3
BAB II. BAHAN DAN METODE
2.1 Kultur Bakteri Pembawa Vaksin
Bakteri Escherichia coli pembawa vaksin DNA Nuryati, 2010 dikultur dengan cara menginokulasi satu koloni bakteri media LB tripton dengan
penambahan antibiotik ampisilin konsentasi 100 µLmL sebanyak 1 µLmL media. Metode kultur yang digunakan adalah metode gores kuadran untuk
mendapatkan koloni tunggal. Biakan diinkubasi pada suhu 37
o
C selama 16 jam, kemudian digunakan untuk kultur cair dan sisanya disimpan pada suhu 4
o
C hingga akan digunakan kembali. Untuk perbanyakan plasmid, bakteri dikultur di
media cair menggunakan thermo shaker dengan kecepatan 240 rpm selama 16 jam Lampiran 2.
Bakteri dipanen dengan merujuk pada metode Yulianti 2011. Sebanyak 40 mL bakteri dituangkan secara parsial ke dalam masing-masing mikrotube
bervolume 1,5 mL, lalu disentrifugasi pada kecepatan 12.000 rpm dan suhu 4
o
C selama 30 detik. Pelet bakteri yang terbentuk dicuci dengan 1 mL phosphate
buffered saline PBS sebanyak tiga kali. Setelah dicuci PBS, bakteri diinaktivasi
dengan perlakuan panas pada suhu 80
o
C selama 5 menit, selanjutnya disentrifugasi, dan supertanan dibuang. Bakteri diresuspensi kembali dengan PBS
sebanyak 1 mL Lampiran 3.
2.2 Vaksinasi dan Uji Tantang
Dosis vaksin yang digunakan adalah 7,6 ng dengan kepadatan bakteri 10
8
cfumL Yulianti, 2011. Bakteri yang mengandung vaksin DNA dicampurkan terlebih dahulu dengan kuning telur sebanyak 1-2 volume bakteri sebelum
dicampurkan ke pakan dengan jumlah pakan sebanyak 5 dari biomasa ikan. Kuning telur berfungsi sebagai pengikat binder. Kemudian pakan didiamkan
pada suhu ruang sampai kering. Pencampuran pakan buatan dengan bakteri pembawa vaksin DNA dilakukan sesaat sebelum pemberian pakan perlakuan
Yulianti, 2011. Penelitian ini menggunakan ikan mas yang telah diseleksi tingkat
kesehatannya. Validasi ikan uji ini dilengkapi dengan pemerikasaan DNA virus
4
menggunakan metode PCR polymerase chain reaction Zahro, 2010. Selain itu, ikan uji yang digunakan merupakan ikan sehat, tidak terserang bakteri dan
penyakit. Untuk menguji ikan tidak terserang penyakit adalah dengan mengamati kondisi tubuh ikan, apakah ada kelainan atau jamur tertentu dan dilakukan juga
adaptasi ikan pada suhu rendah 18 °C selama dua minggu seleksi suhu, setelah itu diamati apakah ada gejala klinis atau tanda-tanda ikan terserang penyakit atau
ikan masih dalam kondisi normal. Ikan mas yang digunakan adalah ikan mas yang memiliki bobot 10,22±1,88 gram sebanyak 200 ekor. Ikan tersebut
dipelihara di dalam 20 akuarium yang berukuran 45x40x35 cm
3
. Sebelum akuarium digunakan, dilakukan persiapan dengan cara dicuci menggunakan
deterjen, kemudian dibilas dengan air dan setelah itu dikeringkan. Selanjutnya akuarium disemprot dengan menggunakan alkohol 70 dan dibiarkan kering di
udara. Akuarium diisi air dengan ketinggian 30 cm. Ikan ditebar dalam 20 akuarium masing-masing 10 ekorakuarium. Selama
masa pemeliharaan, ikan diberi pakan komersial dengan frekuensi 2 kali sehari, yaitu pagi dan sore secara satiasi. Sebelum divaksin, ikan dipuasakan selama satu
hari. Masa vaksinasi hanya dilakukan selama satu minggu, setelah itu dilakukan
pemeliharaan selama 28 hari. Penelitian ini menggunakan lima kelompok
perlakuan dengan masing-masing tiga kali ulangan dan satu ulangan dibuat khusus untuk analisis indeks fagositosis.
Adapun rancangan perlakuan pada penelitian ini adalah setelah ikan diadaptasikan selama satu minggu, kemudian diberi perlakuan sebagai berikut:
Perlakuan A :ikan diberi pakan mengandung vaksin dengan frekuensi
pemberian satu kali dalam seminggu dan diuji tantang dengan filtrat KHV
Perlakuan B :ikan diberi pakan mengandung vaksin dengan frekuensi
pemberian dua kali dalam seminggu dan diuji tantang dengan filtrat KHV
Perlakuan C :ikan diberi pakan mengandung vaksin dengan frekuensi
pemberian tiga kali seminggu dan diuji tantang dengan filtrat KHV
5
Kontrol positif :ikan tanpa diberi pakan mengandung vaksin dan diuji tantang dengan filtrat KHV, dan
Kontrol negatif :ikan tanpa diberi pakan mengandung vaksin dan diinjeksi dengan PBS.
Setelah pemeliharaan 28 hari perlakuan A, B, C, dan kontrol positif diuji tantang dengan menyuntikkan filtrat KHV sebanyak 0,1 mLekor dengan
konsentrasi 10
-2
secara intramuskular. Masa uji tantang untuk melihat gejala klinis dan kelangsungan hidup ikan yang diberi vaksin DNA dilakukan selama 30 hari
Skema dan time line penelitian terlampir pada Lampiran 5.
2.3 Parameter Penelitian 2.3.1 Kelangsungan Hidup relatif Relative Percent SurvivalRPS