Validation Of Commercial Eia Kit For Analysis Of Hormone Estradiol And Progesterone in Female Kacang Goat (Capra hircus)

VALIDASI KIT EIA KOMERSIAL UNTUK
ANALISA HORMON ESTRADIOL DAN PROGESTERON
PADA KAMBING KACANG (Capra hircus) BETINA

DEDI RAHMAT SETIADI

SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2014

PERNYATAAN MENGENAI TESIS DAN
SUMBER INFORMASI SERTA PELIMPAHAN HAK CIPTA*
Dengan ini saya menyatakan bahwa tesis berjudul Validasi Kit EIA
Komersial untuk Analisa Hormon Estradiol dan Progesteron pada Kambing
Kacang (Capra hircus) Betina adalah benar karya saya dengan arahan dari komisi
pembimbing dan belum diajukan dalam bentuk apa pun kepada perguruan tinggi
mana pun. Sumber informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan
maupun tidak diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan
dicantumkan dalam Daftar Pustaka di bagian akhir tesis ini.
Dengan ini saya melimpahkan hak cipta dari karya tulis saya kepada Institut

Pertanian Bogor.
Bogor, Maret 2014
Dedi Rahmat Setiadi
B352110031

RINGKASAN
DEDI RAHMAT SETIADI. Validasi Kit EIA Komersial untuk Analisa Hormon
Estradiol dan Progesteron pada Kambing Kacang (Capra hircus) Betina.
Dibimbing oleh IMAN SUPRIATNA dan MUHAMMAD AGIL.
Enzyme immunosorbent assay (EIA) adalah suatu teknik yang
menghubungkan spesifitas antibodi dengan kepekaan uji enzimatis atau antigen
yang dilekatkan pada enzim dengan spektrofotometer biasa. Analisa dengan
menggunakan teknik EIA telah terbukti cocok untuk menggantikan teknik radio
immunoassay (RIA) yang memiliki berbagai kelemahan. Terdapat beberapa
produk kit EIA komersial yang dapat dipergunakan untuk pengujian konsentrasi
hormon, tetapi belum ada dari produk tersebut yang dapat dijadikan sebagai
rujukan dalam penggunaannya untuk hewan.
Penelitian ini bertujuan untuk menentukan kelaikan kit EIA komersial
estradiol dan progesteron untuk manusia yang dipergunakan untuk monitoring
status reproduksi kambing kacang. Penelitian ini menggunakan tiga ekor kambing

kacang betina berumur 2–3 tahun, kondisi sehat, memiliki siklus estrus reguler,
fertil dan tidak bunting. Sampel darah diambil dari vena jugularis menggunakan
venoject 21 G setiap dua hari sekali dan diintensifkan setiap hari menjelang fase
estrus, plasma disimpan pada suhu -20ºC sampai dilakukan analisa. Ultrasonografi
dipergunakan untuk memeriksa organ reproduksi betina (ovarium) pada saat
pengambilan darah. Validasi hormon asai dilakukan dengan metode validasi
laboratorium dan validasi biologi. Validasi laboratorium dipastikan dengan
melakukan pengukuran akurasi, sensitivitas dan presisi. Validasi biologi
dilakukan berdasarkan perbandingan profil hormon yang diperoleh dengan
perubahan morfologi dan gambaran hasil USG pemeriksaan ovarium.
Uji paralelisme memperlihatkan bahwa kurva sampel paralel dengan kurva
standar kit estradiol (E2) dan progesteron (P4) produk DRG International Inc.,
sedangkan tidak paralel dengan kit hormon EIA produk GBC. Konsentrasi terkecil
hormon estradiol dan progesteron yang terukur pada 90% binding adalah 25
pg/mL dan 0.14 ng/mL untuk kit DRG. Koefisien variasi intra- dan interasai
(%CV) pada kit DRG untuk E2 dan P4 adalah ˂ 10%. Kambing 5 dan 9 tidak
menunjukkan siklus estrus dengan profil hormon tampak datar. Kambing 7
menunjukkan siklus estrus yang tidak teratur, dengan hanya ditemukannya profil
progesteron dari satu siklus selama 62 hari pengamatan walaupun tidak disertai
profil estradiol yang spesifik pada siklus tersebut. Konsentrasi progesteron selama

fase luteal berkisar antara 3.6–42.8 ng/mL. Konsentrasi tampak meningkat
signifikan pada hari ke 4 setelah ovulasi teramati dan mencapai puncaknya pada
hari ke 6 sampai hari ke 14 dengan konsentrasi 19.2–42.8 ng/mL sebelum
menurun drastis pada akhir siklus. Dengan demikian dapat disimpulkan bahwa kit
EIA P4 DRG adalah cocok dan dapat digunakan untuk monitoring status
reproduksi dengan pengujian sampel plasma kambing kacang betina, namun tidak
demikian dengan EIA E2 DRG. Sedangkan kit EIA E2 serta P4 GBC tidak dapat
digunakan untuk menganalisa hormon E2 dan P4 dari sampel darah kambing
kacang.
Kata kunci: EIA, estradiol, kambing kacang, progesteron, ultrasonografi

SUMMARY
DEDI RAHMAT SETIADI. Validation of Commercial EIA Kit for Analysis of
Hormone Estradiol and Progesterone in Female Kacang Goat (Capra hircus).
Supervised by IMAN SUPRIATNA and MUHAMMAD AGIL.
Enzyme immunosorbent assay (EIA) is a technique that connects the
specificity of antibodies with the enzymatic test sensitivity or antigen attached to
the enzyme by regular spectrophotometer. Analysis using EIA technique has been
proved suitable to replace the radio immunoassay (RIA) technique which has
many weaknesses. There are several commercial EIA hormone kit products that

can be used nowadays to test the concentration of the hormone, but not any of the
products which can be used as a reference.
The aims of this study was to determine the feasibility of commercial EIA
hormone kits for human estradiol and progesterone whether can be used or not for
monitoring reproductive status of kacang goat. This study used 3 female kacang
goats 2–3 years old, healthy, have regular estrous cycles, fertile and unpregnant.
Blood samples were taken from the jugular vein using a 21 G venoject every two
days and sample collection was intensified every day prior to heat. Blood plasma
stored at -20ºC until the analyse. Ultrasound is used to check the female
reproductive organs (ovaries) during blood sampling. Hormone assay validation
was conducted through laboratory validation and biologycal validation.
Laboratory validation was carried out by measuring accuracy, sensitivity and
precision. Comparison between hormone profile and morphologycal change and
USG picture of the ovary was used as biologycal validation.
Parallelism test showed that sample curve was parallel with standard curve
of E2 and P4 of DRG commercial kit, in contrast GBC commercial kit was not
parallel. The lowest hormone concentration of estradiol (E2) and progesterone
(P4) at 90% binding was 25 pg/mL and 0.14 ng/mL in DRG kit. Coefficient
variation of intra- and interassay for both DRG EIA commercial kits were less
than 10%. Goat 5 and 9 did not show estrus cycle with hormone profiles appear

flat. Goat 7 showed irregular estrous cycles, with only finding of progesterone
profile of one cycle during 62 days of observation, although it did not coincide
with profiles of estradiol on the cycle. Progesterone concentrations during the
luteal phase ranged from 3.6-42.8 ng/mL. Concentration appears to increase
significantly at day 4 after ovulation was observed and reached a peak on day 6 to
day 14 with a concentration of 19.2-42.8 ng / mL before decreased dramatically
by the end of the cycle. It can be concluded that the P4 DRG EIA kit is suitable
and can be used for monitoring the reproductive status by measuring plasma
samples female kacang goat, but not compatible for E2 EIA DRG. While E2 and
P4 EIA kits GBC can not be used to analyze hormones E2 and P4 from blood
samples of kacang goat.

Keywords: EIA, estradiol, progesterone, kacang goat, ultrasound

© Hak Cipta Milik IPB, Tahun 2014
Hak Cipta Dilindungi Undang-Undang
Dilarang mengutip sebagian atau seluruh karya tulis ini tanpa mencantumkan
atau menyebutkan sumbernya. Pengutipan hanya untuk kepentingan pendidikan,
penelitian, penulisan karya ilmiah, penyusunan laporan, penulisan kritik, atau
tinjauan suatu masalah; dan pengutipan tersebut tidak merugikan kepentingan

IPB
Dilarang mengumumkan dan memperbanyak sebagian atau seluruh karya tulis ini
dalam bentuk apa pun tanpa izin IPB

VALIDASI KIT EIA KOMERSIAL UNTUK ANALISA
HORMON ESTRADIOL DAN PROGESTERON
PADA KAMBING KACANG (Capra hircus) BETINA

DEDI RAHMAT SETIADI

Tesis
sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
Magister Sains pada
Program Studi Biologi Reproduksi

SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2014

Penguji Luar Komisi pada Ujian Tesis: drh Amrozi, PhD

PRAKATA
Puji dan syukur penulis panjatkan kepada Allah SWT atas segala
karuniaNya sehingga karya ilmiah ini berhasil diselesaikan. Penelitian ini
berkaitan dengan validasi kit EIA komersial dengan menggunakan sampel darah
kambing kacang berupa plasma. Sampai saat ini kit EIA komersial tersebut belum
ada yang dapat dijadikan sebagai rujukan atau referensi untuk digunakan karena
memiliki sensitifitas yang berbeda. Kepekaan ini penting untuk diketahui karena
berhubungan erat dengan jumlah konsentrasi hormon yang dapat diketahui oleh
kit EIA komersial tersebut. Karya ilmiah ini juga berisikan informasi mengenai
protokol analisa hormonal untuk sampel kambing kacang serta produk kit EIA
komersial yang tepat dan selanjutnya dapat dipergunakan sebagai bahan referensi
untuk pemeriksaan hormon dalam sampel darah dari ternak tersebut.
Terimakasih penulis sampaikan kepada Prof Dr drh Iman Supriatna
sebagai ketua komisi pembimbing dan Dr drh Muhammad Agil, MScAgr selaku
anggota komisi pembimbing atas bimbingan, arahan, perhatian dan nasehat
selama melakukan penelitian dan penulisan karya ilmiah ini.
Penghargaan disampaikan penulis kepada Ketua Program Studi Biologi
Reproduksi Sekolah Pascasarjana Institut Pertanian Bogor, Kepala Bagian

Reproduksi dan Kebidanan, seluruh staf pendidik dan kependidikan Bagian
Reproduksi dan Kebidanan, Departemen Klinik, Reproduksi dan Patologi, FKHIPB yang telah memberikan ijin sekolah, dukungan dan membantu kepada penulis
dalam menempuh studi hingga selesainya penulisan karya ilmiah ini.
Perhargaan setinggi-tingginya penulis sampaikan kepada Dr drh
Muhammad Agil,MScAgr yang telah mendorong, mendukung dan masukannya
pada saat penulis akan menempuh dan mengikuti studi pada Program Studi
Biologi Reproduksi. Ucapan terimakasih juga disampaikan kepada drh Santoso
dan drh Andriyanto,MSi sebagai rekan kerja dan yang telah membantu selama
penelitian, tak lupa kepada seluruh rekan-rekan pada Program Studi Biologi
Reproduksi 2011 penulis ucapkan terimakasih.
Dengan penuh rasa hormat penulis persembahkan kepada Ayahanda (alm)
Muhammad Dadjri, ibunda Rasimi dan seluruh keluarga atas doa, dukungan dan
kasih sayang yang diberikan. Terimakasih disampaikan kepada seluruh pihak
yang tidak dapat disebutkan satu persatu yang telah memberikan perhatian dan
dukungan kepada penulis.
Karya ilmiah ini didedikasikan untuk istri tersayang ‘Yuli Yulianti’ dan
anak-anakku ‘Rifaa Mufiidah Setiadi’, ‘Fahmida Shaista Setiadi’ dan ‘Muhafiz
Rohail Setiadi’ yang tidak ada lelahnya mendukung selama penulis menempuh
studi. Akhirnya, semoga karya ilmiah berupa tesis ini dapat memberikan
informasi yang bermanfaat dan berguna.

Bogor, Maret 2014

Dedi Rahmat Setiadi

DAFTAR ISI
DAFTAR GAMBAR
1 PENDAHULUAN
Latar Belakang
Kerangka Pemikiran
Tujuan Penelitian
Manfaat Penelitian
Hipotesis
Pertanyaan Saintifik yang Harus Dijawab
2 TINJAUAN PUSTAKA
Kambing Kacang
Taksonomi
Morfologi dan Biologi
Biosintesis Dan Metabolisme Hormon Steroid:Estradiol dan
Progesteron
Kit EIA Komersial

3 MATERI DAN METODE
Waktu dan Tempat Penelitian
Materi Penelitian
Metode Penelitian
Tahap I Monitoring Pola Siklus Estrus pada Kambing Kacang
Analisa Hormon Estradiol dan Progesteron selama Siklus Estrus
Monitoring Siklus Ovarium Menggunakan USG
Tahap II Validasi Beberapa Kit Komersial
Uji Paralelisme
Optimalisasi Standard Kurva Hormon Asai
Sensitivitas Kit EIA
Presisi Kit EIA
Intra- dan Inter-Assay Variation
Analisa Hormon
Prosedur Asai Hormon
Hormon Estradiol DRG Jerman (EIA-2693)
Hormon Progesteron DRG Jerman (EIA-1561)
Hormon Estradiol GBC Taiwan (4S00071)
Hormon Progesteron GBC Taiwan (4S00121)
4 HASIL DAN PEMBAHASAN

Validasi Kit
Gambaran Morfologi dan Perkembangan Struktur Fungsional Ovari
(Folikel dan CL)
Analisa Hormon
5 SIMPULAN DAN SARAN
Simpulan
Saran
DAFTAR PUSTAKA

x
1
1
2
2
3
3
3
3
3
3
4
4
6
8
8
8
9
9
9
9
10
10
10
11
11
11
12
12
12
12
13
13
14
14
17
19
24
24
24
24

DAFTAR GAMBAR
1
2
3
4

5

6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17

Kambing kacang berwarna campuran (coklat dan putih)
Transformasi biokimia utama yang terjadi pada hormon steroid
Mekanisme kerja hormon steroid
Kurva sampel sejajar dengan kurva standar menggunakan kit
EIA komersial estradiol dari produk DRG International Inc.,
Jerman
Kurva sampel sejajar dengan kurva standar menggunakan kit
EIA komersial progesteron dari produk DRG international
Inc.,Jerman
Kurva sampel tidak sejajar dengan kurva standar menggunakan
kit EIA komersial estradiol GBC Taiwan
Kurva sampel tidak sejajar dengan kurva standar menggunakan
kit EIA komersial progesteron GBC Taiwan
Vulva kambing kacang yang diduga estrus (a) dan tidak estrus
(b)
Pertumbuhan folikel 4.3 mm dan 4.9 mm pada ovarium kanan (a)
dan CL 4.0 mm dan 4.6 mm pada ovarium kiri (b)
Ukuran ovarium kiri (a) dan kanan (b) tanda panah
Profil hormon E2 (pg/mL, warna biru) dan P4 (ng/mL, warna
merah) kambing kacang 5 selama 9 minggu (62 hari)
Ukuran folikel dan CL kambing kacang 5 yang terdeteksi dengan
USG
Profil hormon E2 (pg/mL, warna biru) dan P4 (ng/mL, warna
merah) kambing kacang 9 selama 9 minggu (62 hari)
Ukuran folikel dan CL kambing kacang 9 yang terdeteksi dengan
USG
Profil hormon E2 (pg/mL, warna biru) dan P4 (ng/mL, warna
merah) kambing kacang 7 selama 9 minggu (62 hari)
Ukuran folikel dan CL kambing kacang 7 yang terdeteksi dengan
USG
Pertumbuhan dan perkembangan folikel dan CL kambing kacang
7 hari ke 50–54, vesica urinaria (VU)

4
5
6

14

15
16
17
18
18
19
19
20
20
20
21
22
23

1 PENDAHULUAN
Latar Belakang
Enzyme immunosorbent assay (EIA) adalah suatu teknik yang
menghubungkan spesifitas antibodi dengan kepekaan uji enzimatis dengan
spektrofotometer biasa atau antigen yang dilekatkan pada enzim. Ciri utama dari
teknik ini adalah dipakai indikator enzim untuk reaksi imunologi. Penggunaan
reaksi antigen-antibodi sebagai alat analisa telah menimbulkan revolusi dalam
berbagai ilmu–ilmu biomedis. Reaksi ini tidak hanya bermanfaat untuk
mendiagnosa penyakit infeksi dengan cara mendeteksi respons antibodi, tetapi
telah digunakan pula secara meluas untuk mendeteksi antigen seperti hormon.
Analisa dengan menggunakan metoda EIA telah terbukti cocok untuk
menggantikan teknik radio immunoassay (RIA) yang memiliki berbagai
kelemahan. Pendekatan EIA ini memiliki berbagai keunggulan dibandingkan RIA
antara lain: tidak perlu menggunakan bahan radioaktif, label yang stabil sehingga
dapat disimpan lebih lama, deteksi aktivitas enzim hanya memerlukan alat
fotometri (Entwistle dan Ridd 1995).
Penggunaan metoda EIA dalam analisa hormon baik untuk riset maupun
penerapan klinis terus mengalami peningkatan. Keunggulan yang dimiliki metoda
EIA mengakibatkan teknik ini cepat populer. Di negara berkembang EIA lebih
memungkinkan untuk dilakukan dibandingkan dengan RIA karena tidak
membutuhkan pemakaian isotop. Berdasarkan alasan–alasan di atas maka perlu
adanya suatu kajian untuk menganalisa metoda EIA untuk analisa hormon
khususnya hormon reproduksi.
Kaitannya dengan hormon reproduksi, sekarang ini banyak monitoring
status dan evaluasi potensi reproduksi yang telah melakukan analisa hormon
reproduksi menggunakan kit EIA pada hewan domestik seperti pada domba,
kambing dan sapi. Disamping itu, dewasa ini ada beberapa produk kit EIA
komersial yang dapat dipergunakan untuk pengujian konsentrasi hormon, tetapi
belum ada dari produk tersebut yang dapat dijadikan sebagai rujukan dalam
penggunaannya untuk hewan. Sebagian besar sampel yang dipergunakan adalah
darah dalam bentuk serum atau plasma.
Disamping itu pula, dewasa ini banyak sekali produk kit EIA komersial
yang dapat dipergunakan untuk pengujian konsentrasi hormon, tetapi belum ada
dari produk tersebut yang dapat dijadikan sebagai rujukan dalam penggunaannya,
sehingga perlu adanya skrining untuk hal tersebut. Oleh karena itu, maka
pengujian atau analisa ke dua hormon ini menggunakan dua kit EIA komersial
berbeda yang berasal dari perusahaan produk biologis yang berbeda diantaranya
progesteron dan estradiol (GBC) dari Taiwan dan progesteron dan estradiol
(DRG) dari Jerman, sekaligus untuk menguji kepekaan dari kedua macam kit
komersial tersebut.
Kepekaan ini penting untuk diketahui karena berhubungan erat dengan
jumlah konsentrasi hormon yang dapat dideteksi oleh kit EIA komersial tersebut
(pikogram (pg) atau nanogram (ng)), dan nantinya akan dijadikan sebagai bahan
rujukan atau referensi untuk dipergunakan pada analisa hormon estradiol dan
progesteron berikutnya.

2
Kerangka Pemikiran
Perkembangbiakan suatu jenis hewan tidak terlepas dari peran hormon
yang berasal dari organ reproduksinya, pada betina ovarium. Ovarium disamping
berfungsi sebagai kelenjar eksokrin yaitu menghasilkan sel telur, juga berfungsi
sebagai kelenjar endokrin yaitu menghasilkan hormon estrogen dan progesteron.
Kualitas ovarium sangat menentukan dalam menghasilkan kedua hormon tersebut.
Disamping itu pula banyak penelitian di bidang peternakan dan kedokteran
melakukan pengujian hormon reproduksi berkaitan dengan siklus estrus hewan,
dengan menggunakan sampel darah berupa serum atau plasma. Hal ini dilakukan
untuk melihat pola siklus estrus dengan mengacu pada konsentrasi hormon yang
dikandungnya.
Untuk melakukan analisa kadar konsentrasi hormon ini diperlukan suatu
teknik yang akurat dan tidak berbahaya bagi lingkungan yaitu dengan teknik EIA
menggunakan kit komersial. Tetapi kit komersial tersebut sampai saat ini belum
ada yang dapat dijadikan sebagai rujukan atau referensi untuk digunakan dalam
analisa hormon estradiol dan progesteron secara tepat, karena kit komersial
tersebut memiliki sensitifitas yang berbeda. Oleh karena itu, perlu dilakukan uji
kit komersial yang dimaksud terhadap sampel-sampel darah yang berasal dari
ternak.
Kurangnya parameter pendukung (parameter biologi) pada saat koleksi
sampel seperti tingkah laku hewan, waktu koleksi sampel (pagi, siang atau
malam), perubahan eksternal (adanya lendir, kebengkakan, kemerahan) dan
seterusnya, sehingga pada saat dilakukan uji validasi biologi tidak cocok dengan
hasil analisa hormon yang didapat.
Pada analisa hormon dengan menggunakan metoda EIA ini, diperlukan
suatu perbandingan pengenceran untuk sampel-sampel yang akan dianalisa, tetapi
pada kenyataannya hal tersebut belum ada. Perbandingan pengenceran ini penting
untuk mendapatkan suatu nilai konsentrasi hormon yang tidak menyimpang dari
perhitungan standar sehingga nilai tersebut dapat diterima. Didapatkan kit
komersial yang tepat sebagai protokol yang dapat digunakan untuk analisa
hormon pada ternak
Tujuan Penelitian
Tujuan dari pelaksanaan penelitian ini adalah (1) menentukan kelaikan kit
EIA komersial estradiol dan progesteron untuk manusia, yang akan dipergunakan
untuk monitoring status reproduksi kambing kacang sehingga dapat dijadikan
sebagai bahan referensi untuk pemeriksaan hormon dalam sampel darah kambing
kacang, (2) menghasilkan protokol analisa hormon untuk sampel dari kambing
kacang betina.

3
Manfaat Penelitian
Manfaat yang diharapkan dari pelaksanaan penelitian ini adalah
memberikan informasi tentang produk kit EIA komersial yang tepat untuk
digunakan dalam pemeriksaan hormon reproduksi dari sampel plasma darah pada
kambing kacang betina serta menghasilkan protokol analisa hormon yang dapat
dijadikan referensi untuk pemeriksaan hormon reproduksi pada ternak.
Hipotesis
Antibodi terhadap analisa hormon reproduksi manusia dapat dipakai untuk
mendeteksi hormon reproduksi pada ternak.
Pertanyaan Saintifik yang Harus Dijawab
Apakah kit EIA komersial estradiol dan progesteron untuk manusia dapat
digunakan untuk analisa hormon yang sama pada kambing kacang betina dan
apakah kit ELISA komersial dari produk yang berbeda, memiliki keakuratan atau
sensitivitas yang tidak sama.

2

TINJAUAN PUSTAKA
Kambing Kacang

Taksonomi
Kambing kacang merupakan salah satu plasma nutfah yang dimiliki oleh
bangsa Indonesia dan belum tereksploitasi secara optimal, oleh karena itu
diperlukan kegiatan eksplorasi maupun eksploitasi kambing kacang tersebut
sehingga dapat dimanfaatkan untuk peningkatan produktifitasnya. Domestikasi
kambing pada awalnya terjadi di daerah pegunungan asia barat sekitar tahun
8000-7000 SM. Kambing (Capra aegagrus hircus) yang dipelihara berasal dari 3
kelompok kambing liar yang telah dijinakkan yaitu kambing bezoar atau kambing
liar eropa (Capra aegagrus), kambing liar India (Capra aegagrus blithy) dan
kambing makhor di pegunungan Himalaya (Capra falconeri). Sebagian besar
kambing yang diternakkan di Asia berasal dari keturunan bezoar (Pamungkas et
al. 2009).
Terdapat 2 rumpun kambing yang dominan di Indonesia yaitu kambing
kacang dan kambing etawah. Kambing kacang berukuran kecil, sudah ada di
Indonesia sejak tahun 1900-an dan menyusul kemudian kambing etawah yang
memiliki tubuh lebih besar (Setiadi et al. 2002). Sistematika atau klasifikasi
kambing termasuk kambing kacang adalah sebagai berikut : kingdom Animalia,
filum Chordata, subfilum Vertebrata, kelas Mammalia, ordo Artiodactyla, famili
Bovidae, sub famili Caprinae, genus Capra, species Capra hircus (Wilson dan
DeeAnn 2005).

4
Morfologi dan Biologi
Kambing kacang merupakan kambing asli Indonesia, juga terdapat di
Malaysia dan Philipina (Pamungkas et al. 2009), mempunyai bobot hidup lebih
kecil dibanding kambing jenis lainnya (Mahmilia et al. 2009), jantan memiliki
bobot 25 kg sedangkan betina 22 kg (Pamungkas et al. 2009). Keunggulan
kambing kacang adalah mudah beradaptasi dengan lingkungan setempat dan pada
umur 15–18 bulan dapat menghasilkan keturunan (Boer Indonesia 2008).
Kambing ini menyebar di seluruh wilayah Indonesia, cocok sebagai
penghasil daging dan kulit dan bersifat prolifik. Menurut Sodiq dan Tawfik (2003)
kambing yang paling banyak dijumpai di Indonesia adalah kambing kacang dan
kambing peranakan etawah (PE). Kambing kacang memiliki ciri-ciri bulu pendek
dan berwarna tunggal (putih, hitam dan coklat), ada juga campuran dari ketiga
warna tersebut, kambing jantan berbulu surai panjang dan kasar sepanjang garis
leher, pundak, punggung sampai ekor. Janggut selalu terdapat pada jantan, pada
betina jarang ditemukan. Kambing jantan maupun betina memiliki tanduk yang
berbentuk pedang, melengkung ke atas sampai ke belakang, telinga pendek dan
menggantung (Pamungkas et al.2009).

Gambar 1 Kambing kacang berwarna campuran (coklat dan putih).
Biosintesis dan Metabolisme Hormon Steroid: Estradiol dan Progesteron
Hormon steroid disekresikan oleh gonad yaitu ovarium dan testis, plasenta
dan korteks adrenal mempengaruhi fungsi hipotalamus, lobus anterior hipofisis
dan jaringan dari saluran reproduksi. Hormon gonad juga memulai pengembangan
karakteristik seks sekunder yang menyebabkan sifat jantan atau sifat betina. Pada
betina, ovarium memproduksi estrogen, progesteron, inhibin, beberapa
testosteron, oksitosin dan relaksin. Pada jantan, testis menghasilkan testosteron
dan androgen lainnya, inhibin dan estrogen. Hormon steroid disintesis dari
kolesterol melalui serangkaian jalur kompleks dan melibatkan banyak konversi
enzimatik (Senger 2003). Gambar 2 merupakan ilustrasi transformasi biokimia
utama yang terjadi pada jalur hormon steroid.
Kolesterol (C27) menjadi pregnenolon (C20) selanjutnya diubah menjadi
progesteron (C21) kemudian pada gilirannya dikonversi menjadi androgen (C19)
dan estrogen (C18) (Hafez et al. 2000)

5

Gambar 2 Transformasi biokimia utama yang terjadi pada hormon steroid
(Senger 2003).
Jalur biosintesis dalam semua organ endokrin yang menghasilkan hormon
steroid adalah sama hanya berbeda dalam sistem enzim yang dikandungnya, testis
terutama mensintesis androgen, sedangkan ovarium mensintesis dua jenis yaitu
estrogen dan progestin. Dalam plasma darah, hormon steroid sebagian besar
terikat oleh albumin, suatu plasma protein dengan afinitas rendah dan kapasitas
tinggi (Hafez et al. 2000)
Estrogen yang dihasilkan merupakan tahap akhir dari steroidogenesis
dalam folikel matang dan diturunkan dari prekursor androgenik. Terdapat dua
androgen sebagai sumber estrogen yaitu androstenedion dan testosteron (Agil
2007). Aromatase diinduksi oleh follicle stimulating hormone (FSH) dalam
pertumbuhan sel granulosa yang bertindak mengkonversi kedua androgen menjadi
estron atau estradiol. Estradiol adalah estrogen utama, dengan estron dan estriol
secara metabolik mewakili estrogen aktif lainnya.
Pada ruminansia, estrogen juga memiliki efek protein anabolik untuk
meningkatkan pertambahan berat badan dan pertumbuhan. Mekanisme untuk
meningkatkan pertumbuhan mungkin karena kemampuan estrogen merangsang
hipofisis untuk melepaskan lebih banyak hormon pertumbuhan (Hafez et al.
2000).
Progesteron adalah umum, yang terjadi secara alami adalah progestogen
dan disekresikan oleh sel luteal korpus luteum, plasenta, dan kelenjar adrenal.
Progesteron diangkut dalam darah oleh globulin seperti untuk androgen dan
estrogen. Luteinizing hormone (LH) terutama merangsang sekresi progesterone
(Hafez et al. 2000).

6
Hormon steroid dimetabolisir oleh banyak jaringan dalam tubuh termasuk
hati, ginjal, otot dan darah (Schulster et al. 1976), meskipun demikian
metabolisme utama terjadi di hati.
Mekanisme kerja hormon-hormon steroid (estrogen dan progesteron)
berdifusi melalui plasma membran, membran sitoplasma dan inti sel dari sel
target. Mengikat reseptor di inti sel yang memicu terbentuknya mRNA dan
akhirnya terjadi sintesis protein baru (Gambar 3).

Gambar 3 Mekanisme kerja hormon steroid (Senger 2003).
Kit EIA Komersial
Enzim immunosorbent assay (EIA) merupakan teknik pengujian serologi
yang didasarkan pada prinsip interaksi antara antibodi dan antigen. Pada awalnya
metoda EIA hanya digunakan dalam bidang imunologi untuk mendeteksi
keberadaan antigen maupun antibodi dalam suatu sampel seperti dalam
pendeteksian antibodi IgM, IgG, dan IgA pada saat terjadi infeksi (pada tubuh
manusia khususnya). Namun seiring dengan perkembangan ilmu pengetahuan,
metoda EIA juga diaplikasikan dalam bentuk lain termasuk menganalisa kadar
hormon yang terdapat dalam suatu organisme. Secara singkat dapat dikatakan
bahwa teknologi EIA yang digunakan untuk asai hormon dalam cairan tubuh
adalah sistem competitive enzyme immunoassay yang analog dengan metoda radio
immunoassay (RIA). Immunoassay didasarkan pada reaksi kekebalan untuk
pengukuran berbagai analit (misalnya antibodi, hormon) dalam bahan biologis
(misalnya darah, urin, feses). Jenis yang paling umum dari prosedur immunoassay
adalah competitive binding assay (Heistermann et al. 1993), ini adalah metode
yang tepat dan sensitif untuk memperkirakan ng/mL sampai pg/mL dalam larutan,
seperti serum, urin, sperma dan kultur supernatan (Savige 1998). EIA telah
banyak digunakan dalam penelitian ilmu kehidupan (Ma et al. 2004). Jenis uji

7
yang diatur oleh hukum aksi massa di mana antigen tanpa label (Ag) dan antigen
berlabel (Ag*) bersaing untuk pengikatan sejumlah antibodi (Ab).
Antigen yang berlabel dan antigen yang tidak berlabel saling bersaing
untuk berikatan dengan antibodi yang terdapat dalam jumlah terbatas. Contoh
reaksi seperti ini adalah EIA untuk mengukur progesteron, estradiol dan kortisol.
Pengukuran hormon kortisol dalam saliva menggunakan teknik EIA dapat
mengetahui tingkat stres yang di alami oleh organisme (Haussmann et al. 2007).
Uji EIA ini memiliki beberapa keunggulan seperti teknik pengerjaan yang
relatif sederhana, ekonomis, dan memiliki sensitivitas yang cukup tinggi serta
tidak menggunakan radioaktif. EIA diperkenalkan pada tahun 1971 oleh Peter
Perlmann dan Eva Engvall untuk menganalisa adanya interaksi antigen dengan
antibodi di dalam suatu sampel dengan menggunakan enzim sebagai label
(Lequin 2005).
Enzyme immunosorbent assay secara khusus memiliki konjugat dan
substrat yang menghasilkan beberapa bentuk perubahan warna yang dapat diamati
untuk mengetahui kehadiran antigen atau analit. Metoda EIA terbaru seperti
flurogenik, electrochemiluminescent dan real time PCR dibuat untuk mengetahui
sinyal kuantitatif. Metoda ini dapat memberikan berbagai keuntungan diantaranya
sensitivitas yang tinggi dan bersifat multiflexing (Leng et al. 2008).
Metoda
EIA
merupakan
teknik
kuantitatif
yang
sangat
sensitif, penggunaannya sangat luas, memerlukan peralatan yang sedikit, reagen
yang diperlukan sudah tersedia dan dijual secara komersial dan sangat mudah
didapat. Pemeriksaan EIA dapat digunakan untuk mendeteksi antibodi atau
hormon dalam tubuh manusia maupun hewan. Tes ini dapat dilakukan dengan kit
yang sudah jadi atau dapat juga dilakukan dengan menggunakan antigen yang
diracik sendiri (Setiawan 2007). Pada hewan, kit EIA ini sebagian besar
digunakan untuk mengetahui kandungan kadar hormon tertentu (misalnya
estradiol atau progesteron). Kandungan hormon ini biasanya berkaitan erat dengan
siklus reproduksi hewan.
Ada beberapa produsen kit EIA diantaranya DRG International,Inc.
Jerman, General Biological Corporation (GBC) Taiwan, ARP American
Research Products (ARP), Inc. Amerika Serikat, Cosmo Bio Co, Ltd dan lain-lain.
Banyak peneliti yang sudah menggunakan kit EIA untuk tujuan penelitian atau
mengevaluasi kit EIA tersebut. Kit EIA komersial yang ada di Indonesia saat ini
adalah DRG International Inc. dari Jerman dan GBC dari Taiwan.
Secara praktis, metoda yang dapat dipercaya untuk monitoring fungsi
gonad sering sangat penting untuk mengkaji status reproduksi individu hewan,
mendiagnosa masalah kesuburan, dan untuk membantu mengembangkan dan
menggunakan teknologi reproduksi ketika perkembangbiakan secara alamiah
gagal dan/atau manajemen genetik ditingkatkan dengan kriopreservasi plasma
nutfah (Graham et al. 2001). Haisenleder et al. (2011), telah melakukan evaluasi
terhadap sembilan komersial EIA kit estradiol yang akan digunakan dengan serum
tikus, yaitu dengan komponen recovery dan korelasi. Kit EIA komersial yang
dipergunakan berasal dari Calbiotech Enzyme Immunoassay. Ada juga peneliti
dari Italia, Todini et al. (2007) mengevaluasi kesesuaian dua kit EIA Komersial
manusia (Estradiol EIA-2693, DRG Instruments GmbH, Marburg, Germany),
untuk mengukur konsentrasi Inhibin-A (In-A) dan 17 β Estradiol (E2) dalam
plasma kerbau, dan hasil yang diperoleh adalah bahwa kit yang diuji tersebut

8
cocok dan dapat diandalkan untuk sampel plasma kerbau. Konsentrasi steroid
yang bersirkulasi bebas dianggap sebagai yang paling akurat merefleksikan fungsi
dari gonad, namun pengumpulan yang tetap sampel darah bisa sulit dilakukan
pada hewan non-domestik (Graham et al. 2001).
Selain kit EIA estradiol, kit EIA progesteron pun dapat digunakan untuk
evaluasi, seperti untuk menentukan akurasi dari dua kit EIA yang tersedia secara
komersial dalam membedakan antara tinggi dan rendahnya konsentrasi
progesteron (P4) pada serum babi betina (kit EIA Progestassay, Synbiotics Corp.,
San Diego, California dan kit EIA Target, Biometalics, Princeton, New Jersey),
dimana sasaran tes kit EIA bekerja dengan baik pada pengukuran semi kuantitatif
konsentrasi progesteron (P4) serum babi (Althouse dan Hixon, 1999).
Pada penelitian lain, kandungan hormon progesteron dan estradiol dalam
darah juga telah dilakukan pengujian dengan menggunakan kit EIA komersial
(Fertigenix-Prog-Easia, Biosource Europe, SA dan Fertigenix-E2-Easia,
Biosource Europe, SA) terhadap domba jenis akkaraman di Turki, dalam
penelitian ini Risvanli et al. (2010) menunjukkan bahwa efek dosis tunggal analog
PGF2α terhadap berbagai konsentrasi hormon dan tingkat kebuntingan pada
domba nulipara dan domba multipara, ditemukan secara signifikan penurunan
kadar progesteron pada hari penyuntikan, setelah 24 jam dan 48 jam. Selain
domba, pada kambing pun telah dilakukan pengujian hormon progesteron dengan
menggunakan kit EIA progesteron sapi (Progestassay, Pitman Moore,
Washington Crossing, New Jersey) cepat dan tidak mahal (Sherrill et al. 1990).

3

METODE

Waktu dan Tempat Penelitian
Pengambilan dan koleksi sampel berupa darah dari kambing kacang dan
pemeriksaan hormon dilakukan di Laboratorium Unit Rehabilitasi Reproduksi,
Bagian Reproduksi dan Kebidanan, Departemen Klinik, Reproduksi dan Patologi,
Fakultas Kedokteran Hewan, Institut Pertanian Bogor dari bulan Nopember 2012
sampai dengan Pebruari 2013.
Materi Penelitian
Hewan percobaan yang dipergunakan adalah 3 ekor kambing kacang
betina yang dipelihara dikandang percobaan Unit Rehabilitasi Reproduksi, Bagian
Reproduksi dan Kebidanan, Departemen Klinik, Reproduksi dan Patologi FKHIPB, Dramaga, Bogor. Persyaratan ternak ruminansia tersebut berumur 2–3 tahun,
memiliki kualifikasi tubuh yang sehat, status reproduksi memiliki siklus estrus
normal, tidak bunting, pernah beranak (2 kali beranak), dan dikandangkan dalam
kandang individu.
Ultrasonografi (USG) yang dipergunakan untuk memeriksa organ
reproduksi betina (ovarium) pada saat pengambilan darah adalah ALOKA model
SSD-500, tegangan listrik 200-240 volt, 50/60 Hz (ALOKA Co.LTD,Tokyo,
Jepang), dengan probe linear 7,5 MHz. Kit EIA komersial yang dipergunakan
dalam validasi ini adalah kit komersial untuk manusia yang diproduksi oleh DRG

9
International Inc., Jerman dan GBC, Taiwan khusus untuk hormon estradiol dan
progesteron.
Metode Penelitian
Penelitian ini merupakan penelitian eksploratif dalam penentuan profil
hormon estradiol dan progesteron pada kambing kacang betina. Parameter yang
diukur adalah konsentrasi estradiol dan progesteron dalam plasma darah selama 9
minggu (62 hari). Data berupa gejala klinis, konsentrasi hormon, perubahan
struktur fungsional ovaria, folikel dan corpus luteum (CL) dianalisa menggunakan
metoda komparatif deskriptif.
Penelitian ini terdiri atas beberapa tahap kegiatan di lapang dan di
laboratorium. Kegiatan di lapang meliputi pengambilan sampel darah dan
pemeriksaan USG. Kegiatan laboratorium meliputi analisis hormon yang berasal
dari plasma darah.
Metode penelitian yang dilakukan adalah sebagai berikut :
Tahap I. Monitoring Pola Siklus Estrus pada Kambing Kacang
Analisa Hormon Estradiol dan Progesteron selama Siklus Estrus
Pengambilan sampel darah dilakukan selama 9 minggu (62 hari) melalui
vena jugularis (di leher) menggunakan tabung vakum yang berantikoagulan
mengandung K3 EDTA 1.8 mg/mL (Disposable Evacuated Blood Collection
Tubes, Zhejiang U-REAL Medical Technology Co. Ltd) untuk pembuatan plasma
yang akan dianalisa konsentrasi hormon estradiol dan progesteronnya.
Rekomendasi yang disarankan oleh NCCLS (2004) bahwa konsentrasi EDTA
yang digunakan sebagai antikoagulan harus mengandung 1.5–2.2 g/L, dan WHO
(2002) menganjurkan menggunakan konsentrasi EDTA 1.2–2.0 mg/mL. Volume
darah segar yang diambil sebanyak 5 mL. Pengambilan darah dilakukan setiap
dua hari sekali dan diintensifkan menjadi setiap hari menjelang fase estrus. Darah
segar disentrifugasi dengan kecepatan 1500–2000 G selama 10 menit (LT 2007),
plasma yang diperoleh dituangkan ke dalam tabung microtube 2 mL, kemudian
disimpan pada suhu -20ºC sampai dilakukan analisa di laboratorium.
Analisa hormon menggunakan kit EIA komersial untuk estradiol dan
progesteron. Metoda analisa sesuai dengan prosedur yang diberikan oleh kit yang
bersangkutan.
Monitoring Siklus Ovari Menggunakan USG
Pemeriksaan organ reproduksi primer (ovarium) dilakukan untuk
mengetahui perkembangan folikel dan corpus luteum selama periode pengamatan
tersebut. Pemeriksaan ini dilakukan bersamaan dengan pengambilan darah.
Ultrasonografi yang dipergunakan untuk memeriksa organ reproduksi betina
(ovarium) pada saat pengambilan darah adalah ALOKA model SSD-500,
tegangan listrik 200–240 volt, 50/60 Hz (ALOKA Co.LTD,Tokyo, Jepang),
dengan probe linear 7,5 MHz. Probe tersebut dimodifikasi dengan diberikan
tambahan gagang sepanjang 30 cm di bagian pangkal sebagai pegangan pada saat
pemeriksaan secara per rektal.
Monitoring siklus ovari ini untuk mengetahui kandungan hormon estradiol
dan progesteron dalam darah pada saat adanya perkembangan folikel dan corpus

10
luteum. Gambaran folikel dan corpus luteum berupa foto dicetak menggunakan
printer termal (Sony Up-895 MD, Jepang). Data yang diperoleh akan dicocokkan
dengan konsentrasi hormon estradiol dan progesteron yang berasal dari hasil
analisa sampel darah di laboratorium.
Tahap II. Validasi Kit Komersial
Validasi ini dilakukan terhadap dua kit komersial estradiol (E2) dan
progesteron (P4) untuk manusia dari 2 perusahaan produk biologis yang berbeda
yaitu DRG internasional Inc., Jerman dan GBC Taiwan. Validasi ini untuk
membandingkan dan menentukan akurasi, sensitivitas dan presisi dari kedua kit
EIA komersial dalam menganalisa hormon E2 dan P4 pada sampel plasma darah
kambing kacang betina.
Validasi kit EIA komersial, dilakukan melalui prosedur dengan tahapan
sebagai berikut :
Uji Paralelisme
Uji paralelisme adalah uji penentuan kemampuan (dalam kisaran tertentu)
kit EIA untuk memberikan hasil yang berbanding lurus dengan konsentrasi
(jumlah) dari analit dalam sampel (Ederveen 2010). Pengujian ini juga dilakukan
untuk menentukan apakah kit EIA yang digunakan dapat mendeteksi keberadaan
hormon tertentu yang diketahui. Disamping itu dengan uji paralelisme dapat
digunakan untuk mengukur perbandingan pengenceran yang tepat pada saat akan
menganalisa sampel. Hal ini sangat penting dilakukan terhadap kit EIA yang
baru dan belum pernah digunakan untuk menganalisa hormon tertentu pada satu
spesies. Disamping itu uji tersebut penting untuk mengetahui pengenceran
sampel yang tepat digunakan untuk analisa sehingga menghasilkan angka
konsentrasi hormon dalam batas nilai yang valid pada garis linear dari kurva
hormon standar.
Menurut Dunn (2007), tujuan uji paralelisme adalah (1) untuk menentukan
apakah dua zat memiliki kesamaan respon biologis (menunjukkan zat yang
sama) dan (2) untuk menentukan apakah dua lingkungan biologis yang berbeda
akan memberikan kurva respon yang mirip dengan zat yang sama. Lee (2009)
menyampaikan juga bahwa paralelisme adalah uji linieritas pengenceran sampel
otentik, tujuannya adalah untuk menunjukkan bahwa analit endogen dalam
sampel yang tidak diketahui, yang mungkin berbeda dan/atau bervariasi dari
standar menunjukkan hasil yang sama, terlepas dari pengenceran standar.
Perbandingan pengenceran ini didapat dengan melihat kurva, yaitu
membandingkan antara kurva standar dengan kurva sampel yang diuji, biasanya
dilakukan beberapa perbandingan pengenceran (5 perbandingan bertingkat).
Apabila kurva sampel yang diuji sejajar (paralel) dengan kurva standar berarti
hormon asai yang digunakan dapat mendeteksi keberadaan hormon yang akan
dianalisa.
Optimalisasi Standar Kurva Hormon Asai
Penentuan posisi 30% binding dan 70% binding, dimana kisaran
persentase ini akan menentukan angka konsentrasi hormon hasil pembacaan
yang valid (tingkat kepercayaan yang tinggi) sehingga dapat dihitung kadar
hormon yang sebenarnya dari sampel yang diperiksa. Menurut Brown et al.

11
(2005) batas asai adalah 20%-80%, aturan batas asai ini didasarkan pada asumsi
bahwa kurva standar paling linier antara 20%-80% binding.
Sensitivitas Kit EIA
Sensitivitas adalah kemampuan untuk mendeteksi sejumlah kecil antigen
(Brown et al. 2005), jumlah minimum hormon yang dapat dideteksi (Hodges et
al. 2010, Hodges dan Heistermann 2011). Sensitivitas merupakan konsentrasi
terendah dari antigen yang dapat dibedakan secara statistik, dan bertujuan untuk
menentukan nilai dua simpangan baku (2 SD) dari respon rata-rata blank (B0)
dan menentukan nilai maksimum binding 90% atau 95% (Brown et al.2005).
Presisi Kit EIA
Presisi mengacu pada pengulangan nilai yang diukur atau konsistensi hasil
(Brown et al.2005), di dalam dan antara pengulangan asai (Hodges et al. 2010,
Hodges dan Heistermann 2011). Presisi adalah ukuran dari kesalahan acak yang
didefinisikan sebagai variasi antara pengukuran ulangan dari sampel yang
ditetapkan, dinyatakan sebagai koefisien variasi (%CV) yang merupakan standar
deviasi/rata-rata x 100 (Brown et al. 2005). Menurut ICH (2005) menyatakan
bahwa presisi biasanya dinyatakan sebagai standar deviasi (SD) atau sebagai
koefisien variasi (CV) dari serangkaian pengukuran. Ederveen (2010)
menyatakan bahwa beberapa jenis presisi adalah repeatability, variasi interasai
dan reproducibility.
Intra-dan Inter-Assay Variation
Presisi merupakan suatu kemampuan asai untuk secara konsisten
mereproduksi hasil (nilai) yang diambil dari sampel yang sama. Presisi intra-asai
dan inter-asai adalah dua ukuran yang berbeda yang dapat dibuat sebagai bagian
dari prosedur validasi. Rumus yang digunakan untuk perhitungan persentase
koefisien variasi (% CV) sedikit berbeda dengan rumus konvensional (standar
deviasi dibagi dengan rata-rata dan dikalikan dengan 100).
Reproduktifitas (kualitas yang diulang) hasil pangujian dapat dinilai
dengan menghitung nilai koefisien variasi (CV) dengan membandingkan
konsentrasi rata-rata untuk pengulangan sampel yang sama pada plate yang
berbeda (intra-asai).
Intra-assay variation merupakan suatu pengujian untuk memeriksa
variabilitas pengukuran dalam plate (asai) dan untuk mengontrol kualitas hasil
coating. Pengujian ini akan mendapatkan suatu nilai yang disebut koefisien
variasi (CV) yang berasal dari nilai konsentrasi quality control (QC) high dan
quality control (QC) low. Nilai CV-nya harus kurang dari 10% (Brown et al.
2005).
Inter-assay variation merupakan suatu pengujian untuk memeriksa
variabilitas pengukuran antar plate (asai). Pengujian ini juga akan mendapatkan
suatu nilai koefisien variasi (CV), nilai CV nya dihitung dari rataan konsentrasi
yang berasal dari sampel yang sama dengan plate yang berbeda, pengujiannya
dilakukan oleh tenaga laboratorium (teknisi) yang berbeda. Nilai CV yang dapat
diterima adalah 10-15% (Ederveen 2010).

12
Analisa Hormon
Analisa hormon dilakukan untuk mengetahui konsentrasi hormon estradiol
dan progesteron yang dikandung dalam sampel darah.
Prosedur Asai Hormon
Prosedur asai hormon yang dikerjakan mengikuti prosedur yang diberikan
oleh perusahaan produk biologis DRG International Inc. Jerman dan GBC
Taiwan. Larutan standar estradiol dan progesteron dari DRG International Inc.
mengalami modifikasi untuk mendapatkan slope kurva yang lebih baik serta
ditambahkan kontrol atau QC, sedangkan GBC Taiwan tetap. Menurut Lee (2009)
kit komersial untuk penelitian, QC atau kontrol sampel mungkin tidak tersedia,
hal ini merupakan tanggungjawab analis untuk mengatur QC terhadap
karakterisasi akurasi, presisi dan memantau kinerja asai. Prosedur asai secara
keseluruhan adalah sebagai berikut :
a. Hormon Estradiol DRG Jerman (EIA-2693)
Semua reagen dan sampel harus berada di temperatur ruang. Sampel
plasma darah diencerkan dalam aquabidestilata dengan perbandingan pengenceran
bertingkat dimulai dari 1:0 (orisinal plasma)-1:16. Larutan standar 25 pg/mL dan
100 pg/mL dimodifikasi menjadi larutan standar baru 12.5 pg/mL dan 50 pg/mL
(Tabel 1). Memasukkan masing-masing 25 µL duplo larutan standar, kontrol
(konsentrasi 25 pg/mL dan 250 pg/mL sebagai kontrol 1 dan 2) dan sampel ke
dalam setiap sumur terpilih. Larutan enzim konjugat sebanyak 200 µL ke dalam
setiap sumur kecuali blank, kemudian ditutup dengan cling film dan
dihomogenkan dengan cara digoyangkan secara perlahan selama 10 detik dan
diinkubasikan selama 120 menit pada temperatur ruang. Setelah diinkubasi, setiap
sumur dicuci dengan washing solution masing-masing 400 µL selama 3–4 kali
pencucian, kemudian dihentak-hentakan secara perlahan diatas kertas (absorbence
paper) untuk mengeluarkan cairan dalam sumur-sumur secara tuntas.
Memasukkan larutan substrat 200 µL ke dalam setiap sumur-sumur kemudian
ditutup dengan cling film dan diinkubasi selama 15 menit pada temperatur ruang.
Reaksi enzimatis dihentikan dengan menambahkan stop solution 0.5 M H2SO4
sebanyak 100 µL ke dalam setiap sumur-sumur dan pembacaan absorbance
menggunakan EIA reader otomatis dalam waktu 10 menit dengan panjang
gelombang 450±10 nm.
b. Hormon Progesteron DRG Jerman (EIA-1561)
Semua reagen dan sampel harus berada di temperatur ruang. Sampel
plasma darah diencerkan dalam aquabidestilata dengan perbandingan pengenceran
bertingkat dimulai dari 1:0 (orisinal plasma)-1:16. Larutan standar 1.25 ng/mL, 15
ng/mL dan 40 ng/mL dimodifikasi menjadi larutan standar baru 0.625 ng/mL, 10
ng/mL dan 20 ng/mL (Tabel 1). Memasukkan masing-masing 25 µL duplo larutan
standar, kontrol (konsentrasi 1.25 g/mL dan 10 ng/mL sebagai kontrol 1 dan 2)
dan sampel ke dalam setiap sumur terpilih dan diinkubasi selama 5 menit pada
temperatur ruang. Setelah itu larutan enzim konjugat sebanyak 200 µL ke dalam
setiap sumur kecuali blank, kemudian ditutup dengan cling film dan
dihomogenkan dengan cara digoyangkan secara perlahan selama 10 detik dan
diinkubasikan selama 60 menit pada temperatur ruang. Setelah diinkubasi, setiap

13
sumur dicuci dengan washing solution masing-masing 400 µL selama 3–4 kali
pencucian, kemudian dihentak-hentakan secara perlahan diatas kertas (absorbence
paper). Memasukkan larutan substrat 200 µL ke dalam setiap sumur kemudian
ditutup dengan cling film dan diinkubasi selama 15 menit pada temperatur ruang.
Reaksi enzimatis dihentikan dengan menambahkan stop solution 0.5 M H2SO4
sebanyak 100 µL ke dalam setiap sumur dan pembacaan absorbance
menggunakan EIA reader otomatis dalam waktu 10 menit dengan panjang
gelombang 450±10 nm.
c. Hormon Estradiol GBC Taiwan (4S00071)
Semua reagen dan sampel harus berada di temperatur ruang. Sampel
plasma darah diencerkan dalam aquabidestilata dengan perbandingan pengenceran
bertingkat dimulai dari 1:0 (orisinal plasma)-1:16. Memasukkan masing-masing
25 µL duplo larutan standar, kontrol dan sampel ke dalam sumur terpilih. Setelah
itu larutan enzim konjugat sebanyak 100 µL ke dalam setiap sumur dilanjutkan
dengan 50 µL rabbit anti-estradiol ke dalam setiap sumur kecuali blank, kemudian
ditutup dengan cling film dan dihomogenkan dengan cara digoyangkan secara
perlahan selama 30 detik dan diinkubasikan selama 90 menit pada temperatur
ruang. Setelah diinkubasi, setiap sumur dicuci dengan milli-Q water masingmasing 400 µ L selama 3–4 kali pencucian, kemudian dihentak-hentakan secara
perlahan diatas kertas (absorbence paper). Memasukkan larutan substrat TMB
100 µL ke dalam setiap sumur kemudian ditutup dengan cling film dan diinkubasi
selama 20 menit pada temperatur ruang. Reaksi enzimatis dihentikan dengan
menambahkan stop solution 1N HCl sebanyak 100 µL ke dalam setiap sumur
kemudian dihomogenkan secara perlahan selama 30 detik dan pembacaan
absorbance menggunakan EIA reader otomatis dalam waktu 15 menit dengan
panjang gelombang 450 nm.
d. Hormon Progesteron GBC (4S00121)
Semua reagen dan sampel harus berada di temperatur ruang.
Mempersiapkan larutan siap pakai (working reagent) 0.1 mL progesteron-HRP
konjugat dengan menambahakan 0.9 mL pengencer progesteron-HRP konjugat
(pengenceran 1:10) kemudian dihomogenkan. Sampel plasma darah diencerkan
dalam aquabidestilata dengan perbandingan pengenceran bertingkat dimulai dari
1:0 (orisinal plasma)-1:16. Memasukkan masing-masing 25 µL duplo larutan
standar, kontrol dan sampel ke dalam sumur terpilih. Setelah itu larutan siap pakai
progesteron-HRP konjugat sebanyak 100 µ L ke dalam setiap sumur dilanjutkan
dengan 50 µL rabbit anti-progesteron ke dalam setiap sumur kecuali blank,
kemudian ditutup dengan cling film dan dihomogenkan dengan cara digoyangkan
secara perlahan selama 30 detik dan diinkubasikan selama 90 menit pada
temperatur ruang. Setelah diinkubasi, setiap sumur dicuci dengan milli-Q water
masing-masing 400 µL selama 3–4 kali pencucian, kemudian dihentak-hentakan
secara perlahan diatas kertas (absorbence paper). Memasukkan larutan substrat
TMB 100 µL ke dalam setiap sumur kemudian ditutup dengan cling film dan
diinkubasi selama 20 menit pada temperatur ruang. Reaksi enzimatis dihentikan
dengan menambahkan stop solution 1N HCl sebanyak 100 µL ke dalam setiap
sumur kemudian dihomogenkan secara perlahan selama 30 detik dan pembacaan

14
absorbance menggunakan EIA reader otomatis dalam waktu 15 menit dengan
panjang gelombang 450 nm.
Larutan standar asai yang berasal dari kit EIA komersial estradiol dan
progesteron DRG mengalami modifikasi untuk mendapat slope kurva yang lebih
baik (Tabel 1). Modifikasi standar estradiol dilakukan pada konsentrasi 25 pg/mL
dan 100 pg/mL, masing-masing menjadi 12.5 pg/mL dan 50 pg/mL dengan
quality control 1 (QC1) 25 pg/mL dan QC2 250 pg/mL. Sedangkan untuk standar
progesteron pada konsentrasi 1.25 ng/mL, 15 ng/mL dan 40 ng/mL masingmasing menjadi 0.625 ng/mL, 10 ng/mL dan 20 ng/mL, dengan QC1 1.25 ng/mL
dan QC2 10 ng/mL.
Tabel 1 Larutan standar dari 4 kit EIA komersial original dan modifikasi.
Standar

1
2
3
4
5
6
7
8

P4 DRG (ng/mL)
Original
0.3
1.25
2.5
5
15
40

Modifikasi
0.3
0.625
1.25
2.5
5
10
20
40

P4 GBC
(ng/mL)
Original
0.5
3
10
25
50

E2 DRG (pg/mL)
Original
25
100
250
500
1000
2000

Modifikasi
12.5
25
50
100
250
500
1000

E2 GBC
(pg/mL)
Original
10
30
100
300
1000

4 HASIL DAN PEMBAHASAN
Validasi Kit
Hasil validasi kedua kit EIA komersial dengan melakukan uji paralelisme
menggunakan kit EIA komersial estradiol dan progesteron dari produk DRG
International Inc.,Jerman menunjukan bahwa kurva sampel sejajar dengan kurva
standar (Gambar 4 dan Gambar 5). Jumlah sampel yang diambil secara acak
adalah 5 sampel dari status atau fase yang berbeda dalam 62 hari pengamatan,
kemudian dilakukan pengenceran bertingkat dimulai dari 1:0 (larutan orisinal
tanpa pengenceran), 1:2, 1:4, 1:8, 1:16 untuk setiap sampel tersebut menggunakan
pengencer aquabidestilata.

Gambar 4 Kurva sampel sejajar dengan kurva standar menggunakan kit EIA
komersial estradiol dari produk DRG International Inc.,Jerman.

15

Gambar 5 Kurva sampel sejajar dengan kurva standar menggunakan kit EIA
komersial progesteron dari produk DRG International Inc.,Jerman.
Perbandingan pengenceran yang diperoleh untuk sampel kambing kacang untuk
E2 dan P4 adalah 1:2 dan 1:4.
Angka interval konsentrasi yang diperoleh dari hasil uji paralelisme kedua
kit komersial DRG untuk mendeteksi hormon E2 dan P4 masing-masing adalah
58–190 pg/mL dan 0.5–5.0 ng/mL, berarti nilai konsentrasi hormon sampel
kambing kacang betina harus berada dalam interval angka tersebut, jika tidak,
maka harus dilakukan penyesuaian terhadap pe