), 4 isolat dari Lasem (no.99!102), 4 isolat dari Pati (no.103!106), 5
isolat dari Pacitan (no.107!111), 6 isolat dari Gresik (no.112!117), dan 7 isolat dari Tuban
(no.118!124)
*
!
"#$
%
&
'%
(%
( )%
*
* '%
*%
* )%
Gresik
6
5
5
5
4
4
3
2
2
Kupang
5
5
3
1
1
1
1
1
1
Lasem
4
4
2
2
1
1
1
Paciran
5
2
2
2
2
2
2
2
1
Pati
4
4
4
4
4
3
3
3
3
Tuban
7
4
3
3
3
2
2
2
2
Uji toleransi etanol memberikan hasil bahwa isolat khamir dari nira lontar relative
lebih toleran etanol dibandingkan isolat khamir dari nira kelapa dan aren (Tabel 4).
Sebanyak 9 isolat khamir dari nira lontar mampu tumbuh pada konsentrasi etanol 14.75%.
Uji kemampuan dan kecepatan fermentasi juga memberikan hasil yang bagus, yaitu 30 dari
total 31 isolat mampu melakukan fermentasi, dengan sebaran sebagai berikut: 21 isolat
(68%) mampu melakukan fermentasi dalam waktu ≤24 jam, 6 isolat (19%) mampu
melakukan fermentasi dalam waktu 24!48 jam, dan 3 isolat (10%) melalukan fermentasi ≥48
jam.
Oleh karena jumlah isolat potensial yang besar, untuk eksperimen selanjutnya,
dilakukan seleksi isolat dengan cara menumbuhkan khamir yang dorman (setelah inkubasi
pada medium mengandung 15% etanol) pada medium normal (mengandung etanol 5%).
Isolat yang mampu tumbuh kembali setelah inkubasi pada etanol 15% adalah isolat no. 96,
104, 105, 107, dan 119. Dari lima isolat tersebut, isolat no. 96, 104 dan 119 yang
menunjukkan performa terbaik dipilih untuk uji selanjutnya. Dari segi morfologi, isolat khamir
dari nira lontar mempunyai karakteristik sama dengan isolat dari nira kelapa dan aren.
Koloni berwarna putih!krem dengan tepian rata, dan sel sub globuse dengan ukuran 3!5 x 2!
4 Fm.
%
,
!
-
" $+
4 " $+ &* " $+
".$+ /
43 " $
"0$+
" $+
" $
Ketiga isolat terplih lalu diuji kemampuannya menggunakan berbagai sumber karbon
(Gambar 5). Semua isolat mampu tumbuh dengan baik pada medium dengan sumber
karbon fruktosa, sukrosa, dan maltosa, walaupun inokulum yang digunakan pada medium
maltosa dan sukrosa berjumlah dua kali dibanding medium lain. Untuk medium glukosa,
fase adaptasi isolat cukup lama dan fase eksponensial nampaknya baru dimulai setelah jam
ke 15. Pertumbuhan isolat no. 96 jauh lebih pesat dibandingkan 2 isolat lain dan mencapai
fase stationer lebih cepat, sehingga pada akhir eksperimen (jam ke!30), konsentrasi sel
antar isolat hampir sama. Untuk medium dengan xilosa, isolat no. 96 nampak kurang
mampu memetabolisme xilosa dan mengalami kesulitan tumbuh, sehingga OD660 tertinggi
>),+>>,/
8
:
3 #!
'&
!
&
&
. 3
.
&
#!
((
! 1
1 &
!
&
: ! A .
?
( ! '
3
3:
" !
8 . /99- "
!
: '
!!
!
!
2
B
! !
3#!
(( !
&
1
/99) ?
3
,/6/-7
&
((
!
! '&
+.
!
!
"
$
% &
)*+,$
% &
)*+,"
//
#
'(
"
'(
!.
.
01
!
"
!
!
% &
23
4
!
33
!
"
#
$
$
#
&
'()'*
%
&
+
$
),
+
&
),.
). '*
,-*
#
+
,/
!
!
0
1
#
+
#
#
#
#
#
#
#
#
#
#
#
#
3
#
#
5
#
3
# 3
#
#
3
# /
#
&
#
#
3
# ,3
# #
&
#
#
1
&
#
#
#
4
# #
3 #
3
#
#
3
#
3
#
#
#
# #
#
+ # ( #
#
#
#
#
#
#
#
3
#
# #
# #
#
#
#
#
2
#
#
#
#
#
#
'()'*
#
,-*
#
#
(
# #
#
#
#
#
&
#
),
# ),.
). 6'*
#
#
7
(
#
#
#
#
#
#
#
0#
#
(
(
+
5
.
3
7
6
(
&
(
3
1
(
( (
(
3
.
3
3
(
5
(
(
(
(
! (
! ( 68 /99-7
(
1
(
(
3
+
+3
/9;,7
(
(
5
(
(
3
(
(
(
3
(
(
6 3
(
! ! 7
! (
(
3
3
(
(
(
$
(
5
(
(
(
(
(
(
(
5
(
5
( + (
3
(
( (
'
(
(
+
(
!
.
(
/)+/=< 6 !
+
5
6
(
+
(
+
(
(
!
6/99)7
(
5
(
(
(
&
(
3
(
(
*-->7
(
&
3
6:
(
;+/*<
(
(
(
(
(
(
*---7
(
(
(
(
(
(
(
3
3
(
(
3
(
(
(
(
5
(
(
+
3
(
(
&
(
(
Sampel diambil dari tiga (3) spesies
, yaitu kelapa, aren dan lontar. Sampel
diambil dua kali, pada pagi hari (07.00 – 09.00) dan sore hari (15.00 – 17.00). Sebanyak 0.2!
20 ml nira segar diambil secara aseptik dan disimpan dalam suhu 4°C sampai proses
selanjutnya. Lokasi pengambilan yaitu di :
• Nira kelapa: Kecamatan Tuntang, Pabelan, Suruh (Kabupaten Semarang) dan
Kecamatan Wonosegoro (Kabupaten Boyolali) sebanyak 48 sampel.
• Nira aren: Desa Karangnongko (Kecamatan Tuntang), Desa Wonosari, Karang
Bawang, dan Kemambang (Kecamatan Banyubiru), Desa Lanjan, Jambe, Trayu,
Candi Garon, Mitir, Ngoho dan Kebun Agung (Kecamatan Sumowono) di Kabupaten
Semarang sebanyak 45 sampel.
• Nira lontar: Kabupaten Pati, Lasem, Tuban, Gresik, Paciran dan Kupang sebanyak
31 sampel.
Khamir diisolasi menggunakan media YPD (1% Bacto yeast extract, 2% Bacto
pepton, 2% glukosa, pH 5) cair yang mengandung etanol 5%. Sebanyak 0.2 ml nira
diinokulasikan dan diinkubasi selama 24!48 jam pada suhu 30°C. Isolat dipisahkan dan
dimurnikan menggunakan medium agar YPD dengan prosedur mikrobiologi standar.
Pengamatan morfologi koloni dan sel dilakukan terhadap isolat murni.
Isolat ditumbuhkan secara aseptis pada 2 ml medium YPD cair mengandung etanol
dengan konsentrasi 10; 12.5; 13.5; 14; 14.25; 14.5; 14.75 dan 15% selama 24!48 jam pada
suhu 30°C.
Isolat ditumbuhkan secara aseptis pada medium YPD cair yang mengandung etanol
5% dan indicator BCP (
) 1.6% selama 24!72 jam pada suhu 30°C.
Kemampuan fermentasi ditandai dengan perubahan warna menjadi kuning dalam waktu ≤
24 jam.
Isolat ditumbuhkan secara aseptis pada medium YPD cair yang mengandung 2%
sumber karbon yang berbeda!beda, yaitu xilosa, fruktosa, glukosa, maltosa, dan sukrosa.
Kultur ditumbuhkan secara sistem
pada kecepatan 130 rpm pada suhu ruang sampai
mencapai fase stasioner (18!48 jam). Sampel kultur diambil secara periodik tiap 3!5 jam dan
diukur kandungan gulanya dengan metode DNSA (dijelaskan selanjutnya) dan biomassa sel
menggunakan spektofotometer pada panjang gelombang 660 nm.
Isolat ditumbuhkan secara aseptis pada medium YPD cair dengan sumber karbon
glukosa 20% secara anaerob fakultatif. Inkubasi dilakukan selama 12!15 hari pada
kecepatan 130 rpm di suhu ruang. Pengamatan konsentrasi etanol, biomassa dan glukosa
dilakukan 3 hari sekali.
Pengukuran kadar glukosa dilakukan sesuai James (1995). Secara ringkas,
pengukuran kadar glukosa dilakukan sebagai berikut: Sebanyak 0.5 ml supernatant dari
sampel ditambahkan 1 ml air dan 0.5 ml reagen DNS (1% asam 3,5!dinitrosalisilat, 30%
natrium kalium tartrat, 0.4 M NaOH) lalu dipanaskan dalam suhu 100°C selama 5 menit
dalam tabung tertutup untuk menghindari penguapan. Reagen DNS akan bereaksi spesifik
terhadap glukosa dan membentuk asam 3!amino!5!nitrosalisilat yang berwarna merah
kecoklatan. Sampel lalu ditambahkan air sampai 10 ml dan diukur adsorbansinya pada
panjang gelombang 540 nm. Konsentrasi glukosa diukur dengan membuat kurva standar
glukosa.
Kadar etanol diukur berdasarkan jumlah NADH yang terbentuk dari hasil oksidasi
etanol menjadi asetaldehid oleh enzim ADH (alcohol dehydrogenase) dalam suatu reaksi
yang membutuhkan NAD. Jumlah NADH yang terbentuk setara dengan banyaknya etanol ini
kemudian diukur dengan spektrofotometer pada panjang gelombang 340 nm. Prosedur kerja
yang dilakukan adalah sebagai berikut:
4.8 ml buffer (0.1 M Na4P2O7.10H2O, 0.02 M glisin, pH 8.7) ditambah dengan 0.1 ml sampel,
0.1 ml NAD, dan ADH 0.02 ml lalu diinkubasi pada suhu 25°C selama 70 menit. Setelah
inkubasi, adsorbansi diukur pada panjang gelombang 340 nm dengan blanko H2O.
Konsentrasi etanol dihitung dengan menggunakan rumus (Boehringer, 1989):
V x MW
Konsentrasi etanol (g/l)
= _________________x 340 (sampel!blanko) x fp
ε x d x v x 1000
Keterangan:
V
: volume total akhir (ml)
v
: volume sampel (ml)
MW : berat molekul etanol (g/l)
d
: diameter kuvet
ε
: koefisien serapan NADH pada 340 nm (6,31 mol!1cm!1)
fp
: factor pengenceran
Data dianalisis menggunakan ANOVA Satu arah yang dilanjutkan dengan uji Tukey.
Perhitungan dilakukan dengan menggunakan program SPSS versi 12.0.
Pengambilan nira kelapa dilakukan secara acak pada penyadap nira kelapa di 48 titik
lokasi yang tersebar di desa Gedangan, Ujung!Ujung, Krandon lor, Suruh, Plumbon,
Medayu, Bonomerto (Kabupaten Semarang) dan Desa Garangan, Bandung, Gosono, dan
Wonosegoro (Kabupaten Boyolali). Hasil isolasi khamir dari sampel!sampel tersebut
menghasilkan total 48 isolat dengan perincian dan kode nomor sebagai berikut: 10 isolat
dari Desa Gedangan (no. 1!10), 8 isolat dari Ujung!Ujung (no.11!18), 5 isolat dari Krandon
lor (no.19!23), 4 isolat dari Suruh (no.24!27), 2 isolat dari Plumbon (no.28!29), 4 isolat dari
Medayu (no.30!33), 2 isolat dari Bonomerto (no.34!35), 2 isolat dari Gosono (no.36!37), 4
isolat dari Bandung (no.38!41), 2 isolat dari Bedoyo (no.42!43), 2 isolat dari Wonosegoro
(no.44!45), dan 3 isolat dari Garangan (no. 46!48).
Uji toleransi terhadap etanol menunjukkan bahwa isolat dari Gedangan dan Ujung!
Ujung, yaitu no. 1, 5, dan 11, mempunyai toleransi tertinggi, yaitu mampu hidup pada
konsentrasi etanol 14.75% (Tabel 1). Berdasarkan kecepatan fermentasi, sebanyak 9 isolat
mampu melakukan fermentasi dalam waktu ≤24 jam dan menyebabkan perubahan warna
BCP menjadi kuning. Isolat!isolat tersebut yaitu no. 1!2, 4!5, 11, 19, 26, 42, dan 45. Di
antara 9 kultur tersebut, no. 42 mempunyai performa fermentasi terbaik, ditandai dengan
warna kuning yang lebih pekat dibandingkan isolat!isolat lain.
Berdasarkan hasil uji toleransi etanol dan kecepatan fermentasi, isolat no. 1, 5, dan
42 dipilih untuk eksperimen selanjutnya. Berdasarkan pengamatan, semua isolat
menunjukkan morfologi koloni berwarna putih dengan tepi rata dengan bentuk sel sub
globuse. Panjang sel isolat no. 1, 5 dan 42 berturut!turut yaitu 5!7.5, 5!6.25 dan 3.75!5 Fm.
!
%
Gedangan
10
Ujung!Ujung 8
Krandon Lor 5
Suruh
4
Plumbon
2
medayu
4
Bonomerto
2
Garangan
3
Bandung
4
Gosono
4
Wonosegoro 2
&
6
3
2
'%
5
2
1
1
2
1
2
1
(%
5
2
( )%
3
2
*
2
1
"#$
* '%
2
1
*%
2
1
* )%
2
1
Ketiga kultur tersebut menunjukkan respon berbeda dalam adaptasi berbagai
sumber karbon (Gambar 1). Isolat no.1 menunjukkan adaptasi terbaik terhadap glukosa,
sedangkan isolat lainnya pada fruktosa. Berdasarkan peningkatan biomassa, fruktosa dan
glukosa merupakan sumber karbon yang mendukung perkembangbiakan sel. Xilosa
merupakan karbon yang paling sulit diutilisasi oleh khamir. Isolat no. 5 tidak dapat tumbuh,
sedangkan isolat no. 1 dan 42 menunjukkan kecepatan tumbuh yang lambat. Dengan
demikian, glukosa dipilih sebagai sumber karbon dalam uji produktivitas etanol.
Parameter yang diamati pada uji produktivitas etanol yaitu kadar etanol, penggunaan
glukosa dan peningkatan biomassa.
digunakan sebagai control
dalam eksperimen tersebut. Gambar 2 menunjukkan bahwa hampir semua (99%) dari total
glukosa dapat dimanfaatkan oleh semua isolat khamir.
mampu
menggunakan glukosa secara cepat, ditandai dengan penurunan sebanyak 165.6 g/l
(82.8%) sampai hari ketiga. Pada hari ketiga, isolat no. 1, 5, dan 42 menggunakan glukosa
berturut!turut sebanyak 37.57%, 50.15%, dan 62.79% dari konsentrasi glukosa awal.
!
-
" $+
" $+ % " $+
".$+ /
*' " $
"0$+
,
" $+
" $
Dari segi pertumbuhan sel, isolat no.42 menunjukkan fase pertumbuhan yang
relative lebih cepat dibanding isolat lain. Sebagai akibatnya, fase kematian isolat ini lebih
cepat terdeteksi dibanding isolat lain, yaitu pada hari ke 12. Isolat no. 1 dan 5 serta
memasuki fase stationer mulai hari ke 6!12, namun mampu
bertahan sampai pada akhir eksperimen.
Produksi etanol baru tampak jelas setelah hari ke!6 untuk semua isolat. Kadar etanol
tertinggi dihasilkan oleh isolat no.42 pada hari ke!12, yaitu sebesar 82 g/l. Namun demikian,
kadar etanol ini menurun pada hari ke 15, sehingga hampir sama dengan kadar etanol isolat
lain, yaitu 75.3 g/l (isolat no.5), 66.8 g/l (isolat no.1) dan 68.3 g/l (
). Tingginya kadar etanol yang dihasilkan suatu isolat bukanlah jaminan bahwa
isolat tersebut unggul, karena tingkat konversi glukosa ke etanol (produktivitas etanol) juga
harus diperhitungkan. Berdasarkan tingkat konversi substrat, maka isolat no. 1 adalah yang
terunggul.
Hasil eksperimen di atas menunjukkan bahwa di antara 48 isolat yang berhasil
diisolasi dari sampel nira kelapa, isolat no. 42 unggul dalam hal adaptasi terhadap sumber
karbon dan mampu memproduksi etanol dalam jumlah besar. Namun dari segi efektivitas
produksi etanol, maka isolat no. 1 mempunyai produktivitas etanol yang paling tinggi.
'
"2
33&$
" $
!
" 1 $ " $+
% " $+ *' ".$+ "0$
" 1$" $
" $
Sampel nira aren diambil dari titik!titik lokasi yang tersebar di 11 desa di Kabupaten
Semarang. Sebanyak 45 isolat berhasil dimurnikan dari sampel nira tersebut yaitu sebagai
berikut: 4 isolat dari Desa Karangnongko (Kecamatan Tuntang) (no.49!52), 3 isolat dari
Desa Wonosari (no.53!55), 3 isolat dari Desa Tegaron (no.56!58), dan 9 isolat dari Desa
Kemambang (Kecamatan Banyubiru) (no.59!67), 4 isolat dari Desa Lanjan (no.68!71), 3
isolat dari Desa Jambe (no.72!74), 3 isolat dari Desa Candi Garon (no.75!77), 4 isolat dari
Desa Mitir (no.78!81), 3 isolat dari Desa Ngoho (no.82!84), 4 isolat dari Desa Trayu (no.85!
88), dan 5 isolat dari Desa Kebun Agung (Kecamatan Sumowono) (no.89!93). Dari total 45
isolat, 8 isolat yang berasal dari Desa Karangnongko, Kemambang, Kebun Agung dan
Lanjan mampu tumbuh pada medium yang mengandung konsentrasi etanol 14.75% (Tabel
2).
'
!
"#$
%
&
'%
(%
( )%
*
* '%
*%
* )%
Karangnongko 4
3
3
3
3
3
3
3
3
Kemambang
9
4
3
3
3
3
2
2
2
Tegaron
4
2
1
1
Wonosari
3
1
1
1
Kebun Agung
5
3
1
1
1
1
1
1
1
Mitir
4
4
1
1
1
1
1
Trayu
4
3
1
1
Candi Garon
3
2
2
2
Jambe
3
2
2
2
1
1
1
Lanjan
4
3
3
3
2
2
2
Ngoho
2
2
2
Selanjutnya dilakukan uji kecepatan fermentasi dengan menggunakan indicator BCP.
Jumlah isolat khamir yang mampu melakukan fermentasi dalam waktu ≤24 jam, 24!48, dan
≥48 jam yaitu berturut!turut sebanyak 13, 2, dan 27 isolat. Sebanyak 3 isolat (7%) tidak
dapat melakukan fermentasi. Berdasarkan hasil seleksi toleransi terhadap etanol dan
kecepatan fermentasi, maka dipilih 3 isolat terbaik untuk eksperimen selanjutnya yaitu isolat
no.50 (toleran terhadap 14.75% etanol dan mampu memfermentasi ≤24 jam), no.55 (toleran
terhadap 13.75% etanol dan mampu memfermentasi ≤24 jam) dan no.93 (toleran terhadap
14.75% etanol dan mampu memfermentasi ≤24 jam). Berdasarkan morfologi koloni dan sel,
koloni isolat no. 50, 55 dan 93 mempunyai penampakan putih dengan tepi halus dan
mempunyai sel berbentuk sub globuse dengan ukuran sebagai berikut : no.50 (2!4 x 5!10
Fm), no. 55 (2!4 x 4!9 Fm), dan no. 93 (2!8 x 7!10 Fm).
(
!
-
,
%& " $+ %% " $+
" $+
".$+ /
4( " $
"0$+
" $+
" $
Ketiga isolat tersebut ditumbuhkan pada medium YPD yang mengandung sumber
karbon berbeda!beda seperti pada isolat nira kelapa untuk mengetahui sumber karbon yang
cocok dalam produksi etanol. Gambar 3 menunjukkan bahwa masing!masing isolat
memberikan respon berbeda terhadap variasi sumber karbon. Sama halnya dengan isolat
yang diperoleh dari nira kelapa, isolat dari nira aren mampu beradaptasi dan menunjukkan
pertambahan sel secara cepat pada medium yang mengandung glukosa dan fruktosa. Nilai
pertumbuhan eksponensial (F) untuk medium xilosa, glukosa, fruktosa, maltosa, dan
sukrosa ditampilkan di Tabel 3. Berdasarkan lama fase adaptasi dan sudut kemiringan
kurva, isolat khamir dari nira aren memberikan respon pertumbuhan yang baik pada sumber
karbon glukosa, fruktosa dan xilosa, sedangkan pada disakarida maltosa dan sukrosa
responnya lebih lambat dibanding respon di sumber karbon monosakarida sederhana.
(
!
xilosa
glukosa
fruktosa
maltosa
sukrosa
%&
0.225
0.366
0.439
0.084
0.131
%%
0.305
0.209
0.226
0.071
0.091
4(
0.214
0.251
0.416
0.060
0.122
Selanjutnya, ketiga isolat khamir tersebut diuji produktivitas etanolnya pada sumber
karbon glukosa (Gambar 4). Seperti sebelumnya,
digunakan
sebagai kontrol. Seperti halnya isolat nira kelapa, produksi etanol baru mulai meningkat
setelah hari ke!6, sedangkan biomassa cenderung stationer. Pada akhir eksperimen (hari
ke!15), kadar etanol untuk
, isolat no. 50, 55, dan 93 berturut!
turut adalah 68.3, 87.35, 90.3, dan 71.4 g/l. Hampir semua substrat digunakan oleh tiap
isolat (≥99%). Menurut uji statistika, produksi etanol ketiga isolat khamir berbeda nyata dari
. Dengan demikian, isolat khamir lokal dari nira aren
menunjukkan potensi produksi etanol yang lebih tinggi dibanding strain khamir tradisional
yang telah banyak dikenal dan dimanfaatkan manusia.
5
*
"2
33&$ " $
" 1 $ " $+
" $+
!
" 1$" $
%& ".$+ %% "0$+ 4( " $
Nira lontar diambil dari beberapa daerah di Jawa dan Nusa Tenggara Timur. Total
isolat yang diperoleh dari nira lontar yaitu 31 isolat, dengan perincian sebagai berikut: 5
isolat dari NTT (no.94!98), 4 isolat dari Lasem (no.99!102), 4 isolat dari Pati (no.103!106), 5
isolat dari Pacitan (no.107!111), 6 isolat dari Gresik (no.112!117), dan 7 isolat dari Tuban
(no.118!124)
*
!
"#$
%
&
'%
(%
( )%
*
* '%
*%
* )%
Gresik
6
5
5
5
4
4
3
2
2
Kupang
5
5
3
1
1
1
1
1
1
Lasem
4
4
2
2
1
1
1
Paciran
5
2
2
2
2
2
2
2
1
Pati
4
4
4
4
4
3
3
3
3
Tuban
7
4
3
3
3
2
2
2
2
Uji toleransi etanol memberikan hasil bahwa isolat khamir dari nira lontar relative
lebih toleran etanol dibandingkan isolat khamir dari nira kelapa dan aren (Tabel 4).
Sebanyak 9 isolat khamir dari nira lontar mampu tumbuh pada konsentrasi etanol 14.75%.
Uji kemampuan dan kecepatan fermentasi juga memberikan hasil yang bagus, yaitu 30 dari
total 31 isolat mampu melakukan fermentasi, dengan sebaran sebagai berikut: 21 isolat
(68%) mampu melakukan fermentasi dalam waktu ≤24 jam, 6 isolat (19%) mampu
melakukan fermentasi dalam waktu 24!48 jam, dan 3 isolat (10%) melalukan fermentasi ≥48
jam.
Oleh karena jumlah isolat potensial yang besar, untuk eksperimen selanjutnya,
dilakukan seleksi isolat dengan cara menumbuhkan khamir yang dorman (setelah inkubasi
pada medium mengandung 15% etanol) pada medium normal (mengandung etanol 5%).
Isolat yang mampu tumbuh kembali setelah inkubasi pada etanol 15% adalah isolat no. 96,
104, 105, 107, dan 119. Dari lima isolat tersebut, isolat no. 96, 104 dan 119 yang
menunjukkan performa terbaik dipilih untuk uji selanjutnya. Dari segi morfologi, isolat khamir
dari nira lontar mempunyai karakteristik sama dengan isolat dari nira kelapa dan aren.
Koloni berwarna putih!krem dengan tepian rata, dan sel sub globuse dengan ukuran 3!5 x 2!
4 Fm.
%
,
!
-
" $+
4 " $+ &* " $+
".$+ /
43 " $
"0$+
" $+
" $
Ketiga isolat terplih lalu diuji kemampuannya menggunakan berbagai sumber karbon
(Gambar 5). Semua isolat mampu tumbuh dengan baik pada medium dengan sumber
karbon fruktosa, sukrosa, dan maltosa, walaupun inokulum yang digunakan pada medium
maltosa dan sukrosa berjumlah dua kali dibanding medium lain. Untuk medium glukosa,
fase adaptasi isolat cukup lama dan fase eksponensial nampaknya baru dimulai setelah jam
ke 15. Pertumbuhan isolat no. 96 jauh lebih pesat dibandingkan 2 isolat lain dan mencapai
fase stationer lebih cepat, sehingga pada akhir eksperimen (jam ke!30), konsentrasi sel
antar isolat hampir sama. Untuk medium dengan xilosa, isolat no. 96 nampak kurang
mampu memetabolisme xilosa dan mengalami kesulitan tumbuh, sehingga OD660 tertinggi
>),+>>,/
8
:
3 #!
'&
!
&
&
. 3
.
&
#!
((
! 1
1 &
!
&
: ! A .
?
( ! '
3
3:
" !
8 . /99- "
!
: '
!!
!
!
2
B
! !
3#!
(( !
&
1
/99) ?
3
,/6/-7
&
((
!
! '&
+.
!
!