Pengaruh pemberian ekstrak etanolik daun mimba [Azadirachta indica A.Juss] terhadap peningkatan kadar antibodi darah pada tikus putih jantan galur wistar - USD Repository

  

PENGARUH PEMBERIAN EKSTRAK ETANOLIK DAUN MIMBA

(Azadirachta indica A. Juss) TERHADAP PENINGKATAN KADAR

ANTIBODI DARAH PADA TIKUS PUTIH JANTAN GALUR WISTAR

SKRIPSI

  Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S. Farm)

  Program Studi Ilmu Farmasi Oleh :

  Maria Amarylis Illona Muda NIM : 058114083

  

FAKULTAS FARMASI

UNIVERSITAS SANATA DHARMA

YOGYAKARTA

2009

  

PENGARUH PEMBERIAN EKSTRAK ETANOLIK DAUN MIMBA

(Azadirachta indica A. Juss) TERHADAP PENINGKATAN KADAR

ANTIBODI DARAH PADA TIKUS PUTIH JANTAN GALUR WISTAR

SKRIPSI

  Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S. Farm)

  Program Studi Ilmu Farmasi Oleh :

  Maria Amarylis Illona Muda NIM : 058114083

  

FAKULTAS FARMASI

UNIVERSITAS SANATA DHARMA

YOGYAKARTA

2009

  

Berusahalah dahulu hingga kau pantas

menjadi pemberi, dan sebuah alat

untuk membagi.

Sebab sesungguhnya, kehidupanlah

yang memberi pada kehidupan.

  (Kahlil Gibran) Karya ini kupersembahkan untuk Tuhan Yesus yang selalu menjadi jalan hidupku Mama, Papa, Lora Almamaterku

  

PRAKATA

  Puji dan syukur kepada Tuhan Yang Maha Esa atas segala kasih dan berkat-Nya sehingga penulis dapat menyelesaikan skripsi dengan judul “Pengaruh Pemberian Ekstrak Etanolik Daun Mimba (Azadirachta indica A. Juss) terhadap Peningkatan Kadar Antibodi Darah pada Tikus Jantan Galur Wistar”. Skripsi ini dibuat untuk memenuhi salah satu syarat memperoleh gelar Sarjana Farmasi (S.Farm.) pada Program Studi Farmasi di Universitas Sanata Dharma Yogyakarta.

  Penulisan skripsi ini tidak mungkin selesai tanpa adanya dukungan dari berbagai pihak. Pada kesempatan ini penulis ingin menyampaikan ucapan terimakasih kepada:

  1. Drs. A. Yuswanto, S.U., Ph.D., Apt selaku dosen pembimbing, yang telah memberikan inspirasi kepada penulis serta selalu memberikan semangat, dukungan, bimbingan, dan saran selama penyusunan skripsi.

  2. Rm. Sunu Hardiyanta, M.Sc., S.J., selaku dosen penguji yang telah berkenan menguji dan banyak memberikan masukan dan pengetahuan yang berkaitan dengan skripsi ini, terutama dalam analisis statistik. 3. dr. Fenty, M.Kes., Sp.P.K., selaku dosen penguji yang telah berkenan menguji dan memberikan masukan dan saran.

  4. Rita Suhadi, M.Si., Apt., selaku dekan fakultas farmasi Universitas Sanata Dharma.

  5. Mas Heru, Mas Kayat, Mas Parjiman, Mas Wagiran, Mas Andri, Mas Yuwono, segenap dosen dan karyawan di Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma yang telah memberikan bimbingan dan bantuan.

  6. Mbak Yuli, Pak Yudhi, Bu Arsi, segenap karyawan LPPT dan PAU UGM yang telah banyak membantu dan menemani selama penelitian skripsi ini.

  7. Papa, Mama, dan Lora, yang menjadi pelita dan motivasi bagi penulis.

  Untuk setiap doa dan kasih sayang yang tak tertandingi.

  8. Anna, Rias, Ika, Yesika, atas kerjasama, diskusi, senyum, tawa, dan keluh kesah selama penelitian dan penyusunan skripsi.

  9. Tami, Nolen, Sekar, Lina Boy, Paulina, Siska, Jovan, teman-teman 2005 FST dan FKK atas persahabatan, dukungan, masukan, dan kebersamaan selama ini.

  10. Tim penelitian Steviosida (Retha, Tyas, Diana, Nia, Ferry) atas keceriaan yang telah dibagikan.

  11. Komunitas pendamping PIA Maguwo atas persahabatan dan keriangan yang selalu menyegarkan.

  12. Semua pihak yang telah memberikan dukungan dalam penyusunan skripsi ini yang tidak dapat disebutkan satu persatu.

  Penulis menyadari bahwa dalam skripsi ini masih banyak terdapat kekurangan dan kesalahan. Oleh karenanya penulis mengharapkan kritik dan saran atas skripsi ini. Penulis berharap tulisan ini dapat berguna bagi kepentingan ilmu kefarmasian.

  Penulis

PERNYATAAN KEASLIAN KARYA

  Saya menyatakan dengan sesungguhnya bahwa skripsi yang saya tulis ini tidak memuat karya atau bagian karya orang lain, kecuali yang telah disebutkan dalam kutipan dan daftar pustaka, sebagaimana layaknya karya ilmiah.

  Yogyakarta, 20 Januari 2009 Penulis

  Maria Amarylis Illona Muda

  

INTISARI

  Sistem imun merupakan sistem pertahanan yang melindungi tubuh dari suatu penyakit. Tanaman mimba merupakan tumbuhan obat tradisional yang dapat digunakan sebagai obat alternatif untuk menyembuhkan berbagai penyakit. Berbagai penelitian yang telah dilakukan menyatakan bahwa ekstrak air daun dan batang mimba memiliki aktivitas imunostimulan. Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui pengaruh pemberian ekstrak etanol daun mimba terhadap peningkatan kadar antibodi dan berapa besar persentase peningkatan kadar antibodi.

  Penelitian ini bersifat eksperimental murni dengan rancangan acak lengkap pola searah. Tikus jantan galur Wistar diberi perlakuan ekstrak etanolik daun mimba dan diinduksi dengan antigen vaksin Hepatitis B. Uji peningkatan kadar antibodi dilakukan dengan metode ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent

  Assay ). Data hasil uji dianalisis secara statistik menggunakan uji Kruskal Wallis.

  Hasil penelitian menunjukkan bahwa ekstrak etanolik daun mimba dengan dosis 35;70;140 mg/kg BB tidak memberikan efek imunostimulan dengan meningkatkan kadar antibodi darah.

  Kata kunci: peningkatan kadar antibodi, tikus jantan, ekstrak etanolik, daun mimba

  

ABSTRACT

  Immune System protects the body from many diseases. Neem plant is one of traditional herbal drug that can be used as alternative medicine for healing many diseases. Various researches had been done previously showed that water extract of neem’s leaf and bark had the immunostimulant activity. The purposes of this research are to know the effect of ethanolic extract of neem’s leaf on the increase of antibody concentration and to determine the percentage of the increase of antibody concentration.

  This research is a pure experimental research with the one way pattern complete random design. Male Wistar rats were given ethanolic extract of neem’s leaf and induced by Hepatitis B vaccine. Increase of antibody concentration was measured by using ELISA method (Enzyme Linked Immunosorbent Assay). The result was statistically analyzed by using Kruskal-Wallis test.

  The result indicates that ethanolic extract of neem’s leaf at the dose of 35;70;140 mg/kgBB does not show immunostimulant activity to the increase of antibody concentration.

  Key words: increase of antibody concentration, male rat, ethanolic extract, neem’s leaf

  DAFTAR ISI

  Halaman HALAMAN JUDUL…………………………………………………. ii HALAMAN PERSETUJUAN PEMBIMBING……………………… iii HALAMAN PENGESAHAN……………………………………….... iv HALAMAN PERSEMBAHAN……………………………………… v LEMBAR PERNYATAAN PERSETUJUAN PUBLIKASI vi PRAKATA……………………………………………………...…….. vii PERNYATAAN KEASLIAN KARYA……………………………… ix

  INTISARI………………………………………………………..…… x

  ABSTRACT ………………………………………………...………….. xi

  DAFTAR ISI…………………………………………………...……... xii DAFTAR TABEL…………………………………………………...... xv DAFTAR GAMBAR…………………………………………………. xvi DAFTAR LAMPIRAN……………………………………………….. xvii

  BAB I PENGANTAR…………………………………………………

  1 A. Latar Belakang……...…………………………………………...

  1 1. Rumusan masalah……..………………………………….

  2 2. Keaslian penelitian………...……………………………...

  2

  3. Manfaat penelitian…………...……………………………

  3 B. Tujuan Penelitian……………………...………………………...

  3

  1. Tujuan umum……………………..………………………

  3 2. Tujuan khusus……………………..……………………...

  4

  BAB II PENELAAHAN PUSTAKA…………………………………

  5 A. Azadirachta indica A. Juss………………………………….......

  5 B.

  7 Sistem Imun……………………………………………………..

  C. Imunomodulator………………………………………………... 8

  D. Antibodi……………………………………………………….... 9

  E. Antigen…………………………………………………………. 11 1. Vaksin Hepatitis B………………………………………..

  12

  2. Hepavax-Gene®………………………………………….. 12

  F. Ekstraksi………………………………………………..………. 13 G. Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA)……………......

  14 1. ELISA langsung…………………………………………..

  15

  2. ELISA tak langsung………………………………………

  15 3. ELISA penangkap antigen atau ELISA sandwich………..

  16 4. ELISA penangkap antibodi……………………………….

  16 5. ELISA kompetitif atau ELISA pemblok………………….

  16 H. Kerangka Pemikiran…………………………………………….

  17 I. Hipotesis………………………………………………..………. 18 BAB III METODOLOGI PENELITIAN……………………………..

  19 A. Jenis dan Rancangan Penelitian…………………………………

  19 B. Variabel Penelitian dan Definisi Operasional……………..……

  19

  1. Variabel penelitian……………………………………..…

  19

  2. Definisi operasional………………………………………

  20 C. Alat dan Bahan Penelitian………………………………………

  20 1. Alat penelitian…………………………………………….

  23

  B. Saran……………………………………………………………. 34 DAFTAR PUSTAKA…………………………………………………

  34 A. Kesimpulan……………………………………………………... 34

  29 BAB V KESIMPULAN DAN SARAN……………………………….

  26 D. Hasil Pengamatan Titer Antibodi……………………………….

  26 C. Hasil Perlakuan terhadap Hewan Uji……………………………

  25 B. Hasil Ekstraksi…………………………………………………..

  25 A. Pengumpulan Daun Mimba dan Pembuatan Simplisia…………

  24 BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN……………………………...

  23 E. Analisis Hasil……………………………………………………

  7. Metode ELISA……………………………………………

  6. Perlakuan hewan percobaan………………………………

  20 2. Bahan penelitian…………………………………………..

  22

  5. Pembuatan ekstrak etanolik daun mimba…………………

  22

  22 4. Pembuatan serbuk daun mimba…………………………..

  3. Pengeringan daun mimba…………………………………

  22

  21 2. Pengumpulan daun mimba………………………………..

  1. Determinasi tumbuhan……………………………………

  21

  20 D. Tatacara Penelitian……………………………………………...

  36 LAMPIRAN………………………………………………………….. 39 BIOGRAFI PENULIS………………………………………………... 53

  DAFTAR TABEL

  Halaman Tabel I. Data Rata-rata Absorbansi Titer Antibodi Setelah

  32 Perlakuan……………………………………………… Tabel II. Profil Berat Badan Tikus Hasil Rata-rata Mingguan

  42 Selama Masa Perlakuan………………………………..

  Tabel III. Hasil Uji Peningkatan Titer Antibodi secara ELISA…..

  43

  

DAFTAR GAMBAR

  Halaman Gambar 1. Pengenalan Antigen dan Respon Imun Tubuh………...

  8 Gambar 2. Profil Rata-rata Berat Badan Tikus Setiap Minggu Selama Masa Perlakuan………………………………..

  28 Gambar 3. Foto histologi hepar…………………………………....

  29 Gambar 4. Skema ikatan yang terjadi dalam plat ELISA…………

  31 Gambar 5. Reaksi substrat NPP dengan enzim alkalin fosfatase….

  31 Gambar 6. Grafik Rata-rata Absorbansi Kelompok Kontrol dan Perlakuan………………………………………………

  32

  DAFTAR LAMPIRAN

  Halaman Lampiran 1. Perhitungan Dosis………………………………….....

  40 Lampiran 2. Rata-rata Berat Badan Tikus per Minggu…………….

  42 Lampiran 3. Data Absorbansi Peningkatan Titer Antibodi………...

  43 Lampiran 4. Hasil Analisis Statistik Deskriptif……………………

  43 Lampiran 5. Uji Normalitas Data dengan Uji Shapiro-Wilk dan Uji Homogenitas Data………………………………..

  45 Lampiran 6. Hasil Uji Kruskal-Wallis……...……………………...

  46 Lampiran 7. Uji Kruskal-Wallis untuk Kelompok yang Mendapat Perlakuan Daun Mimba………………………………

  47 Lampiran 8. Tanaman Mimba (Azadirachta indica A.Juss)……….

  48 Lampiran 9. Daun Mimba (Azadirachta indica A.Juss)…………...

  49 Lampiran 10. Serbuk Daun Mimba………………………………….

  50 Lampiran 11. Ekstrak Etanolik Daun Mimba……………………….

  50 Lampiran 12. 96 well plate (Nunc)………………………………….

  51 Lampiran 13. ELISA reader SLT 340 ATC………………………...

  51 Lampiran 14. Hasil Histologi Hepar………………………………...

  52

BAB I PENGANTAR A. Latar Belakang Berbagai penyakit yang timbul dewasa ini berakar pada permasalahan

  sistem imun. Sistem imun merupakan mekanisme pertahanan tubuh terhadap zat asing (misalnya penyebab infeksi). Imunitas yang lemah memudahkan terjadinya infeksi mikroorganisme patogen. Imunitas dapat bersifat alami maupun diperoleh (adaptif). Imunitas alami adalah imunitas yang dimiliki sejak lahir dan bersifat nonspesifik, sedangkan imunitas adaptif adalah imunitas yang diperoleh karena adanya paparan suatu penyebab infeksi, bersifat spesifik dan diperantarai oleh antibodi atau sel limfoid.

  Pemeliharaan kesehatan yang ideal adalah yang berawal dari pemeliharaan sistem imun. Dengan sistem imun yang kuat dan berfungsi baik, tubuh dapat terhindar dari berbagai penyakit. Pemeliharaan sistem imun dapat dilakukan melalui berbagai cara seperti cukup beristirahat, berolahraga, mengonsumsi makanan yang memberikan asupan gizi seimbang dan suplemen yang mengandung komponen yang dapat meningkatkan imunitas tubuh.

  Senyawa-senyawa yang dapat meningkatkan imunitas tubuh disebut sebagai imunostimulan. Semakin tingginya tingkat resiko paparan penyakit yang bersumber pada kelemahan sistem imun menyebabkan permintaan akan imunostimulan di masyarakat juga semakin meningkat. Peningkatan kebutuhan ini mendorong pencarian sumber-sumber imunostimulan dari alam yaitu tumbuhan.

  2 Salah satu tumbuhan yang diketahui memiliki potensi sebagai imunostimulan adalah mimba (Azadirachta indica A. Juss). Berbagai penelitian yang dilakukan terhadap tumbuhan ini menunjukkan bahwa mimba memiliki aktivitas antiinflamasi, antipiretik, analgesik, hipoglikemik, antiulcer, antifertilitas, antimalaria, antifungi, antibakteri, antivirus, antikarsinogenik, hepatoprotektif, antioksidan, dan imunostimulan (kulit batang pohon mimba) (Biswas, 2002). Penelitian lain menyebutkan bahwa ekstrak air daun mimba juga memiliki aktivitas imunostimulan (Ray, 1996).

  Penelitian ini dilakukan untuk melihat pengaruh pemberian ekstrak etanolik daun mimba dalam peningkatan produksi antibodi yang merupakan molekul komponen sistem imun. Penelitian dilakukan secara in vivo pada hewan uji dan perbedaan kadar antibodi diukur dengan metode ELISA.

  Penelitian ini diharapkan dapat memunculkan suatu pengembangan sediaan herbal yang mampu meningkatkan sistem imun tubuh, sehingga tubuh selalu dalam keadaan siap menghadapi penyakit.

  1. Rumusan Masalah

  a. Apakah ekstrak etanolik daun mimba dapat meningkatkan kadar antibodi dalam darah pada tikus jantan galur Wistar? b. Berapa persen peningkatan kadar antibodi darah pada tikus jantan galur

  Wistar dengan pemberian ekstrak etanolik daun mimba?

  2. Keaslian Penelitian

  Sejauh yang diketahui penulis, belum pernah dilakukan penelitian tentang pengaruh ekstrak etanolik daun mimba dalam peningkatan kadar antibodi

  3 dalam darah pada tikus jantan galur wistar. Penelitian yang pernah dilakukan terkait efek imunostimulan mimba antara lain: Efek Imunomodulator dari Minyak Mimba (Azadirachta indica A.Juss) (Upadhyay, 1992); Modulasi respon imun humoral dan seluler oleh Azadirachta indica (Mimba) pada mencit (Ray, 1996); Efek Imunomodulator NIM-76, suatu Fraksi Menguap dari Minyak Mimba (Sairam, 1997); Daun mimba Meningkatkan Aktivasi Imun yang Menghambat Perkembangan Murine Erlich Carcinoma dan B16 Melanoma (Baral, 2004); Preparat mimba meningkatkan respon imun tipe Th1 dan imunitas anti tumor melawan antigen tumor payudara (Mandal, 2007).

3. Manfaat Penelitian

  Penelitian pengaruh ekstrak etanolik daun mimba terhadap peningkatan kadar antibodi ini diharapkan bermanfaat antara lain: a. manfaat teoritis penelitian ini adalah menambah khasanah ilmu pengetahuan dan eksplorasi tanaman yang dapat meningkatkan sistem imun tubuh dengan peningkatan kadar antibodi dalam darah

  b. manfaat praktis penelitian ini adalah daun mimba dapat digunakan sebagai suplemen peningkat sistem imun.

B. Tujuan

1. Tujuan umum

  Untuk mengetahui apakah ekstrak etanolik daun mimba (Azadirachta

  indica

  A. Juss.) mempunyai efek imunomodulator

  4

2. Tujuan Khusus a.

  Untuk mengetahui apakah ekstrak etanolik daun mimba dapat meningkatkan kadar antibodi dalam darah tikus jantan galur Wistar.

  b.

  Untuk mengetahui berapa persen peningkatan kadar antibodi dalam darah tikus jantan galur Wistar dengan pemberian ekstrak etanolik daun mimba.

BAB II PENELAAHAN PUSTAKA A. Azadirachta indica A. Juss Pohon mimba (Azadirachta indica) merupakan tumbuhan asli Asia Tenggara. Tumbuhan ini cepat tumbuh, dapat bertahan di tanah yang buruk dan

  kekurangan nutrisi, serta tetap berdaun sepanjang tahun. Pohon mimba dapat mencapai 30 meter, dengan cabang-cabang berdaun yang menyebar (Anonim, 1998). Sistematika tumbuhan mimba adalah sebagai berikut: Divisi : Spermatophyta Sub divisi : Angiospermae Kelas : Dicotyledoneae Bangsa : Meliales Suku : Meliaceae Marga : Azadirachta Jenis : Azadirachta indica

  A. Juss (Hutapea, 1993)

  Deskripsi tanaman pohon dengan tinggi 10-15 m; Batang tegak, berkayu, bulat, permukaan kasar, simpodial, coklat; Daun majemuk, berhadapan, lonjong, melengkung, tepi bergerigi, ujung lancip, pangkal meruncing, pertulangan menyirip; Bunga majemuk, berkelamin dua, di ujung cabang, tangkai silindris; Buah buni, bulat telur, hijau ; biji bulat, diameter ±1 cm, putih; Akar tunggang, coklat (Hutapea, 1993).

  6 Tumbuhan mimba memiliki banyak kegunaan. Salah satu kegunaannya yang paling dikenal adalah sebagai biopestisida. Hampir seluruh bagian mimba memiliki fungsi dan kegunaan yang dapat dimanfaatkan, antara lain sebagai repelan, penyubur, makanan diabetik, pakan ternak, kayu bakar, bahan dasar batu bara, tanaman peneduh, bahan tambahan pada media pertumbuhan tanaman, dan penurun keasaman tanah (Anonim, 1998).

  Ekstrak mimba digunakan untuk mengatasi berbagai masalah kesehatan. Mandi dengan air rendaman mimba dipercaya dapat menyembuhkan ruam panas dan bisul. Minyak mimba digunakan untuk mengatasi ulcer perut dan rematik.

  Batang mimba mengandung antiseptik kuat dan mimba digunakan untuk membuat sabun dan pasta gigi. Ranting mimba digunakan untuk membersihkan gigi (Anonim, 1998). Selain kegunaan-kegunaan tersebut, daun Azadirachta indica juga berkhasiat sebagai obat demam dan untuk menguatkan badan (Hutapea, dkk, 1993).

  Komponen mimba dapat dibagi ke dalam dua golongan, yakni isoprenoid dan nonisoprenoid. Golongan isoprenoid termasuk diterpenoid dan triterpenoid mencakup protomeliasin, limonoid, azadiron dan derivatnya, gedunin dan derivatnya, komponen tipe vilasinin, dan Csecomeliasin seperti nimbin, salanin, dan azadirachtin. Golongan nonisoprenoid termasuk protein dan karbohidrat, senyawa sulfur, polifenolik seperti flavonoid dan glikosidanya, dihidrokalkon, kumarin dan tannin, senyawa alifatik, dan sebagainya (Biswas, 2002). Daun dan kulit Azadirachta indica mengandung saponin, di samping itu daunnya juga mengandung flavonoida dan tanin (Hutapea, dkk, 1993).

  7

B. Sistem Imun

  Imunitas adalah resistensi terhadap penyakit terutama penyakit infeksi (Bratawidjaja, 2004). Imunitas bersifat alami (bawaan) dan didapat (adaptif).

  Imunitas yang alami adalah imunitas yang tidak diperoleh melalui kontak dengan suatu antigen dan bersifat non spesifik, sedangkan imunitas didapat adalah imunitas yang diperoleh setelah pemaparan terhadap suatu penyebab infeksi, bersifat khusus dan dapat diperantarai oleh antibodi atau sel limfoid. Masuknya zat asing dalam tubuh akan menimbulkan berbagai macam reaksi yang bertujuan untuk mempertahankan keutuhan dirinya (Gan, 1991). Gabungan sel, molekul dan jaringan yang berperan dalam resistensi terhadap infeksi disebut sistem imun, dan reaksi yang dikoordinasi sel-sel dan molekul-molekul terhadap mikroba dan bahan lainnya disebut respons imun (Bratawidjaja, 2004).

  Respons imun merupakan serangkaian proses yang saling berkaitan dan diatur oleh suatu sistem yang saling menunjang. Dalam keadaan optimal atau dalam keadaan sehat sistem ini berfungsi secara efisien sehingga seseorang dapat terhindar dari dampak yang tidak menguntungkan akibat masuknya substansi asing (antigen). Setelah terjadi respon imun, sel-sel yang spesifik terhadap antigen bersangkutan bertambah banyak, dan sel-sel efektor beraksi untuk menyingkirkan antigen (Kresno, 1996).

  Antigen yang masuk dalam tubuh akan mengaktifkan makrofag atau monosit. Makrofag akan mempengaruhi sel imunokompeten yaitu sel limfoid dari sistem retikuloendotelial. Antigen yang telah diaktifkan oleh plasma sel akan merangsang sel limfoid dalam proses imunologik selanjutnya. Sel limfosit terdiri

  8 dari dua jenis sel, yaitu sel B dan sel T. Pada kontak pertama, di bawah pengaruh antigen, sel B akan berdiferensiasi dan berproliferasi menjadi sel plasma yang menghasilkan antibodi, sedangkan sel T (thymus derived) akan tersensitisasi menjadi sensitized T cells menghasilkan limfokin, reaksi imun seluler. Disamping itu, diferensiasi dan proliferasi sel B dan sel T menghasilkan sel memori. Pada kontak ulang, sel memori tersebut akan lebih cepat berproliferasi menjadi sel plasma dan sensitized T cells (gambar 1). Memori imunologik dapat berada dalam bentuk memori pasif jangka pendek dan memori aktif jangka panjang (Gan, 1991).

  

Gambar 1. Pengenalan Antigen dan Respon Imun Tubuh (Anonim, 2008a)

C. Imunomodulator

  Imunomodulator dapat didefinisikan sebagai substansi biologi atau sintetis yang mampu menstimulasi, menekan, atau memodulasi komponen- komponen pada sistem imun. Fungsi utama sistem imun adalah melindungi individu dalam menghadapi agen infeksi dan potensial patogen. Hal ini

  9 menempatkan sistem imun pada posisi vital yaitu antara kondisi sehat dan sakit (Juyal, 2003). Imunomodulator juga dideskripsikan sebagai suatu agen kimia yang memodifikasi respon atau fungsi sistem imun, baik dengan stimulasi pembentukan antibodi atau penghambatan aktivitas sel darah putih (Anonim, 2008b).

  Imunomodulator dapat diklasifikasikan menjadi tiga, yaitu imunorestorasi, imunosupresan, dan imunostimulan. Imunorestorasi adalah pengembalian fungsi sistem imun yang terganggu dengan memberikan berbagai komponen sistem imun, seperti imunoglobulin (Baratawidjaja, 2004).

  Imunostimulan adalah senyawa dari luar yang dapat membantu meningkatkan resistensi tubuh terhadap antigen yang masuk (Juyal, 2003). Imunosupresi adalah suatu penekanan sistem imun (Baratawidjaja, 2004).

  Senyawa-senyawa yang bersifat sebagai imunomodulator antara lain: rutin, saponin, polisakarida, artemisin, ginsenosid, inosin, limonen, asam linoleat, asam oleanolik, ursolic acid. Sedangkan senyawa yang bersifat imunostimulan antara lain: phosphorus (Duke, 1996).

D. Antibodi

  Bila darah dibiarkan membeku akan meninggalkan serum yang mengandung berbagai bahan larut tanpa sel. Bahan larut tersebut mengandung molekul antibodi yang digolongkan dalam protein yang disebut globulin dan sekarang disebut imunoglobulin. Dua cirinya yang penting adalah spesifisitas dan aktivitas biologik. Antibodi diinduksi oleh infeksi subklinis (antara lain flora normal) dan oleh komponen dalam diit yang imunogenik (Bratawidjaja, 2004).

  10 Imunoglobulin merupakan salah satu sistem genetik yang paling menarik. Kemampuannya untuk mengikat antigen yang spesifik memberikan dasar imunitas humoral (Korsmeyer, 1991). Antibodi pertama kali dikenal sebagai protein Bence Jones pada tahun 1874, dan dideskripsikan sebagai senyawa baru yang tidak diketahui spesifisitasnya yang terdapat dalam urin pasien dengan ‘Mollities Ossium’ (Dasgupta, 1992).

  Imunoglobulin merupakan substansi pertama yang diidentifikasi sebagai molekul dalam serum yang mampu menetralkan sejumlah mikroorganisme penyebab infeksi. Molekul ini disintesis oleh sel B dalam 2 bentuk berbeda, yaitu sebagai reseptor permukaan (untuk mengikat antigen), dan sebagai antibodi yang disekresikan ke dalam cairan ekstraseluler. Antibodi yang disekresikan dapat berfungsi sebagai adaptor yang mengikat antigen melalui binding-sites-nya yang spesifik, sekaligus merupakan jembatan yang menghubungkan antigen dengan sel- sel imun atau mengaktivasi komplemen (Kresno, 2001). Adaptor mempunyai bagian pengenalan komplementer bentuk terhadap mikroorganisme dan selanjutnya dapat terikat secara kuat (Roitt, 2003).

  Terdapat 5 kelas imunoglobulin dalam serum manusia yaitu IgG, IgA, IgM, IgD, dan IgE. Perbedaan di antara kelima kelas tersebut didasarkan pada tiga karakteristik utama: antigenisitas, sifat fisik, dan aktivitas biologis dari molekul antibodi (Dasgupta, 1992).

  Imunoglobulin G (IgG)

  IgG merupakan tipe antibodi yang paling umum, mencakup tiga per empat gamaglobulin total dalam serum normal. Produksi IgG relatif lebih

  11 tergantung pada sel T dibandingkan IgM. Dalam respon terhadap stimulus antigen, molekul imuoglobulin ini muncul segera setelah antibodi IgM. IgG dapat dengan segera berdifusi ke dalam rongga ekstravaskuler serta meningkatkan fagositosis dan membantu netralisasi toksin. Makrofage memiliki reseptor untuk bagian fragmen crystalline (Fc, yaitu bagian yang mudah terkristalkan dari molekul IgG dan tidak memiliki kemampuan untuk berikatan dengan antigen) dari molekul IgG tertentu. Sel lain yang memiliki reseptor permukaan yang mampu berikatan dengan Fc adalah sel B dan sel K. IgG mampu menembus plasenta dan memproteksi bayi dalam minggu-minggu hingga bulan-bulan pertama kehidupannya (Dasgupta, 1992).

E. Antigen

  Antigen yang juga disebut imunogen adalah bahan yang dapat merangsang respon imun atau bahan yang dapat bereaksi dengan antibodi yang sudah ada tanpa memperhatikan kemampuannya untuk merangsang produksi antibodi. Secara fungsional antigen dibagi menjadi imunogen dan hapten (Bratawidjaja, 2004).

  Substansi dengan berat molekul rendah bila diikat pada protein yang imunogenik akan membentuk suatu kompleks yang dapat merangsang sistem imun untuk memproduksi antibodi terhadap molekul tersebut. Substansi tersebut disebut hapten. Istilah epitop adalah bagian dari antigen yang bereaksi dengan antibodi atau dengan reseptor spesifik pada limfosit T (Kresno, 2001).

  12

  1. Vaksin Hepatitis B

  Vaksin Hepatitis B terdiri atas partikel antigen permukaan hepatitis B yang diinaktifkan (HbsAg) dan diabsorpsi dengan tawas, dimurnikan dari plasma manusia/karier hepatitis. Vaksin rekombinan HbsAg (rHBsAg) diproduksi dengan rekayasa genetik galur Saccharomyces cerevisae yang mengandung plasmid/gen untuk antigen HbsAg (Bratawidjaja, 2004).

  2. Hepavax-Gene® ® Hepavax-Gene adalah suatu vaksin rekombinan hepatitis B.

  Komponen imunogenik yang terkandung, yaitu rekombinan antigen permukaan hepatitis B (HbsAg), diproduksi dengan modifikasi yeast menggunakan Crucell’s propietary Hansenula polymorpha expression system. 1 ml vaksin mengandung 20 mcg HbsAg yang diabsorbsikan pada 0,5 mg

  ®

  alumunium hidroksida. Hepavax-Gene adalah salah satu vaksin yang kualitasnya diakui WHO untuk imunisasi aktif melawan virus Hepatitis B (Anonim, 2008c). Vaksin ini diproduksi oleh Berna Biotech Korea Corporation.

F. Ekstraksi

  Ekstraksi adalah kegiatan penarikan kandungan kimia yang terlarut supaya terpisah dari bahan yang tidak dapat larut dengan pelarut cair. Simplisia yang diekstrak mengandung senyawa aktif yang dapat larut dan senyawa yang tidak dapat larut dalam cairan penyari (Anonim, 2000).

  13 Cairan penyari yang biasa digunakan adalah air, eter atau campuran etanol dan air. Penyarian simplisia dengan air dilakukan dengan cara maserasi, perkolasi atau penyeduhan dengan air mendidih. Penyarian dengan campuran etanol dan air dilakukan dengan cara maserasi atau perkolasi. Penyarian dengan eter dilakukan dengan cara perkolasi (Anonim, 1979).

  Maserasi merupakan cara penyarian yang sederhana. Maserasi dilakukan dengan cara merendam serbuk simplisia dalam cairan penyari. Cairan penyari akan menembus dinding sel dan masuk ke dalam rongga sel yang mengandung zat aktif, zat aktif akan larut dan karena adanya perbedaan konsentrasi antara larutan zat aktif di dalam dengan yang di luar sel, maka larutan yang terpekat didesak ke luar. Peristiwa tersebut berulang sehingga terjadi keseimbangan konsentrasi antara larutan di luar sel dan di dalam sel. Cairan penyari yang digunakan dapat berupa air, etanol, air-etanol atau pelarut lain. Keuntungan cara penyarian dengan maserasi adalah cara pengerjaan dan peralatan yang digunakan sederhana dan mudah diusahakan (Anonim, 1986).

G. Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA)

  Uji imunologi dengan bantuan enzim secara luas dikenal sebagai ELISA (enzyme-linked immunosorbent assays). Enzim digunakan untuk melabeli antigen yang akan diukur kadarnya menggunakan reaksi enzim yang sesuai. Dalam tekhnik ini aktivitas enzim biasanya dihambat oleh reaksi imunokimia dan penurunan aktivitas dapat diukur dalam sistem uji imunologi yang homogen (Christian, 2004).

  14 Quinn et al (2004) menyebutkan bahwa metode ELISA yang memenuhi persyaratan memiliki Limit of Detection (LOD) dan Limit of Quantification

  (LOQ) untuk sampel serum yang mengandung IgG masing-masing sebesar 0,09 µg/ml dan 3,0 µg/ml. Sensitivitas metode ini adalah sebesar 97,8%, sedangkan spesifisitasnya 97,6%.

  Prinsip teknik ELISA sama dengan teknik RIA (radioimmunoassay), yaitu dengan mereaksikan antigen (Ag) yang tidak dilabel dan terdapat dalam spesimen, bersama antigen yang dilabel (Ag*) dengan antibodi (Ab) spesifik, sehingga antigen berlabel dan antigen dalam spesimen akan berkompetisi untuk mengikat antibodi dan membentuk kompleks Ag*-Ab-Ag. Apabila kadar Ag* sebelum reaksi diketahui, maka sisa Ag* yang tidak bereaksi atau yang terikat pada kompleks dapat diukur. Pada teknik ELISA indikator yang digunakan adalah enzim. Kelebihan teknik ELISA adalah: cukup sensitif, reagen mempunyai half

  

life yang lebih panjang dibanding reagen RIA, dapat menggunakan

  spektrofotometer biasa dan mudah dilakukan, serta tidak mengandung bahaya radioaktif (Kresno, 1996).

  Bergantung pada apa yang ingin diuji, pada teknik ELISA harus ada antibodi atau antigen yang dikonjugasikan dengan enzim dan substrat yang sesuai.

  Enzim yang paling disukai adalah fosfatase alkali (AP) dan horseradish

  peroxidase (HRP), sedangkan substrat yang paling sering digunakan adalah o- phenylenediamine (OPD), dan tetramethylbenzidine (TMB). Substrat para-

nitrophenylphosphate (pNPP) dapat dipilih apabila enzim yang digunakan adalah

  fosfatase alkali. Hidorlisis substrat oleh enzim biasanya berlangsung dalam waktu

  15 tertentu dan reaksi dihentikan dengan penambahan asam atau basa kuat. Karena

  E E

  banyaknya antibodi berlabel enzim (Ab ) yang terikat pada kompleks Ag-Ab sesuai dengan kadar Ag dalam spesimen, maka banyaknya enzim yang terikat pada kompleks dan intensitas warna yang timbul setelah substrat dihidrolisis oleh

  E

  enzim yang terikat pada kompleks Ag-Ab merupakan ukuran untuk kadar Ag yang diuji (Kresno, 1996).

  ELISA telah banyak mengalami perubahan sejak teknik ini pertama kali dipublikasikan. Keragaman terbesar dalam ELISA dapat dilihat dari pemilihan konjugat dan substratnya. Keragaman lain terdapat pada konfigurasinya. Konfigurasi paling sederhana adalah ELISA langsung, sedangkan konfigurasi lain adalah ELISA tak langsung, ELISA penangkap antigen atau ELISA sandwich, ELISA penangkap antibodi, dan ELISA kompetitif atau ELISA pemblok (Burgess, 1995).

  1. ELISA langsung

  Ini merupakan konfigurasi paling sederhana. Antigen secara langsung diadsorbsikan ke suatu substrat padat. Permukaan substrat dicuci dan antibodi yang ditempeli enzim digunakan untuk menunjukkan adanya antigen. Konfigurasi ini memerlukan antiserum yang dikonjugasikan pada enzim dan bersifat sesifik untuk antigen yang dimaksud. Terapannya meliputi skrinning antigen seperti imunoglobulin pada serum janin sapi (Burgess, 1995).

  2. ELISA tak langsung

  Metode ini merupakan konfigurasi paling sederhana yang dapat digunakan untuk mengukur titer antibodi. Antigen teradsorbsi pada substrat

  16 padat. Antibodi primer diperoleh dari serum atau bermacam cairan tubuh lainnya. Antibodi sekunder terikat pada enzim yang sesuai, dan biasanya disebut sebagai konjugat. Hasil akan tampak bila ditambahkan substrat. Cara ini juga digunakan untuk identifikasi antigen dan untuk skrining Hibridoma (Burgess, 1995).

  3. ELISA penangkap antigen atau ELISA sandwich

  Konfigurasi ini menggunakan antibodi yang terikat pada fase padat untuk menangkap antigen secara spesifik. Konfigurasi sisanya serupa dengan ELISA tidak langsung. Antibodi penangkap, antigen dan sistem indikator dibuat konstan dan yang berubah adalah titer antibodi primer untuk antigen spesifik (Burgess, 1995).

  4. ELISA penangkap antibodi

  Konfigurasi ini menggunakan antiglobulin yang terikat pada substrat padat. Antibodi sampel yang diuji ditangkap dan sistem indikator menempeli antigen berlabel (Burgess, 1995).

  5. ELISA kompetitif atau ELISA pemblok

  Pengujian kompetisi antibodi membutuhkan antigen untuk ditangkap antibodi secara langsung maupun lewat antibodi spesifik ke substrat padat.

  Antibodi yang telah dikenal bersaing dengan antibodi yang tidak dikenal untuk mendapatkan tempat penempelan pada antigen. Antibodi yang telah diketahui dapat dilabel atau dapat dideteksi menggunakan antibodi antispesiesnya (Burgess, 1995).

  17

H. Kerangka Pemikiran

  Sistem imun merupakan suatu sistem pertahanan tubuh yang berfungsi untuk menolak segala substansi asing yang dapat memberikan efek buruk bagi tubuh. Salah satu substansi yang berperan dalam imunitas tubuh adalah antibodi. Substansi ini bertugas melindungi tubuh dari zat asing yang masuk ke tubuh, yang dikenal sebagai antigen. Karena peranan yang sangat penting, yaitu mencegah serangan penyakit dan menjaga kesehatan tubuh, maka sistem imun harus selalu dalam kondisi baik dan kuat. Salah satu cara meningkatkan kekuatan sistem imun adalah dengan pemberian suplemen.

  Daun mimba, salah satu tanaman obat tradisional Indonesia, telah banyak dipercaya sebagai sarana untuk menyehatkan tubuh, salah satunya dengan memperkuat tubuh (Hutapea, 1993). Tumbuhan mimba mengandung berbagai senyawa kimia, di antaranya adalah flavonoid, rutin, tanin, dan senyawa fosforus yang memiliki aktivitas imunostimulan. Beberapa bagian tumbuhan mimba telah diteliti berkaitan dengan aktivitas imunomodulator. Dari penelitian-penelitian tersebut diketahui bahwa ekstrak air dari batang dan daun mimba memiliki aktivitas imunostimulan baik secara humoral maupun seluler (Biswas, 2002). Pada uji respon imun humoral, tikus yang diberi perlakuan ekstrak daun mimba (100 mg/kg) memiliki level IgG dan IgM serta titer antibodi anti-ovalbumin yang lebih tinggi daripada kelompok kontrol (Ray, 1996).

  18

I. Hipotesis

  Ekstrak etanolik daun mimba (Azadirachta indica A. Juss) dapat berefek sebagai imunomodulator dengan peningkatan kadar antibodi dalam darah.

BAB III METODOLOGI PENELITIAN A. Jenis dan Rancangan Penelitian Penelitian ini merupakan penelitian jenis eksperimental murni dengan

  rancangan acak lengkap pola searah B.

   Variabel Penelitian dan Definisi Operasional 1. Variabel penelitian

  a. Variabel bebas Dosis ekstrak etanolik daun mimba yaitu 35 mg/kg BB tikus, 70 mg/kg BB tikus, dan 140 mg/kg BB tikus.

  b. Variabel tergantung Titer antibodi dalam darah pada tikus pada tiap perlakuan dalam jangka waktu 7 hari setelah setiap pemberian antigen.

  c. Variabel pengacau terkendali 1) Waktu pengambilan darah dilakukan setiap 7 hari setelah pemberian antigen.

  2) Hewan uji yang digunakan adalah tikus jantan galur wistar berusia 3 bulan dengan berat badan 150-250 g.

  3) Pemanenan daun mimba dilakukan satu kali pada tempat dan waktu yang sama.

  20 d.

  Variabel pengacau tak terkendali Kondisi patofisiologis hewan uji.

2. Definisi Operasional a.

  Hewan uji yang digunakan adalah tikus jantan galur wistar yang diperoleh dari Unit Pemeliharaan Hewan Percobaan (UPHP) UGM berumur 3 bulan.

  b.

  Ekstrak etanolik daun mimba merupakan hasil penyarian serbuk daun mimba secara maserasi dengan penyari etanol 70%.

  c.

  Imunostimulan adalah senyawa yang menyebabkan peningkatan sistem imun tubuh antara lain dengan peningkatan kadar antibodi.

  d. Antibodi yang terukur adalah subkelas imunoglobulin G (IgG).

  e. Titer antibodi merupakan besaran konsentrasi antibodi yang dinyatakan dalam absorbansi atau optical density (OD).

C. Alat dan Bahan Penelitian

  1. Alat penelitian