B1J010155 10.
II. METODE PENELITIAN
A. Materi, Lokasi dan Waktu Penelitian
1. Materi Penelitian
a. Bahan
Bahan-bahan yang digunakan dalam penelitian tersebut adalah daun
Angsana (Pterocarpus indicus Willd.), HNO3 1 %, HNO3 pekat, H2O2, PbNO3 PPB
(Potassium Phosphate Buffer), guaiacol, polyvinylpyrrolidone, akuabides, aseton
80%, whatman 42, kertas saring dan akuades.
b. Alat
Alat yang digunakan adalah timbangan analitik, oven, pipet ukur, pipet
tetes, kuvet, Spektrofotometer Serapan Atom (SSA), Spektrofotometer UV Vis,
cawan porselen, muffle furnace, labu destruksi, gelas ukur, corong, botol film, labu
takar, centrifuge, saringan buchner, pisau, galah atau bambu, mortar, tabung
effendov, beaker glass, hand counter, kulkas, mikropipet, tip, tabung reaksi, rak
tabung, gunting, silet, kertas label, kamera, kantong plastik, tissue dan alat tulis.
2. Lokasi dan Waktu Penelitian
Pengambilan sampel daun Angsana dilakukan di empat lokasi dengan
tingkat kepadatan lalu lintas yang berbeda di Purwokerto Kabupaten Banyumas,
yaitu jalan H. R. Bunyamin, Ovis Isdiman, Dr. Soeharso dan Gerilya. Penelitian
dilaksanakan di Fakultas Biologi, Universitas Jenderal Soedirman. Pembuatan filtrat
daun untuk pengukuran kadar timbal di Laboratorium Ekotoksikologi. Pengukuran
kadar klorofil dan pengukuran aktivitas enzim peroksidase di Laboratorium
Genetika dan Laboratorium Lingkungan. Analisis kadar logam berat timbal daun
dilakukan di Laboratorium Wahana, Semarang. Penelitian dilakukan pada bulan
Oktober 2013- Februari 2014. Gambar lokasi dan objek penelitian disajikan di
Lampiran 9.
B. Metode Penelitian
1. Metode Penelitian
Metode penelitian yang digunakan adalah metode survai dengan teknik
purposive sampling. Pengambilan sampel daun diulang masing-masing jalan
sebanyak 6 kali. Variabel bebas dalam penelitian berupa kadar timbal pada daun,
5
sedangkan variabel terikat berupa kadar klorofil dan aktivitas enzim peroksidase
daun Angsana.
2. Cara Kerja
a. Pengambilan Sampel
Sampel daun yang diambil adalah tajuk paling bawah dari cabang dekat
batang utama, dan daun ketiga termuda dari ujung batang (Sembiring dan
Sulistyawati, 2006). Pengambilan sampel daun dilakukan dengan menggunakan
bantuan pisau, galah atau bambu dan benang kasur. Cara pengambilan sampel
adalah sebagai berikut :
(1). Pisau diikat dengan galah atau bambu menggunakan benang
kasur pada ketinggian dibatasi antara 1-2 m di atas
permukaan tanah;
(2).
Pengambilan
sampel dilakukan secara acak di beberapa
tanaman Angsana yang terdapat di lokasi pengambilan
sampel;
(3).
Daun
sampel
dibersihkan
dari
debu
dengan
cara
menyemprotkan air menggunakan spray dan dikeringkan
dengan tissue kemudian dimasukan ke dalam kantong pastik,
diberi label.
b. Perhitungan Kepadatan Lalu Lintas
Kepadatan lalu lintas dinyatakan dalam satuan kendaraan bermotor
per jam, dihitung dengan hand counter dalam jangka waktu selama satu
jam. Waktu pelaksanaan akan dilakukan pada pagi hari (pukul 06.30-10.00),
siang hari (pukul 11.00-14.30) dan sore hari (pukul 15.00-18.30). Lokasi
perhitungan kepadatan lalu lintas dilakukan di sekitar pengambilan sampel
daun Angsana. Data kepadatan kendaraan bermotor dimasukkan kedalam
tabel pada lampiran 1.
c. Pengukuran Konsentrasi Timbal Daun
(1). Pembuatan filtrat sampel daun (Herlich, 1991)
(a). Daun Angsana dikeringkan dengan cara dijemur selama 1 x 24
jam kemudian dikeringkan dalam oven hingga berat konstan.
(b). Daun Angsana di potong kecil-kecil dan diambil sebanyak 5 gr
lalu dipanaskan dalam muffle furnace pada suhu 6000C. Abu
6
daun ditambah dengan HNO3 pekat sebanyak 10 ml dan H2O2
sebanyak 5 ml.
(c). Larutan disaring dengan kertas saring Whatman No. 42 dan
dimasukkan ke dalam labu ukur 50 ml. Filtrat yang didapat
diencerkan hingga batas tera kemudian dibaca absorbansinya
dengan alat AAS.
(d). Data absorbansi dimasukkan ke dalam tabel pada lampiran 2.
(2). Analisis kandungan Logam berat (Herlich, 1991)
(a). Larutan blanko dibuat untuk menghindari kesalahan dalam
penghitungan kadar logam berat dalam sampel yang dianalisis.
(b). Larutan blanko dibuat dengan cara memperlakukan aquades
sama seperti pada sampel air.
(c). Larutan standar digunakan sebagai indikator untuk mengetahui
kandungan logam berat dari sampel yang dianalisis. Larutan
standar Pb dibuat dengan melarutkan 1,598 gr PbNO3
ditambah HNO3 1% sampai homogen, setelah homogen
ditambahkan aquades hingga 1000 ml.
(d). Kurva standar dibuat dalam tabung reaksi dengan konsentrasi
0,005; 0,01; 0,015 dan 0,02 mg/L. Tabung reaksi dikocok
sampai homogen. Adsorbansi larutan standar dengan AAS
nyala asetilen.
(e). Dibuat hubungan antara konsentrasi Pb (sebagai absis) dan nilai
adsorban (sebagai ordinat) dengan analisis regresi linier
sehingga didapatkan persamaan Y= a + bx.
(f). Analisis kandungan logam berat menggunakan seperangkat
alat AAS dengan tingkat kepekaan 0,003.
d. Pengukuran Kadar Klorofil
(1). Pembuatan ekstrak klorofil ( Arnon, 1949)
(a). Sampel helaian daun dengan berat 5 gr dipersiapkan dan
dibersihkan. Daun di potong kecil-kecil.
(b). Daun ditimbang menggunakan timbangan analitik dengan berat
1 gram.
7
(c). Daun dimasukkan dalam mortar dan ditambahkan 4 - 5 tetes
aseton 80% dimaserasi hingga halus dan berubah menjadi
ekstrak yang homogen.
(d). Ekstrak disaring dengan kertas saring ke dalam labu ukur
berukuran 100 ml. Kemudian ditambahkan dengan aseton 80 %
sehingga larutan menjadi 100 ml.
(2). Kalibrasi Transmitan
Pengukuran kadar klorofil, terlebih dahulu dilakukan kalibrasi
terhadap nilai transmitansinya. Nilai transmitan pelarutnya harus dibuat
atau
diatur 100%, sehingga nilai absorbansi yang dihasilkan saat
pengukuran semata-mata ditentukan oleh klorofil sebagai zat
terlarutnya (bukan oleh pelarut). Langkah-langkahnya :
(a). Spektrofotometer dihidupkan sebelum digunakan untuk
mengukur (20 menit) agar alatnya stabil.
(b). Pelarut aseton dituangkan ke dalam cuvet sampai garis batas
(c). Permukaan luar tabung cuvet dibersihkan dan dikeringkan
menggunakan tissue
(d). Panjang gelombang pengukuran pada spektrofotometer diatur.
(e). Cuvet dimasukkan ke spektrofotometer
(f). Nilai transmittan dibuat menjadi 100 %, dengan memutar
tombol pengatur sinarnya.
(3). Kadar klorofil (Arnon, 1949)
(a). Larutan klorofil dituangkan ke cuvet sampai garis batas
(b). Permukaan cuvet dibersihkan dengan tissue, dan dimasukkan
ke spektrofotometer.
(c). Nilai absorbansi dicatat untuk setiap panjang gelombangnya,
dengan pelarut aseton : 645 dan 663 nm.
(d). Kadar klorofil dihitung menggunakan rumus:
Klorofil a
= 12,7 D663 - 2,69 D645 (mg/ l)
Klorofil b
= 22,9 D645 - 4,68 D663(mg/ l)
Klorofil Total = 20,2 D645 + 8,02 D663 (mg/l)
Keterangan :
12,7; 2,69; 22,9; 4,68; 20,2; 8,02
D663, D645
= Konstanta
=Absorbansi pada panjang gelombang
663 nm dan 645 nm
8
(e). Data disajikan dalam lampiran 3.
e. Pengukuran aktivitas enzim peroksidase
(1). Pembuatan ekstrak enzim ( Janda et.al., 2003 )
(a). Beberapa helai daun dipersiapkan dan dibersihkan
(b). Daun ditimbang menggunakan timbangan analitik sebanyak 500
mg.
(c). Daun dihomogenkan dengan 5 ml PPB (Pottasium Phosphate
Buffer) yang mengandung polyvinylpyrrolidone 4 % pada pH 7
(d). Larutan di sentrifugasi pada 12.000 g pada suhu 40C selama 30
menit, sehingga dihasilkan natan dan supernatant.
(e). Supernatan digunakan sebagai ekstrak enzim
(2). Pengukuran aktivitas enzim peroksidase ( Janda et. al., 2003 )
(a). Disiapkan 3,5 ml phosphate buffer 50 mM yang mengandung 1
mM guaiacol dan 0,5 mM H2O2 pada tabung reaksi dengan pH
5,5
(b). Ditambahkan ekstrak enzim sebanyak 0,4 ml di homogenkan
menggunakan mikropipet kemudian di vorteks
(c). Diukur menggunakan spektrofotometer Uv vis pada panjang
gelombang 470 nm
(d). Diukur pada 0 detik dan 60 detik setelah didiamkan
(e). Aktivitas satu unit enzim peroksidase dapat dilihat dari
peningkatan absorbansi 0,01/ menit.
(f). Data aktivitas enzim peroksidase dimasukkan kedalam tabel pada
lampiran 4.
C. Metode Analisis
Data yang diperoleh berupa kadar timbal daun, kadar klorofil dan aktivitas enzim
peroksidase kemudian ditabulasi dan disajikan dalam bentuk diagram atau grafik. Data
dianalisis menggunakan anova taraf 5 % dan 1 %, analisis statistic. Analisis regresi linier
digunakan untuk mengetahui hubungan antar kadar timbal daun dengan respon kadar
klorofil dan aktivitas enzim peroksidase. Rumus regresi linier sederhana yaitu Y = a + bx .
Keterangan :Y = variabel tak bebas
a = konstanta
b = koefisien regresi
x = variabel bebas.
9
A. Materi, Lokasi dan Waktu Penelitian
1. Materi Penelitian
a. Bahan
Bahan-bahan yang digunakan dalam penelitian tersebut adalah daun
Angsana (Pterocarpus indicus Willd.), HNO3 1 %, HNO3 pekat, H2O2, PbNO3 PPB
(Potassium Phosphate Buffer), guaiacol, polyvinylpyrrolidone, akuabides, aseton
80%, whatman 42, kertas saring dan akuades.
b. Alat
Alat yang digunakan adalah timbangan analitik, oven, pipet ukur, pipet
tetes, kuvet, Spektrofotometer Serapan Atom (SSA), Spektrofotometer UV Vis,
cawan porselen, muffle furnace, labu destruksi, gelas ukur, corong, botol film, labu
takar, centrifuge, saringan buchner, pisau, galah atau bambu, mortar, tabung
effendov, beaker glass, hand counter, kulkas, mikropipet, tip, tabung reaksi, rak
tabung, gunting, silet, kertas label, kamera, kantong plastik, tissue dan alat tulis.
2. Lokasi dan Waktu Penelitian
Pengambilan sampel daun Angsana dilakukan di empat lokasi dengan
tingkat kepadatan lalu lintas yang berbeda di Purwokerto Kabupaten Banyumas,
yaitu jalan H. R. Bunyamin, Ovis Isdiman, Dr. Soeharso dan Gerilya. Penelitian
dilaksanakan di Fakultas Biologi, Universitas Jenderal Soedirman. Pembuatan filtrat
daun untuk pengukuran kadar timbal di Laboratorium Ekotoksikologi. Pengukuran
kadar klorofil dan pengukuran aktivitas enzim peroksidase di Laboratorium
Genetika dan Laboratorium Lingkungan. Analisis kadar logam berat timbal daun
dilakukan di Laboratorium Wahana, Semarang. Penelitian dilakukan pada bulan
Oktober 2013- Februari 2014. Gambar lokasi dan objek penelitian disajikan di
Lampiran 9.
B. Metode Penelitian
1. Metode Penelitian
Metode penelitian yang digunakan adalah metode survai dengan teknik
purposive sampling. Pengambilan sampel daun diulang masing-masing jalan
sebanyak 6 kali. Variabel bebas dalam penelitian berupa kadar timbal pada daun,
5
sedangkan variabel terikat berupa kadar klorofil dan aktivitas enzim peroksidase
daun Angsana.
2. Cara Kerja
a. Pengambilan Sampel
Sampel daun yang diambil adalah tajuk paling bawah dari cabang dekat
batang utama, dan daun ketiga termuda dari ujung batang (Sembiring dan
Sulistyawati, 2006). Pengambilan sampel daun dilakukan dengan menggunakan
bantuan pisau, galah atau bambu dan benang kasur. Cara pengambilan sampel
adalah sebagai berikut :
(1). Pisau diikat dengan galah atau bambu menggunakan benang
kasur pada ketinggian dibatasi antara 1-2 m di atas
permukaan tanah;
(2).
Pengambilan
sampel dilakukan secara acak di beberapa
tanaman Angsana yang terdapat di lokasi pengambilan
sampel;
(3).
Daun
sampel
dibersihkan
dari
debu
dengan
cara
menyemprotkan air menggunakan spray dan dikeringkan
dengan tissue kemudian dimasukan ke dalam kantong pastik,
diberi label.
b. Perhitungan Kepadatan Lalu Lintas
Kepadatan lalu lintas dinyatakan dalam satuan kendaraan bermotor
per jam, dihitung dengan hand counter dalam jangka waktu selama satu
jam. Waktu pelaksanaan akan dilakukan pada pagi hari (pukul 06.30-10.00),
siang hari (pukul 11.00-14.30) dan sore hari (pukul 15.00-18.30). Lokasi
perhitungan kepadatan lalu lintas dilakukan di sekitar pengambilan sampel
daun Angsana. Data kepadatan kendaraan bermotor dimasukkan kedalam
tabel pada lampiran 1.
c. Pengukuran Konsentrasi Timbal Daun
(1). Pembuatan filtrat sampel daun (Herlich, 1991)
(a). Daun Angsana dikeringkan dengan cara dijemur selama 1 x 24
jam kemudian dikeringkan dalam oven hingga berat konstan.
(b). Daun Angsana di potong kecil-kecil dan diambil sebanyak 5 gr
lalu dipanaskan dalam muffle furnace pada suhu 6000C. Abu
6
daun ditambah dengan HNO3 pekat sebanyak 10 ml dan H2O2
sebanyak 5 ml.
(c). Larutan disaring dengan kertas saring Whatman No. 42 dan
dimasukkan ke dalam labu ukur 50 ml. Filtrat yang didapat
diencerkan hingga batas tera kemudian dibaca absorbansinya
dengan alat AAS.
(d). Data absorbansi dimasukkan ke dalam tabel pada lampiran 2.
(2). Analisis kandungan Logam berat (Herlich, 1991)
(a). Larutan blanko dibuat untuk menghindari kesalahan dalam
penghitungan kadar logam berat dalam sampel yang dianalisis.
(b). Larutan blanko dibuat dengan cara memperlakukan aquades
sama seperti pada sampel air.
(c). Larutan standar digunakan sebagai indikator untuk mengetahui
kandungan logam berat dari sampel yang dianalisis. Larutan
standar Pb dibuat dengan melarutkan 1,598 gr PbNO3
ditambah HNO3 1% sampai homogen, setelah homogen
ditambahkan aquades hingga 1000 ml.
(d). Kurva standar dibuat dalam tabung reaksi dengan konsentrasi
0,005; 0,01; 0,015 dan 0,02 mg/L. Tabung reaksi dikocok
sampai homogen. Adsorbansi larutan standar dengan AAS
nyala asetilen.
(e). Dibuat hubungan antara konsentrasi Pb (sebagai absis) dan nilai
adsorban (sebagai ordinat) dengan analisis regresi linier
sehingga didapatkan persamaan Y= a + bx.
(f). Analisis kandungan logam berat menggunakan seperangkat
alat AAS dengan tingkat kepekaan 0,003.
d. Pengukuran Kadar Klorofil
(1). Pembuatan ekstrak klorofil ( Arnon, 1949)
(a). Sampel helaian daun dengan berat 5 gr dipersiapkan dan
dibersihkan. Daun di potong kecil-kecil.
(b). Daun ditimbang menggunakan timbangan analitik dengan berat
1 gram.
7
(c). Daun dimasukkan dalam mortar dan ditambahkan 4 - 5 tetes
aseton 80% dimaserasi hingga halus dan berubah menjadi
ekstrak yang homogen.
(d). Ekstrak disaring dengan kertas saring ke dalam labu ukur
berukuran 100 ml. Kemudian ditambahkan dengan aseton 80 %
sehingga larutan menjadi 100 ml.
(2). Kalibrasi Transmitan
Pengukuran kadar klorofil, terlebih dahulu dilakukan kalibrasi
terhadap nilai transmitansinya. Nilai transmitan pelarutnya harus dibuat
atau
diatur 100%, sehingga nilai absorbansi yang dihasilkan saat
pengukuran semata-mata ditentukan oleh klorofil sebagai zat
terlarutnya (bukan oleh pelarut). Langkah-langkahnya :
(a). Spektrofotometer dihidupkan sebelum digunakan untuk
mengukur (20 menit) agar alatnya stabil.
(b). Pelarut aseton dituangkan ke dalam cuvet sampai garis batas
(c). Permukaan luar tabung cuvet dibersihkan dan dikeringkan
menggunakan tissue
(d). Panjang gelombang pengukuran pada spektrofotometer diatur.
(e). Cuvet dimasukkan ke spektrofotometer
(f). Nilai transmittan dibuat menjadi 100 %, dengan memutar
tombol pengatur sinarnya.
(3). Kadar klorofil (Arnon, 1949)
(a). Larutan klorofil dituangkan ke cuvet sampai garis batas
(b). Permukaan cuvet dibersihkan dengan tissue, dan dimasukkan
ke spektrofotometer.
(c). Nilai absorbansi dicatat untuk setiap panjang gelombangnya,
dengan pelarut aseton : 645 dan 663 nm.
(d). Kadar klorofil dihitung menggunakan rumus:
Klorofil a
= 12,7 D663 - 2,69 D645 (mg/ l)
Klorofil b
= 22,9 D645 - 4,68 D663(mg/ l)
Klorofil Total = 20,2 D645 + 8,02 D663 (mg/l)
Keterangan :
12,7; 2,69; 22,9; 4,68; 20,2; 8,02
D663, D645
= Konstanta
=Absorbansi pada panjang gelombang
663 nm dan 645 nm
8
(e). Data disajikan dalam lampiran 3.
e. Pengukuran aktivitas enzim peroksidase
(1). Pembuatan ekstrak enzim ( Janda et.al., 2003 )
(a). Beberapa helai daun dipersiapkan dan dibersihkan
(b). Daun ditimbang menggunakan timbangan analitik sebanyak 500
mg.
(c). Daun dihomogenkan dengan 5 ml PPB (Pottasium Phosphate
Buffer) yang mengandung polyvinylpyrrolidone 4 % pada pH 7
(d). Larutan di sentrifugasi pada 12.000 g pada suhu 40C selama 30
menit, sehingga dihasilkan natan dan supernatant.
(e). Supernatan digunakan sebagai ekstrak enzim
(2). Pengukuran aktivitas enzim peroksidase ( Janda et. al., 2003 )
(a). Disiapkan 3,5 ml phosphate buffer 50 mM yang mengandung 1
mM guaiacol dan 0,5 mM H2O2 pada tabung reaksi dengan pH
5,5
(b). Ditambahkan ekstrak enzim sebanyak 0,4 ml di homogenkan
menggunakan mikropipet kemudian di vorteks
(c). Diukur menggunakan spektrofotometer Uv vis pada panjang
gelombang 470 nm
(d). Diukur pada 0 detik dan 60 detik setelah didiamkan
(e). Aktivitas satu unit enzim peroksidase dapat dilihat dari
peningkatan absorbansi 0,01/ menit.
(f). Data aktivitas enzim peroksidase dimasukkan kedalam tabel pada
lampiran 4.
C. Metode Analisis
Data yang diperoleh berupa kadar timbal daun, kadar klorofil dan aktivitas enzim
peroksidase kemudian ditabulasi dan disajikan dalam bentuk diagram atau grafik. Data
dianalisis menggunakan anova taraf 5 % dan 1 %, analisis statistic. Analisis regresi linier
digunakan untuk mengetahui hubungan antar kadar timbal daun dengan respon kadar
klorofil dan aktivitas enzim peroksidase. Rumus regresi linier sederhana yaitu Y = a + bx .
Keterangan :Y = variabel tak bebas
a = konstanta
b = koefisien regresi
x = variabel bebas.
9