Pemanfaatan Teknik Kultur In Vitro untuk Konservasi Plasma Nutfah Ubi ubian
Pemanfaatan Teknik Kultur In Vitro untuk Konservasi
Plasma Nutfah Ubi-ubian
Nurwita Dewi- * , Iswari S. Dewi, dan Ika Roostika
bio dive rsity
Dio sco re a
) , talas ( Co lo casia e scule nta) , be litung ( Xantho so m as agittifo lium ) , dan Dio sco re a spp. sangat po tensial se bagai bahan pangan alte rnatif, te r- utam a untuk m enghadapi raw an pangan akibat pe - ningkatan jum lah pe nduduk dan perubahan iklim glo bal yang m e m pe ngaruhi pro ses pro duksi pangan. Be be rapa je nis ubi-ubian, se pe rti ke ntang hitam dan
tube ro sus
Di Indo ne sia, ubi jalar ( Ipo m o e a batatas) dan ubi kayu ( Maniho t e scule nta) sudah lam a digunakan se bagai tanam an pangan pe nghasil karbo hidrat di sam ping se re alia yang m e njadi tanam an pangan utam a. Se lain ke dua ubi-ubian terse but, be be rapa jenis ubi-ubian, sepe rti garut ( Marantha arundina) , ganyo ng ( Canna e dulis) , ke ntang hitam ( Co le us
Am o rpho phallus, yaitu A. cam panulatus ( suw e g) , A. m ulle ri atau A. o nco phyllus ( iles-iles) .
, D. acue lata, dan D. bulbife ra, serta pada
alata ( ubi ke lapa) , D. hispida ( gadung) , dan D. e scule nta
) di dunia m e m iliki banyak plasm a nutfah tanam an pangan, di antaranya plasm a nutfah ubi- ubian. Me nurut Flac h dan Rum aw as ( 1996) , Indo nesia m e m iliki be be rapa plasm a nutfah ubi-ubian sam pai ke tingkat spe sie s, se pe rti pada Dio sco re a, yaitu D.
Indo ne sia yang telah diakui se bagai salah satu pusat keane karagam an hayati te rbe sar ( m e ga
Balai Besar Penelitian dan Pengembangan Bioteknologi dan Sumber Daya Genetik Pertanian, Jl. Tentara Pelajar 3A, Bogor 16111
Telp. (0251) 8337975; Faks. (0251) 8338820; *E-mail: [email protected]
Diajukan: 18 September 2013; Diterima: 10 Januari 2014
PENDAHULUAN
Kata kunci: Kultur in vitro , ko nservasi, ubi-ubian.
um um nya tanam an ubi-ubian m asih kurang pe m anfaatan- nya. Tanam an ubi-ubian berpo te nsi sebagai sumbe r karbo - hidrat alternatif se hingga dapat me njadi c adangan pangan dalam m enghadapi perubahan iklim glo bal yang saat ini m e m pe ngaruhi ketahanan pangan di beberapa dae rah ter- te ntu di dunia, te rm asuk di Indo nesia. Indo nesia yang me- m iliki diversitas yang tinggi untuk plasm a nutfah ubi-ubian harus dapat me m pe rtahankan keterse diaannya di m asa de pan. Tanpa me ngesam pingkan ke ndala yang akan tim bul, pe luang pe m anfaatan te knik kultur in vitro sangat besar dalam pe rbaikan c ara ko nse rvasi dan pe ngelo laan sum ber daya ge ne tik tanam an ubi-ubian di Indo ne sia, baik dalam be ntuk ko le ksi aktif m aupun ko le ksi dasar. Dalam tinjauan ini, dipaparkan pe m anfaatan strategi penyim panan plasma nutfah ubi-ubian in vitro m elalui te knik pe rtumbuhan lam bat untuk ko nservasi jangka m ene ngah dan pe nghe ntian per- tum buhan m elalui krio preservasi untuk pe nyim panan jangka panjang, term asuk c ara m e nganalisis ke stabilan ge netik ko le ksi. Di sam ping itu, dike mukakan juga be berapa institusi nasio nal dan internasio nal yang m elakukan pe ne litian dan penge m bangan te knik ko nservasi in vitro .
ABSTRAK Pemanfaatan Teknik Kultur I n Vitro untuk Konservasi Plasma Nutfah Ubi-ubian. Nurwita Dewi, Isw ari S. Dew i, dan I ka Roostika. Se lain kentang, ubi jalar dan ubi kayu,
Keywords: In vitro c ulture, c o nse rvatio n, tuber c ro ps.
c assava, m o st o f tuber c ro ps are c o nside re d as unde rutilize d c ro ps. Ho w e ve r, tuber c ro ps are po tential as alternative c arbo hydrate so urc e s, so the y c an be use d as fo o d re se rve s to fac e glo bal c lim ate c hange that affe c ts fo o d sec urity in c e rtain are a thro ugho ut the w o rld, inc luding Indo nesia. Having high dive rsity in tuber c ro ps germ plasm , Indo nesia m ust be able to c o nse rve tho se ge rm plasm to e nsure their availability in the future. In the future , w itho ut igno ring all the pro bable c o nstraints, the pro spec t in utilizatio n o f in vitro c ulture te c hnique w ill be highe r fo r im pro vem ent o f c o nservatio n and m anage m ent o f ge netic reso urc es in the fo rm o f ac tive and base c o llec tio ns. In this paper, strate gy in de velo ping in vitro c o lle c tio n o f tuber c ro ps germ plasm , i.e. slo w gro w th te c hnique fo r m e dium term sto rage and c ryo pre se rvatio n te c hnique fo r lo ng te rm sto rage, is disc usse d inc luding ho w to analyze ge netic stability o f the c o llec tio ns. Se veral natio nal and internatio nal re se arc h c e nters de aling w ith re se arc h and de velo pm e nt o f in vitro c o nservatio n te c hnique are pre se nte d.
Utilization of In Vitro Culture Technique for Tuber Crops Conservation. Nurwita Dewi, Isw ari S. Dew i, and Ika Roostika. Exc e pt fo r po tato , sw e et po tato, taro , yam, and
ABSTRACT
, te rnyata se lain se bagai pe nghasil karbo hid- rat juga m e m punyai pro pe rti yang dapat dim anfaatkan untuk be rbagai ke pe rluan industri dan o bat-o batan ( Harijo no e t al., 2013; Nugrahe ni e t al., 2011) . Nam un de m ikian, sam pai saat ini tingkat ko nsum si dan pe - m anfaatan ubi-ubian, te rutam a ubi-ubian m ino r, m a- sih re ndah dan ke be radaannya juga kurang m e ndapat pe rhatian. Jurnal AgroBiogen10(1):34-44
2014 N. D EWI ET AL .: Pemanfaatan Teknik Kultur In Vitro
35 Untuk m e njam in kete rsediaannya di m asa
de pan, usaha ko nservasi perlu dilakukan kare na plasm a nutfah ubi-ubian te rse but dikhaw atirkan m en- jadi punah, baik akibat dinam ika alam m aupun ulah m anusia, se pe rti de fo re stasi, te rjadinya pe nge m bang- an se c ara be rle bihan te rhadap suatu kultivar yang dianggap m e nguntungkan se c ara e ko no mi, dan juga m e ningkatnya alih fungsi lahan se iring de ngan m e - ningkatnya pe m bangunan infrastruktur ( To w ill, 2005) . Biji m e rupakan m ate rial yang um um digunakan untuk ko nse rvasi. Nam un de mikian, tidak se m ua akse si plasm a nutfah tanam an ubi-ubian dapat be rbunga dan m e nghasilkan biji. W alaupun ada yang m e nghasilkan biji, biji ubi-ubian tidak dapat disim pan dalam ko ndisi kele m baban dan suhu re ndah dalam jangka w aktu yang lam a ( re calcitrant) . Ole h se bab itu, um um nya ko nse rvasi plasm a nutfah ubi-ubian dilakukan dalam ke adaan tanam an tum buh o ptim al se c ara e x situ di lapang atau fie ld ge ne bank ( Go nzales-Be nito e t al., 2004) . Nam un, terdapat ke le m ahan ko nse rvasi e x situ di lapang, yaitu te rjadinya ke hilangan plasm a nutfah akibat se rangan o rganisme pe ngganggu tanam an ( OPT) , se pe rti ham a dan pe nyakit, se lain c ekam an lingkungan abio tik ( To w ill, 2005) . Untuk m engatasi m asalah te rse but, pe nge m bangan ko le ksi plasm a nutfah se c ara in vitro m e rupakan strate gi alte rnatif se bagai c adangan plasm a nutfah yang diko nse rvasi di lapang. Te kno lo gi in vitro saat ini sudah m e njadi ke - butuhan dalam strate gi pem e liharaan diversitas ta- nam an dalam be ntuk ko le ksi aktif ( active co lle ctio ns) dan ko le ksi dasar ( base co lle ctio ns) , te rutam a untuk spesie s yang pe rbanyakannya dilakukan se c ara ve ge tatif, se pe rti tanam an ubi-ubian ( Kelle r e t al., 2006) . Bebe rapa strate gi yang dapat digunakan dalam ko nse rvasi plasm a nutfah tanam an se c ara in vitro , antara lain pe nyim panan dalam ke adaan ( a) kultur tum buh no rm al untuk pe nyimpanan jangka pe nde k, ( b) kultur tum buh de ngan pe nam pilan m inim al ( gro w th re ductio n o r m iniaturiz atio n) kare na kultur tum buh sangat lam bat untuk pe nyim panan jangka m e ne ngah, dan ( c ) kultur sam a se kali tidak tum buh ( suspe nd o r sto p the gro w th) kare na kultur disim pan pada suhu sangat re ndah ( -196°C) untuk pe nyim pan- an jangka panjang ( Dube e t al., 2011) .
STRATEGI METODE PERTUMBUHAN LAMBAT
Tinjauan ini akan m em aparkan strate gi, peluang, dan kendala pe nyim panan me lalui te knik kultur in
vitro ,
yaitu m e to de pertum buhan lam bat ( m inim al o r
slo w gro w th
) dan pe nghe ntian pe rtum buhan ( cryo pre se rvatio n) , yang te lah dike m bangkan untuk m e nyim pan plasm a nutfah ubi-ubian, se rta te knik bio lo gi m o lekule r yang dapat diaplikasikan untuk pengujian stabilitas ge ne tik pada plasm a nutfah te r- se but se telah pe nyim panan. Di sam ping itu, tinjauan ini juga m e m be rikan info rm asi te ntang be rbagai le m baga pe ne litian inte rnasio nal yang m e lakukan pe - ne litian dan pe nge m bangan te knik ko nse rvasi plasm a nutfah ubi-ubian in vitro .
Penyim panan tanam an se c ara in vitro untuk ko le ksi aktif um um nya dilakukan dalam ke adaan ta- nam an tum buh no rm al de ngan m e nggunakan fo rm u- lasi m e dia untuk pe rbanyakan. Tanam an yang disim - pan di m e dia te rse but biasanya hanya dapat be rtahan 2 3 bulan akibat ke habisan nutrisi dan dipe rlukan subkultur ke m bali ke m edia baru ( Ram khrisna e t al., 2005) . Siklus subkultur akan be rpe ngaruh te rhadap lam a pe nyim panan dan biaya pe m e liharaan yang di- pe rlukan dalam ko nse rvasi plasm a nutfah in vitro . Se baliknya, pada pe nyim panan de ngan m e to de pe r- tum buhan lam bat m e lalui induksi pe ngham batan laju pe rtum buhan, tanam an tum buh m inim al se hingga fre- kue nsi subkultur berkurang dan inte rvalnya m e ning- kat. Hal ini te ntu akan m e nghindarkan risiko te rhadap hilangnya ko le ksi se bagai akibat dari pe nurunan vigo r, ko ntam inasi atau te rjadi ke salahan pe labelan. Pada dasarnya strate gi pe nyim panan in vitro ditujukan agar kapan saja dipe rlukan, tanam an se ge ra dapat dipe r- banyak dan didistribusikan ( To w ill, 2005) .
Laju m e tabo lism e tanam an in vitro dapat diham - bat de ngan dua c ara, yaitu ( 1) m e m o difikasi ko m po - ne n m e dia, m elalui pe nggunaan re gulato r o sm o tik ( o sm o re gulato r) dan zat pengham bat tum buh ( re tardant) , pe nurunan ko nse ntrasi garam -garam m akro , peningkatan atau pe nurunan ko nse ntrasi sukro sa, se rta ( 2) m e m o difikasi lingkungan tum buh, de ngan pe nyim panan pada suhu rendah dan pe ngu- rangan inte nsitas c ahaya. Ko m binasi dari ke dua c ara te rse but dapat pula dilakukan ( Ke lle r e t al., 2006) .
Modifikasi Komponen Media Penggunaan regulator osmotik
Regulato r o sm o tik ( o sm o re gulato r) adalah suatu se nyaw a o rganik yang dapat m e m pe ngaruhi te kanan o sm o tik dalam m e dia kultur se hingga m e ngurangi se - rapan hara m ineral dan air o leh se l atau jaringan yang m e ngakibatkan te rham batnya pertum buhan kultur ( Do dds dan Ro berts, 1985) . Sukro sa, m anito l, dan so r- bito l yang m e rupakan pro duk fo to sinte sis utam a ba- nyak digunakan dan dilapo rkan dapat m em pe rpan- jang m asa sim pan in vitro kare na dapat be rfungsi se - bagai o sm o re gulato r ( Chao re nsub dan Phansiri, 2004; Dew i, 2002; Hassan e t al., 2007; Shaw ky dan Aly, 2007) .
36 Sukro sa se be narnya m e rupakan sum be r e ne rgi
hingga 5 ppm dapat m e ngham bat pe rtum - buhan ubi jalar hingga m asa sim pan 8 bulan. Untuk
ancym ido l
juga dapat m e ngham bat sintesis se lulo sa se hingga m e ngham bat sintesis dan pe m anjangan dinding se l ( Ho fm anno vá e t al., 2008) . Penggunaan
ancym ido l
se ring digunakan se bagai pe ngganti m anito l dalam ko nse rvasi tanam an in vitro kare na pa- da ko nse ntrasi re ndah dapat m e ngham bat pe rtum - buhan de ngan m enghalangi tahap pe m be ntukan ent- kaurene m e njadi e nt-kaure no l dan o ksidasi ent- kaurenal m e njadi asam e nt-kaure no id pada lintasan bio sinte sis GA ( Sarkar e t al., 2001) . Di sam ping itu,
Ancym ido l
PBZ m e rupakan se nyaw a o rganik sinte tik yang m e ng- ham bat urutan re aksi o ksidasi dari e nt-kaure ne m e n- jadi asam e nt-kaure no id dalam pe m be ntukan asam gibe re lin ( GA) dan se ring ditam bahkan ke dalam m e- dia kultur untuk m em pe rpanjang m asa sim pan. Ketika pe m be ntukan GA te rham bat, w alaupun pe m be lahan se l m asih te rjadi, sel tidak m e m anjang se hingga m e - nye babkan buku dan tunas m e njadi pende k ( Arte c a, 1996) . PBZ juga be rpe ran dalam m e nginduksi m o difi- kasi m o rfo lo gi, se perti po ri sto m ata daun m e njadi lebih ke c il dan daun le bih te bal ( Ke atm e tha e t al., 2006) , m e ningkatkan bio sinte sis klo ro fil dalam jaring- an tanam an ( Pinc he ra dan Fle tc he v, 1994) se hingga batang m e njadi le bih te gar dan daun m e njadi le bih hijau, m engham bat pe m anjangan se l pada m e riste m subapikal, m e m pe rpe nde k ruas tanam an, dan m e m - pe rte bal batang ( Cathey, 1975) . PBZ dapat m e m pe r- baiki pe nam pilan tanam an yang disim pan dan m e m - pe rpanjang m asa sim pan pada pe nyim panan be be- rapa akse si ubi jalar ( Ro o stika dan Sunarlim , 2001) .
chlo ride /CCC) , ancym ido l, dan asam absisat ( ABA) .
Zat pe ngham bat tum buh yang dapat digunakan untuk ko nse rvasi in vitro antara lain paclo butrazo l ( PBZ) , cyco ce l ( chlo rm e quat chlo ride /chlo ro cho line
Penggunaan zat penghambat tumbuh
. De ngan disim pan be rkali-kali pada m e dia yang sam a, baru se te lah 7 tahun, planlet vanila pada m e dia te rse but m ulai m e nunjukkan pe nurunan laju pe r- tum buhan dan akhirnya m ati ( Divakaran e t al., 2006) .
fo il
10 g/l) dapat m enginduksi pe rtum - buhan lam bat dan 80 90% kultur dapat disim pan sam pai 360 hari ( 1 tahun) de ngan syarat pe nyim panan dalam w adah yang te rtutup rapat dengan alum inium
J URNAL A GRO B
IOGEN V OL .
al
, 1999) . De ngan penggunaan m anito l 4%, be be rapa aksesi ubi jalar m e nurun kete garannya ( Sunarlim e t
Di Inte rnatio nal Po tato Ce nte r ( CIP) , pro to ko l penyim panan ubi-ubian, khususnya ubi jalar, diguna- kan so rbito l 3 4% ( Panta e t al., 2009) . Pada um um nya, be be rapa pe ne liti m enyatakan bahw a m anito l tidak c o c o k untuk pe nyim panan plasm a nutfah ubi-ubian al.
., 1992; Xin, 1988; Zandvo o rt e t al., 1994) . Hal ini dise babkan te rjadinya pe ningkatan te kanan o sm o tik m e dia se hingga aliran nutrisi ke dalam jaringan ta- nam an terham bat. Manito l dan so rbito l, se pe rti halnya gula, juga dapat dim e tabo lism e kan se bagai sum be r e ne rgi o le h tanam an se sudah be be rapa bulan dalam penyim panan se hingga m e ngurangi efektivitas w aktu sim pan kare na pe rtum buhan yang m e ningkat.
e t al
Manito l dan so rbito l m erupakan gula alko ho l po lihidrik yang pada be be rapa tanam an be rpe ran penting dalam translo kasi asim ilat di dalam flo em ( De guc hi e t al., 2004) . Pe nam bahan m anito l atau so rbito l pada ko nse ntrasi te rte ntu ke dalam m e dia kultur dapat m e ngham bat pe rtum buhan ubi-ubian ( Ac e do , 1995; Be sse m binde r at al., 1993; Bo rge s e t al., 2004; De w i, 2002; Sunarlim e t al., 2004; Unnikrishnan
. ( 2012) dike tahui bahw a je ruk besar hanya dapat di- sim pan m inim al tujuh bulan pada m e dia MS de ngan sukro sa 1 2%. Dalam ko ndisi e kstrim , yaitu m e dia tanpa dibe ri sukro sa, pe rtum buhan tanam an sangat te rham bat, m isalnya pada kultur ke ntang hitam ( Ro o stika e t al., 2005) . Kultur ubi jalar dalam m e dia tanpa sukro sa, se te lah disim pan delapan bulan, bah- kan tidak dapat be rtahan hidup dan m ati ( Ro o stika dan Sunarlim , 2001) .
al
Dalam hubungannya se bagai sum be r e ne rgi, pe - nurunan ko nsentrasi sukro sa ( < 30 g/l) dalam m e dia kultur akan m enye babkan tanam an m e m pe rlam bat siklus selnya se hingga pe m be lahan dan pe m bentukan se l yang berjalan lam bat m e nye babkan pe rtum buhan te rham bat. Hal ini ditunjukkan o leh Hassan e t al. ( 2007) pada tanam an baw ang putih, yaitu pada m e dia yang dibe ri 0,1 M dan 0,2 M sukro sa dan Dio sco re a spp. ( Malaurie e t al., 1993) yang te rham bat pe rtum - buhan akar dan tunasnya. Dari hasil pene litian Tyas e t
sangat te rgantung pada ko nse ntrasi sukro sa yang dibe rikan. Ko nse ntrasi sukro sa dalam m e dia dasar untuk m e ndapatkan pe rtum buhan no rm al adalah 30 g/l ( Murashige dan Sko o g, 1962) , sedangkan dalam ko nse ntrasi yang sangat tinggi ( 90 g/l) sukro sa dapat berfungsi se bagai o sm o re gulato r yang m e ngham bat pertum buhan tanam an ( Po o km anee e t al., 2001) .
vitro
dan sum be r karbo n utam a dalam kultur in vitro dan sangat be rpe ran dalam siklus se l ( Tyas e t al., 2013) , se rta pe m be lahan dan pe m be ntukan se l ( De w itte dan Murray, 2003) . Pe rtum buhan tanam an dalam kultur in
1
10 N O .
., 1999) atau m e m be ntuk kalus ( Go lm irzaie dan To le do , 1999) . Oleh kare na itu, pe m berian m anito l um um nya diko m binasikan de ngan pe m be rian sukro - sa. Pada vanila, penam bahan m anito l ( 10 15 g/l) yang se im bang de ngan pe m be rian sukro sa pada ko nse n- trasi re ndah ( 15
2014 N. D EWI ET AL .: Pemanfaatan Teknik Kultur In Vitro
Me nurunkan suhu lingkungan tum buh hingga m e nde kati 0°C untuk tanam an subtro pis dan be be - rapa de rajat di baw ah no rm al untuk tanam an tro pis dapat m e ngurangi ke c e patan pe rtum buhan pada ba- nyak tanam an ( Do dds dan Ro be rts, 1985; Geo rge dan She ringto n, 1984) . Hal ini disebabkan suhu rendah m e nginduksi akum ulasi le m ak tidak je nuh pada m e m bran se l se hingga m em bran sel m enjadi tebal dan akibatnya pem be lahan dan pem anjangan se l ter- ham bat. Ko nse rvasi pada suhu 9°C dalam ke adaan gelap ( Staritsky e t al., 1986) dan suhu 4°C ( He dan Li,
de hydratio n
Te knik klasik didasarkan pada fre e z e -induce
Te knik krio pre se rvasi m e rupakan pe nyim panan m ate rial tanam an pada suhu sangat re ndah dalam nitro ge n c air ( suhu -196°C) . Te knik ini m e rupakan c a- ra yang ide al untuk m e nyim pan plasm a nutfah dalam jangka panjang kare na tidak dipe rlukan subkultur ( Enge lm ann, 1997; Kartha dan Enge lm ann, 1994; Ree d, 2001) . Ke stabilan ge ne tik tanam an diasum sikan dapat terjaga pada saat e ksplan ditum buhkan kem - bali. Ke adaan ini dim ungkinkan kare na pada suhu sa- ngat re ndah se luruh pro se s m e tabo lism e dan pe m - be lahan se l be rlangsung sangat lam bat atau bahkan te rhe nti ( Kartha dan Enge lm ann, 1994) . Teknik krio - pre se rvasi yang dapat digunakan m e liputi teknik kla- sik yang didasarkan pada teknik pe m be kuan lam bat/ be rtahap ( slo w -fre e z ing/tw o -ste p fre e z ing) dan te knik baru yang didasarkan pada vitrifikasi ( Enge lm ann, 2000) .
KRIOPRESERVASI
Se lain m e nggunakan gula yang te rse dia dalam m e dia se bagai sum ber karbo n, biakan juga m e nggu- nakan gula dari hasil fo to sinte sis. Me lalui pengurang- an inte nsitas c ahaya, m asa sim pan dapat dipe rpan- jang kare na inte nsitas c ahaya rendah dapat m e ng- ham bat ke c e patan tum buh de ngan m e ngurangi pro - se s fo to sinte sis dan m etabo lism e ( Huge s, 1981 dalam Go lm irzaie dan To le do , 1999) .
Pengurangan intensitas cahaya
12 bulan ( Taylo r, 1996) . Dalam kisaran ge no tipe yang luas, ubi jalar m e m e rlukan kisaran suhu pe nyim panan yang c ukup be sar, yaitu 18 27°C ( Panta e t al., 2009) . Se baliknya, be be rapa spe sies, sepe rti ubi kayu ( Aladele dan Kuta, 2008) dan Dio sco re a ( Mandal dan Chandel, 1996) , sangat sensitif te rhadap pe nyim panan de ngan suhu re ndah kare na dapat m e nim bulkan fe no lisasi dan nekro sis ( De sam ero , 1990 dalam Go lm irzaie dan To le do , 1999) . Um um nya, pe ngguna- an suhu re ndah untuk pe nyim panan in vitro diko m - binasikan de ngan mo difikasi m e dia ( Po o km anee , 2001; Zandvo o rt e t al., 1994) . Se c ara um um , tanam an tro pis biasanya ke hilangan viabilitasnya bila disim pan pada suhu re ndah ( Go lm irzaie dan To le do , 1999) .
2 tahun ( Ng dan Ng, 1997) , se dangkan be be rapa akse si talas dapat disim pan pada suhu 20°C se lam a 9
He nsaw , 1987) dapat m e m pe rpanjang m asa simpan hingga 1 3 tahun. Penurunan suhu juga te lah diaplikasikan pada Dio sco re a, yaitu de ngan suhu inkubasi 10 22°C se hingga dapat disim pan se lam a 1
dalam
( Xantho so m a sagittifo lium ) ( Ac he am pe o ng, 1982
Modifikasi Lingkungan Fisik Suhu rendah
37
kare na pem be ntukan kalus c e nde rung m e nye - babkan variasi so m aklo nal.
in vitro
dapat m e m pe rpanjang m asa sim pan ( Po o km ane e e t al., 2001) , nam un pe nggunaan ½ MS dan ¼ MS pada ubi jalar m e nye babkan pe ngkalusan pada batang. Keadaan ini se suai de ngan pendapat Ge o rge dan She ringto n ( 1984) yang m e nyatakan bah- w a m e dia de ngan ko nse ntrasi hara m akro sangat ren- dah akan m e ndo ro ng pe rtum buhan kalus dan akar. Ko ndisi ini tidak direko m e ndasikan untuk ko nse rvasi
o ncho phyllus
( N) se bagai unsur yang pe nting untuk pe rtum buhan m e njadi be rkurang dan be rakibat pertum buhan biak- an te rham bat. Pe nggunaan ¼ MS pada Am o rpho pallus
Pe rtum buhan lam bat dapat dilakukan de ngan m e nggunakan m e dia dasar yang die nc e rkan antara se te ngah dan se pe re m pat bagian dari fo rm ulasi dasar. Pe nge nc e ran m e dia m e njadi se te ngah atau sepe r- e m pat bagiannya m e nye babkan berkurangnya unsur m akro , te rutam a NH 4 + dan NO 3 -, se hingga nitro ge n
Pengenceran garam-garam mineral
Cyco ce l , dalam ko nse rvasi in vitro jarang dilakukan.
dapat m e ngham bat pe rtum buhan ta- nam an. Pe nggunaannya hingga ko nse ntrasi 500 m g/l dapat m e ngham bat pe rtum buhan ubi jalar, nam un ko nse ntrasi yang lebih tinggi dapat be rsifat to ksik bagi tanam an ( Go lm irzaie dan To le do , 1999) . ABA m e rupa- kan ho rm o n pe rtum buhan yang be rpe ran se bagai inhibito r se hingga dapat m e ngham bat pem be lahan dan pe m anjangan se l. Penam bahan ABA 5 20 m g/l ke dalam m e dia dapat m e ngham bat pe rtum buhan ubi jalar ( Go lm irzaie dan To le do , 1999) dan Dio sco re a ( IITA, 2012) , nam un pe nggunaan ABA, sepe rti juga
Cyco ce l
m e m pe rpanjang m asa sim pan, pe ningkatan ko nse n- trasi diduga dapat dilakukan kare na ancym ido l tidak m e nim bulkan to ksisitas, nam un hal ini tidak disaran- kan kare na harga ancym ido l re latif m ahal ( Ro o stika dan Sunarlim , 2001) .
, yaitu de hidrasi yang diinduksi m e lalui
- 40°C) . Te knik lam a se ring dise but juga se bagai te knik pem be kuan lam bat atau te knik pe m be kuan dua tahap yang m e liputi inkubasi sel pada krio pro te ktan ( 1 2 µl) yang m e nye babkan de hidrasi m o de rat lalu diikuti de ngan pe m be kuan lam bat de ngan kec e patan 1°C/m e nit dan pe m be kuan dalam nitro ge n c air. Eksplan yang c o c o k digunakan pada krio pre se rvasi de ngan teknik klasik, yaitu yang be rasal dari kultur yang tidak te rdife re nsiasi, se pe rti suspe nsi se l dan kalus serta spe sies yang to le ran terhadap suhu ren- dah, se dangkan yang tidak c o c o k digunakan, yaitu tunas apikal, e m brio zigo tik dan e m brio so m atik se rta spesie s tanam an tro pis ( Enge lm ann, 1997; Takagi, 2000) . Teknik ini telah be rhasil digunakan untuk krio - pre servasi ubi kayu, nam un te knik pe m bekuan be r- tahap kurang diaplikasikan se c ara luas kare na m e - m e rlukan pe ralatan pe ndingin ( fre e z e r) yang m ahal ( Danso dan Fo rd-Llyo d, 2011; Esc o bar e t al., 1997) . Pada ubi jalar dan ge m bili, pe nggunaan te knik klasik m e nunjukkan ke m am puan hidup kultur yang rendah ( Be nso n e t al., 2011) .
Desikasi
al.
Pene litian krio pre se rvasi telah banyak dilakukan pada be be rapa je nis plasm a nutfah ubi-ubian ( Tabe l 1) . Pro to ko l krio prese rvasi untuk ubi kayu te lah dipe r- o le h dengan m e nggunakan m e to de klasik ( Esc o bar e t
dan dite te si larutan krio pro te ktan, ke - m udian sec ara c e pat dim asukkan ke dalam nitro ge n c air. Te knik ini se c ara rutin telah dite rapkan untuk ko nse rvasi jangka panjang pada ke ntang dan pisang ( Panis e t al., 2005) , juga te lah be rhasil digunakan pada be rbagai je nis tanam an, se pe rti baw ang putih, pe - paya, dan ubi-ubian se pe rti talas, Dio sco re a spp., dan ubi jalar ( Le unufna, 2007; Sakai dan Enge lm ann, 2007) .
alum inium fo il
Dro plet-vitrifikasi adalah te knik krio prese rvasi de ngan m ate ri tanam an yang dipe rlakukan de ngan larutan krio pro te ktan, ke m udian dile takkan di atas
Droplet-vitrifikasi
Pratum buh-de sikasi adalah te knik krio prese rvasi de ngan bahan tanam an yang dipe rlakukan de ngan krio pro te ktan, ke m udian sec ara c e pat dim asukkan ke nitro ge n c air. Te knik ini te lah digunakan pada e m brio zigo tik ke lapa dan kelapa saw it ( Enge lm ann, 2000) , nam un be lum dite m ukan lapo ran pada ubi-ubian.
Pratumbuh-desikasi
Pratum buh m e rupakan te knik dengan bahan tanam an yang dipe rlakukan de ngan krio pro te ktan, ke- m udian se c ara c e pat direndam ke dalam nitro ge n c air. Te knik ini re latif se de rhana dan m urah, te tapi ke- sulitannya te rjadi dalam m e m anipulasi jaringan e m brio ge nik tanpa e nkapsulasi. Teknik ini tidak di- ke m bangkan untuk pe nyim panan ubi-ubian.
Pratumbuh ( pregrowth)
Desikasi m e rupakan te knik yang paling se de r- hana, yaitu tanam an yang te lah dide sikasi, kem udian se c ara c epat dire ndam ke dalam nitro ge n c air. Te knik ini sangat se suai untuk tanam an yang to le ran te r- hadap de sikasi. Te knik ini tidak dike m bangkan untuk pe nyim panan ubi-ubian.
spp., ubi jalar, dan ubi kayu ( Sakai dan Enge lm ann, 2007; Sakai e t al., 2008) .
J URNAL A GRO B
Dio sco re a
Te knik ini m e rupakan ko m binasi antara te knik e nkapsulasi-de hidrasi dan vitrifikasi. Pada te knik ini, bahan tanam an die nkapsulasi dalam kapsul alginat, ke m udian dilakukan de hidrasi jaringan de ngan m e ng- gunakan larutan krio pro te ktan, se lanjutnya dilakukan pe m be kuan jaringan. Te knik ini dapat digunakan pada tanam an yang pe ka te rhadap pe rlakuan de sikasi dan te lah digunakan pada banyak tanam an, se pe rti
Enkapsulasi-vitrifikasi
Te knik ini didasarkan pada pro ses vitrifikasi, yaitu pro se s pe m be ntukan struktur be rupa kac a ( m e ta-stable glass) pada suhu yang sam a de ngan atau di baw ah titik beku larutan terte ntu. Me to de nya le bih se de rhana daripada e nkapsulasi-de hidrasi, banyak di- gunakan untuk tanam an yang peka terhadap pe rlaku- an suhu re ndah ( Takagi e t al., 1997) . Teknik vitrifikasi te lah digunakan se c ara luas pada banyak tanam an ( Sakai dan Enge lm ann, 2007) , di antaranya ubi kayu, ubi jalar, dan Dio sco re a spp. Fakto r pe m batas te knik ini, yaitu dipe rlukannya to leransi yang c ukup tinggi dari bahan tanam an te rhadap larutan vitrifikasi ( Sakai dan Enge lm ann, 2007) .
Vitrifikasi
Te knik ini didasarkan pada pe nggunaan be nih sinte tik. Me to de nya se de rhana, nam un m e m e rlukan be nih sinte tik yang c ukup banyak dan hanya dapat di- gunakan pada tanam an yang to leran te rhadap ko n- se ntrasi sukro sa tinggi. Te knik ini te lah dike m bangkan pada ubi kayu ( Sakai, 2004) .
Enkapsulasi-dehidrasi
Te knik baru yang be rdasarkan vitrifikasi, terdiri atas e nkapsulasi de hidrasi, vitrifikasi, e nkapsulasi vitri- fikasi, de sikasi, pratum buh ( pre gro w th) , pratum buh de sikasi, dan dro ple t.
38
1
10 N O .
IOGEN V OL .
, 1997) dan e nkapsulasi-dehidrasi ( Esc o bar e t al., 2000) , se rta untuk ubi jalar dan pisang de ngan dro ple t- vitrifikasi ( Panis e t al., 2005) .
2014 N. D EWI ET AL .: Pemanfaatan Teknik Kultur In Vitro
Analisis histo lo gi dan sito lo gi dapat dilakukan de ngan m e ngam ati inte gritas jaringan, analisis kro m o - so m , dan tingkat plo idi. Analisis te rse but te lah dilaku- kan pada ke ntang yang disim pan sec ara e nkapsulasi- de hidrasi ( Be nso n e t al., 1996) . Hasilnya m e nunjukkan bahw a tanam an ke ntang hasil krio pre se rvasi bersifat stabil dan tidak be rbe da de ngan tanam an ko ntro lnya.
Tunas pucuk Vitrifikasi Zhang et al. (2001)
Dioscorea alata Tunas pucuk Vitrifikasi Ng dan Ng (2000)Dioscorea spp. Tunas pucuk Enkapsulasi-dehidrasi Malaurie et al. (1998); Mandal et al. (1996)
Dioscorea spp. Tunas pucuk Vitrifikasi Kyesmu dan Takagi (2000); Mandal (2000)
Talas Tunas pucuk Enkapsulasi-dehidrasi Taylor (1996) Talas Tunas pucuk Droplet-vitrifikasi Sant et al. (2008a) Talas Tunas pucuk Vitrifikasi Sant et al. (2008b); Takagi et al. (1997)Komoditas Jenis eksplan Teknik kriopreservasi Pustaka
Ubi kayu Tunas pucuk Vitrifikasi Charoensub et al. (2000); Ng dan Ng (2000)
Ubi kayu Tunas pucuk Enkapsulasi-dehidrasi Escobar et al. (2000) Ubi jalar Tunas pucuk Vitrifikasi Towill dan Jarret (1992) Ubi jalar Tunas pucuk Enkapsulasi-vitrifikasi Hirai dan Sakai (2003) Amorphopallus sp.( AFLP) . Analisis Tabel 1. Hasil penelitian kriopreservasi pada berbagai jenis ubi-ubian.
Fragm e nt Le ngth Po lym o rphism
( SSR) , dan Am plifie d
Sim ple Se que nce Re pe at
Analisis m o le kule r dapat dilakukan antara lain de ngan Rando m Am plifie d Po lym o rphic DNA ( RAPD) ,
Analisis molekuler
Analisis bio kim ia dapat dilakukan me lalui anali- sis iso e nzim . Iso e nzim dapat digunakan untuk m e nga- rakte risasi plasm a nutfah kare na analisis te rse but re latif le bih stabil te rhadap lingkungan daripada anali- sis mo rfo lo gi dan um um nya be rsifat po lim o rfik, nam un pe nggunaannya te rbatas kare na tidak dapat m e nde te ksi tingkat variasi yang se dikit ( Shukla e t al., 2004) . Di CIAT, analisis iso e nzim te lah digunakan untuk m e nganalisis ke stabilan ge netik ubi kayu hasil pe nyim panan in vitro .
Analisis biokimia
Analisis histologi dan sitologi
39 Aplikasi te knik krio pre servasi sec ara rutin pada
Analisis m o rfo lo gi di lapang dapat dilakukan de ngan m e nggunakan de skripto r tanam an yang di- am ati. Analisis dilakukan de ngan m em bandingkan pe - nam pilan fe no tipik tanam an hasil ko nservasi in vitro de ngan tanam an asalnya. Untuk m e njam in ke pastian ke stabilan gene tik, analisis ( karakte risasi) m o rfo lo gi pe rlu diko m binasikan de ngan analisis m o le kuler ka- re na hasil analisis m o rfo lo gi sangat dipe ngaruhi o leh lingkungan. Analisis m o rfo lo gi dilakukan se c ara rutin te rhadap ko le ksi kultur in vitro ubi kayu di CIAT dan ubi jalar di CIP.
Analisis morfologi
Tujuan ko nse rvasi adalah m e le starikan plasm a nutfah yang dim iliki agar dapat dim anfaatkan untuk m asa kini dan m e ndatang. Dalam ke giatan te rse but, pem e liharaan stabilitas gene tik m e rupakan hal yang sangat pe nting dipe rhatikan untuk m e njam in plasm a nutfah yang disim pan te tap se suai de ngan ide ntitas asalnya. Dalam ke giatan ko nse rvasi in vitro , untuk m e nghindari ke tidakstabilan ge ne tik, biasanya diguna- kan bahan tanam an yang te lah m engalam i difere n- siasi, se pe rti kultur e m brio , tunas, dan planle t ( W ithe rs, 1991) kare na je nis e ksplan yang digunakan re latif stabil te rhadap variasi so m aklo nal. Be rbagai m e to de dapat digunakan untuk m e nge valuasi ke - stabilan ge netik dan ke rusakan yang m ungkin te rjadi akibat ko nservasi in vitro ( Be nso n e t al., 2011) , di antaranya analisis m o rfo lo gi, histo lo gi, sito lo gi, bio kim ia, dan m o lekule r.
( Ce PaCT-SPC) untuk talas. Di Indo ne sia, be be rapa pe ne litian te knik krio pre se rvasi te lah dilakukan, antara lain di Balai Besar Pe ne litian dan Penge m bangan Bio te kno lo gi dan Sum be r Daya Ge ne tik Pe rtanian ( BB Bio ge n) pada tanam an ubi kayu dan ubi jalar ( Ro o stika e t al., 2004a; 2004b) dan Lem baga Ilm u Pe nge tahuan Indo ne sia ( LIPI) pada tanam an ubi kayu ( Sudarm o no w ati, 2000) .
the Pacific Co m m unity
( CIAT) untuk ubi kayu ( Ashmo re , 1997) , dan Ce ntre fo r Pacific Cro ps and Tre e s-Se cre tariat o f
Agriculture
( IITA) untuk Dio sco re a spp. dan ubi kayu, Inte rnatio nal Ce nte r fo r Tro pical
Institute o f Tro pical Agriculture
tanam an ubi-ubian m asih te rbatas pada le m baga- le m baga pe nelitian te rtentu, se pe rti CIP untuk ko nse r- vasi plasm a nutfah ubi jalar ( Lizzaraga e t al., 1992; Tay, 2000) dan ganyo ng ( Panta, 2009) , Inte rnatio nal
PENGUJIAN STABILITAS GENETIK PADA PLASMA NUTFAH PASCAKONSERVASI
J URNAL A GRO B
Bio ve rsity
in vitro
de ngan m e to de pertum buhan lam bat ( IITA, 2012) . Meskipun BB Bio ge n be lum m e m iliki bank ge n
Dio sco re a
CePaCT-SPC m e m iliki ko le ksi in vitro talas te rbanyak yang disim pan de ngan m e to de pe rtum buhan lam bat ( Se c re tariat o f the Pac ific Co m m unity, 2002; Taylo r, 2000) , se dangkan IITA telah m e ngo le ksi 1.000 akse si
IN VITRO UBI-UBIAN DI BERBAGAI
safe ty back up co lle ctio n
di antara bank ge n tersebut, yaitu black bo x ubi jalar di CIAT dan black bo x ubi kayu di CIP ( Panta e t al., 2009) . BB Bio ge n te lah m e nyim pan ko le ksi in vitro ubi jalar di CIP dan talas di CePaCT se bagai duplikat. Standar bank gen untuk in
vitro
IOGEN V OL .
dan krio pre se rvasi te lah disusun o le h FAO ( FAO, 2014)
, CIP, CIAT, dan IITA. CGIAR te lah m e nge m - bangkan dan m e nggunakan strate gi ko nse rvasi in vitro se c ara rutin pada tanam an ke ntang, ubi jalar, ubi kayu, Dio sco re a spp., dan pisang di le m baga-lem baga pene litian te rkait, juga m e ne rim a duplikat kultur in
( CGIAR) , se perti
Dalam rangka m e nge m bangkan kualitas dan siste m m anaje m e n risiko di bank gen in vitro , baik CIAT, CIP m aupun IITA telah m e lakukan pe rbaikan dan standardisasi pro se dur pe nyim panan tanam an yang dipe rbanyak se c ara ve getatif dan m e lakukan
Inte rnatio nal Agricultural Re se arch
Pe ne litian, pe nge m bangan, dan pe m anfaatan te knik kultur in vitro untuk ko nse rvasi tanam an ubi- ubian te lah dilakukan di be rbagai pusat pe ne litian yang be rada di baw ah naungan Co nso rtium o f
KONSERVASI
Adanya ke tidakstabilan ge ne tik be rupa m e tilasi DNA dilapo rkan pada ke ntang yang dikrio pre se rvasi de ngan pe m be kuan c e pat ( Harding, 1997) dan pada je ruk yang dikrio pre se rvasi de ngan c ara vitrifikasi ( Hao dan De ng, 2002) , se rta pe rubahan kro m atin pada m aho gani ( Sw ie te ria m acro phylla) yang dikrio pre se r- vasi de ngan pe m bekuan lam bat ( Harding e t al., 2000) .
Analisis epigenetik
Be be rapa c o nto h aplikasi analisis m o lekule r pada tanam an hasil ko nse rvasi, yaitu analisis RFLP dan RAPD pada ubi kayu yang disim pan de ngan pe r- tum buhan lam bat ( Ange l e t al., 1996) dan analisis RAPD untuk Dio sco re a spp. yang disim pan se c ara krio pre se rvasi de ngan teknik vitrifikasi dan e nkapsulasi-de hidrasi ( Mandal e t al., 2008) . Hasil analisis m o le kule r me nunjukkan adanya ke stabilan gene tik dari bahan tanam an yang disim pan de ngan ke dua te knik ko nse rvasi te rse but.
e t al ., 2008) .
sam pai pada tingkat DNA te rhadap ada tidaknya perubahan ge ne tik pada m ateri yang diko nse rvasi. Analisis be rbasis DNA ini le bih disukai kare na be rsifat po lim o rfis dan tidak dipe ngaruhi lingkungan ( Pe re do
40
1
10 N O .
hingga tahun 2012, ke giatan ko nse rvasi in vitro te lah rutin dilakukan untuk tanam an ubi jalar, ubi kayu, dan talas.
PROSPEK DAN KENDALA APLIKASI KONSERVASI
Be be rapa bank ge n in vitro m e ngo leksi ubi-ubian se c ara rutin. Se bagai c o nto h, ko le ksi in vitro terbanyak te rdapat di bank ge n in vitro CIP ( Tay, 2000) , te rutam a untuk ubi jalar dan ganyo ng yang disim pan de ngan m e to de pe rtum buhan lam bat untuk pe nyim panan jangka m e ne ngah ( Lizzaraga e t al., 1992) dan krio pre - se rvasi untuk pe nyim panan jangka panjang ( Tay, 2000) . Bank ge n in vitro CIAT m e ngo le ksi le bih dari lim a ribu ge no tipe ubi kayu de ngan m e to de pe rtum - buhan lam bat, yaitu m e nggunakan pe nge nc e ran m e dia dasar atau pe nurunan taraf sukro sa ( Ashmo re , 1997) untuk pe nyim panan jangka m e ne ngah dan krio - pre se rvasi untuk jangka panjang ( Thro e t al., 1996) .
( IPGRI) atau Inte rnatio nal Bo ard fo r Plant Ge ne tic Re so uce s ( IBPGR) , m e naruh pe rhatian te rhadap pe nge m bangan strategi dan te kno lo gi ko nse rvasi de ngan m enggunaan m e to de yang tepat, di antaranya ko nservasi in vitro untuk jangka pende k dan jangka panjang ( krio pre se r- vasi) . Bio ve rsity se c ara rutin m e nggunakan m e to de ko nse rvasi in vitro untuk kentang, ubi jalar, ubi kayu, dan Dio sco re a di le m baga-le m baga pene litian terkait, juga m e m be rikan pe latihan, bantuan, dan distribusi pustaka yang be rhubungan de ngan ko nse rvasi in vitro .
Inte rnatio nal Plant Ge ne tic Re se arch Institute
Bio ve rsity
Ke ane karagam an jenis ubi-ubian dan be ragam - nya varie tas yang ada di Indo ne sia harus dipe rtahan- kan. Te knik kultur in vitro dan krio pre se rvasi dapat di- gunakan untuk m e ngo nse rvasi plasm a nutfah ubi- ubian kare na spe sie s ini sulit diko nservasi dalam be n- tuk biji. Banyak pe luang pe ne litian dan pe ngujian untuk m e m pero le h m e to de ko nservasi in vitro yang te pat bagi m asing-m asing jenis dan varie tas, baik de ngan te knik pertum buhan lam bat m aupun krio pre - se rvasi. Nam un de m ikian, pe ne rapan teknik ko nse r- vasi se c ara in vitro tentu akan m em e rlukan biaya, ruangan khusus, peralatan, dan sum be r daya m anusia ( SDM) yang m e m adai dan te rlatih ( skillfull) . Hal ini dise babkan ke giatan m e ngo nservasi harus didukung o le h pro to ko l standar.
Sam pai saat ini, de ngan te knik induksi pe rtum - buhan lam bat ( slo w gro w th) dan pe nghe ntian pe r-
vitro yang diko nse rvasi dari le m baga pe ne litian lain.
, sebe lum nya dike nal se bagai
2014 N. D EWI ET AL .: Pemanfaatan Teknik Kultur In Vitro
1993. Long-term in vitro storage of Colocasia esculenta under minimal growth conditions. Plant Cell Tiss. Org. 33(2):121-127. Borges, M., W. Ceiro, S. Meness, N. Aguilera, J. Vazquez, Z.
nd Edition. Cambridge University Press.
Dodds, J.H. and L.W. Roberts. 1985. Experiments in Plant Tissue Culture. 2
Conservation of vanilla species, in vitro. Sci. Hort. 110:175-180.
Anuu. Rev. Plant. Biol. 54:235-264. Divakaran, M., K.N. Babu, and K.V. Peter. 2006.
Tesis S2, Program Studi Bioteknologi, Sekolah Pascasarjana Institut Pertanian Bogor. 56 hlm. Dewitte, W. and J.A. Murray. 2003. The plant cell cycle.
Yamaki, and Y. Kanayama. 2004. Engineered sorbitol accumulation induces dwarfism in Japanese persimmon. J. Plant Physiol. 161:1177-1184. Dewi, N. 2002. Perbanyakan dan pelestarian plasma nutfah talas (Colocasia esculenta [L.] Schott) secara in vitro.
Danso, K.E. and B.V. Ford-Llyod. 2011. Cryopreservation of cassava micropagules using simple slow freezing and vitrification techniques. Biotechnol. 10(5):415-420. Deguchi, M., Y. Koshita, M. Gao, R. Tao, T. Tetsumura, S.
Yongmanitchai. 2000. Cryopreservation of in vitro-grown shoot tips of cassava cooled to -196°C by vitrification. p. 401-403. In F. Engelmann and H. Takagi (eds.) Cryopreservation of Tropical Plant Germplasm. Current Research Progress and Application. JIRCAS, Japan/IPGRI, Rome, Italy.
Cathey, H.M. 1975. Comparative plant growth-retarding activities of ancymidol with ACPC, phosfon, chlormequat, and SADH on ornamental plant species. Hort. Sci. 10(3):204-215. Charoensub, R. and S. Phansiri. 2004. In vitro conservation of rosecolouredleadwort: Effect of mannitol on growth of plantlets. Kasetsart J. (Nat. Sci.) 38:97-102. Charoensub, R., S. Phansiri, A. Sakai, and W.
in vitro. Plant Cell Tiss. Org. 76:87-90.
Infante, and M. Fonseca. 2004. Regeneration and multiplication of Dioscorea alata germplasm maintained
Escobar, G. Mafia, B. Panis, A. Panta, D. Tay, I. Van den Huwe, and N. Roux. 2011. Global Public Goods Phase 2: Part I. Project landscape and general status of clonal crops in vitro conservation technologies. System- Wide Genetic Resources Program. Rome, Italy. 82 p. Bessembinder, J.J.E., G. Staritsky, and E.A. Zandvoort.
41
1996. Developmental competence and ploidy stability in plants regenerated from cryopreserved potato shoot- tips. CryoLetters 17:119-128. Benson, E.E., K. Harding, D. Debouck, D. Dumet, R.
Benson, E.E., M. Wilkinson, A. Todd, U. Ekuere, and J. Lyon.
Ashmore, S.E. 1997. Status report on the development and application of in vitro techniques for the conservation and use of the plant genetic resources. International Board for Plant Genetic Resouces, Rome. 67 p.
345 p.
Stability of cassava at the DNA level after retrieval from 10 years of in vitro storage. Euphytica 90:307-313. Arteca, R.N. 1996. Plant Growth Substances: Principles and Applications. Chapman and Hall. New York, USA.
Angel, F., V.E. Barney, J. Tohme, and W.M. Roca. 1996.
Aladele, S.E. and D.D. Kuta. 2008. Environmental and genotypic effects on the growth rate of in vitro cassava plantlet (Manihot esculenta). Afr. J. Biotechnol. 7(4):381- 385.