EFEK PEMBERIAN STATIN TERHADAP PROLIFERASI ENDOTHELIAL PROGENITOR CELL (EPC) PADA DARAH TEPI PENDERITA PENYAKIT JANTUNG KORONER STABIL Repository - UNAIR REPOSITORY
EFEK PEMBERIAN STATIN TERHADAP PROLIFERASI
PENDERITA PENYAKIT JANTUNG KORONER STABIL Karya Akhir Untuk Mendapatkan Keterangan Keahlian di Bidang Ilmu Penyakit Jantung dan Pembuluh Darah
Peneliti
Feranti Meuthia, dr NIM : 011181303
Pembimbing
Dr. Yudi Her Oktaviono, dr., SpJP(K), FIHA Prof. Dr. Djoko Soemantri, dr., SpJP(K), FIHA PROGRAM PENDIDIKAN DOKTER SPESIALIS – 1 DEPARTEMEN ILMU PENYAKIT JANTUNG DAN PEMBULUH DARAH FAKULTAS KEDOKTERAN UNIVERSITAS AIRLANGGA RSUD Dr. SOETOMO SURABAYA 2016
KARYA AKHIR EFEK PEMBERIAN STATIN... dr. FERANTI MEUTHIA
KARYA AKHIR EFEK PEMBERIAN STATIN... dr. FERANTI MEUTHIA
KATA PENGANTAR
Puji syukur penulis panjatkan kehadirat Allah SWT atas berkat, rahmat dan anugerahNya sehingga karya akhir dengan judul Efek Pemberian Statin Terhadap Proliferasi Endothelial Progenitor Cell (EPC) Pada Darah Tepi Penderita Penyakit Jantung Koroner Stabil telah terselesaikan dengan baik.
Penulis menyadari bahwa karya akhir ini tidak dapat terselesaikan dengan baik tanpa bantuan, bimbingan dan dorongan dari berbagai pihak. Kepada Dr. Yudi Her Oktaviono, dr. SpJP(K), FIHA dan Prof. DR. Djoko Soemantri, dr. SpJP(K), FIHA selaku pembimbing karya akhir kami, pembimbing metodologi penelitian dan statistik serta sebagai koordinator penelitian, penulis ucapkan terima kasih yang sebesar-besarnya atas segala bimbingan, dukungan dan semangat yang telah diberikan untuk menyelesaikan penelitian ini. Pada kesempatan ini penulis juga menghaturkan terima kasih kepada yang terhormat:
1. Prof. Dr. H. Fasich, Apt selaku Rektor Universitas Airlangga saat penulis memulai pendidikan, Prof. Dr. Mohammad Nasih, SE., Mt., Ak.,CMA selaku Rektor Universitas Airlangga, Prof. Dr. Agung Pranoto, dr., M.Sc., Sp.PD, K- EMD FINASIM selaku Dekan FK Unair saat penulis memulai pendidikan, Prof. Dr. Soetojo,dr., Sp.U selaku Dekan FK Unair saat ini, H. Slamet Riyadi Yuwono, dr., DTM & H. MARS selaku direktur RSUD Dr. Soetomo saat penulis memulai pendidikan, H. Dodo Anondo, dr., MPH selaku direktur RSUD Dr. Soetomo selama penulis menjalani pendidikan dan H. Harsono, dr. selaku Plt. Direktur RSUD Dr. Soetomo saat ini, atas kesempatan dan fasilitas yang diberikan untuk menempuh PPDS-1 Ilmu Penyakit Jantung dan Pembuluh Darah FK Unair.
2. Muhammad Aminuddin,dr., SpJP (K)., FIHA., FAsCC selaku Departemen Ilmu Penyakit Jantung dan Pembuluh Darah FK Unair saat penulis memulai pendidikan hingga saat ini atas kesempatan untuk menempuh pendidikan, bimbingan serta bantuannya selama pendidikan.
3. Andrianto, dr., SpJP (K)., FIHA, FAsCC selaku Ketua Program Studi Ilmu Penyakit Jantung dan Pembuluh Darah FK Unair atas kesempatan menempuh pendidikan, dan bimbingan serta bantuannya selama pendidikan.
4. Agus Subagjo, dr., Sp.JP(K), FIHA, FAsCC selaku Ketua Program Studi Ilmu Penyakit Jantung dan Pembuluh Darah FK Unair saat penulis memulai pendidikan atas kesempatan menempuh pendidikan, dan bimbingan serta bantuannya selama pendidikan.
5. Prof. Dr. Djoko Soemantri, dr., Sp.JP(K), FIHA, FAsCC dan Dr. J. Nugroho, dr., Sp.JP(K), FIHA, FasCC selaku koordinator penelitian pada Program Studi Ilmu Penyakit Jantung dan Pembuluh Darah FK Unair atas segala bimbingan dan bantuannya selama pendidikan.
6. Prof. Maria Inge Lusida, dr., M.Kes., Ph.D., SpMK(K) sebagai kepala ITD- UNAIR Surabaya dan Dr. Purwati, dr., SpPD, FINASIM, selaku kepala Instalasi Laboratorium Stem Cell ITD-UNAIR Surabaya beserta jajaran staf dan teknisinya (Helen Susilowati, SKM., dkk) yang telah memberikan saya kesempatan dan dukungan untuk melakukan penelitian di tempat tersebut, memberikan bantuan, dukungan, dan arahan untuk menyelesaikan karya akhir ini.
7. Bambang Herwanto, dr., SpJP., FIHA., selaku dosen asuh penulis selama masa PPDS I Ilmu Penyakit Jantung dan Pembuluh Darah, atas segala bimbingan dan motivasi selama pendidikan.
8. Prof. Dr. Budi Susetyo Juwono (Alm), dr., SpJP (K)., FIHA dan Jatno Karjono (Alm), dr., SpJP (K)., FIHA atas bimbingan, bantuan dan keteladanan yang diberikan selama masa hidup beliau selama pendidikan.
9. Seluruh Staf Pengajar Program Studi Ilmu Penyakit Jantung dan Pembuluh Darah FK Unair : Prof. Dr. Budi S. Pikir, dr., SpJP (K)., Prof. Dr. Rochmad Romdoni, dr., SpJP (K)., Jeffrey D. Adipranoto, dr., SpJP (K)., RP.
Soeharsohadi, dr., SpJP (K)., Iswanto Pratanu, dr., SpJP (K)., Dyah Priyatini, dr., SpJP (K)., Esti Hindariati, dr., SpJP (K)., Budi Baktijasa, dr., SpJP (K)., I Gde Rurus Suryawan, dr., SpJP (K)., Bambang Herwanto, dr., SpJP (K)., Achmad Lefi, dr., SpJP (K)., Yudi Her Oktaviono, dr., SpJP (K)., Moh.
Budiarto, dr., SpJP., M. Yusuf., dr., SpJP., Meity Ardiana, dr., SpJP., Rerdin Julario, dr., SpJP., Rosi Amrilla F, dr., SpJP. dan Nia Dyah Rahmianti, dr., SpJP. atas segala bimbingan, bantuan dan semangat yang diberikan selama pendidikan.
10. Kepala Bagian/SMF Ilmu Penyakit Dalam, Paru, Radiologi, Rehabilitasi Medik, dan Ilmu Kesehatan Anak beserta staf pengajar atas kesempatan belajar serta bimbingannya selama pendidikan.
11. Kepala Ruangan Rawat Inap, Poliklinik Jantung, ICCU, IDIK, IRD dan Ekokardiografi beserta seluruh staf paramedis RSUD Dr. Soetomo Surabaya dan karyawan bagian Ilmu Penyakit Jantung dan Pembuluh Darah FK Unair atas segala bimbingan, kerjasama, motivasi dan bantuannya selama pendidikan.
12. Seluruh pasien yang telah dirawat maupun responden penelitian atas ketulusan dan kerjasamanya, sekaligus menjadi guru bagi penulis selama pendidikan.
13. Rekan – rekan seangkatan : Ahmad Surya Darma.dr, Intan Komalasari.dr, Devie Caroline.dr, Revi Adheriyani.dr, Aussie F. Ghaznawie.dr, dan Nadya Luthfah.dr, atas kerjasama, dukungan, motivasi dan semangat selama pendidikan.
14. Rekan – rekan seperjuangan dalam ujian tulis nasional (CBT Maret 2016): Rina Mawarti.dr, Irma Kartikasari.dr, Susetyo Atmojo.dr, Ahmad Faizal Amir.dr, dan Luh Oliva S.dr, atas segala bantuan, dukungan dan kerjasamanya.
15. Rekan – rekan PPDS-1 stase IDIK yang turut memberikan dukungan dalam penyelesaian penelitian ini atas jerih payah, kerjasama dan dukungan yang diberikan
16. Rekan – rekan PPDS – 1 Ilmu Penyakit Jantung dan Pembuluh Darah FK Unair atas segala kerjasama, bantuan, semangat selama pendidikan.
17. Anak saya tercinta, Tania Rossa Fidelya, atas segala pengertian, dukungan, kesabaran, pengorbanan, serta doa yang diberikan selama menempuh pendidikan.
18. Orang tua saya, Prof. Dr. Sabilal Alif (Alm), dr, SpU(K) dan Nur Laily, serta kakak-adik saya Ferizal Ardiansyah, ST., MBA., Fikri Rizaldi, dr. SpU., Ferdian Rizaliansyah, dan Farhan Nurdiansyah dengan penuh kasih sayang dan perhatian mendoakan dan memberikan dukungan, motivasi, dan bantuannya selama menempuh pendidikan.
19. Semua pihak yang tidak bisa disebutkan satu – persatu, yang turut membantu dan mendukung penulis selama menjalani pendidikan.
Penulis menyadari bahwa karya akhir ini masih banyak kekurangan, oleh karena itu diharapkan sumbang saran dan kritik dari semua pihak demi perbaikan di masa mendatang. Saya berharap karya akhir ini dapat bermanfaat bagi masyarakat dan bagi perkembangan ilmu pengetahuan. Tidak lupa penulis memohon maaf yang sebesar – besarnya kepada semua pihak atas segala kekurangan dan kesalahan yang dilakukan selama menjalani pendidikan.
Surabaya, 8 Agustus 2016 Penulis,
ABSTRAK Efek Pemberian Statin Terhadap Proliferasi Endothelial Progenitor Cell (EPC) Pada Darah Tepi Penderita Penyakit Jantung Koroner Stabil
Feranti Meuthia Yudi Her Oktaviono
Djoko Soemantri
Latar Belakang: Lesi atherosklerotik merupakan akibat dari proses inflamasi
yang diawali oleh kerusakan endotel. EPC, yang berasal dari sumsum tulang, berpartisipasi dalam perbaikan endotel dan pertumbuhan pembuluh darah baru. Farmakoterapi kardiovaskular telah dibuktikan dapat memperbaiki jumlah dan fungsi EPC pada penderita dengan risiko kardiovaskular dan penyakit kardiovaskular. Banyak studi melaporkan bahwa statin memiliki efek yang menguntungkan terhadap EPC yaitu dengan meningkatkan proliferasi dan diferensiasi. Oleh karena itu, kami melakukan penelitian untuk menganalisis efek tiga statin yang berbeda terhadap proliferasi EPC.
Tujuan: Untuk menganalisis efek pemberian statin terhadap proliferasi EPC pada darah tepi penderita penyakit jantung koroner stabil. Metode: Penelitian ini kami lakukan secara in vitro true experimental post-test only control group design. Sel mononuklear diisolasi dari darah tepi penderita
penyakit jantung koroner stabil dan dilakukan kultur dalam medium CFU-Hill selama 3 hari. Kemudian sampel dibagi menjadi empat kelompok yaitu kelompok simvastatin,, atorvastatin, rosuvastatin dan kelompok kontrol. Tiap kelompok yang diberi perlakuan dibagi lagi menjadi 3 subkelompok dengan dosis yang berbeda, yaitu 0.1 µmol/L, 0.5 µmol/L, dan 2.5 µmol/L kemudian diinkubasi selama 48 jam. Proliferasi EPC dievaluasi setelahnya dengan MTT cell
proliferation assay. Metode imunositokimia dilakukan untuk identifikasi EPC
+
dengan mengevaluasi ekspresi CD34 . Pemeriksaan dan penghitungan CFU-Hill dilakukan untuk mengkonfirmasi karakteristik fungsional EPC. Data dianalisis dengan uji T independen dan ANOVA.
Hasil: MTT cell prolifeation assay menunjukkan peningkatan bermakna terhadap
proliferasi EPC pada kelompok simvastatin, atorvastatin, dan rosuvastatin dibandingkan dengn kelompok kontrol (0.237±0.007, 0.248±0.01, 0.231±0.008 vs 0.019±0.008, p<0.05). Proliferasi EPC juga berbeda antar kelompok statin, dimana efek tertinggi didapatkan pada kelompok atorvastatin. Proliferasi EPC pada kelompok atorvastatin lebih tinggi daripada kelompok simvastatin (0.248±0.01 vs 0.237±0.007, p<0.05), dan simvastatin lebih tinggi daripada kelompok rosuvastatin (0.237±0.007 vs 0.231±0.008, p<0.05). Penghitungan CFU-Hill memperlihatkan jumlah tertinggi pada kelompok rosuvastatin, diikuti atorvastatin, dan simvastatin. Pemeriksaan imunositokimia menunjukkan ekspresi positif terhadap CD34.
Kesimpulan: Statin meningkatkan proliferasi EPC pada darah tepi penderita
penyakit jantung koroner stabil. Efek tertinggi tampak pada kelompok atorvastatin, diikuti kelompok simvastatin, dan rosuvastatin. Tiap statin meningkatkan proliferasi dengan bergantung dosis (dose-dependent).
Kata kunci: Proliferasi EPC, simvastatin, atorvastatin, rosuvastatin
ABSTRACT Effect of Statins on Endothelial Progenitor Cell (EPC) Proliferation from Peripheral Blood of Stable Coronary Artery Disease Patient
Feranti Meuthia Yudi Her Oktaviono
Djoko Soemantri
Background: Atherosclerotic lesions develop as the result of an inflammatory
process initiated by endothelial damage. EPCs, which is derived from bone marrow, participate in endothelial repair and new vessel growth. Cardiovascular pharmacotherapies have been shown to improve overall numbers and function of EPCs in patients with cardiovascular risk and cardiovascular disease. Studies have reported that statins exert beneficial effects on EPCs by enhancing EPC proliferation and differentiation. Thus, we require a research to analyze the effects of three different statins on EPC proliferation.
Objective: To analyze the effect of statins on EPC proliferation from peripheral blood of stable coronary artery disease patient. Methods: This is an in vitro true experimental post-test only control group
design. The MNCs were isolated from peripheral blood of stable coronary artery disease patient and were cultured in CFU-Hill medium for 3 days. Then samples were put into four groups, simvastatin experiment group, atorvastatin experiment group, rosuvastatin experiment group and control group. Each experiment group was divided into 3 subgroups with different doses, 0.1 µmol/L, 0.5 µmol/L, dan 2.5 µmol/L then incubated for 48 hours. EPC proliferation was evaluated afterwards with MTT cell proliferation assay. Immunocytochemistry method was
- performed for EPC identification to evaluate expression of CD34 . CFU-Hill were observed to confirm functional characteristics of EPC. Datas were analyzed by independent T test and ANOVA.
Results: MTT cell proliferation assay showed a significant increase of EPC
proliferation in simvastatin, atorvastatin, and rosuvastatin groups compared with control group (0.237±0.007, 0.248±0.01, 0.231±0.008 vs 0.019±0.008, p<0.05). It also revealed significant difference in EPC proliferation between each experiment groups, which atorvastatin showed the highest effect. EPC proliferation in atorvastatin is higher than simvastatin group (0.248±0.01 vs 0.237±0.007, p<0.05), and simvastatin is also higher than rosuvastatin group (0.237±0.007 vs 0.231±0.008, p<0.05). CFU-Hill counts demonstrated highest number in rosuvastatin group, followed by atorvastatin, and simvastatin. Immunocytochemistry showed positive expression of CD34.
Conclusion: Statins increase EPC proliferation from peripheral blood of stable
coronary artery disease patient. Atorvastatin showed the highest EPC proliferation, followed by simvastatin, and rosuvastatin. Each statins increased EPC proliferation dose-dependently.
Keywords: EPC proliferation, simvastatin, atorvastatin, rosuvastatin
DAFTAR ISI
SAMPUL DEPAN SAMPUL DALAM LEMBAR PENGESAHAN ......................................................................... ii PERNYATAAN .......................................................................................... iii PERNYATAAN PERSETUJUAN .............................................................. iv KATA PENGANTAR .................................................................................. v ABSTRAK ................................................................................................... x ABSTRACT ................................................................................................. xi DAFTAR ISI ................................................................................................ xii DAFTAR GAMBAR ................................................................................... xv DAFTAR TABEL ........................................................................................ xvi DAFTAR LAMPIRAN ............................................................................... xvii DAFTAR SINGKATAN ............................................................................. xix
BAB 1 PENDAHULUAN ............................................................................ 1
1.1. Latar Belakang Masalah ................................................................. 1
1.2. Rumusan Masalah .......................................................................... 4
1.3. Tujuan Penelitian ........................................................................... 4
1.3.1. Tujuan Umum .................................................................. 4
1.3.2. Tujuan Khusus ................................................................. 4
1.4. Manfaat Penelitian ......................................................................... 5
1.4.1. Manfaat Akademik .......................................................... 5
1.4.2. Manfaat Klinis ................................................................. 5
BAB 2 TINJAUAN KEPUSTAKAAN ....................................................... 6
2.1. Endothelial Progenitor Cell (EPC) ............................................... 6
2.1.1. Definisi dan Karakteristik EPC ........................................ 6
2.1.2. Mobilisasi dan Homing EPC ............................................ 8
2.1.3. Isolasi dan Kuantifikasi EPC ........................................... 10
2.2. Transduksi Sinyal pada Proliferasi EPC ........................................ 13
2.2.1. Reseptor Transmembran .................................................. 13
2.2.2. Second Messenger ........................................................... 14
2.2.3. Jalur Transduksi Sinyal ................................................... 15
2.3. EPC dan Faktor Risiko Kardiovaskular ......................................... 17
2.4. EPC dan Kolesterol ........................................................................ 20
2.5. EPC dan Penyakit Jantung Koroner ............................................... 21
2.6. HMG-CoA reductase inhibitor (Statin) .......................................... 23
BAB 3 KERANGKA KONSEP DAN HIPOTESIS .................................... 34
3.1. Kerangka Konsep ........................................................................... 34
3.2. Hipotesis Penelitian ....................................................................... 35
BAB 4 MATERI DAN METODE PENELITIAN ...................................... 36
4.1. Rancangan Penelitian ..................................................................... 36
4.2. Tempat dan Waktu Penelitian ........................................................ 37
4.3. Sampel Penelitian ........................................................................... 37
4.3.1. Cara Pengambilan Sampel ............................................... 37
4.3.2. Besar sampel .................................................................... 38
4.4. Variabel Penelitian ......................................................................... 39
4.4.1. Variabel Bebas ................................................................. 39
4.4.2. Variabel Eksperimental ................................................... 40
4.4.3. Variabel Tergantung ........................................................ 40
4.5. Definisi Operasional ...................................................................... 40
4.6. Bahan dan Alat Penelitian ............................................................. 41
4.7. Prosedur Penelitian ........................................................................ 42
4.7.1. Koleksi Sampel ................................................................ 42
4.7.2. Isolasi Sel Darah Tepi dan Kultur EPC ........................... 43
4.7.3. Pemeriksaan untuk Menilai Proliferasi EPC ................... 45
4.7.4. Pemeriksaan Menghitung Jumlah Koloni EPC ............... 45
4.7.5. Pemeriksaan Imunofluoresensi ........................................ 45
4.8. Alur Penelitian ............................................................................... 47
4.9. Pengumpulan, Pengolahan, dan Analisis Data .............................. 48
4.9.1. Pengumpulan Data ........................................................... 48
4.9.2. Pengolahan dan Analisis Data ......................................... 48
4.10. Kelaikan Etik ................................................................................. 48
BAB 5 HASIL PENELITIAN ..................................................................... 50
5.1. Gambaran Umum Penelitian ......................................................... 50
5.2. Karakteristik Subjek Penelitian ..................................................... 51
5.3. Proliferasi EPC antara Kelompok Simvastatin, Atorvastatin, Rosuvastatin, dan Kontrol ............................................................. 52
5.3.1. Perbandingan Proliferasi EPC antara Kelompok yang Diberikan Simvastatin dan Kontrol ................................. 52
5.3.2. Perbandingan Proliferasi EPC antara Kelompok yang Diberikan Atorvastatin dan Kontrol ................................ 53
5.3.3. Perbandingan Proliferasi EPC antara Kelompok yang Diberikan Rosuvastatin dan Kontrol ............................... 53
5.4. Perbedaan Proliferasi EPC antara Kelompok Simvastatin, Atorvastatin, dan Rosuvastatin ..................................................... 55
5.5. Perbedaan Proliferasi EPC pada Dosis Rendah, Sedaang, Tinggi dari Simvastatin, Atorvastatin, dan Rosuvastatin ................................. 56
5.5.1. Perbedaan Proliferasi EPC pada Simvastatin Dosis Rendah, Sedang, dan Tinggi ....................................................................... 56
5.5.2. Perbedaan Proliferasi EPC pada Atorvastatin Dosis Rendah, Sedang, dan Tinggi ....................................................................... 57
5.5.3. Perbedaan Proliferasi EPC pada Rosuvastatin Dosis Rendah, Sedang, dan Tinggi ....................................................................... 58
5.6. Pemeriksaan CFU pada Kelompok Simvastatin, Atorvastatin, Rosuvastatin, dan Kontrol ............................................................. 59
5.7. Pemeriksaan Imunofluoresensi ...................................................... 61
BAB 6 PEMBAHASAN ............................................................................. 62 BAB 7 KESIMPULAN DAN SARAN ....................................................... 67
7.1. Kesimpulan .................................................................................... 67
7.2. Saran .............................................................................................. 67 DAFTAR PUSTAKA .................................................................................. 69 LAMPIRAN ................................................................................................ 73
DAFTAR GAMBAR
Gambar 2.1. Sel progenitor dan stem cell ................................................. 7Gambar 2.2. Mobilisasi EPC dari sumsum tulang ................................... 8Gambar 2.3. Mekanisme homing dan diferensiasi EPC ......................... 9Gambar 2.4. Morfologi early EPC dan late EPC .................................... 11Gambar 2.5. Kaskade MAP kinase ........................................................... 16Gambar 2.6. Jalur PI3K/Akt ...................................................................... 16Gambar 2.7. Efek molekular dari oxLDL ................................................. 20Gambar 2.8. Regulasi EPC pada perjalanan atherosklerosis .................... 23Gambar 2.9. Jalur mevalonate ................................................................... 25Gambar 2.10. Stuktur kimia statin .............................................................. 25Gambar 2.11. Intervensi terapi untuk peningkatan EPC ......................... 29Gambar 2.12. Skema representasi ERK 1/2, Akt, dan eNOS oleh atorvastatin ........................................................................... 30Gambar 2.13. Peran statin pada inflamasi dalam patogenesis penyakit jantung koroner ................................................................... 32Gambar 2.14. Efek statin dan SDF-1 dalam meningkatkan angiogenesis ......................................................................... 33Gambar 3.1. Kerangka konseptual penelitian ......................................... 34Gambar 4.1. Desain penelitian “postest only control groupdesign” ............................................................................... 36
Gambar 4.2. Alur penelitian ...................................................................... 47Gambar 5.1. Perbandingan proliferasi EPC antara kelompok Simvastatin dan kontrol ........................................................................... 52Gambar 5.2. Perbandingan proliferasi EPC antara kelompok Atorvastatin dan kontrol ........................................................................... 53Gambar 5.3. Perbandingan proliferasi EPC antara kelompok Rosuvastatin dan kontrol ........................................................................... 54Gambar 5.4. Perbedaan proliferasi EPC antara kelompokSimvastatin, Atorvastatin, dan Rosuvastatin ........................ 55
Gambar 5.5. Perbedaan proliferasi EPC pada Simvastatin dosis rendah,sedang, dan tinggi ................................................................ 56
Gambar 5.6. Perbedaan proliferasi EPC pada Atorvastatin dosis rendah, sedang, dan tinggi ................................................................ 57Gambar 5.7. Perbedaan proliferasi EPC pada Rosuvastatin dosis rendah, sedang, dan tinggi ................................................................ 58Gambar 5.8. Gambaran mikroskopis CFU kelompok kontrol ................. 59Gambar 5.9. Gambaran mikroskopis CFU kelompok simvastatina. dosis 0.1 µmol/L b. dosis 2.5 µmol/L ............................. 59
Gambar 5.10. Gambaran mikroskopis CFU kelompok atorvastatina. dosis 0.1 µmol/L b. dosis 2.5 µmol/L ............................. 60
Gambar 5.11. Gambaran mikroskopis CFU kelompok simvastatina. dosis 0.1 µmol/L b. dosis 2.5 µmol/L .............................. 60
Gambar 5.12. Gambaran imunofluoresensi ekspresi CD34 ....................... 61DAFTAR TABEL
Tabel 2.1. Faktor Risiko Kardiovaskular dan EPC ............................. 18Tabel 5.1. Karakteristik dasar subjek penelitian ................................. 51Tabel 5.2. Perbandingan proliferasi EPC antara kelompok SimvastatinAtorvastatin, Rosuvastatin, dan kontrol ............................. 54
Tabel 5.3. Jumlah CFU pada kelompok kontrol, simvastatin, atorvastatin dan rosuvastatin .................................................................. 60DAFTAR LAMPIRAN
Lampiran 1 Lembar pengumpulan Data Subjek Penelitian ..................... 73 Lampiran 2 Penjelasan Untuk Mendapatkan Persetujuan Subjek
Penelitian Dewasa (Information for Consent) ...................... 76 Lampiran 3 Persetujuan Ikut Serta Dalam Penelitian
(Informed Consent) .............................................................. 80 Lampiran 4 Hasil Analisis statistik SPSS Windows Version ................. 81
DAFTAR SINGKATAN
Flk-1 Fetal liver kinase-1 FOXO Forkhead Box O GGPP Geranylgeranylpyrophosphate GTP Guanosine Triphosphate HIV
ITD Institute of Tropical Disease KDR Kinase Insert Domain Receptor
IMA Infark Miokard Akut
IDIK Instalasi Diagnostik Intervensi Kardiologi
Intercelluar Adhesion Molecule-1
ICAM-1
HMG-CoA 3-Hydroxy-Methylglutaryl Coenzyme A HDL-C High-Density Lipoprotein Cholesterol HSC Hematopoetic Stem Cell hsCRP High-sensitivity C-Reactive Protein
Human Immunodeficiency Virus
AGE
Advanced Glycation Endproduct
EGF Epidermal growth factor eNOS endothelial Nitric Oxide Synthase ERK Extracellular Signal-Regulated Kinase FBS Fetal Bovine Serum FCS
Extracellular Matrix
ECM
Deoxyribose Nucleic Acid
CFU Colony Forming Unit CRP C-Reactive Protein CXCR C-X-C Chemokine Receptor DNA
Carotid Intima-Media Thickness
eNOS endothelial Nitric Oxide Synthase EPC Endothelial Progenitor Cell CABG Coronary Artery Bypass Graft CARE Cholesterol and Recurrent Events CIMT
Fetal Calf Serum LDL Low Density Lipoprotein LOX-1
Lectin-like Oxidized Low Density Lipoprotein Receptor 1
MAPK Mitogen-Activated Protein Kinase MAPK K Mitogen-Activated Protein Kinase Kinase MMP Matrix Metalloproteinase MNC Mononuclear Cell MCP-1
Monocyte Chemoattractant Protein-1
NAD(P)H Nicotinamide Adenine Dinucleotide Phosphate NF-ҡβ Nuclear Factor-ҡβ NO Nitric Oxide oxLDL oxidized Low Density Lipoprotein PBS
Phosphate Buffer Saline
PDK-1 Pyruvate dehidrogenase Kinase-1 PI3K Phosphatidil Inositol-3-Kinase PIP2 Phosphatidilinositol biphosphate PIP3 Phosphatidilinositol triphosphate PJK Penyakit Jantung Koroner PP Pyrophosphate ROS Reactive Oxygen Species RTK Tyrosine Kinase Receptor SCAD Stable Coronary Artery Disease SDF-1
Stromal cell-derived factor-1
TPHA Treponema Pallidum Haemagglutination
VDRL Venereal Disease Research Laboratory
VEGF Vascular Endothelial Growth Factor
VEGFR-2 Vascular Endothelial Growth Factor Receptor-2
VLDL
Very-Low-Density Lipoprotein
vWF Von Willebrand Factor
BAB 1 PENDAHULUAN
1.1. Latar Belakang Masalah
Penyakit kardiovaskular saat ini tetap merupakan penyebab terbanyak kematian di seluruh dunia. Pada tahun 2008 lebih dari 17 juta penderita mengalami kematian akibat penyakit kardiovaskular, dimana serangan jantung merupakan penyebab kematian pada 7.3 juta penderita. Proses yang mendasari penyakit jantung koroner adalah atherosklerosis. Atherosklerosis merupakan proses patologis kompleks pada dinding pembuluh darah yang terjadi bertahun- tahun (Mendis et al., 2011). Definisi dari penyakit jantung koroner stabil atau
stable coronary artery disease (SCAD) adalah suatu penyakit dengan manifestasi
nyeri dada yang disebabkan oleh suatu aktivitas atau stress akibat penyempitan ≥50% arteri koroner left main dan ≥70% pada satu atau lebih pembuluh darah koroner mayor lainnya. Prevalensi angina pada studi populasi menunjukkan peningkatan sesuai usia pada kedua jenis kelamin, mulai dari 5-7% pada wanita usia 45-64 tahun, hingga 10-12% pada wanita usia 65-84 tahun, dan 4-7% pada laki-laki usia 45-64 tahun hingga 12-14% pada laki-laki usia 65-84 tahun (Montalescot et al., 2013).
Patofisiologi yang mendasari penyakit jantung koroner (PJK) adalah adanya gangguan aliran darah koroner akibat atherosklerosis yang dipicu terutama oleh ketidakseimbangan homeostasis endotel (Padfield et al., 2010). Adanya penemuan bahwa sel-sel yang berasal dari sumsum tulang yang dikenal dengan
endothelial progenitor cells (EPC) berperan dalam perbaikan sel endotel dan
pertumbuhan vaskuler baru telah mengubah model patogenesis penyakit kardiovaskular ini (Fadini et al., 2007). Terapi saat ini untuk penyakit kardiovaskular meliputi manajemen gaya hidup, kontrol farmakologis terhadap faktor risiko, revaskularisasi baik melalui intervensi maupun operasi, dimana tidak dapat mengontrol penyakit jantung koroner secara komplit. Oleh karena itu, pendekatan baru seperti terapi berbasis sel diperlukan. Sejak EPC ditemukan berkontribusi pada vaskularisasi jaringan setelah kejadian iskemik di ekstremitas, retina, dan miokard, EPC mempunyai peluang yang menjanjikan sebagai terapi baru sebagai perbaikan vaskular dan kontrol penyakit kardiovaskular (Du et al., 2012). EPC memiliki peran utama dalam pembentukan pembuluh darah baru. EPC pertama kali berhasil diisolasi oleh Ashahara dkk pada tahun 1997 sebagai suatu sel progenitor hematopoietik dari sel darah tepi. Peran utama dari EPC adalah mendukung proses vaskulogenesis serta memperbaiki kerusakan dan disfungsi endotel (Ana et al., 2012).
Hubungan antara jumlah EPC dengan PJK telah dibuktikan dalam beberapa hasil penelitian. Jumlah dan aktivitas EPC menurun pada kondisi risiko tinggi PJK. Beberapa peneliti telah menunjukkan bahwa jumlah EPC pada penderita PJK lebih rendah bila dibandingkan orang sehat dan berkorelasi negatif dengan jumlah faktor risiko. Sebaliknya, penelitian akhir menunjukkan adanya peningkatan jumlah EPC pada penderita infark miokard akut (IMA), angina pektoris stabil kronik, maupun paska coronary artery bypass grafting (CABG). Pada penderita angina pektoris stabil didapatkan jumlah EPC yang lebih rendah dibandingkan angina pektoris tidak stabil (Siddique et al., 2010).
Kontribusi kuantitatif EPC secara tepat pada homeostasis endotel belum jelas diketahui (Fadini et al., 2007). Beberapa hasil penelitian menunjukkan bahwa EPC mempuyai peranan penting dalam reendothelialisasi cepat untuk pemulihan fungsi vaskular normal, menurunkan inflamasi vaskular, mencegah remodelling, angiogenesis, dan neovaskularisasi. Sebaliknya, respon EPC yang tidak adekuat menyebabkan keterlambatan reendotelialisasi dan inflamasi persisten sehingga menimbulkan restenosis dan gejala iskemia miokard (Padfield
et al., 2010; Pellicia et al., 2010).
Berbagai upaya terus dikembangkan untuk meningkatkan jumlah dan fungsi EPC sirkulasi. Sampai saat ini, mekanisme diferensiasi, proliferasi, dan sumber EPC serta faktor-faktor yang dapat menginduksi atau menghambat proses tersebut belum diketahui secara pasti. Ada beberapa terapi yang dapat mempengaruhi fisiologi EPC, salah satunya adalah statin (Park et al, 2011). Statin atau HMG-CoA reductase inhibitors menurunkan level kolesterol melalui inhibisi HMG-CoA reductase, enzim yang penting untuk sintesis kolesterol di liver. Data mengenai statin sebagai terapi primer dan sekunder penyakit kardiovaskular sangat konsisten (Lee dan Poh, 2014). Statin terdiri dari beberapa jenis yang telah beredar luas. Walaupun semua statin memiliki kesamaan mekanisme aksi, masing-masing statin memiliki struktur kimia, profil farmakokinetik, dan efektivitas modifikasi lipid yang berbeda. Struktur kimia statin mempengaruhi sifat solubilitas terhadap air, yang selanjutnya mempengaruhi sifat absorpsi, distribusi, metabolisme, dan ekskresi (Schachter, 2004). Statin dengan dosis yang berbeda-beda telah dilaporkan berguna dalam meningkatkan jumlah dan fungsi EPC. Beberapa studi melaporkan statin memiliki efek menguntungkan pada EPC dengan meningkatkan proliferasi dan diferensiasi EPC. Hal ini dapat mengakibatkan aktivasi jalur endothelial nitric oxide synthase (eNOS) dan migrasi sel endotel yang dipicu oleh vascular endothelial growth factor (VEGF) (Lee dan Kian, 2014).
1.2. Rumusan Masalah
1. Apakah terdapat peningkatan proliferasi EPC pada darah tepi penderita penyakit jantung koroner stabil antara kelompok yang diberikan simvastatin, atorvastatin, dan rosuvastatin dengan kelompok kontrol?
2. Apakah terdapat perbedaan proliferasi EPC pada darah tepi penderita penyakit jantung koroner stabil antara kelompok yang diberikan simvastatin, atorvastatin, dan rosuvastatin?
3. Apakah terdapat perbedaan proliferasi EPC pada dosis rendah, sedang, dan tinggi dari pemberian simvastatin, atorvastatin, dan rosuvastatin yang diberikan pada darah tepi penderita penyakit jantung koroner stabil?
1.3. Tujuan Penelitian
1.3.1. Tujuan Umum
Penelitian ini bertujuan untuk menganalisis efek pemberian statin terhadap proliferasi EPC pada darah tepi penderita penyakit jantung koroner stabil.
1.3.2. Tujuan Khusus
Tujuan khusus penelitian ini adalah :
1. Menganalisis peningkatan proliferasi EPC pada darah tepi penderita penyakit jantung koroner stabil antara kelompok yang diberikan simvastatin, atorvastatin, dan rosuvastatin dengan kelompok kontrol.
2. Menganalisis perbedaan proliferasi EPC pada darah tepi penderita penyakit jantung koroner stabil antara kelompok yang diberikan simvastatin, atorvastatin, dan rosuvastatin.
3. Menganalisis perbedaan proliferasi EPC pada dosis rendah, sedang, dan tinggi dari pemberian simvastatin, atorvastatin, dan rosuvastatin yang diberikan pada darah tepi penderita penyakit jantung koroner stabil.
1.4. Manfaat Penelitian
1.4.1. Manfaat Akademik
1. Menambah dasar pemahaman dan ilmu pengetahuan mengenai efek statin terhadap proliferasi EPC.
2. Memberikan sarana informasi dalam hal regenerative medicine sehingga dapat dijadikan acuan untuk penelitian selanjutnya yang berhubungan dengan EPC.
1.4.2. Manfaat Klinis
1. Menambah dasar pemahaman dan ilmu pengetahuan mengenai upaya peningkatan EPC pada penderita penyakit arteri koroner stabil.
2. Sebagai bahan pertimbangan untuk jenis dan dosis statin yang dapat diberikan untuk penderita penyakit arteri koroner stabil.
BAB 2 TINJAUAN KEPUSTAKAAN
2.1. Endothelial Progenitor Cell (EPC)
2.1.1. Definisi dan Karakteristik EPC
Endotel vaskular berperan penting dalam meregulasi tonus vaskular, struktur, pertumbuhan, fibrinolisis, dan homeostasis. Oleh karena itu, endotel memproteksi pembuluh darah dari inflamasi, respon imun, thrombosis, dan penyakit kardiovaskular. Disfungsi endotel merupakan kejadian awal yang kemudian dapat mengakibatkan kelainan di dinding vaskular. Proses ini menyebabkan lepasnya sel endotel dan pengambilan sel progenitor yang terlibat dalam perbaikan vaskular. Banyak studi yang menunjukkan, dimana pertama ditunjukkan oleh Asahara dan kawan-kawan, EPC berperan penting dalam perbaikan endotel yang rusak dengan melawan kerusakan yang disebabkan faktor risiko kardiovaskular. Oleh karena itu, EPC memiliki kontribusi penting dalam neovaskularisasi fisiologis dan patologis (Du et al., 2012).
EPC merupakan bagian dari sel berinti tunggal atau mononuclear cell (MNC) yang memiliki ciri khas ekspresi dari 3 marker yaitu CD133, CD34, dan
vascular endothelial growth factor receptor-2 (VEGFR-2) yang disebut juga kinase insert domain receptor (KDR) atau fetal liver kinase-1 (Flk-1). Sel dengan
karakteristik ini terlokalisasi predominan di sumsum tulang dan dapat diinduksi untuk terjadinya mobilisasi menuju sirkulasi perifer oleh berbagai macam stimulus termasuk iskemia jaringan melalui rilis dari berbagai growth factors. Begitu mencapai sirkulasi perifer, EPC membentuk kumpulan sel yang secara aktif memperbaiki lapisan endotel dengan menutup daerah yang mengalami kerusakan. Pada sirkulasi perifer orang dewasa, EPC yang lebih matur ditemukan telah kehilangan CD133 namun positif untuk CD34 dan VEGFR-2. Sel endotel yang matur menunjukkan ekspresi tinggi dari VEGFR-2, VE-cadherin, dan faktor von Willebrand. Oleh karena itu, hilangnya CD133 kemungkinan merefleksikan transformasi EPC dalam sirkulasi menjadi sel endotel yang matur. Namun, hingga saat ini belum jelas kapan EPC mulai kehilangan CD133 (Hristov et al., 2003; Fadini et al., 2007)
Seperti halnya stem cell, EPC juga memiliki kemampuan proliferasi dan diferensiasi namun lebih terbatas. Sel ini bersifat unipoten, hanya dapat berdiferensiasi menjadi sel endotel matang (Leone et al., 2009).
Gambar 2.1. Sel progenitor dan stem cell (Sumber: Asahara, 2004)Bukti yang ada menunjukkan bahwa hematopoetic stem cell (HSC) dan EPC berasal dari prekursor yang sama (hemangioblast). Pertumbuhan dan fusi dari kumpulan darah dalam yolk sac embrio mengakibatkan peningkatan kapiler yang kemudian akan berdiferensiasi menjadi sistem arteriovenous vaskular. Sel yang akan berkembang menjadi sel hematopoetik berada di tengah, yang disebut dengan HSC. EPC, atau angioblast, terletak di bagian perifer (Murasawa dan Asahara, 2005).
2.1.2. Mobilisasi dan Homing EPC
EPC dapat mengalami mobilisasi akibat berbagai stimulus, menuju sirkulasi dan berkontribusi pada proses neoangiogenesis atau proses perbaikan lapisan sel endotel yang mengalami kerusakan.
Gambar 2.2. Mobilisasi EPC dari sumsum tulang (Sumber: George etal., 2011)
Iskemia merupakan sinyal utama yang dapat menginduksi mobilisasi EPC dari sumsum tulang. Iskemia kemudian meningkatkan regulasi VEGF dan stromal
cell-derived factor-1 (SDF-1) yang kemudian meningkatkan eNOS dan produksi
NO, yang selanjutnya mengaktivasi matrix metalloproteinase-9 (MMP-9) (Urbidh dan Dimmeler, 2004; George et al., 2011). Aktivasi MMP-9 membantu transformasi ligand Kit yang terikat membran menjadi ligand Kit yang solubel kemudian mengakibatkan pindahnya sel progenitor endotelial dan sel prekursor hematopoetik menuju zona vaskular dari lingkungan sumsum tulang (Hristov et al., 2003).
Setelah mobilisasi, EPC menemukan jalan menuju endotel yang mengalami kerusakan dan memerlukan perbaikan. Homing adalah proses awal yang cepat (diukur dalam hitungan jam dan tidak sampai 1-2 hari). Molekul adhesi (selectin dan integrin) melakukan mediasi homing sel menuju dinding pembuluh darah (Tousoulis et al., 2008).
Langkah awal homing sel progenitor menuju jaringan iskemik yaitu adhesi sel progenitor dengan sel endotel yang diaktivasi oleh sitokin dan iskemia, lalu transmigrasi sel progenitor menuju lapisan sel endotel.
Gambar 2.3. Mekanisme homing dan diferensiasi EPC (Sumber:Urbich dan Dimmeler, 2004) Integrin bertugas membantu adhesi dari berbagai sel menuju sel endotel.
β 1 -Integrin diekspresikan pada bermacam-macam tipe sel termasuk sel endotel dan sel hematopoetik, sedangkan β -Integrin ditemukan hanya pada sel 2 hematopoetik. Banyak studi menunjukkan kemokin seperti SDF-1 menstimulasi pengambilan sel progenitor menuju jaringan iskemik. Selain itu, invasi sel imunokompeten ke jaringan iskemik meningkatkan kemokin di dalam jaringan tersebut, misalnya monocyte chemoattractant protein-1 (MCP-1) dan interleukin, yang kemudian dapat menarik sel progenitor di dalam sirkulasi. Pada akhirnya, EPC mengalami maturasi manjadi sel endotel yang fungsional (Urbich dan Dimmeler, 2004).
2.1.3. Isolasi dan Kuantifikasi EPC
Ada 2 tipe EPC yaitu early EPC dan late EPC. Early EPC biasanya merupakan populasi EPC angiogenik yang didapatkan dari kultur jangka pendek
in vitro selama 4-7 hari. Early EPC ini membentuk colony forming units (CFU) dan memiliki banyak karakteristik endotel seperti marker CD31 dan VEGFR2.
Late EPC, biasa juga disebut out-growth EPC, memiliki pola pertumbuhan yang
berbeda dan didapatkan dari kultur jangka panjang yaitu selama 2-3 minggu in
vitro (Lee dan Poh, 2014). Kemampuan EPC untuk bermigrasi menuju satu sama
lain untuk membentuk suatu koloni menunjukkan fungsi EPC. Penghitungan koloni merepresentasikan karakteristik kumulatif kuantitas EPC dan karakteristik fungsional, termasuk diferensiasi, proliferasi, senecence, dan aktivitas migrasi (Shantsila et al., 2007).
Out-growth EPC mempunyai karakteristik lain endotel yaitu VE-cadherin
dan faktor von Willebrand, selain CD31, CD133, CD34, dan VEGFR2. EPC ini kemudian akan berdiferensiasi menjadi sel endotel matur untuk angiogenesis dan vaskulogenesis. Morfologi kedua EPC ini pun berbeda, early EPC berbentuk
spindle-shape sedangkan late EPC berbentuk cobblestone-like shape (Lee dan Poh, 2014).
Gambar 2.4. Morfologi early EPC dan late EPC (Sumber: Lee dan Poh,2014) EPC dapat diisolasi dan dikultur dari sumsum tulang, hati janin, tali pusat serta sirkulasi darah perifer. Setelah diisolasi, sel dikultur dalam medium dengan penambahan growth factor yang spesifik (VEGF, bovine brain extract, atau epidermal growth factor/EGF) untuk memfasilitasi pertumbuhan sel endotel.
Isolasi dan kuantifikasi EPC dapat dilakukan melalui 2 pendekatan: seleksi kultur karena sifat adhesi dan pertumbuhan in vitro dan seleksi berdasarkan fenotip sel menggunakan agen berlabel fluoresensi dan dibaca dengan flow cytometer (Hirschi et al., 2008). Inkubasi dapat dilakukan secara in vitro maupun in vivo.