Penggunaan Gen GH sebagai Marka Molekuler DNA Gurami, Osphronemus goramy dalam Pengembangan Teknologi Surrogate Broodstock | Achmad | Jurnal Perikanan Universitas Gadjah Mada 7 35 1 PB
157
Jurnal Perikanan (J. Fish. Sci.) XI (2): 157-160 ISSN: 0853-6384
Full Paper
PENGGUNAAN GEN GH SEBAGAI MARKA MOLEKULER DNA GURAMI,
Osphronemus goramy DALAM PENGEMBANGAN TEKNOLOGI SURROGATE BROODSTOCK
THE USE OF GH GENE AS DNA MOLECULAR MARKER OF GIANT GOURAMY,
Osphronemus goramy TOWARDS DEVELOPMENT OF SURROGATE BROODSTOCK
TECHNOLOGY
Marlina Achmad1, Alimuddin2*, Odang Carman2, Harton Arfah2 dan Muhammad Zairin2
1
Jurusan Perikanan, Fakultas Ilmu Kelautan dan Perikanan, Universitas Hasanuddin, Makassar, Sulawesi Selatan.
2
Departmen Budidaya Perairan, Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan, Institut Pertanian Bogor, Bogor 16680.
*Penulis untuk korespondensi, E-mail: alimuddin@ipb.ac.id; alimuddin_alsani@yahoo.com
Abstract
The technology of ish germ cell transplantation had been established to create broodstock systems by which
a target offspring can be produced from a surrogate parent. Donor cell for transplantation is derived from
transgenic ish carrying green luorescent protein gene as a marker to distinguish the donor from recipient
cell. In this study, an alternative technique was developed for identifying gouramy-derived donor cell and Nile
tilapia as recipient by PCR ampliication method using growth hormone (GH) gene as a molecular marker.
Speciic primer for GH gouramy was designed by using Genetyx version 7 software. β-actin gene was used
as an internal control of DNA loading. The result showed that a speciic PCR ampliication product of 340 in
length was obtained from DNA template of gouramy, while no PCR product from Nile tilapia. The minimum
concentration of genomic DNA of gouramy mixed with a 700 ng/µl of Nile tilapia that could be detected by
PCR was 1 ng/µl. Thus, PCR method with speciic GH primer may be useful to detect the incorporation of
donor cell in recipient gonad towards development of surrogate broodstock technology.
Key words: giant gouramy, GH, molecular marker, PCR, transplantation
Pengantar
Teknologi transplantasi sel germinal ikan telah
dikembangkan baru-baru ini untuk merekayasa
produksi benih ikan melalui induk “semang” atau
surrogate broodstock (Okutsu et al., 2006a). Teknologi
induk semang tersebut dilakukan dengan cara
mentransplantasikan sel germinal berupa primordial
germ cells (PGC) (Takeuchi et al., 2003) atau sel
spermatogonia (Okutsu et al., 2006b) ke dalam
rongga perut larva ikan resipien, selanjutnya sel donor
berdiferensiasi menjadi telur atau sperma. Pemijahan
antar ikan semang/resipien yang membawa sperma
dan telur yang berkembang dari sel donor, akan
menghasilkan ikan target (Okutsu et al., 2006a).
Keberhasilan teknologi ini telah ditunjukkan pada
ikan trout pelangi/rainbow trout (Oncorhynchus
mykiss) menggunakan induk semang salmon masu
(Oncorhynchus masou) (Takeuchi et al., 2004). Teknik
ini berpotensi digunakan untuk merekayasa produksi
benih ikan budidaya di Indonesia, khususnya ikan
yang matang gonad relatif lambat seperti gurami
(Osphronemus goramy).
Gurami merupakan salah satu jenis ikan air tawar yang
memiliki harga jual relatif tinggi dan pengembangan
usaha budidayanya telah menjadi salah satu fokus
revitalisasi perikanan budidaya 2009-2025 (Nurdjana,
2008). Waktu pencapaian matang gonad pertama kali
pada gurami cukup lama, yakni sekitar 2-4 tahun,
sehingga dibutuhkan waktu relatif panjang untuk
memproduksi induk gurami.
Aplikasi teknologi transplantasi sel germinal gurami
pada ikan semang yang cepat matang gonad
diduga dapat mengatasi keterlambatan gurami
matang gonad dan selanjutnya dapat mendukung
peningkatan produksi benih gurami secara signiikan
di masa mendatang.
Identiikasi sel donor dalam individu ikan resipien
umumnya dilakukan dengan cara mengamati
pendaran sel yang mengekspresikan gen GFP
(green luorescent protein) menggunakan mikroskop
fluoresens. Sel donor tersebut diperoleh dari
ikan transgenik (Yoshizaki et al., 2000). Saat ini,
gurami transgenik yang memiliki sel germinal
mengeksrepsikan gen GFP belum tersedia. Karena
waktu matang gonad gurami secara alamiah cukup
lama, maka waktu yang dibutuhkan untuk membuat
gurami transgenik juga panjang. Selain itu, metode
Copyright©2009. Jurnal Perikanan (Journal of Fisheries Sciences) All Right Reserved
Achmad et al., 2009
158
efektif untuk pembuatan gurami transgenik juga
belum diketahui. Ketersediaan mikroskop luoresens
yang masih terbatas di Indonesia juga menjadi
salah satu kendala penggunaan sel berpendar
sebagai donor. Oleh karena itu, pada penelitian ini
dikembangkan metode alternatif untuk identiikasi sel
donor menggunakan gurami bukan transgenik. Sistem
penanda sel germinal donor yang berasal dari ikan
bukan transgenik telah dikembangkan meggunakan
PKH26. Sel donor akan berpendar merah bila
terpapar dengan sinar UV, sehingga dapat dibedakan
dengan sel endogenus ikan resipien. PKH26 telah
digunakan dalam penelitian transplantasi sel testikular
ikan mulloway Argyrosomus hololepidotus pada ikan
nibe Jepang Nibea mitsukurii (Takeuchi et al., 2009).
Seperti halnya pada sel donor mengekspresikan
gen GFP, identiikasi sel donor yang ditandai dengan
PKH26 juga membutuhkan mikroskop luoresens.
Dengan demikian, penggunaan PKH26 juga belum
eisien diaplikasikan di Indonesia.
Pada penelitian ini dikembangkan metode alternatif
yang lebih aplikatif yang didukung oleh ketersediaan
fasilitas. Metode alternatif yang memungkinkan
diaplikasikan saat ini di Indonesia adalah marka
molekular DNA, yang dapat dideteksi dengan metode
PCR (Polymerase Chain Reaction) menggunakan
primer spesiik bagi ikan donor. Mesin PCR sudah
tersebar di seluruh Indonesia. Primer spesiik didisain
dari sekuen gen target ikan donor. Pada gurami,
sekuen gen yang tersedia adalah gen penyandi
hormon pertumbuhan (growth hormone, GH)
(Nugroho et al., 2008). Pada penelitian ini gen GH
tersebut dikembangkan sebagai marka molekular
pendeteksi DNA gurami yang dicampur dengan DNA
nila sebagai pendekatan dalam mendeteksi sel gonad
donor dalam individu resipien.
Bahan dan Metode
Disain Primer untuk Marka Molekular
Primer spesifik untuk GH dirancang dengan
menyejajarkan (alignment) sekuens GH gurami
(Nugroho et al., 2008) dan sekuens GH nila (no.
aksesi Bank Gen: M26916) (Gambar 1). Seperti
halnya pada GH, primer β-aktin juga dirancang dengan
menyejajarkan β-aktin gurami (Nugroho et al., 2009)
dan nila (no. aksesi Bank Gen: AY116536), tetapi primer
tersebut didisain sedemikian rupa sehingga mampu
anneal dengan sekuens β-aktin gurami dan nila.
Penyejajaran sekuens dilakukan menggunakan
program GENETYX versi 7, untuk memperoleh area
potensial sebagai primer forward dan reverse sebagai
marka molekular penanda sel gonad gurami. β-aktin
berfungsi sebagai kontrol internal loading DNA dalam
ampliikasi PCR. Sekuens nukleotida primer GH gurami
adalah F1GH (5’-TGTTCTCTGACGGCGTGGTT3’) dan R1GH (5’-GCAACAAAAAACCACCAGAAAGAG-3’). Primer forward untuk β-aktin adalah
aktin-F (5’-GTGCCCATCT-ACGAGGGTTA-3’),
sedangkan primer reverse adalah aktin-R (5’TTTGAT-GTCACGCACGATTT-3’).
Ekstraksi DNA Genom
DNA diekstraksi dari jaringan sirip menggunakan
kit isolasi DNA (Gentra, Minneapolis, USA) sesuai
dengan prosedur yang ada. Inkubasi untuk proses
lisis sel dilakukan pada suhu 55oC selama semalam.
RNase (4 mg/ml) sebanyak 1,5 µl ditambahkan ke
dalam mikrotub berisi sel yang telah terlisis dan
selanjutnya diinkubasi pada suhu 37oC selama 60
menit. Protein diendapkan menggunakan protein
precipitation solution 100 µl dan disentrifugasi pada
kecepatan 12.000 rpm selama 15 menit. Supernatan
dipindahkan ke dalam mikrotub yang berisikan
300 µl isopropanol, dan DNA diendapkan dengan
Gambar 1. Penyejajaran sekuens parsial gen GH gurami (Nugroho et al., 2008) dan nila (no. aksesi Bank Gen:
M26916), dan posisi sekuens primer spesiik GH gurami (garis panah).
Copyright©2009. Jurnal Perikanan (Journal of Fisheries Sciences) All Right Reserved
159
Jurnal Perikanan (J. Fish. Sci.) XI (2): 157-160 ISSN: 0853-6384
sentrifugasi pada kecepatan 12.000 rpm selama 10
menit. Supernatan dibuang dan selanjutnya pelet
DNA dicuci dengan etanol dingin 70% sebanyak 300
µl. Setelah dikeringudarakan, DNA dilarutkan dengan
30 µl ion exchange water.
Konsentrasi DNA genom hasil ekstraksi diukur
menggunakan spektrofotometer dengan mesin
DNA/RNA calculator (GenQuant, Amersham) pada
panjang gelombang λ260. Konsentrasi DNA genom
hasil ekstraksi dari gurami dan nila masing-masing
adalah 1424 dan 760 ng/µl.
Ampliikasi DNA dengan Polymerase Chain Reaction
(PCR)
Ampliikasi DNA hasil ekstraksi dilakukan menggunakan
PCR dengan primer spesifik GH gurami. Untuk
menguji sensitivitas PCR dalam mendeteksi DNA
gurami dan nila, dilakukan dengan cara membuat
campuran DNA gurami dan nila dengan rasio yang
berbeda yaitu 700:700; 600:700; 500:700; 400:700;
300:700; 200:700; 100:700; 50:700; 10:700; 1:700;
0,1: 700 ng/μL.
Total volume untuk reaksi PCR adalah 10 µl,
mengandung 1 µl 10x Ex Taq buffer; 1 µl dNTPs mix;
0,05 µL Ex Taq polimerase (Takara Bio, Shiga, Japan);
1 µl DNA cetakan; dan 1 µl masing-masing primer
forward dan reverse; sisanya adalah ion exchange
water. Program PCR untuk primer spesiik GH adalah
pre-denaturasi 94oC selama 3 menit; 35 siklus untuk
denaturasi 94oC selama 30 detik, annealing 58oC
selama 30 detik, ekstensi 72oC selama 1 menit; dan
ekstensi akhir 72oC selama 3 menit. Program PCR
untuk β-aktin adalah pre-denaturasi 94oC selama 3
menit; 35 siklus untuk denaturasi 94oC selama 30
detik, annealing 59oC selama 30 detik, ekstensi 72oC
selama 1 menit; dan ekstensi akhir 72oC selama
3 menit. Produk PCR diseparasi menggunakan
elektroforesis dengan gel agarosa 0,7%, dan
selanjutnya divisualisasi menggunakan sinar UV.
Hasil dan Pembahasan
Primer spesiik adalah primer yang dapat mengenali
sekuens berdasarkan cetakan DNA target, sementara
sekuens dengan cetakan DNA dari ikan yang lain tidak
dapat dikenali. Seperti ditunjukkan pada Gambar 2
(atas), produk PCR dengan cetakan DNA dari gurami
menghasilkan pita dengan panjang sekitar 340 bp,
sedangkan DNA dari nila tidak dapat diampliikasi.
Dengan demikian, primer spesiik GH tersebut dapat
menjadi marka molekular untuk membedakan ikan
donor dengan ikan resipien dan menjadi alternatif
marka molekular untuk mendeteksi sel germinal
gurami yang ditransplantasikan. Sebagai kontrol
internal loading DNA, primer β-aktin didisain untuk
bisa anneal pada gen β-aktin gurami dan nila.
Dengan menggunakan DNA yang sama pada proses
PCR menggunakan primer spesiik GH, ampliikasi
PCR menggunakan primer β-aktin semuanya
menghasilkan pita DNA dengan panjang sekitar 150
bp (Gambar 2).
Agar sel germinal yang berkoloni dalam gonad
individu resipien dapat dideteksi oleh penanda
(marka), maka perlu menentukan konsentrasi
pencampuran sel donor dan sel resipien. Sebagai
pendekatan terhadap pencampuran sel donor dan
resipien tersebut, pada penelitian ini dilakukan
pencampuran DNA hasil ekstraksi dari gurami dan
nila. Hasil pengujian sensitivitas PCR menunjukkan
bahwa konsentrasi pencampuran DNA gurami dan
nila yang paling rendah yang dapat dideteksi adalah
1:700 ng/μl (Gambar 3). Dengan kata lain, marka
molekuler GH mampu mendeteksi DNA gurami 1 ng/μl
dalam 700 ng/μl DNA nila. Selanjutnya, semakin kecil
rasio perbandingan konsentrasi pencampuran DNA,
maka semakin tipis fragmen DNA yang dihasilkan
(Gambar 3).
Gambar 2. Elektroforegram produk PCR dengan
primer
GH (atas) dan β-aktin (bawah). M = marka
Gambar
2 hal spesiik
159
panjang fragmen DNA (2-log ladder, BioLabs Inc., New England); N1-N3= DNA nila; G1-G4 = DNA
gurami.
Copyright©2009. Jurnal Perikanan (Journal of Fisheries Sciences) All Right Reserved
Achmad et al., 2009
160
Gambar 3. Elektroforegram produk PCR dengan
DNA campuran dari gurami dan nila. M= marker
Gambarcetakan
3 hal 160
panjang fragmen DNA (2-log ladder, BioLabs Inc., New England); angka 700 s/d 0,1= konsentrasi
DNA gurami yang dicampur dengan 700 ng/µl DNA nila; tanda minus (-) = produk PCR tanpa
cetakan DNA.
Kesimpulan
1. Marka GH spesifik dapat dijadikan sebagai
penanda untuk mengidentifikasi sel germinal
donor (gurami) di dalam gonad resipien (nila).
2. Konsentrasi minimum DNA gurami dalam 700 ng/μl
DNA nila yang dapat dideteksi adalah 1 ng/μl.
Ucapan Terima Kasih
Penelitian ini sebagian didanai dari Grant DIPA IPB
No. 50/13.24.4/SPK/BG-PSN/2009.
Daftar Pustaka
Nugroho, E., Alimuddin, A.H. Kristanto, O. Carman,
N. Megawati & K. Sumantadinata. 2008.
Kloning cDNA hormon pertumbuhan dari gurami
(Osphronemus gouramy). J. Ris. Akuakultur 3:
183-190.
Nugroho, E., Alimuddin, A.H. Kristanto & O. Carman.
2009. Kloning promoter β-aktin dari gurami
(Osphronemus gouramy). J. Ris. Akuakultur 4:
23-31.
Nurdjana, M.L. 2008. Roadmap mencapai industri
perikanan budidaya yang tangguh di tahun
2025. Forum pemantapan konsep rencana
pembangunan jangka panjang perikanan budidaya
2010-2025. Safari Garden Hotel, Bogor, 2-5
Desember 2008.
Okutsu, T., A. Yano, K. Nagasawa, S. Shikina, T.
Kobayashi, K. Takeuchi & G. Yoshizaki. 2006a.
Manipulation of fish germ cell: visualization,
cryopservation and tranplantation. J Reprod Dev
52:685.
Okutsu, T., K. Suzuki, Y. Takeuchi, T. Tekeuchi &
G. Yoshizaki. 2006b. Testicular germ cells can
colonize sexually undifferentiated embryonic
gonad and produce functional egg in ish. Proc
Natl Acad Sci. USA. 103: 2725-2729.
Takeuchi, Y., G. Yoshizaki & T. Takeuchi. 2003.
Generation of live fry from intraperitonally
transplanted primordial germ cells in rainbow
trout. Biology of Reproduction 6: 1142-1149.
Takeuchi, Y., G. Yoshizaki & T. Takeuchi. 2004.
Surrogate broodstock produces salmonids.
Nature. 430: 629-630.
Takeuchi, Y., K. Higuchi, T. Yatabe, M. Miwa & G.
Yoshizaki. 2009. Development of spermatogonial
cell transplantation in nibe croaker, Nibea
mitsukurii (Perciformes, Sciaenidae). Biology of
Reproduction. 81:1055-1063.
Yoshizaki, G., Y. Takeuchi, S. Sakatani & T. Takeuchi.
2000. Germ cell-specific expression of green
luorescent protein in transgenic rainbow trout
under control of the rainbow trout vasa-like gene
promoter. Int.J.Dev. Biol. 44: 323-326.
Copyright©2009. Jurnal Perikanan (Journal of Fisheries Sciences) All Right Reserved
Jurnal Perikanan (J. Fish. Sci.) XI (2): 157-160 ISSN: 0853-6384
Full Paper
PENGGUNAAN GEN GH SEBAGAI MARKA MOLEKULER DNA GURAMI,
Osphronemus goramy DALAM PENGEMBANGAN TEKNOLOGI SURROGATE BROODSTOCK
THE USE OF GH GENE AS DNA MOLECULAR MARKER OF GIANT GOURAMY,
Osphronemus goramy TOWARDS DEVELOPMENT OF SURROGATE BROODSTOCK
TECHNOLOGY
Marlina Achmad1, Alimuddin2*, Odang Carman2, Harton Arfah2 dan Muhammad Zairin2
1
Jurusan Perikanan, Fakultas Ilmu Kelautan dan Perikanan, Universitas Hasanuddin, Makassar, Sulawesi Selatan.
2
Departmen Budidaya Perairan, Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan, Institut Pertanian Bogor, Bogor 16680.
*Penulis untuk korespondensi, E-mail: alimuddin@ipb.ac.id; alimuddin_alsani@yahoo.com
Abstract
The technology of ish germ cell transplantation had been established to create broodstock systems by which
a target offspring can be produced from a surrogate parent. Donor cell for transplantation is derived from
transgenic ish carrying green luorescent protein gene as a marker to distinguish the donor from recipient
cell. In this study, an alternative technique was developed for identifying gouramy-derived donor cell and Nile
tilapia as recipient by PCR ampliication method using growth hormone (GH) gene as a molecular marker.
Speciic primer for GH gouramy was designed by using Genetyx version 7 software. β-actin gene was used
as an internal control of DNA loading. The result showed that a speciic PCR ampliication product of 340 in
length was obtained from DNA template of gouramy, while no PCR product from Nile tilapia. The minimum
concentration of genomic DNA of gouramy mixed with a 700 ng/µl of Nile tilapia that could be detected by
PCR was 1 ng/µl. Thus, PCR method with speciic GH primer may be useful to detect the incorporation of
donor cell in recipient gonad towards development of surrogate broodstock technology.
Key words: giant gouramy, GH, molecular marker, PCR, transplantation
Pengantar
Teknologi transplantasi sel germinal ikan telah
dikembangkan baru-baru ini untuk merekayasa
produksi benih ikan melalui induk “semang” atau
surrogate broodstock (Okutsu et al., 2006a). Teknologi
induk semang tersebut dilakukan dengan cara
mentransplantasikan sel germinal berupa primordial
germ cells (PGC) (Takeuchi et al., 2003) atau sel
spermatogonia (Okutsu et al., 2006b) ke dalam
rongga perut larva ikan resipien, selanjutnya sel donor
berdiferensiasi menjadi telur atau sperma. Pemijahan
antar ikan semang/resipien yang membawa sperma
dan telur yang berkembang dari sel donor, akan
menghasilkan ikan target (Okutsu et al., 2006a).
Keberhasilan teknologi ini telah ditunjukkan pada
ikan trout pelangi/rainbow trout (Oncorhynchus
mykiss) menggunakan induk semang salmon masu
(Oncorhynchus masou) (Takeuchi et al., 2004). Teknik
ini berpotensi digunakan untuk merekayasa produksi
benih ikan budidaya di Indonesia, khususnya ikan
yang matang gonad relatif lambat seperti gurami
(Osphronemus goramy).
Gurami merupakan salah satu jenis ikan air tawar yang
memiliki harga jual relatif tinggi dan pengembangan
usaha budidayanya telah menjadi salah satu fokus
revitalisasi perikanan budidaya 2009-2025 (Nurdjana,
2008). Waktu pencapaian matang gonad pertama kali
pada gurami cukup lama, yakni sekitar 2-4 tahun,
sehingga dibutuhkan waktu relatif panjang untuk
memproduksi induk gurami.
Aplikasi teknologi transplantasi sel germinal gurami
pada ikan semang yang cepat matang gonad
diduga dapat mengatasi keterlambatan gurami
matang gonad dan selanjutnya dapat mendukung
peningkatan produksi benih gurami secara signiikan
di masa mendatang.
Identiikasi sel donor dalam individu ikan resipien
umumnya dilakukan dengan cara mengamati
pendaran sel yang mengekspresikan gen GFP
(green luorescent protein) menggunakan mikroskop
fluoresens. Sel donor tersebut diperoleh dari
ikan transgenik (Yoshizaki et al., 2000). Saat ini,
gurami transgenik yang memiliki sel germinal
mengeksrepsikan gen GFP belum tersedia. Karena
waktu matang gonad gurami secara alamiah cukup
lama, maka waktu yang dibutuhkan untuk membuat
gurami transgenik juga panjang. Selain itu, metode
Copyright©2009. Jurnal Perikanan (Journal of Fisheries Sciences) All Right Reserved
Achmad et al., 2009
158
efektif untuk pembuatan gurami transgenik juga
belum diketahui. Ketersediaan mikroskop luoresens
yang masih terbatas di Indonesia juga menjadi
salah satu kendala penggunaan sel berpendar
sebagai donor. Oleh karena itu, pada penelitian ini
dikembangkan metode alternatif untuk identiikasi sel
donor menggunakan gurami bukan transgenik. Sistem
penanda sel germinal donor yang berasal dari ikan
bukan transgenik telah dikembangkan meggunakan
PKH26. Sel donor akan berpendar merah bila
terpapar dengan sinar UV, sehingga dapat dibedakan
dengan sel endogenus ikan resipien. PKH26 telah
digunakan dalam penelitian transplantasi sel testikular
ikan mulloway Argyrosomus hololepidotus pada ikan
nibe Jepang Nibea mitsukurii (Takeuchi et al., 2009).
Seperti halnya pada sel donor mengekspresikan
gen GFP, identiikasi sel donor yang ditandai dengan
PKH26 juga membutuhkan mikroskop luoresens.
Dengan demikian, penggunaan PKH26 juga belum
eisien diaplikasikan di Indonesia.
Pada penelitian ini dikembangkan metode alternatif
yang lebih aplikatif yang didukung oleh ketersediaan
fasilitas. Metode alternatif yang memungkinkan
diaplikasikan saat ini di Indonesia adalah marka
molekular DNA, yang dapat dideteksi dengan metode
PCR (Polymerase Chain Reaction) menggunakan
primer spesiik bagi ikan donor. Mesin PCR sudah
tersebar di seluruh Indonesia. Primer spesiik didisain
dari sekuen gen target ikan donor. Pada gurami,
sekuen gen yang tersedia adalah gen penyandi
hormon pertumbuhan (growth hormone, GH)
(Nugroho et al., 2008). Pada penelitian ini gen GH
tersebut dikembangkan sebagai marka molekular
pendeteksi DNA gurami yang dicampur dengan DNA
nila sebagai pendekatan dalam mendeteksi sel gonad
donor dalam individu resipien.
Bahan dan Metode
Disain Primer untuk Marka Molekular
Primer spesifik untuk GH dirancang dengan
menyejajarkan (alignment) sekuens GH gurami
(Nugroho et al., 2008) dan sekuens GH nila (no.
aksesi Bank Gen: M26916) (Gambar 1). Seperti
halnya pada GH, primer β-aktin juga dirancang dengan
menyejajarkan β-aktin gurami (Nugroho et al., 2009)
dan nila (no. aksesi Bank Gen: AY116536), tetapi primer
tersebut didisain sedemikian rupa sehingga mampu
anneal dengan sekuens β-aktin gurami dan nila.
Penyejajaran sekuens dilakukan menggunakan
program GENETYX versi 7, untuk memperoleh area
potensial sebagai primer forward dan reverse sebagai
marka molekular penanda sel gonad gurami. β-aktin
berfungsi sebagai kontrol internal loading DNA dalam
ampliikasi PCR. Sekuens nukleotida primer GH gurami
adalah F1GH (5’-TGTTCTCTGACGGCGTGGTT3’) dan R1GH (5’-GCAACAAAAAACCACCAGAAAGAG-3’). Primer forward untuk β-aktin adalah
aktin-F (5’-GTGCCCATCT-ACGAGGGTTA-3’),
sedangkan primer reverse adalah aktin-R (5’TTTGAT-GTCACGCACGATTT-3’).
Ekstraksi DNA Genom
DNA diekstraksi dari jaringan sirip menggunakan
kit isolasi DNA (Gentra, Minneapolis, USA) sesuai
dengan prosedur yang ada. Inkubasi untuk proses
lisis sel dilakukan pada suhu 55oC selama semalam.
RNase (4 mg/ml) sebanyak 1,5 µl ditambahkan ke
dalam mikrotub berisi sel yang telah terlisis dan
selanjutnya diinkubasi pada suhu 37oC selama 60
menit. Protein diendapkan menggunakan protein
precipitation solution 100 µl dan disentrifugasi pada
kecepatan 12.000 rpm selama 15 menit. Supernatan
dipindahkan ke dalam mikrotub yang berisikan
300 µl isopropanol, dan DNA diendapkan dengan
Gambar 1. Penyejajaran sekuens parsial gen GH gurami (Nugroho et al., 2008) dan nila (no. aksesi Bank Gen:
M26916), dan posisi sekuens primer spesiik GH gurami (garis panah).
Copyright©2009. Jurnal Perikanan (Journal of Fisheries Sciences) All Right Reserved
159
Jurnal Perikanan (J. Fish. Sci.) XI (2): 157-160 ISSN: 0853-6384
sentrifugasi pada kecepatan 12.000 rpm selama 10
menit. Supernatan dibuang dan selanjutnya pelet
DNA dicuci dengan etanol dingin 70% sebanyak 300
µl. Setelah dikeringudarakan, DNA dilarutkan dengan
30 µl ion exchange water.
Konsentrasi DNA genom hasil ekstraksi diukur
menggunakan spektrofotometer dengan mesin
DNA/RNA calculator (GenQuant, Amersham) pada
panjang gelombang λ260. Konsentrasi DNA genom
hasil ekstraksi dari gurami dan nila masing-masing
adalah 1424 dan 760 ng/µl.
Ampliikasi DNA dengan Polymerase Chain Reaction
(PCR)
Ampliikasi DNA hasil ekstraksi dilakukan menggunakan
PCR dengan primer spesifik GH gurami. Untuk
menguji sensitivitas PCR dalam mendeteksi DNA
gurami dan nila, dilakukan dengan cara membuat
campuran DNA gurami dan nila dengan rasio yang
berbeda yaitu 700:700; 600:700; 500:700; 400:700;
300:700; 200:700; 100:700; 50:700; 10:700; 1:700;
0,1: 700 ng/μL.
Total volume untuk reaksi PCR adalah 10 µl,
mengandung 1 µl 10x Ex Taq buffer; 1 µl dNTPs mix;
0,05 µL Ex Taq polimerase (Takara Bio, Shiga, Japan);
1 µl DNA cetakan; dan 1 µl masing-masing primer
forward dan reverse; sisanya adalah ion exchange
water. Program PCR untuk primer spesiik GH adalah
pre-denaturasi 94oC selama 3 menit; 35 siklus untuk
denaturasi 94oC selama 30 detik, annealing 58oC
selama 30 detik, ekstensi 72oC selama 1 menit; dan
ekstensi akhir 72oC selama 3 menit. Program PCR
untuk β-aktin adalah pre-denaturasi 94oC selama 3
menit; 35 siklus untuk denaturasi 94oC selama 30
detik, annealing 59oC selama 30 detik, ekstensi 72oC
selama 1 menit; dan ekstensi akhir 72oC selama
3 menit. Produk PCR diseparasi menggunakan
elektroforesis dengan gel agarosa 0,7%, dan
selanjutnya divisualisasi menggunakan sinar UV.
Hasil dan Pembahasan
Primer spesiik adalah primer yang dapat mengenali
sekuens berdasarkan cetakan DNA target, sementara
sekuens dengan cetakan DNA dari ikan yang lain tidak
dapat dikenali. Seperti ditunjukkan pada Gambar 2
(atas), produk PCR dengan cetakan DNA dari gurami
menghasilkan pita dengan panjang sekitar 340 bp,
sedangkan DNA dari nila tidak dapat diampliikasi.
Dengan demikian, primer spesiik GH tersebut dapat
menjadi marka molekular untuk membedakan ikan
donor dengan ikan resipien dan menjadi alternatif
marka molekular untuk mendeteksi sel germinal
gurami yang ditransplantasikan. Sebagai kontrol
internal loading DNA, primer β-aktin didisain untuk
bisa anneal pada gen β-aktin gurami dan nila.
Dengan menggunakan DNA yang sama pada proses
PCR menggunakan primer spesiik GH, ampliikasi
PCR menggunakan primer β-aktin semuanya
menghasilkan pita DNA dengan panjang sekitar 150
bp (Gambar 2).
Agar sel germinal yang berkoloni dalam gonad
individu resipien dapat dideteksi oleh penanda
(marka), maka perlu menentukan konsentrasi
pencampuran sel donor dan sel resipien. Sebagai
pendekatan terhadap pencampuran sel donor dan
resipien tersebut, pada penelitian ini dilakukan
pencampuran DNA hasil ekstraksi dari gurami dan
nila. Hasil pengujian sensitivitas PCR menunjukkan
bahwa konsentrasi pencampuran DNA gurami dan
nila yang paling rendah yang dapat dideteksi adalah
1:700 ng/μl (Gambar 3). Dengan kata lain, marka
molekuler GH mampu mendeteksi DNA gurami 1 ng/μl
dalam 700 ng/μl DNA nila. Selanjutnya, semakin kecil
rasio perbandingan konsentrasi pencampuran DNA,
maka semakin tipis fragmen DNA yang dihasilkan
(Gambar 3).
Gambar 2. Elektroforegram produk PCR dengan
primer
GH (atas) dan β-aktin (bawah). M = marka
Gambar
2 hal spesiik
159
panjang fragmen DNA (2-log ladder, BioLabs Inc., New England); N1-N3= DNA nila; G1-G4 = DNA
gurami.
Copyright©2009. Jurnal Perikanan (Journal of Fisheries Sciences) All Right Reserved
Achmad et al., 2009
160
Gambar 3. Elektroforegram produk PCR dengan
DNA campuran dari gurami dan nila. M= marker
Gambarcetakan
3 hal 160
panjang fragmen DNA (2-log ladder, BioLabs Inc., New England); angka 700 s/d 0,1= konsentrasi
DNA gurami yang dicampur dengan 700 ng/µl DNA nila; tanda minus (-) = produk PCR tanpa
cetakan DNA.
Kesimpulan
1. Marka GH spesifik dapat dijadikan sebagai
penanda untuk mengidentifikasi sel germinal
donor (gurami) di dalam gonad resipien (nila).
2. Konsentrasi minimum DNA gurami dalam 700 ng/μl
DNA nila yang dapat dideteksi adalah 1 ng/μl.
Ucapan Terima Kasih
Penelitian ini sebagian didanai dari Grant DIPA IPB
No. 50/13.24.4/SPK/BG-PSN/2009.
Daftar Pustaka
Nugroho, E., Alimuddin, A.H. Kristanto, O. Carman,
N. Megawati & K. Sumantadinata. 2008.
Kloning cDNA hormon pertumbuhan dari gurami
(Osphronemus gouramy). J. Ris. Akuakultur 3:
183-190.
Nugroho, E., Alimuddin, A.H. Kristanto & O. Carman.
2009. Kloning promoter β-aktin dari gurami
(Osphronemus gouramy). J. Ris. Akuakultur 4:
23-31.
Nurdjana, M.L. 2008. Roadmap mencapai industri
perikanan budidaya yang tangguh di tahun
2025. Forum pemantapan konsep rencana
pembangunan jangka panjang perikanan budidaya
2010-2025. Safari Garden Hotel, Bogor, 2-5
Desember 2008.
Okutsu, T., A. Yano, K. Nagasawa, S. Shikina, T.
Kobayashi, K. Takeuchi & G. Yoshizaki. 2006a.
Manipulation of fish germ cell: visualization,
cryopservation and tranplantation. J Reprod Dev
52:685.
Okutsu, T., K. Suzuki, Y. Takeuchi, T. Tekeuchi &
G. Yoshizaki. 2006b. Testicular germ cells can
colonize sexually undifferentiated embryonic
gonad and produce functional egg in ish. Proc
Natl Acad Sci. USA. 103: 2725-2729.
Takeuchi, Y., G. Yoshizaki & T. Takeuchi. 2003.
Generation of live fry from intraperitonally
transplanted primordial germ cells in rainbow
trout. Biology of Reproduction 6: 1142-1149.
Takeuchi, Y., G. Yoshizaki & T. Takeuchi. 2004.
Surrogate broodstock produces salmonids.
Nature. 430: 629-630.
Takeuchi, Y., K. Higuchi, T. Yatabe, M. Miwa & G.
Yoshizaki. 2009. Development of spermatogonial
cell transplantation in nibe croaker, Nibea
mitsukurii (Perciformes, Sciaenidae). Biology of
Reproduction. 81:1055-1063.
Yoshizaki, G., Y. Takeuchi, S. Sakatani & T. Takeuchi.
2000. Germ cell-specific expression of green
luorescent protein in transgenic rainbow trout
under control of the rainbow trout vasa-like gene
promoter. Int.J.Dev. Biol. 44: 323-326.
Copyright©2009. Jurnal Perikanan (Journal of Fisheries Sciences) All Right Reserved