Aktivitas fagositosis pada tikus wistar yang diinokulasi Candida albicans dan diberi mimba (Azadirachta indica) Phagocytosis activity on wistar rats were inoculated by Candida albicans and fed with neem (Azadirachta indica)

  Dentofasial, Vol.10, No.1, Februari 2011:26-31

Aktivitas fagositosis pada tikus wistar yang diinokulasi Candida albicans dan

diberi mimba (Azadirachta indica)

Phagocytosis activity on wistar rats were inoculated by Candida albicans and fed

with neem (Azadirachta indica)

  I Dewa Ayu Ratna Dewanti

  Bagian Biomedis Fakultas Kedokteran Gigi, Universitas Jember Jember, Indonesia

  ABSTRACT

Neem is one of the traditional medicine known by society as immunomodulator. On the other hand, 80% of oral

infection diseases is caused by C. albicans. This research is aimed to explain the phagocytosis activities on wistar

rats which were inoculated with C. albicans and fed with neem leaves. There are 5 groups, namely control group

(KO) with no treatment, the other treatment groups were classified into 4 groups. First group (KP1) was inoculated

with C. albicans only. KP2 was fed with 50 mg/day/kg BW aqueous extracts from neem leaves, then inoculated with

  

C. albicans start from day 8-21. KP3 was fed with 100 mg/day/kg BW aqueous extract from neem leaves, then

inoculated with C. albicans start from day 8-21. KP4 was fed with 200 mg/day/kg BW aqueous extract from neem

leaves, then inoculated with C. albicans start from day 8-21. On day 22, the tongue was swabbed for each group,

then cut for immunohistochemistry preparation. The study that there was significant difference showed that there

were different results computed using anova, HSD test, and linier regression. The conclusion was neem leaves

increased the phagocytosis activity of wistar rats, inoculated with C.albicans.

  Key words: Azadirachta Indica juss, macrophage; phagocytosis, innate immune, Candida albicans ABSTRAK

  Mimba adalah salah satu tanaman tradisional yang dikenal masyarakat dan berfungsi sebagai imunomodulator. Di sisi lain, 80% infeksi di mulut adalah kandidiasis dengan penyebab C. albicans. Penelitian ini bertujuan mengetahui aktivitas fagositosis pada tikus wistar yang diinokulasi C. albicans dan diberi daun mimba. Terdapat 5 kelompok, kelompok kontrol (KO) tidak diberi perlakuan. Kelompok perlakuan 1 diinokulasi C. albicans (KP1). KP2 diberi 50 mg/hari/kg BB ekstrak cair daun mimba, kemudian diinokulasi C. albicans dari hari 8-21. KP3 diberi 100 mg/hari/kg BB ekstrak cair daun mimba, kemudian diinokulasi C. albicans dari hari 8-21. Sedangkan KP4 diberi 200 mg/hari/kg BB ekstrak cair daun mimba, kemudian diinokulasi C. albicans dari hari 8-21. Semua kelompok pada hari ke-22 dilakukan swab lidah, kemudian lidah dipotong untuk dibuat sediaan dengan imunohistokimia. Hasil penelitian menunjukkan terdapat perbedaan bermakna baik dengan Anova, uji HSD, dan regresi linier. Sebagai simpulan, daun mimba meningkatkan aktivitas fagositosis pada tikus wistar yang diinokulasi C. albicans.

  Kata kunci: Azadirachta Indica juss, makrofag,fagositosis, innate immune, Candida albicans

Koresponden: I Dewa Ayu Ratna Dewanti, Fakultas Kedokteran Gigi Universitas Jember, Jl. Kalimantan 37

  Jember, Telp.0331-333536, Faks.0331-331991, E-mail: dewadewanti@yahoo.com fagosit mengenali dan menghancurkan patogen

  PENDAHULUAN

  Mimba (Azadirachta Indica) telah dikenal melalui beberapa reseptor merangsang produksi dan dimanfaatkan masyarakat untuk mengatasi substansi mikrobial melalui CD14 yang berbagai macam penyakit, seperti cacingan, kudis, diekspresikan ke permukaan sel, akan _1-2 malaria, infeksi jamur, tumor dan alergi. mengaktifkan toll-like receptors (TLRs) serta NF- _9-10

  Beberapa penelitian membuktikan mimba κB. Stimulasi sitokin proinflamatori dan _3-6 memodulasi imunitas alami dan adaptif, aktivasi innate immunity tergantung keakuratan sedangkan imunitas alami (fagositosis) terutama pengenalan dari invasi patogen. Oksidatif antara makrofag berperan penting melawan C. albicans lain dengan cara menghasilkan superoksid dan NO yang merupakan penyebab utama kandidiasis yang dihasilkan sistem iNOS, aktivitas keduanya _7-8 mulut. Penelitian sebelumnya membuktikan dapat diinduksi TNF-α, sedangkan aktivitas perasan daun mimba dapat menghambat fagositosis meliputi fungsi penelanan (fungicidal ₉ pertumbuhan C. albicans secara in vitro. Daun uptake) dan pembunuhan intrasel (fungisidal). mimba mempunyai khasiat antimikroba dan Sedangkan non-oksidatif dengan memproduksi sebagai imunomodulator. Makrofag sebagai sitokin, seperti TNF-α yang dapat memodulasi

  IDA Ratna Dewanti: Aktivitas fagositosis pada tikus wistar yang diinokulasi C. albicans

  aktivitas fagositosis. ^10-12 Penelitian lain membuktikan ekstrak cair daun mimba dapat meningkatkan jumlah makrofag, sehingga diduga dapat mempengaruhi TNF-α yang merupakan sitokin yang berperan mengaktivasi fagositosis. ¹³ Untuk itu penelitian ini ditujukan untuk mengetahui aktivitas fagositosis pada tikus wistar yang diinokulasi C. albicans dan diberi daun mimba. Harapannya, di masa depan dapat dihasilkan obat yang berasal dari tanaman dan dapat bersifat imunomodulator maupun antijamur.

  Penelitian ini menggunakan sampel 25 ekor tikus wistar jantan, yang memenuhi deklarasi Helsinki, dengan berat 100-200 gr, usia 2-3 bulan yang dilakukan adaptasi 1 minggu. Terdapat 5 kelompok yang terbagi menjadi kelompok kontrol (KO), yaitu tikus yang tidak diberi konsumsi ekstrak cair daun mimba dan tidak diinokulasi C.

  albicans, KP1 yaitu tikus yang diinokulasi C. albicans, KP2 yaitu tikus yang diberi konsumsi

  ekstrak cair daun mimba dosis 50 mg/hari/kg BB, kemudian mulai hari ke-8 sampai 21 diinokulasi

  C. albicans. Selanjutnya , tikus yang diberi

  konsumsi ekstrak cair daun mimba dosis 100 mg/hari/kg BB, kemudian mulai hari ke-8 sampai 21 diinokulasi C. albicans (KP3). Sedangkan KP4 adalah tikus yang diberi konsumsi ekstrak cair daun mimba dosis 200 mg/hari/kg BB, kemudian mulai hari ke-8 sampai 21 diinokulasi C. albicans.

  Pada hari ke-22 masing-masing kelompok coba diamati dengan cara swab ringan tanpa tekanan dengan cotton bud pada dorsum lidah tikus wistar dan ditanam pada Saburoud’s agar, dan setelah 48 jam dilakukan penghitungan koloni C. albicans.

  Aktivitas fagositosis makrofag dilakukan dengan memotong lidah untuk dibuat sediaan dan pengecatan dengan cara imunohistokimia, dengan deparanisasi menggunakan xylol.Xylol dihilangkan dengan etanol mulai absolut sampai 70%, air, dan

  phosphate buffer saline (PBS) pH 7,4 dan diberi

BAHAN DAN METODE

  tripsin 0,0 25%. Preparat digenangi larutan H ^{2 O 2} 3%, dicuci dengan PBS 2x dan dilakukan proses bloking dengan BSA 3%. Anti mouse fagositosis direaksikan, diinkubasi selama 24 jam pada suhu

  4 C dalam humidity chamber, lalu direaksikan dengan biotiyilized secondary Ab (anti rabbit). Dicuci 3x dengan PBS, dan ditambahkan streptavidin berlabel peroksidase dan diinkubasi selama 1 jam. Selanjutnya dilakukan pencucian kembali dengan dengan PBS 3x, direaksikan dengan substrat DAB (diamine benzidine

  ),

  kemudian ditambahkan Meyer-HE. Data dianalisis dengan Anova dan dilanjutkan uji HSD.

HASIL PENELITIAN

  KO KP1 KP2 KP3 KP4

  1

  2

  2 2 2 2 2 8 8 8

  11

  11

  11

  21

  21

  21

  1 1 1 1 1 8 8 8

  21

  11

  11

  11

  22

  21

  21 Gambar 1. Aktivitas fagositosis pada makrofag (pembesaran 400x). Panah hitam menunjukkan aktivitas fagositosis, panah abu-abu menunjukkan tidak ada aktivitas fagositosis. A. Kontrol pengecatan, B. Aktivitas fagositosis makrofag terhadap C. albicans (KO), C. Aktivitas fagositosis makrofag terhadap C.

  

albicans (KP1), D. Aktivitas fagositosis makrofag terhadap C. albicans (KP2), E. Aktivitas fagositosis

B C D E A

  F

  Data penelitian mengenai jumlah sel makrofag yang aktif memfagosit C. albicans terlihat di tabel 1.

  21

  21

  3

  12

  3 3 1 1 1 9 9 9

  13

  12

  13

  21

  22

  21

  1

  1 1 1 1 1 9 9 9

  12

  13

  13

  23

  Tabel 1. Data jumlah sel makrofag yang aktif menfagosit C. albicans

  23

  3

  3

  3 2 2 2 7 7 7

  13

  13

  22

  Dentofasial, Vol.10, No.1, Februari 2011:26-31

  Hasil penelitian (gambar 1) menunjukkan sangat erat (0,985) (gambar 3), sehingga semakin aktivitas fagositosis pada makrofag pada tinggi dosis ekstrak cair daun mimba, maka kelompok yang diinokulasi C. albicans terjadi semakin tinggi aktivitas fagositosis sel makrofag. penurunan dibanding kontrol, sedangkan Pola kontribusi diskriminan menunjukkan kelompok perlakuan dengan ekstrak cair daun kemampuan ekstrak cair daun mimba, yaitu mimba terjadi peningkatan, yaitu semakin tinggi semakin tinggi dosis yang diberikan, maka dosis ekstrak mimba yang diberikan semakin aktivitas fagositosis semakin tinggi. tinggi aktivitas fagositosis. Gambar

  2 Gambar 4 menunjukkan bahwa aktivitas menunjukkan aktivitas fagositosis makrofag pada fagositosis (bulatan) terletak di sekitar garis yang epitel lebih tinggi dibandingkan subepitel. Hal ini lurus ke kanan dengan posisi naik, artinya bahwa menunjukkan bahwa mungkin C. albicans banyak semakin tinggi dosis mimba yang diberikan, maka dijumpai di epitel. semakin meningkatkan aktivitas fagositosis.

  Perbedaan bermakna (p<0,01) terbukti dari Penghitungan jumlah C albicans pada lidah hasil uji manova dan juga dari uji HSD. tikus dan ditumbuhkan pada saburoud’s agar yang Selanjutnya dilakukan uji korelasi dengan regresi dihitung menggunakan colony counter (gambar 5). linier menggambarkan hubungan positif yang _25.00 O :observasi

  __: linear

  F _20.00 A a g _15.00 o s i _10.00 t o _5.00 B s i _0.00 s _{0.00 50.00 100.00 150.00 200.00 Dosis Mimba (mg/kgBB)} Gambar 2. Aktivitas fagositosis pada makrofag

  Gambar 4. Grafik linier aktivitas fagositosis makrofag

  dengan teknik imunohistokimia (pembesaran 400x) di A. epitel, dan B. subepitel.

  Pada kelompok KO tidak didapati C.albicans. Koloni C.albicans terbanyak pada kelompok KP1, terkecil pada KP4. Hasil ini membuktikan bahwa

  Aktivitas fagositosis makrofag

  Aktivitas fagosit makrofag ₂₅ makin tinggi dosis ekstrak cair daun mimba, makin sedikit koloni C albicans (gambar 5 dan 6). _{15 20 KP1 bermakna, kecuali antara KP0 dengan KP4, KO bermakna (p<0,01). Uji HSD terdapat perbedaan} Uji manova menunjukkan perbedaan

  Fagositosis _{10 KP2 5 KP3} menunjukkan bahwa ekstrak cair daun mimba _KP4 dengan dosis 200mg/BB/hari dapat menurunkan _{1 2 3 4 5} jumlah C. albicans sampai mendekati normal. Uji korelasi (gambar 7) terdapat hubungan negatif Sampel penelitian (5 sampel)

  yang sangat erat (-0,973), semakin tinggi dosis

  Gambar 3. Aktivitas fagositosis makrofag akibat

  ekstrak cair daun mimba, semakin sedikit jumlah ekstrak cair daun mimba koloni C albicans.

  IDA Ratna Dewanti: Aktivitas fagositosis pada tikus wistar yang diinokulasi C. albicans

KP3 KP4 KO KP1 KP2

  

Gambar 5. Jumlah koloni C albicans. C albicans pada sabouroud’s agar tampak sebagai bentukan bulat, putih

  kekuningan, mengkilat, permukaan halus. Infeksi C albicans tidak mutlak ditentukan oleh jumlah spora, karena satu hifa sudah menunjukkan adanya infeksi. mempengaruhi aktivitas jun , sedangkan p38

  120 mempengaruhi produksi IL-6, IL-8 dan IL-12. 100

  Aktivitas p38 dan ERK dapat mengaktivasi AP-

  80

  1. Ketiga jalur MAPK dapat diaktivasi dalam

  KO

  J waktu yang sama. NF-κB merupakan regulator

60 KP1

  U

  KP2 dari respons awal terhadap patogen dan sebagai

  40 M KP3

  aktivator respons imun. NF-κB adalah p50-p65

  20 L KP4

  dari keluarga protein heterodimer yang A mentranskripsi bermacam-macam gen. Aktivasi

  1

  2

  3

  4

5 H

  NF-κB memerlukan fosforilasi protein IκB,

  Gambar 6. Grafik jumlah koloni C. albicans

  kemudian terjadi degradasi yang menyebabkan _120.00 p50-p65 berada dalam nukleus dan mengaktifkan bermacam-macam gen. Setelah

  O :observasi terjadi pelepasan I-κB, maka terjadi peningkatan _100.00 __: linear aktivitas faktor transkripsi NF-κB yang

  K _80.00

  menstimulasi ekspresi gen yang mempengaruhi

  o

  produksi TNF-α yang berpengaruh pada aktivitas

  l _60.00

  fagositosis. Stimulasi ekspresi gen antara lain

  o

  mempengaruhi produksi TNF-α dalam respons

  n _40.00

  imun terhadap patogen. TNF-α berperan sebagai

  i _20.00

  imun primer dalam regulasi sistem imun. Khusus pada makrofag sitokin ini meningkatkan _0.00 aktivitas dalam membunuh patogen, yang menjadi _{14-16 0.00 50.00 100.00 150.00 200.00} mediator penting pada inflamasi. Ekstrak cair _{Dosis Mimba (mg/kgBB)} daun mimba dengan komponen galic acid,

  epicatechin, catechin, dapat menurunkan jumlah Gambar 7. Grafik linier jumlah koloni C.albicans

  koloni C albicans, meskipun jumlah ini tidak mutlak menunjukkan adanya infeksi, tetapi

  

PEMBAHASAN dapat digunakan untuk menunjukkan adanya

  Hasil penelitian ini menunjukkan bahwa daun infeksi. Jumlah yang lebih banyak dari mimba dengan komponen imunomodulator kelompok kontrol dapat digunakan sebagai (diduga galic acid, catechin, epicatechin ) parameter terjadinya infeksi karena satu saja membangun keseimbangan baru melalui regulasi bentuk hifa sudah menunjukkan infeksi. sistem imun yang hasilnya dapat mempengaruhi Penelitian ini menunjukkan jumlah koloni C. makrofag yang kita kenali dari produk yang albicans yang semakin menurun dengan semakin dihasilkan sel makrofag, dalam menghadapi tinggi dosis ekstrak daun mimba, karena dosis stresor. Aktivitas TLR2, TLR4 mempengaruhi 200 mg/kg BB terlihat jumlah koloni paling fospatidilinositol pada membran sel makrofag sedikit. Penurunan jumlah koloni C albicans dan akan mengaktifkan protein Rac, selanjutnya diduga karena kandungan imunomodulator (galic akan mengaktivasi NF-κB dan AP-1 melalui jun acid, epicatechin, catechin ) dan kandungan kinase melalui jalur MAPK (mitogen-activated nimbidin , azadirachtin , gedunin, cyclic

  

protein kinase ). Termasuk jalur ini ERK trisulphide, cyclic tetrasulphide yang dapat

  (extracelluler signal-regulated kinase), JNK (c- berfungsi sebagai antijamur. Kandungan

  Dentofasial, Vol.10, No.1, Februari 2011:26-31

  8. Roeder

  Immunomodulation effects of neem Azadirachta indica) oil. Int J Immunopharmacol 1992; 14(7): 1187-93.

  4. SaiRam K, Sharma SK, Havazhagan G, Kumar D, Selavamurthy W. Immunomodulatory effect of NIM-76, a volatile fraction from neem oil. J Ethnopharmacol 1997; 55(2): 133-9.

  5. Sastrodihardjo S. Evaluasi daya insektisida dari ekstrak daun mimba (Azadirachta indica A. juss). Seminar Hasil Penelitian Pangan dan Gizi, Ilmu Hayati, 1988. 17 PAU: Jakarta. Hlm: 18.

  6. Sadekar D, Kolte AY, Barnase BS, Desai VF.

  Immunopotentiating effects of Azadirachta indica (Neem) dry leaves powder in broilers, naturally infected with IBD virus. Indian J Exp Biol 1998; 36(11): 1151-3.

  7. Lehner T. Immunologi of oral disease. In: Imunologi pada penyakit mulut. Ed. 3. Alih bahasa: Farida R, Suryadhana NG. Jakarta: Penerbit Buku Kedokteran EGC. 1992. Hlm: 112-5.

  A, Carsen J, KirChing, Rudolf A, Rupec, Martin S, Gunther W, Hans CK. December toll-like receptors as key mediators in innate antifungal immunity. J Ethnopharmacol 2004; 107: 485-98.

  2. Goel RK, Sairam K. Anti ulcer drugs from indigenous source with emphasis on musa sapientum, tamrabhasma, asparagus racemous and zingiber officinale. Indian J Pharmacol 2002; 34: 100-10.

  9. Dewanti R. Daya hambat pertumbuhan C. albicans oleh perasan daun mimba (Azadirachta Indica juss). Maj Ked Gigi (Dent J), Edisi khusus Temu Ilmiah Nasional III 6-9 Agustus 2003; Hlm.

  342-4.

  10. Diamond RD, Caron A, Lyman DR, Wysong.

  Disparate effects of interferon-γ and tumor necrosis factor-α on early neutrophil respiratory burst and fungicidal responses to Candida albicans hyphae in vitro. J Clin Invest 1991; 87: 711-20.

  11. Newman SL, Angela H. Candida albicans is phagocytosed, killed, and processed for antigen presentation by human dendritic cells. Infect Immunity 2001; 69 (11): 6813-22.

  12. Ulmann BD, Hadley M, Wiriya C, Anna LL, Qiang Z, Luis AV. Inducible defense mechanism against nitric oxide in Candida albicans. Eukaryotic Cell 2004; 3 (3): 715-23.

  13. Ray B, Banerjee BD, Sen PJ. Modulation of humoral and cell-mediated immune responses by Azadirachta indica (Neem) in mice. Indian J Exp Biol 1996; 34 (7): 698-701.

  3. Upadhayay D, Garg S, Talwar GP.

  Current Sci 2002; 23: 82-11.

  imun terhadap C albicans, sedangkan kandungan antijamur dapat membunuh jamur secara langsung dengan cara merusak membran sel jamur. Efek imunomodulator dapat terjadi melalui CD14, TLR2, TLR4, TNF-α, aktivitas fagositosis. Jadi penurunan jumlah koloni C.

  albicans, sedangkan pada jumlah koloni C. albicans kelompok kontrol tidak dijumpai C. albicans . Hal tersebut mungkin terjadi akibat

  albicans dapat melalui dua jalur, yaitu

  pembunuhan secara langsung dan efek imunomodulatori.

  Pembunuhan secara langsung dapat terjadi karena kandungan antijamur (nimbidin,

  azadirachtin , gedunin, trisulphida dan tetrasulphida ) dapat merusak membran sel

  jamur dengan merubah permeabilitas membran sel, kemudian terbentuk pori-pori yang menyebabkan membran sel menjadi bocor, yang menyebabkan kematian sel jamur. Selain itu kandungan sulfur pada daun mimba diduga dapat berkompetisi dengan oksigen pada sel jamur, sehingga menyebabkan terjadinya toksisitas pada jamur dan menyebabkan kematian jamur.

  Kelompok kontrol pada penelitian ini memperlihatkan adanya sel makrofag yang aktif menfagosit C. albicans. Hal ini kemungkinan disebabkan oleh karena secara fisiologis aktivitas fagositosis juga terjadi pada tikus wistar atau karena pada saat penelitian sulit didapatkan rongga mulut tikus yang steril terbebas dari C.

  sudah dapat direspons oleh sel imunokompeten, sehingga meskipun terdapat aktivitas fagositosis namun pada saat dilakukan penghitungan jumlah koloni tidak terdapat C

  DAFTAR PUSTAKA 1. Ganguli SJ. Neem: A therapeutic for all seasons.

  albicans.

  SIMPULAN

  Dari penelitian mengenai aktivitas fagositosis pada tikus wistar yang diinokulasi

  Candida albicans dan diberi mimba (Azadirachta indica ), daun mimba meningkatkan aktivitas

  fagositosis makrofag pada tikus wistar yang diinokulasi C. albicans.

  SARAN

  Untuk hasil yang lebih baik diperlukan dosis mimba yang lebih bervariasi serta aplikasi ke manusia.

  14. Tada H, Eiji N, Hidetoshi S, Tshihiko W, Takeshi M, Tatsuji M, dkk. Sachoromyces cerevisiae and Candida albicans derived Mannan Induced production of tumor necrosis factor alpha by human monocytes in a CD14 and Toll-Like Receptor 4

  IDA Ratna Dewanti: Aktivitas fagositosis pada tikus wistar yang diinokulasi C. albicans

  dependent Manner. Mycrobiol Immunol 2002; 46 (7): 503-12.

  15. Wang JE, Warris A, Ellingsen EA, Fio T, Espevick T, Solberg S, Verwe PE. Involvement of CD14 and Toll-Like receptors in activation of human monocyte. Mycrobiology and Immunology, 2001.Vol. 69: No. 4: 2402-6.

  16. Outburg S, Joke S, Janneke EH, Jolande AL, Johan SF, Polein P, dkk. J Translational Medicine. BMC Infectious Dis 2005; 114 (5): 1471-86.