BAB 3
BAHAN DAN METODELOGI PENELITIAN
3.1. Bahan-Bahan
1. Bintil akar putri malu
2. Media Yeast Extract Manitol Agar YEMA
3. Media Yeast Manitol Broth YMB
4. Dolomit
5. Akuades
6. Larutan Klorok
7. Congo red
p.a. E. Merck 8.
Kristal Violet p.a. E. Merck
9. Iodine
p.a. E. Merck 10.
Aseton Alkohol 11.
Safranin p.a. E. Merck
12. Alkohol 70
Teknis
3.2. Alat-Alat
1. Cawan Petri
Pyrex 2.
Tabung Reaksi Pyrex
3. Pipet Volume
Pyrex 4.
Gelas Ukur Pyrex
5. Gelas Beaker
Pyrex
Universitas Sumatera Utara
6. Gelas Erlenmeyer
Pyrex 7.
Oven Memmert
8. Autoklaf
Webeco 9.
Inkubator Gallenkamp
10. Mikroskop
Prior England 11.
Neraca Analitis Mettler Toledo
12. Shaker
Eberbach 13.
Jarum Ose 14.
Spatula 15.
Pipet tetes 16.
Magnetic stirrer 17.
Aluminium Foil
3.3. Prosedur Penelitian
3.3.1. Pembuatan YEMA Yeast Extract Manitol Agar
Ditimbang 0,2 gram Yeast Extract, 2 gram Manitol, 0,1 gram K
2
HPO
4
, 0,04 gram MgSO
4
, 0,1 gram NaCl, dan 7,8 gram PDA. Kemudian dimasukkan ke dalam gelas beaker. Lalu ditambahkan 200 mL akuades, kemudian diaduk hingga rata. Lalu
dipanaskan sampai mendidih. Ditambah 0,25 gram congo red yang diencerkan dengan 100 mL akuades, lalu ditambahkan ke dalam media YEMA yang telah homogen
hingga berwarna merah. Dibagi ke dalam 20 tabung reaksi. Diautoklaf pada tekanan 15 psi dengan suhu 121
o
C selama 1 jam.
3.3.2. Pembuatan YMB Yeast Manitol Broth
Ditimbang 0,1 gram Yeast Extract, 1 gram Manitol, 0,05 gram K
2
HPO
4
, 0,02 gram MgSO
4
dan 0,01 gram NaCl. Kemudian dimasukkan ke dalam gelas beaker. Lalu ditambahkan 100 mL akuades, kemudian diaduk hingga rata. Lalu dipanaskan sampai
mendidih. Diautoklaf pada tekanan 15 psi dengan suhu 121
o
C selama 1 jam.
Universitas Sumatera Utara
3.3.3. Preparasi Sampel
Sampel yang digunakan adalah Rhizobium hasil isolasi dari bintil akar putri malu
Lampiran A gambar 1, yang diambil dari FMIPA USU. Pengambilan sampel
dilakukan dengan mencabut putri malu yang akarnya berbintil lalu bintilnya
dikumpulkan. Kemudian dibawa ke Laboratorium Biokimia FMIPA USU.
3.3.4. Isolasi Bakteri Rhizobium dari Bintil Akar
Sampel yang telah dibawa ke Laboratorium, kemudian diproses. Bintil akar dipilih dari tanaman putri malu yang tersedia kemudian bintil akar tersebut dicuci dengan
merendamnya ke dalam tabung reaksi yang berisi akuades kemudian disaring. Lalu bintil akar tersebut dimasukkan dalam tabung reaksi. Dilanjutkan dengan disemprot
dengan menggunakan alkohol 70. Lalu disemprot kembali dengan larutan klorok dan dibilas dengan akuades. Kemudian bintil akar yang telah steril digerus
menggunakan gelas objek sambil ditambahkan akuades. Lalu bintil akar yang steril tersebut digiling.
3.3.4.1. Isolasi Bakteri Rhizobium pada Media Selektif dengan Penambahan Congo Red
Satu ose dari suspense bintil akar putri malu yang sudah disiapkan sebelumnya
diambil, kemudian digoreskan pada media YEMA + Congo Red Lampiran A, gambar 2. Lalu kultur diinkubasi pada suhu 37
o
C selama 2 hari. Pertumbuhan Rhizobium diamati dengan memperhatikan bentuk dan warnanya. Pada umumnya
koloni berwarna putih transparan, mukoid dan sedikit berlendir. Rhizobium yang diperoleh disimpan dalam lemari es pada suhu 4
o
C. Bakteri yang diperoleh
ditumbuhkan kembali pada medium YEMA Lampiran A gambar 3 dengan
menggunakan metode gores sinambung, lalu diinkubasi pada suhu 37
o
C selama 2 hari. Tujuannya yaitu untuk memperoleh biakan murni dari bakteri Rhizobium.
Universitas Sumatera Utara
3.3.4.2. Identifikasi Bakteri Rhizobium
Plat kaca atau gelas objek disterilkan dengan alkohol 70. Satu ose biakan media
diambil Lampiran A gambar 4. Kemudian diletakkan di atas plat kaca ditetesi
akuades sebanyak 2 tetes lalu didiamkan sampai kering. Plat kaca kemudian ditetesi dengan larutan kristal violet dan didiamkan selama 30 detik, lalu dicuci dengan
akuades. Plat kaca ditetesi kembali dengan larutan iodine dan didiamkan selama 30 detik, lalu dicuci dengan akuades. Kemudian ditetesi dengan larutan aseton alkohol
dan didiamkan selama 30 detik, dicuci dengan akuades. Plat kaca ditetesi kembali dengan larutan safranin dan didiamkan selama 30 detik, dan dicuci dengan akuades,
dibiarkan mengering lalu diamati dibawah mikroskop.
3.3.5. Pembuatan Starter Kultur
Biakan Rhizobium yang ditumbuhkan kembali pada YEMA kemudian diambil 1-2 ose dan dicampur dengan 100 mL Yeast Manitol Broth YMB dalam gelas Erlenmeyer
Lampiran A gambar 5, lalu dikocok dengan menggunakan shaker pada temperatur
kamar hingga diperoleh starter kultur.
3.3.6. Pencampuran Starter dengan Medium Pembawa Carrier
Dolomit sebagai medium pembawa ditimbang sebanyak 140 gram lalu disterilkan. Sterilisasi dilakukan pada suhu 121
o
C pada tekanan 15 psi selama 60 menit. Medium yang sudah disterilisasi dibagi wadah plastik dengan pembagian sebagai berikut :
1. Wadah I : 5 g dolomit ditambahkan dengan 35 mL Starter 1:7
2. Wadah II : 5 g dolomit ditambahkan dengan 40 mL Starter 1:8
3. Wadah III : 5 g dolomit ditambahkan dengan 45 mL Starter 1:9
4. Wadah IV : 5 g dolomit ditambahkan dengan 50 mL Starter 1:10
Masing-masing wadah kemudian dibolak balik sehingga antara starter dengan media tercampur secara homogen lalu diinokulasikan dan disimpan selama 5 minggu pada
temperature di bawah 20
o
C Lampiran A gambar 6.
Universitas Sumatera Utara
3.3.7. Pengujian Jumlah Sel dari Medium Pembawa Carrier
Masing-masing wadah dengan perbandingan antara dolomit dengan starter kultur 1:7, 1:8, 1:9, 1:10 ditimbang sebanyak 1 gram dan dimasukkan dalam masing-masing 5
tabung reaksi yang berbeda, kemudian ditambahkan dengan 10 mL akuades steril. Dikocok sampai homogen dengan menggunakan vorteks lalu didiamkan selama 1
menit atau sampai partikel tanah mengendap. Sebanyak 1 mL diambil dengan menggunakan pipet volume kemudian dimasukkan ke dalam tabung reaksi, lalu di
vorteks pengenceran 10
-2
. Hal yang sama dilakukan sampai pengenceran 10
-9
. Suspensi diambil sebanyak 0,25 mL dan disebarkan pada medium YEMA + congo red
dalam cawan petri dengan menggunakan cawan sebar. Kemudian diinkubasi pada suhu 37
o
C 2 hari. Isolasi Rhizobium dari media pembawa dilakukan dari minggu ke-1 sampai minggu ke-5 hingga diperoleh pupuk Rhizobium.
3.3.8. Pengujian Lapangan
Pupuk Rhizobium yang diperoleh kemudian diaplikasikan dalam bentuk tabur kedalam masing-masing pot tanaman kacang hijau. Kemudian diamati pertumbuhan tanaman
kacang hijau sampai dihasilkan buah.
Universitas Sumatera Utara
3.4. Bagan Penelitian 3.4.1. Isolasi Bakteri Rhizobium
dicuci dengan akuades dibiarkan 1 menit
disaring dimasukkan kedalam tabung reaksi
disemprot dengan alkohol 70 disemprot dengan larutan klorok
dibilas dengan akuades digiling dengan menggunakan alu dan lumpang
ditambah 1 mL akuades steril
diinokulasi 1 ose pada media YEMA + congo red
diinkubasikan pada suhu 37
o
C selama 2 hari
dilihat bentuknya diamati warnanya
dipisahkan dengan jarum ose
disimpan dalam lemari es pada suhu 4
o
C selama 2 hari diuji mikroskop
dikembangbiakkan kembali untuk mendapatkan biakan murni pada medium YEMA dengan menggunakan metode gores sinambung
diinkubasi pada suhu 37
o
C selama 2 hari
Bintil akar tanaman putri malu
Bintil akar tanaman putri malu
Bintil akar tanaman putri malu
Suspensi bintil akar tanaman putri malu
Koloni berwarna putih Rhizobium
Koloni berwarna merah Agrobacterium
Campuran Koloni Rhizobium dan Agrobacterium
Hasil
Universitas Sumatera Utara
3.4.2. Pembuatan Perbandingan Biakan Murni Rhizobium dan Media Pembawa Carrier
diambil 1-2 ose isolat Rhizobium ditimbang dolomit sebanyak
140 gram diinokulasikan kedalam media disterilkan di dalam autoklaf
Yeast Manitol Broth YMB pada suhu 121
o
C dan tekanan 15 psi selama 1 jam
Dikocok dengan shaker pada temperatur kamar
diukur volume dengan variasi 35, 40, 45, dan 50 mL
dicampurkan starter kultur dengan dolomit dimasukkan ke dalam 4 wadah plastik yang
berbeda dengan perbandingan 1:7, 1:8, 1:9, 1:10
diinokulasikan selama 5 minggu pada temperatur di bawah 20
o
C Biakan murni
Rhizobium
Starter kultur Dolomit
Wadah IV 5 gram
dolomit + 50 mL starter
Wadah III 5 gram
dolomit + 45 mL starter
Wadah II 5 gram
dolomit + 40 mL starter
Wadah I 5 gram
dolomit + 35 mL starter
Rhizobium dalam serbuk dolomit
Dolomit Steril
Universitas Sumatera Utara
3.4.3. Perhitungan Jumlah Sel Pada Pembawa Carrier Metode Lay, 1994
ditimbang sebanyak 1 gram dimasukkan kedalam masing-masing 5 tabung
reaksi ditambahkan 10 mL akuades steril
dihomogenkan dengan vorteks didiamkan selama 1 menit
dipipet sebanyak 1 mL dimasukkan ke dalam tabung reaksi
dihomogenkan dengan vorteks
diambil sebanyak 0,25 mL disebarkan pada media YEMA+congo red dalam cawan petri
diinkubasi pada suhu 37
o
C selama 2 hari dihitung jumlah sel pada pembawa carier dari minggu ke-1 sampai
minggu ke-5 Rhizobium dalam serbuk dolomit
Filtrat Rhizobium Endapan
serbuk
Suspensi Rhizobium Filtrat
Hasil
Universitas Sumatera Utara
3.4.4. Pengaplikasian Pupuk Rhizobium Terhadap Tanaman Kacang Hijau
3.4.4.1. Tanaman Kacang Hijau Tanpa Penambahan Pupuk Rhizobium
diambil 2 – 3 biji kacang hijau dimasukkan ke dalam polybag yang telah diisi
tanah dan dolomit yang telah dihomogenkan
diamati pertumbuhan tanaman kacang hijau sampai dihasilkan buah
dicatat hasil pengamatan
3.4.4.2. Tanaman Kacang Hijau Dengan Penambahan Pupuk Rhizobium
diambil 2 – 3 biji kacang hijau dimasukkan ke dalam polybag yang telah diisi
tanah
ditambahkan dengan pupuk Rhizobium dengan variasi perbandingan 1:7, 1:8, 1:9, 1:10
diamati pertumbuhan tanaman kacang hijau sampai dihasilkan buah
dicatat hasil pengamatan Biji Kacang Hijau
Tanaman Kacang Hijau
Hasil
Tanaman Kacang Hijau
Hasil Biji Kacang Hijau
Universitas Sumatera Utara
BAB 4
HASIL DAN PEMBAHASAN
4.1. Hasil Penelitian
Dari hasil penelitian pupuk mikroba dan pengaplikasian pada tanaman kacang hijau yang dilakukan, diperoleh hasil bahwa produksi buah kacang hijau dengan
penambahan starter kultur 1:9 memperlihatkan hasil yang paling baik dibandingkan dengan perbandingan starter kultur yang lainnya. Hal ini dapat dilihat dari tabel 4.1.
dan tabel 4.2. berikut ini:
Tabel 4.1. Data Perhitungan Jumlah Koloni Bakteri Rhizobium Sampel Pengenceran
Minggu koloni I
II III
IV V
1:7 10
9
300 335
385 435
467 1:8
10
9
314 347
403 458
482 1:9
10
9
328 372
420 485
509 1:10
10
9
291 320
359 406
443
Tabel 4.2. Data Pengamatan Produksi Kacang Hijau Perlakuan
Polybag g Rata-rata g
I II
III
Blanko 19,1655 20,5445 22,5306
20,7469 1:7
24,2687 26,0222 27,2810 25,8573
1:8 29,4250 28,3765 29,3228
32,3948 1:9
40,3831 37,1520 36,7736 38,1029
1:10 27,8555 30,3362 31,4840
29,8919
4.1.1. Perhitungan Jumlah Sel Rhizobium
V df
a ml
CFU ×
=
−1
Universitas Sumatera Utara
CFU : Colony Forming Unit a
: Rata-rata jumlah koloni per cawan petri df
: Faktor pnegenceran V
: Volume suspensi biakan yang disebarkan
Perbandingan 1:7 Minggu I
1 9
9
10 1200
25 ,
10 300
−
× =
× =
mL sel
mL sel
CFU
Data perhitungan jumlah sel bakteri selengkapnya dapat dilihat pada Lampiran B
4.1.2. Perhitungan Penambahan Produksi Kacang Hijau
Penambahan Produksi Kacang Hijau = 100
× −
b b
p
m m
m
m
p
: massa perlakuan m
b
: massa blanko
Perbandingan 1:7
Penambahan Produksi Kacang Hijau = 63
, 24
100 7469
, 20
7469 ,
20 8573
, 25
= ×
−
Data perhitungan penambahan produksi kacang hijau selengkapnya dapat dilihat
pada Lampiran C
4.1.3. Perhitungan Aktivitas Air A
w
n
1
: jumlah mol dolomit. n
2
: jumlah mol air.
Perbandingan 1:7
9862 ,
9457 ,
1 0272
, 9457
, 1
= +
=
w
A Data Perhitungan A
w
selengkapnya dapat dilihat pada Lampiran D
2 1
2
n n
n A
w
+ =
Universitas Sumatera Utara
4.2. Pembahasan
Menurut Quality Standards and Control of Biofertilizers, kualitas pupuk hayati ditentukan oleh beberapa faktor di antaranya adalah jumlah populasi mikroba yang
terdapat dalam bahan pembawa carrier, keefektifan mikroba, bahan pembawa, dan masa penyimpanan pupuk hayati tersebut.
Jumlah populasi mikroba yang terdapat dalam bahan pembawa pada waktu produksi dan saat penyimpanan sangat penting karena akan memberikan pengaruh
terhadap pertumbuhan tanaman. Menurut Rao, jumlah populasi mikroba yang memenuhi persyaratan pupuk hayati adalah 10
8
-10
9
selgram carrier. Jumlah tersebut harus dipenuhi agar mikroba dapat secara efektif mengikat nitrogen bebas dari udara.
Menurut Sunarlim et al 1993, nitrogen yang dapat difiksasi oleh mikroba ini dapat memenuhi 45,4 dari keseluruhan kebutuhan nitrogen N yang dibutuhkan tanaman.
Dari penelitian yang dilakukan dapat dilihat bahwa jumlah populasi mikroba memenuhi syarat di atas.
Bahan pembawa yang digunakan dalam pupuk hayati ini harus dapat memberikan lingkungan hidup yang baik bagi mikroba baik itu selama proses
produksi maupun saat penyimpanan sebelum inokulan tersebut digunakan. Dalam penelitian ini bahan pembawa yang digunakan adalah dolomit. Dolomit digunakan
sebagai bahan pembawa karena mempunyai kemampuan menahan air A
w
yang tinggi dan tidak bersifat toksik bagi mikroba. Aktivitas air A
w
merupakan faktor yang penting dalam kelangsungan hidup mikroba sehingga keberadaan air dalam
carrier sangat penting. Kebanyakan bakteri nonhalofilik mempunyai tingkat pertumbuhan maksimum pada kisaran nilai A
w
0,980-0,997. Dari hasil penelitian didapat harga A
w
sebesar 0,9862 1:7; 0,9879 1:8; 0,9892 1:9; 0,9903 1:10. Aktivitas air diperlukan untuk mengendalikan perubahan-perubahan yang bersifat
kimiawi, fisik, maupun mikrobiologik pada saat produksi dan penyimpanan.
Salah satu faktor yang menentukan mutu pupuk hayati adalah jumlah populasi mikroba yang terdapat dalam carrier. Jumlah mikroba tersebut dapat berkurang
karena suhu yang tinggi. Hasil penelitian menunjukkan bahwa penyimpanan pada
Universitas Sumatera Utara
suhu rendah umumnya lebih cocok untuk ketahanan hidup mikroba dari pada suhu tinggi. Peningkatan suhu menyebabkan kelembaban menurun. Dengan
mempertahankan kelembaban, kematian mikroba dapat dikurangi. Selain peka terhadap suhu tinggi mikroba juga peka terhadap sinar matahari langsung. Pada
penggunaan inokulan bakteri Rhizobium, harus dilakukan pada tempat yang teduh karena bakteri tersebut tidak tahan terhadap sinar matahari langsung. Biasanya
penyimpanan dilakukan pada suhu di bawah 20
o
C dalam kantong polikelonium, dengan masa simpan selama enam bulan.
Dari hasil pengaplikasian pupuk hayati di lapangan terhadap tanaman kacang hijau dapat dilihat bahwa produksi buah kacang hijau kontrol dan produksi buah
kacang hijau dengan penambahan pupuk hayati terdapat perbedaan yang signifikan yaitu besarnya persen penambahan produksi buah antara tanaman kontrol dengan
tanaman perlakuan, yaitu sebesar 24,63 1:7; 56,14 1:8; 83,65 1:9; 44,08 1:10. Penambahan produksi buah ini menunjukkan bahwa pupuk hayati efektif
dalam memenuhi kebutuhan unsur nitrogen yang dibutuhkan oleh tanaman kacang hijau.
Nitrogen dalam bentuk N
2
merupakan senyawa inert tidak reaktif karena adanya ikatan rangkap tiga yang sulit untuk diputuskan. Dengan bantuan katalis
berupa enzim nitrogenase maka nitrogen yang bersifat inert tadi dapat menjadi reaktif. Molibdenum dalam enzim nitrogenase membantu dalam fiksasi nitrogen dengan jalan
menjadikan N
2
yang tidak reaktif menjadi bentuk MoRS7N=N- yang reaktif. Dengan bantuan Fe
3+
sebagai sebagai penyedia elektron melalui reaksi reduksinya menjadi Fe
2+
akan membantu dalam pelepasan satu ligan sistein pada atom pusat Mo
4+
sehingga reaksi molibdenum dengan N
2
dapat terjadi. Bentuk MoRS7N=N- merupakan prekursor untuk pembentukan NH
3
sebagai bahan dasar pembentukan asam-asam amino pembentuk protein.
Selain itu nitrogen ini juga dibutuhkan untuk membentuk senyawa penting seperti klorofil, asam nukleat dan enzim. Senyawa-senyawa ini dibutuhkan dalam
jumlah relatif besar untuk pembentukan tunas atau perkembangan batang dan daun. Klorofil yang terdapat pada daun berperan dalam kegiatan fotosintesis tanaman,
Universitas Sumatera Utara
sehingga apabila sintesis klorofil pada daun bertambah maka akan memungkinkan bagi tanaman melakukan proses fotosintesis semakin besar pula. Dengan demikian
produksi buah pada tanaman akan bertambah.
Penambahan produksi buah maksimum terdapat pada perlakuan 1:9. Pada perlakuan 1:9 ini jumlah total sel bakteri yang terdapat dalam carrier adalah 2036 ×
10
9
selgram carrier dan merupakan jumlah bakteri yang terbanyak dibandingkan dengan perlakuan yang lainnya. Dari hasil penelitian dapat dilihat hubungan antara
jumlah sel bakteri berbanding lurus dengan penambahan produksi buah. Yang berarti bahwa semakin banyak jumlah sel bakteri maka penambahan produksi buah akan
semakin besar.
Universitas Sumatera Utara
BAB 5
KESIMPULAN DAN SARAN
5.1. Kesimpulan
