DETEKSI MOLEKULAR GEN SERTA UJI AKTIVITAS ENZIM KATABOLIK DARI BAKTERI Actinobacillus sp. P3(7)TERHADAP SUBSTRAT HIDROKARBON Repository - UNAIR REPOSITORY

  TESIS DETEKSI MOLEKULAR GEN SERTA UJI AKTIVITAS ENZIM KATABOLIK DARI BAKTERI Actinobacillus sp. P3(7) TERHADAP SUBSTRAT HIDROKARBON MIRANTI PUSPITASARI NIM. 081414253001 PROGRAM STUDI MAGISTER KIMIA FAKULTAS SAINS DAN TEKNOLOGI UNIVERSITAS AIRLANGGA 2016

  

TESIS DETEKSI MOLEKULAR GEN ... MIRANTI PUSPITASARI

  

TESIS DETEKSI MOLEKULAR GEN ... MIRANTI PUSPITASARI

UCAPAN TERIMA KASIH

  vi

  Segala puji syukur dipanjatkan ke hadirat Allah SWT yang telah melimpahkan rahmat serta hidayah-Nya, sehingga penulisan tesis berjudul “Deteksi Molekular Gen serta Uji Aktivitas Enzim Katabolik dari Bakteri

  Actinobacillus sp. P3(7) terhadap Substrat Hidrokarbon

  ” dapat terselesaikan dengan baik. Penulisan tesis ini banyak mendapatkan bantuan moril maupun materil dari berbagai pihak, sehingga ucapan terima kasih disampaikan dengan tulus kepada:

  1. Dr. Sri Sumarsih, M.Si. selaku Dosen Pembimbing I sekaligus Dosen Wali.

  Terima kasih telah berkenan meluangkan waktu untuk selalu membimbing, memberikan saran, memberikan motivasi, serta memberikan kesempatan belajar dan berdiskusi.

  2. Dr. Ni’matuzahroh selaku Dosen Pembimbing II. Terima kasih telah berkenan meluangkan waktu untuk selalu membimbing, memberikan saran, memberikan motivasi, serta memberikan kesempatan untuk belajar dan memberikan pengalaman penelitian sehingga tesis ini dapat terselesaikan dengan baik.

  3. Tim penguji, Dr. Ir. Suyanto, M.Si., Prof. Dr. Afaf Baktir, MS., serta Dr.

  Muji Harsini, M.Si. Terima kasih telah berkenan memberikan evaluasi dan saran terkait penelitian dan penulisan tesis.

  4. Ketua Program Studi Magister Kimia Fakultas Sains dan Teknologi Universitas Airlangga, M. Zakki Fahmi, S.Si., M.Si., Ph.D. Terima kasih telah memberikan masukan, saran, serta arahannya.

  5. Tenaga kependidikan Departemen Kimia yang telah membantu kelancaran penelitian.

  6. Orang tua dan keluarga yang telah memberikan doa, kasih sayang, dan dukungan yang tiada henti.

  7. Tim penelitian bidang biokimia serta angkatan 2014/2015 atas bantuannya selama ini.

  ABSTRAK Deteksi Molekular Gen serta Uji Aktivitas Enzim Katabolik dari Bakteri Actinobacillus sp. P3(7) terhadap Substrat Hidrokarbon

  Penelitian ini bertujuan untuk mendeteksi keberadaan gen katabolik pada DNA genom bakteri hidrokarbonoklastik Actinobacillus sp. P3(7) serta uji aktivitas enzim katabolik terhadap substrat hidrokarbon. Fragmen gen diamplifikasi dari DNA genom menggunakan primer spesifik untuk gen alkM,

  tod , dan ndo. Isolat ditumbuhkan pada media Sea Salt diperkaya yeast extract dan

  hidrokarbon, yaitu heksadekana, toluena, dan naftalen. Enzim katabolik diuji aktivitasnya terhadap substrat masing-masing. Hasil amplifikasi gen katabolik menunjukkan bahwa isolat memiliki fragmen gen alkM, tod, dan ndo dengan ukuran berturut-turut sebesar 900 bp, 600 bp, dan 650 bp. Isolat selama proses inkubasi menggunakan ketiga substrat hidrokarbon untuk proses pertumbuhan dan perkembangan hingga 10 hari inkubasi. Induksi ekspresi enzim alkana monooksigenase, toluena dioksigenase, dan naftalen dioksigenase terjadi selama proses degradasi namun pada waktu inkubasi yang berbeda. Aktivitas tertinggi alkana monooksigenase, toluena dioksigenase, dan naftalen dioksigenase berturut- turut sebesar 4,630 U/mL; 5,338 U/mL; dan 6,367 U/mL yang dicapai pada kondisi 10 hari, 8 hari, dan 10 hari inkubasi.

  

Kata Kunci : Actinobacillus sp. P3(7), hidrokarbon, gen katabolik, enzim katabolik

  vii

  ABSTRACT Molecular Detection of Gen and Activity Assay of Catabolic Enzyme from Actinobacillus sp. P3(7) toward Hydrocarbon Substrates

  This research aims to detect the presence of catabolic genes in hydrocarbonoclastic bacteria Actinobacillus sp. P3 (7) and the catabolic enzyme activity assay against hydrocarbon substrate. Gene fragmen amplified from genomic DNA using specific primers for alkM, tod, and ndo genes. The isolate then grown on Sea Salt media enriched with yeast extract and hydrocarbons, namely hexadecane, toluene, and naphthalene. Catabolic enzymes tested for its activities against their respective substrates. Catabolic gene fragmen amplification results showed that the isolates have gene fragmen of alkM, tod, and ndo gene with consecutive size of 900 bp, 600 bp, and 650 bp. Isolates during the process of incubation using hydrocarbon substrate for growing and developing process until the 10 days of incubation. Induction of alkane monooxygenases, toluene dioxygenase, and naphthalene dioxygenase enzyme expression occur during the degradation process but at different incubation time. The highest activity of the alkane monooxygenases, toluene dioxygenase, and naphthalene dioxygenase are 4,630 U/mL; 5,338 U/mL; dan 6,367 U/mL, respectively, reached on the 10 days, 8 days, and the 10 days of incubation.

  

Keywords : Actinobacillus sp. P3(7), hydrocarbon, catabolic gene, catabolic enzyme

  viii

  DAFTAR ISI Halaman

  Sampul Luar i

  Sampul Dalam ii

  Halaman Judul iii

  Halaman Prasyarat Gelar iv

  Halaman Pengesahan v

  UCAPAN TERIMA KASIH vi

  ABSTRAK vii

  ABSTRACT

  viii DAFTAR ISI ix

  DAFTAR TABEL xi

  DAFTAR GAMBAR xii

  DAFTAR LAMPIRAN xiii

  DAFTAR SINGKATAN xiv

  BAB I PENDAHULUAN

  1

  1.1. Latar Belakang Permasalahan

  1

  1.2. Rumusan Masalah

  4

  1.3. Tujuan Penelitian

  4

  1.4. Manfaat Penelitian

  4 BAB II TINJAUAN PUSTAKA

  6

  2.1. Biodegradasi Hidrokarbon

  6

  2.2. Bakteri Hidrokarbonoklastik

  7 2.3. Actinobacillus sp.

  8

  2.4. Enzim Monooksigenase dan Dioksigenase

  9

  2.4.1. Alkana Monooksigenase

  10

  2.4.2. Toluen Dioksigenase

  12

  2.4.3. Naftalen Dioksigenase

  13

  2.5. Gen Penyandi Enzim Monooksigenase dan Dioksigenase

  15

  2.5.1. Gen Penyandi Alkana Monooksigenase

  16

  2.5.2. Gen Penyandi Toluen Dioksigenase

  16

  2.5.3. Gen Penyandi Naftalen Dioksigenase

  17 BAB III KERANGKA KONSEPTUAL DAN HIPOTESIS PENELITIAN

  18

  3.1. Kerangka Konseptual

  18

  3.2. Hipotesis Penelitian

  19 BAB IV METODE PENELITIAN

  21

  4.1. Lokasi dan Waktu Penelitian

  21

  4.2. Bahan dan Alat Penelitian

  21

  4.2.1. Isolat Bakteri

  21

  4.2.2. Bahan Penelitian

  21

  4.2.3. Alat penelitian

  21

  4.3. Diagram Alir Penelitian

  22

  4.4. Cara Kerja 23 ix x

  4.4.1. Pembuatan Media

  5.7.1. Alkana Monooksigenase

  5.3. Respon Pertumbuhan Actinobacillus sp. P3(7) pada Berbagai Substrat Hidrokarbon

  35

  5.4. Biomassa yang dihasilkan Kultur Actinobacillus sp. P3(7)

  42 5.5. pH Akhir Kultur Actinobacillus sp. P3(7)

  43

  5.6. Kadar Protein Sel Actinobacillus sp. P3(7)

  44

  5.7. Aktivitas Enzim dari Actinobacillus sp. P3(7)

  45

  45

  5.2. Amplifikasi Gen Katabolik pada Actinobacillus sp. P3(7)

  5.7.2. Toluena Dioksigenase dan Naftalena Dioksigenase

  47

  5.7.3. Pengaruh Penambahan Substrat terhadap Aktivitas Enzim Katabolik dari Actinobacillus sp. P3(7)

  49 BAB VI KESIMPULAN

  52

  6.1. Kesimpulan

  52

  6.2. Saran

  52 DAFTAR PUSTAKA

  33

  32

  23

  25

  4.4.2. Peremajaan Mikroba

  23

  4.4.3. Kultivasi Mikroba dalam Media LB

  23

  4.4.4. Ekstraksi DNA Genom

  24

  4.4.5. Penentuan Kadar DNA Genom

  25

  4.4.6. Amplifikasi Gen Penyandi Enzim Monooksigenase dan Dioksigenase

  4.4.7. Elektroforesis DNA

  5.1. Ekstraksi DNA Genom Actinobacillus sp. P3(7)

  25

  4.4.8. Kultivasi Mikroba dalam Media Sea Salt diperkaya

  

Yeast Extract dan Substrat Hidrokarbon

  27

  4.4.9. Pengukuran OD 600nm Mikroba

  27

  4.4.10. Uji Aktivitas Enzim Oksigenase

  28 BAB V HASIL PENELITIAN DAN PEMBAHASAN

  32

  53 LAMPIRAN

  DAFTAR TABEL

  No. Judul Tabel Halaman

Tabel 4.1. Primer yang digunakan untuk amplifikasi fragmen gen…………….. 26Tabel 4.2. Set kondisi PCR

  ……………………………………………………... 26

Tabel 4.3. Komposisi penentuan kadar protein dengan metode Bradford

  ……… 29

Tabel 4.4. Komposisi uji aktivitas enzim oksigenase…………………………... 31Tabel 5.1. Perbandingan antara hasil penelitian dengan hasil dari Marquez-

  Rocha et al. (2005) ………………………………………………….. 34 xi

  xii

  36 Gambar 5.4. Warna kultur pada berbagai variasi waktu inkubasi .................

  48 Gambar 5.12. Regulasi ekspresi gen pada operon .........................................

  47 Gambar 5.11. Kurva produksi enzim naftalena dioksigenase selama proses kultivasi Actinobacillus sp. P3(7) dalam media mengandung substrat naftalena ....................................................................

  46 Gambar 5.10. Kurva produksi enzim toluena dioksigenase selama proses kultivasi Actinobacillus sp. P3(7) dalam media mengandung substrat toluena .......................................................................

  substrat heksadekana .................................................................

Gambar 5.9. Kurva produksi enzim alkana monooksigenase selama proses kultivasi Actinobacillus sp. P3(7) dalam media mengandung

  44 Gambar 5.8. Profil kadar protein sel dari kultur dengan penambahan substrat hidrokarbon dan kultur tanpa penambahan substrat hidrokarbon 45

Gambar 5.7. Profil pH dari kultur dengan penambahan substrat hidrokarbon dan kultur tanpa penambahan substrat hidrokarbon .................

  38 Gambar 5.6. Profil massa sel dari kultur dengan penambahan substrat hidrokarbon dan kultur tanpa penambahan substrat hidrokarbon 42

  37 Gambar 5.5. Struktur senyawa katekol, protokatekuat, dan asam salisilat ....

  33 Gambar 5.3. Kurva pertumbuhan bakteri Actinobacillus sp. P3(7) ...............

  DAFTAR GAMBAR

  32 Gambar 5.2. Hasil amplifikasi dengan berbagai variasi suhu annealing .......

  22 Gambar 5.1. Hasil elektroforesis DNA genom Actinobacillus sp. P3(7) ......

  20 Gambar 4.1. Diagram alir penelitian ..............................................................

  14 Gambar 3.1. Kerangka konsep penelitian ......................................................

  14 Gambar 2.5. Ikatan koordinasi pada naftalena dioksigenase .........................

  12 Gambar 2.4. Struktur oksigenase pada sistem naftalena dioksigenase ..........

  11 Gambar 2.3. Struktur oksigenase pada sistem toluena dioksigenase .............

  8 Gambar 2.2. Struktur monooksigenase pada sistem alkana monooksigenase

  No Judul Gambar Halaman Gambar 2.1. Fotomikrograf Actinobacillus sp. P3(7) ....................................

  50

DAFTAR LAMPIRAN

  xiii

  No Judul Lampiran Lampiran 1. Koloni Actinobacillus sp. P3(7) koleksi Laboratorium FST

  Universitas Airlangga Lampiran 2. Data penentuan OD 600nm kultur Actinobacillus sp. P3(7) Lampiran 3. Data penentuan biomassa kultur Actinobacillus sp. P3(7) Lampiran 4. Data penentuan pH akhir kultur Actinobacillus sp. P3(7) Lampiran 5. Data penentuan kadar protein sel Actinobacillus sp. P3(7) Lampiran 6. Data penentuan aktivitas crude enzyme

DAFTAR SINGKATAN

  xiv

  bp : base pair BLAST : Basic Local Alignment Search Tool DNA : Deoxyribonucleic acid NADH : Nicotinamide adenine dinucleotide Trp : Triptofan Ile : Isoleusin Thr : Treonin Leu : Leusin His : Histidin Asp : Asam aspartat PCR : Polymerase Chain Reaction AlkB : Alkana monooksigenase untuk rantai C medium (C

  5 -C 12 )

  AlkM : Alkana monooksigenase untuk rantai C panjang (C >12 ) CYP : Sitokrom P450 NA : Nutrient Agar SS : Sea Salt EtBr : Etidium bromida DMSO : Dimetil sulfoksida OD : Optical density (densitas optik) BSA : Bovine serum albumin cAMP : Cyclic adenosine monophosphate CRP : cAMP receptor protein

BAB I PENDAHULUAN 1.1. Latar Belakang Permasalahan Lumpur minyak bumi (oil sludge) adalah campuran logam, minyak,

  padatan, dan air yang membentuk emulsi air/minyak yang stabil dan terdeposisi pada bagian dasar tangki penyimpanan minyak mentah maupun yang telah melalui tahap pengolahan. Oil sludge terbentuk karena adanya proses oksidasi minyak dan air oleh udara sehingga menghasilkan sedimentasi pada dasar tangki dan menjadi hasil samping dalam proses pengolahan dan pemurnian minyak bumi. Sedimen yang terbentuk menghambat aliran minyak dalam pipa dan bersifat korosif terhadap permukaan tangki penyimpanan minyak sehingga dapat mempercepat kerusakan komponen tangki. Oil sludge juga mengandung hidrokarbon alifatik, hidrokarbon aromatik, serta senyawa organik yang mengandung atom N, O, atau S yang sangat berbahaya bagi lingkungan dan kesehatan sehingga perlu dilakukan pengolahan untuk menekan atau menghilangkan kandungan berbahaya dari oil sludge (Hu et al., 2013).

  Berbagai metode degradasi oil sludge secara fisika maupun kimia telah banyak digunakan dan memiliki kelebihan yaitu efisien serta mampu menurunkan kadar hidrokarbon pada oil sludge secara maksimal namun memiliki kelemahan yaitu tidak ekonomis terutama jika diaplikasikan dalam skala industri. Salah satu metode yang dapat menjadi pilihan untuk pengolahan oil sludge adalah biodegradasi dengan menggunakan mikroorganisme yaitu bakteri, yeast, atau fungi. Bakteri banyak dipilih dibandingkan yeast atau fungi karena memiliki kecepatan pertumbuhan yang tinggi serta kemudahan untuk memperbanyak jumlah selnya. Komponen oil sludge sebagian besar tersusun dari senyawa hidrokarbon sehingga dapat digunakan oleh bakteri yang memiliki kemampuan untuk mendegradasi hidrokarbon sebagai satu-satunya sumber karbon yang tersedia untuk proses metabolisme, yang disebut sebagai bakteri hidrokarbonoklastik (Hu et al., 2013). Spesies bakteri yang memiliki kemampuan untuk mendegradasi komponen hidrokarbon tersebar luas dalam berbagai jenis

  1 bakteri, baik bakteri Gram positif maupun Gram negatif, seperti Aeromonas

  hydrophila , Acinetobacter faecalis tipe II, Actinobacillus sp. P(3)7, Pseudomonas

  , Pseudomonas putida, Pseudomonas cepacea, Pseudomonas

  aeruginosa fluorescens -25, dan Pseudomonas pseudomallei

  (Ni’matuzahroh et al., 2009). Kemampuan bakteri dalam mendegradasi hidrokarbon dipengaruhi oleh adanya enzim katabolik yang mampu memecah senyawa hidrokarbon menjadi senyawa metabolit yang mampu masuk ke dalam siklus asam sitrat. Enzim katabolik yang paling berperan penting dalam proses katabolisme hidrokarbon yang masuk ke dalam sel bakteri adalah enzim yang mengkatalisis reaksi oksidasi hidrokarbon tahap pertama. Tahap pertama katabolisme alkana dan aromatik oleh bakteri masing-masing diinisiasi oleh enzim monooksigenase dan dioksigenase (Jauhari et al., 2014).

  Aktivitas enzim monooksigenase dan dioksigenase yang diisolasi dari beberapa spesies bakteria dalam mendegradasi substrat hidrokarbon telah berhasil dilaporkan. Aktivitas alkana monooksigenase dari Pseudomonas sp. BP10 dan

  Stenotrophomonas nitritireducens E9 yang diisolasi dari petroleum sludge serta

  konsorsiumnya dalam mendegradasi heksakosan (C ) masing-masing mencapai

  26

  527 ηmol/mg, 563 ηmol/mg, dan 607 ηmol/mg protein (Jauhari et al., 2014), sedangkan aktivitas alkana monooksigenase dari Pseudomonas aeruginosa PSA5,

  Rhodococcus sp. NJ2 dan Ochrobactrum intermedium P2 yang diisolasi dari

  petroleum sludge dalam mendegradasi heksadekana (C

  16 ) masing-masing

  mencapai 89,83 μmol/g, 185 μmol/g, dan 186 μmol/g protein (Mishra dan Singh,

  2012). Aktivitas naftalena dioksigenase dari Pseudomonas sp. NCIB9816 dan

  Rhodococcus sp. NCIMB12038 dalam mendegradasi naftalen masing-masing

  sebesar 37,9 U/mg protein dan 0,731 U/mg protein (Ensley dan Gibson, 1983; Larkin et al., 1999). Aktivitas enzim alkana monooksigenase dan aromatik dioksigenase dari spesies bakteri lain perlu diteliti untuk mengetahui keanekaragaman aktivitas enzimatis bakteri hidrokarbonoklastik lainnya.

  Berbagai spesies bakteri hidrokarbonoklastik berhasil diisolasi dari lokasi yang tidak terkontaminasi maupun yang terkontaminasi oleh hidrokarbon, namun karakteristik gen yang menyandi sistem enzim pendegradasi hidrokarbon masih belum banyak diteliti. Enzim yang berperan dalam tahap pertama degradasi hidrokarbon, seperti alkana monooksigenase, toluena monooksigenase, naftalena dioksigenase yang masing-masing disandi oleh gen alk, tod, serta ndo dapat diamplifikasi dari DNA genom bakteri menggunakan primer spesifik sehingga dapat diketahui sekuens gen yang menyandi enzim-enzim penting dalam katabolisme hidrokarbon. Fragmen gen alkB yang menyandi alkana monooksigenase untuk substrat C -C berhasil diamplifikasi dari Rhodococcus

  5

  

12

  sp. dengan ukuran 701 bp menggunakan primer spesifik untuk bakteri

  Rhodococcus sp. yang didesain berdasarkan daerah lestari gen alkB dari hasil

  penjajaran gen alkB dari berbagai spesies Rhodococcus sp. (Tancsics et al., 2015) serta fragmen gen alkB, ndo, C12O, dan C23O berhasil diamplifikasi dari DNA genom Sphingomonas koreensis ASU06 yang diisolasi dari sampel tanah dari perusahaan pengolahan minyak di Assiut, Mesir. Produk PCR yang didapatkan berturut-turut yaitu 100; 487; 350; dan 900 bp (Hesham et al., 2014). Fragmen gen alkM yang menyandi alkana monooksigenase untuk substrat C

  13 -C 30 juga

  berhasil diamplifikasi dari Acinetobacter baumannii OS1 yang diisolasi dari sampel oil sludge dari pengolahan minyak di Manila, Filipina, dengan ukuran 715 bp. Analisis BLAST menunjukkan adanya kemiripan sekuens gen alkM sebesar 99% dengan gen alkM A. baumannii AB307-0294 (Hedreyda dan Sarmago, 2014).

  Salah satu bakteri yang memiliki kemampuan untuk mendegradasi hidrokarbon adalah Actinobacillus sp. P3(7) hasil isolasi dari sampel tanah pengilangan minyak Desa Wonocolo, Bojonegoro oleh Ni’matuzahroh et al. (2009). Actinobacillus sp. P3(7) mampu hidup pada tanah yang tercemar minyak bumi sehingga diperkirakan mampu menggunakan hidrokarbon sebagai sumber karbon untuk proses metabolisme dengan bantuan enzim-enzim katabolik.

  Actinobacillus sp. P3(7) memiliki aktivitas emulsifikasi substrat crude oil sebesar

  100% dan mampu menurunkan tegangan permukaan hingga 51,2 mN/m melalui proses pelepasan biosurfaktan. Pelepasan biosurfaktan akan menyebabkan terjadinya emulsifikasi hidrokarbon dan penurunan tegangan antarmuka minyak- air sehingga hidrokarbon dapat larut dan meningkatkan bioavailabilitas hidrokarbon dalam fasa air sehingga hidrokarbon dapat masuk ke dalam sel dan dimetabolisme oleh bakteri (Fatimah et al., 2009). Jenis-jenis gen katabolik dan enzim katabolik yang berperan dalam proses degradasi hidrokarbon tahap pertama untuk substrat heksadekana, toluena, dan naftalena serta nilai aktivitas masing- masing enzim tersebut perlu dikaji lebih lanjut untuk mengetahui tingkat degradasi enzimatis hidrokarbon oleh bakteri Actinobacillus sp. P3(7).

  1.2. Rumusan Masalah

  Rumusan masalah yang dikaji dalam penelitian ini berdasarkan uraian latar belakang di atas yaitu sebagai berikut.

  1. Apakah fragmen gen penyandi enzim monooksigenase dan dioksigenase dapat diamplifikasi dari DNA genom Actinobacillus sp. P3(7)?

  2. Berapa nilai aktivitas enzim monooksigenase dari Actinobacillus sp. P3(7) dalam mengkatalisis reaksi oksidasi heksadekana sebagai substrat?

  3. Berapa nilai aktivitas enzim dioksigenase dari Actinobacillus sp. P3(7) dalam mengkatalisis reaksi oksidasi toluena dan naftalena sebagai substrat?

  1.3. Tujuan Penelitian

  Tujuan yang ingin dicapai dalam penelitian ini berdasarkan permasalahan yang akan dikaji yaitu sebagai berikut.

  1. Mengamplifikasi fragmen gen penyandi enzim monooksigenase dan dioksigenase dari DNA genom Actinobacillus sp. P3(7).

  2. Menentukan nilai aktivitas enzim monooksigenase dari Actinobacillus sp.

  P3(7) dalam mengkatalisis reaksi oksidasi heksadekana sebagai substrat.

  3. Menentukan nilai aktivitas enzim dioksigenase dari Actinobacillus sp. P3(7) dalam mengkatalisis reaksi oksidasi toluena dan naftalena sebagai substrat.

1.4. Manfaat Penelitian Manfaat yang diharapkan dari penelitian ini yaitu sebagai berikut.

1. Memberikan informasi mengenai pemanfaatan bakteri sebagai alternatif agen pendegradasi hidrokarbon, khususnya heksadekana, toluena, dan naftalena.

  2. Memberikan informasi mengenai gen-gen penyandi enzim pendegradasi hidrokarbon sebagai identifikasi awal untuk mengenali selektifitas substrat hidrokarbon untuk bakteri tertentu.

3. Memberikan informasi mengenai enzim-enzim yang berperan dalam proses degradasi hidrokarbon menggunakan bakteri hidrokarbonoklastik.

BAB II TINJAUAN PUSTAKA 2.1. Biodegradasi Hidrokarbon Biodegradasi merupakan proses konversi atau transformasi senyawa toksik

  menjadi senyawa yang kurang toksik atau tidak toksik melalui aktivitas metabolisme dari mikroorganisme, ragi, atau tumbuhan yang menggunakan polutan sebagai sumber karbon dan energi. Produk degradasi hidrokarbon yang memasuki siklus asam sitrat berfungsi sebagai substrat metabolisme energi dan sebagai zat pembangun untuk proses biosintesis sel dan proses pertumbuhan bakteri. Proses degradasi dapat dibagi menjadi dua model yaitu melalui metabolisme aerob yang membutuhkan molekul oksigen serta metabolisme anaerob yang tidak membutuhkan oksigen (Fritsche dan Hofrichter, 2008).

  Laju biodegradasi komponen hidrokarbon oleh bakteri dipengaruhi oleh: i) sifat biodegradabilitas senyawa, misalnya senyawa alifatik dengan C

  10 -C 18 lebih

  mudah didegradasi oleh bakteri dibandingkan dengan rantai karbon yang lebih pendek atau lebih panjang, sedangkan alifatik rantai panjang didegradasi lebih lambat karena memiliki bioavailabilitas yang rendah karena senyawa tersebut sulit larut dalam air sehingga tidak mudah digunakan oleh mikroba sebagai sumber karbon, dan alifatik rantai pendek mudah larut dalam air namun sangat toksik untuk sel mikroba; serta ii) kemudahan senyawa untuk diakses oleh mikroba dan oleh aktivitas biologis sehingga proses degradasi menjadi berjalan lebih cepat (Mishra dan Singh, 2012).

  Biodegradasi komponen hidrokarbon oleh bakteri dimediasi oleh beberapa jenis enzim degradatif. Jenis enzim degradatif yang terlibat dalam degradasi hidrokarbon dapat dibagi menjadi dua berdasarkan mekanisme kerja enzim, yaitu enzim periferal dan enzim fisi. Enzim periferal bekerja untuk mengenali dan mengkonversi hidrokarbon menjadi molekul yang lebih mudah masuk ke dalam sel sehingga lebih mudah didegradasi, contohnya yaitu enzim lipase. Enzim fisi bekerja mendegradasi molekul tersebut melalui jalur metabolisme sel, contohnya yaitu kelas enzim monooksigenase dan dioksigenase (Mishra dan Singh, 2012).

  6 Enzim yang dihasilkan oleh bakteri hidrokarbonoklastik dapat mendegradasi hidrokarbon melalui satu atau lebih jalur metabolik karena enzim-enzim tersebut tidak mampu mendegradasi semua jenis senyawa hidrokarbon (Mishra et al., 2014; Macaulay, 2014). Enzim fisi yang bekerja pada proses degradasi alkana bergantung dari panjang rantai karbon alkana tersebut, sehingga bakteri yang mampu mendegradasi alkana umumnya memiliki beberapa gen yang menyandi berbagai variasi enzim alkana monooksigenase (Van Beilen et al., 2003).

2.2. Bakteri Hidrokarbonoklastik

  Aktivitas hidup bakteri memerlukan senyawa karbon sebagai salah satu sumber nutrisi dan energi untuk melangsungkan proses metabolisme dan perkembangbiakan. Beberapa bakteri memiliki kemampuan yang khas yaitu menggunakan senyawa hidrokarbon sebagai satu-satunya sumber karbon dan energi. Bakteri jenis ini tersebar luas di alam dan dikenal sebagai bakteri hidrokarbonoklastik. Bakteri ini dapat memetabolisme hidrokarbon dengan dikatalisis enzim-enzim katabolik pendegradasi hidrokarbon yang dihasilkan secara intraseluler (Fritsche dan Hofrichter, 2008).

  Beberapa genus bakteri hidrokarbonoklastik yang mampu menggunakan hidrokarbon sebagai sumber karbon antara lain Achromobacter, Acinetobacter,

  Aeromonas , Alcaligenes, Arthrobacter, Bacillus, Benecdea, Brevibacterium, Candida , Corynebacterium, Flavobacterium, Methylobacterium, Methylococcus, Methylocystis , Methylomonas, Micromonospora, Micrococcus, Mycobacterium, Nocardia , Pseudomonas, Rhodotula, Spirillium, Sporobolomyces, dan Vibrio.

  Beberapa bakteri mampu menggunakan hidrokarbon sebagai sumber karbon akibat adanya proses adaptasi setelah terjadi kontaminasi minyak di laut, yaitu genus Oleispira, Marinobacter, Thalassolitus, Alcanivorax, dan Cycloclasticus. Hal ini menunjukkan bahwa kemampuan degradasi hidrokarbon dapat muncul secara alami akibat adanya proses evolusi (Chen, 2013). Spesies bakteri yang berhasil diisolasi dan memiliki kemampuan dalam mendegradasi hidrokarbon dalam minyak mentah antara lain Acinetobacter faecalis tipe II, Actinobacillus sp. P3(7), Aeromonas hydrophila, Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas putida,

  Pseudomonas cepacea , Pseudomonas fluorescens-25, dan Pseudomonas pseudomallei

  (Ni’matuzahroh et al., 2009).

2.3. Actinobacillus sp.

  Actinobacillus sp. merupakan bakteri Gram negatif, imotil, tidak

  menghasilkan spora, serta berbentuk oval hingga batang. DNA genom bakteri

  Actinobacillus sp. mengandung 40% mol guanin dan 47% mol sitosin. Taksonomi dari spesies Actinobacillus sp. dapat dilihat di bawah ini (Mutters et al., 1986).

  Kingdom : Bacteria Filum : Proteobacteria Kelas : Gammaproteobacteria Ordo : Pasteurellales Famili : Pasteurellaceae Genus : Actinobacillus Gambar 2.1. Fotomikrograf Actinobacillus sp. Spesies : Actinobacillus sp.

  P(3)7

  Spesies Actinobacillus sp. diketahui memiliki kemampuan untuk mendegradasi senyawa hidrokarbon. Actinobacillus sp. mampu mendegradasi fenol 100 mg/L hingga 100% pada kondisi optimum yaitu pada pH 7, suhu inkubasi 35-37ºC, serta kecepatan agitasi 150 rpm. Asam suksinat serta glisin sebagai sumber karbon dan sumber nitrogen merupakan jenis kosubstrat yang paling efisien dalam menunjang proses degradasi hidrokarbon (Khleifat , 2007).

  Actinobacillus sp. P3(7) hasil isolasi dari sampel tanah pengilangan minyak

  Desa Wonocolo, Bojonegoro oleh Ni’matuzahroh et al. (2009) mampu hidup pada tanah yang tercemar minyak bumi sehingga diperkirakan mampu menggunakan hidrokarbon sebagai sumber karbon untuk proses metabolisme. Actinobacillus sp.

  P3(7) memiliki aktivitas emulsifikasi substrat crude oil sebesar 100% dan mampu menurunkan tegangan permukaan hingga 51,2 mN/m melalui proses pelepasan biosurfaktan. Pelepasan biosurfaktan akan menyebabkan terjadinya emulsifikasi hidrokarbon dan penurunan tegangan antarmuka minyak-air sehingga hidrokarbon dapat larut dan meningkatkan bioavailabilitas hidrokarbon dalam fasa air sehingga hidrokarbon dapat masuk ke dalam sel dan dimetabolisme oleh bakteri (Fatimah et al ., 2009). sp. juga memiliki kemampuan untuk mensekresikan enzim

  Actinobacillus

  lipase dan dapat dikombinasikan dengan Acinetobacter sp. P2(1), Bacillus subtilis

  3KP, serta Pseudomonas putida yang memiliki kemampuan untuk menghasilkan biosurfaktan, untuk proses pengolahan crude oil dengan metode sand pack

  column . Masing-masing jenis kombinasi biosurfaktan dan lipase dari keempat

  bakteri tersebut secara efektif mampu menurunkan kadar crude oil sebesar 16,73%; 12%; dan 11,9%. Keefektifan kombinasi biosurfaktan dan lipase dalam menurunkan kadar crude oil sebanding dengan surfaktan sintetik yang digunakan sebagai kontrol positif yaitu Tween-20 yang mampu menurunkan kadar crude oil hingga 13,40%, sehingga kombinasi biosurfaktan dan lipase dari keempat bakteri tersebut diharapkan dapat digunakan dalam proses oil recovery

  (Ni’matuzahroh et al ., 2015).

2.4. Enzim Monooksigenase dan Dioksigenase

  Tahap pertama dalam mekanisme degradasi alkana oleh bakteri dalam kondisi aerob adalah oksidasi alkana oleh kelas enzim monooksigenase yaitu enzim yang mengkatalisis inkorporasi satu atom oksigen ke dalam substrat, sedangkan tahap pertama dalam mekanisme degradasi hidrokarbon aromatik selain benzena oleh bakteri dalam kondisi aerob adalah oksidasi aromatik oleh kelas enzim dioksigenase yaitu enzim yang mengkatalisis inkorporasi dua atom oksigen ke dalam substrat (Madigan et al., 2012).

  Sistem enzim yang terlibat dalam oksigenasi hidrokarbon alkana pada prokariot telah banyak ditemukan dan diklasifikasikan berdasarkan panjang rantai karbon substrat serta karakteristik degradasi karena sistem enzim yang berbeda dibutuhkan untuk mengoksidasi alkana dengan panjang rantai yang berbeda untuk menginisiasi proses biodegradasi, antara lain metana monooksigenase (MMO yang dikode oleh klaster gen mmo), sitokrom P450 (CYP yang dikode oleh klaster gen CYP), alkana monooksigenase untuk rantai C medium yaitu C -C (AlkB

  5

  12 yang dikode oleh klaster gen alkB), dan alkana monooksigenase untuk rantai C panjang yaitu C >12 (AlkM yang dikode oleh klaster gen alkM) (Singh et al., 2012).

2.4.1. Alkana monooksigenase

  Enzim alkana monooksigenase merupakan enzim yang paling banyak ditemukan pada bakteri pendegradasi alkana dan dikode oleh klaster gen alk. Enzim ini mengkatalisis reaksi tahap pertama dalam degradasi alkana, yaitu oksidasi hidrokabon alkana linier (rantai medium C

  5 -C 12 dan rantai panjang C 12-30 )

  melalui inkorporasi 1 atom O dari O

  2 dan penggunaan NADH. Reaksi katalisis oksidasi alkana menjadi alkohol yaitu sebagai berikut.

  CH

  3 -(CH 2 ) n -CH 3 + O 2 + NADH + H 3 -(CH 2 ) n -CH

  2 OH + NAD + H

  2 O +

  → CH

• H (Ji et al., 2013).

  Enzim famili alkana monooksigenase memiliki tiga komponen, yaitu monooksigenase, rubredoksin, rubredoksin reduktase, serta dua atom Fe. Komponen monooksigenase adalah protein integral membran, sedangkan komponen rubredoksin dan rubredoksin reduktase merupakan protein sitoplasma dan larut pada sitoplasma. Elektron ditangkap oleh NADH kemudian rubredoksin reduktase mentransfer elektron dari NADH ke rubredoksin. Rubredoksin kemudian mereduksi monooksigenase yang menyebabkan katalisis adisi 1 atom O dari O

  2 ke alkana membentuk alkohol (Singh et al., 2012).

  Komponen monooksigenase (gambar 2.2) memiliki 6 situs heliks transmembran dan sisi aktif yang menghadap ke arah sitoplasma. Sisi aktif enzim tersebut meliputi motif yang mengandung 4 residu histidin (simbol H) yang membentuk kelat dengan dua at om Fe (simbol ●), dan bekerja dalam aktivasi alkana dengan adanya O

  2 melalui pembentukan intermediet radikal. Satu dari

  atom O pada O ditransfer ke gugus metil terminal dari alkana menghasilkan

  2

  alkohol, sedangkan atom O lainnya direduksi menjadi H

  2 O melalui proses transfer elektron oleh rubredoksin (Singh et al., 2012).

Gambar 2.2. Struktur monooksigenase pada sistem alkana monooksigenase. Simbol H: residu histidin, simbol : atom Fe, dan simbol batang: situs heliks

  ●

  transmembran (Van Beilen et al., 2003)

  Enzim alkana monooksigenase memiliki spesifisitas substrat yang rendah namun tetap bekerja secara regiospesifik (hanya bekerja pada posisi satu jenis ikatan tertentu) dan stereospesifik (hanya menghasilkan salah satu jenis stereoisomer). Alkana monooksigenase yang diisolasi dari Pseudomonas

  Gpo1 mampu mengkatalisis reaksi oksidasi pada alkana linier, alkana

  oleovorans

  bercabang, serta sikloalkana. Alkana linier seperti dekana, undekana, heksana, serta heptana dioksidsasi menjadi alkohol primer. Alkana bercabang seperti metilbutana, metilpentana, serta metilheksana dioksidasi pada atom karbon sekunder. Oksidasi alkana tidak terjadi jika terdapat atom karbon tersier. Alkana siklik tersubstitusi seperti metilsikloheksana dioksidasi pada posisi trans-4 dari posisi substituen. Alkana selain jenis alkana linier dioksidasi dalam laju yang sangat lambat. Enzim bekerja terhadap jenis substrat yang luas namun terbatas pada substrat dengan struktur yang sederhana karena sisi aktif enzim yang berukuran sempit sehingga substrat berukuran besar seperti dekalin serta indolin dioksidasi dalam laju yang sangat lambat. Spesifisitas enzim ditentukan oleh residu asam amino Trp-55 yang berada pada sisi aktif enzim (Van Beilen et al., 1994).

2.4.2. Toluena dioksigenase

  Toluena dioksigenase merupakan enzim yang mengkatalisis reaksi tahap pertama dalam degradasi toluena, yaitu oksidasi toluena menjadi (+)-cis-(1S,2R)- dihidroksi-3-metilsikloheksa-3,5-diena (cis-toluena dihidrodiol) melalui penggunaan O

  2 dan NADH. Reaksi yang terjadi sebagai berikut.

  Toluena + NADH + H + O

  2

  → (+)-cis-(1S,2R)-dihidroksi-3-metilsikloheksa-3,5-

  diena + NAD (Jiang et al., 1999). Toluena dioksigenase merupakan sistem enzim multikomponen yang terdiri dari ferodoksin reduktase, ferodoksin, dan oksigenase (gambar 2.3). Elektron ditangkap oleh NADH lalu ditransfer ke ferodoksin reduktase, kemudian ditransfer ke ferodoksin. Ferodoksin kemudian mereduksi oksigenase yang menyebabkan katalisis adisi 2 atom O dari O

  2 ke senyawa toluena secara stereospesifik membentuk (+)-cis-(1S,2R)-dihidroksi-3-metilsikloheksa-3,5-diena.

  Komponen oksigenase pada enzim toluena dioksigenase merupakan heteroheksamer yang terdiri dari subunit katalitik (sub-unit α) dan subunit struktural (sub-unit

  β). Sub-unit katalitik mengandung Rieske center [2Fe-2S] dan Fe mononuklir pada sisi aktif (Friemann et al., 2009).

  (a) (b)

Gambar 2.3. Struktur oksigenase pada sistem toluena dioksigenase tampak samping (a) dan tampak atas (b). Sub-unit

  α berwarna merah, hijau, dan kuning. Sub- unit β berwarna merah muda, hijau muda, dan abu-abu. Atom Fe berwarna magenta dan atom S berwarna oranye (Friemann et al., 2009) Toluena dioksigenase bekerja pada rentang jenis substrat yang luas yaitu berbagai jenis alkilbenzena sederhana seperti toluena, etilbenzena, maupun dimetilbenzena, namun tetap memberikan sifat spesifisitas yaitu merubah substrat tersebut menjadi produk dihidrodiol secara stereospesifik dan regiospesifik. Sifat ini menjadikan toluena dioksigenase bernilai tinggi dalam proses sintesis senyawa yang dikontrol berdasarkan sifat enantiomerik. Residu asam amino yang berperan dalam menentukan spesifisitas substrat yaitu Ile-301, Thr-305, Ile-307, dan Leu- 309. Residu ini tidak berada pada sisi pengikatan substrat namun pada bagian saluran yang dilalui substrat untuk menuju sisi aktif (Bagneris et al., 2005).

2.4.3. Naftalen dioksigenase

  Naftalena dioksigenase merupakan enzim yang mengkatalisis reaksi tahap pertama dalam degradasi naftalen, yaitu oksidasi naftalen menjadi (+)-cis-(1R,2S)- dihidroksi-1,2-dihidronaftalen (naftalen cis-dihidrodiol) melalui penggunaan O

  2 dan NADH. Reaksi yang terjadi yaitu sebagai berikut.

• Naftalena + NADH + H + O

  2

  → (+)- cis-(1R,2S)-dihidroksi-1,2-dihidronaftalena

• NAD (Lee, 2005).

  Naftalena dioksigenase merupakan sistem enzim multikomponen yang terdiri dari ferodoksin reduktase, ferodoksin, dan oksigenase. Elektron ditangkap oleh NADH lalu ditransfer ke ferodoksin reduktase, kemudian ditransfer ke ferodoksin. Ferodoksin kemudian mereduksi oksigenase yang menyebabkan katalisis adisi 2 atom O dari O

  2 ke senyawa naftalena secara stereospesifik membentuk (+)-cis-(1R,2S)-dihidroksi-1,2-dihidronaftalen (Lee, 2005).

  Struktur oksigenase pada sistem enzim naftalena dioksigenase juga terdiri .

  3 3 (gambar 2.4) Tiap subunit pada komponen oksigenase

  dari heksamer α β mengandung Rieske center [2Fe-2S] dan sisi aktif berupa Fe yang berkoordinasi dengan molekul air, 2 residu histidin, dan 1 residu aspartat bidentat membentuk triad 2-His-1-Asp yang terlibat dalam aktivasi O

  2 dan proses katalisis. Salah satu

  Fe pada Rieske center berkoordinasi dengan 2 residu sistein sedangkan Fe lainnya berkoordinasi dengan 2 residu histidin (gambar 2.5) (Lee, 2005).

Gambar 2.4. Struktur oksigenase pada sistem enzim naftalena dioksigenase. Sub-unit α

  berwarna ungu, hijau, dan biru. Sub-unit β berwarna ungu muda, hijau muda, dan biru muda. Atom Fe berwarna merah dan atom S berwarna kuning (Kauppi et al, 1998)

Gambar 2.5. Ikatan koordinasi pada naftalena dioksigenase. Ikatan terbentuk antara triad

  2-His-1-Asp dan molekul air dengan atom Fe pada sisi aktif dan terbentuk antara 2 residu sistein dan 2 residu histidin dengan 2 atom Fe pada Rieske center , kedua bagian distabilkan oleh residu Asp-205 (Parales et al., 2000) Enzim naftalena dioksigenase memiliki spesifisitas substrat yang rendah namun tetap bekerja secara regiospesifik (hanya bekerja pada posisi satu jenis ikatan tertentu) dan stereospesifik (hanya menghasilkan salah satu jenis stereoisomer) dalam menghasilkan produk dihidrodiol. Naftalena dioksigenase mampu mengkatalisis reaksi oksidasi naftalena dan bifenil dalam laju yang sama, namun mengkatalisis reaksi oksidasi fenantrena dalam laju yang lebih lambat. Poliaromatik cincin 4 seperti krisen dan benz[a]antrasena juga dapat mengalami reaksi oksidasi dengan dikatalisis oleh enzim nafttalena dioksigenase menghasilkan struktur bis-cis-dihidrodiol (Parales et al., 2000; Jouanneau et al., 2006).

2.5. Gen Penyandi Enzim Monooksigenase dan Dioksigenase

  Bakteri mampu mendegradasi hidrokarbon karena bakteri memiliki gen penyandi enzim-enzim katabolik yang berperan dalam jalur katabolisme hidrokarbon, baik karena proses adaptasi akibat terjadinya kontaminasi maupun muncul secara alamiah sebagai sifat bakteri. Gen katabolik ini dapat digunakan sebagai dasar untuk mengidentifikasi dan mengevaluasi potensi isolat dalam mendegradasi hidrokarbon dengan proses amplifikasi menggunakan metode PCR (Chen, 2013; Mathew dan Hobani, 2015). Gen-gen katabolik penyandi enzim hidrokarbon alifatik maupun aromatik yang telah berhasil diamplifikasi dari DNA bakteri antara lain klaster gen alk, CYP, tod, ndo, phn, xyl, serta PAH-RHD yang berturut-turut menyandi enzim alkana monooksigenase, sitokrom P450, toluena dioksigenase, naftalen dioksigenase, fenantren dioksigenase, katekol dioksigenase, serta PAH-ring hydroxylating dioxygenase (Marquez-Rocha et al., 2005; Phillips et al., 2008; Hesham et al., 2014). Enzim pendegradasi hidrokarbon merupakan enzim multikomponen sehingga gen struktural yang menyandi komponen enzim tersebut tersusun dalam sebuah klaster gen (operon), baik dalam bentuk operon polisistronik pada kromosom atau pada plasmid (Sahoo, 2010).

  2.5.1. Gen penyandi alkana monooksigenase

  Alkana monooksigenase untuk rantai C medium yaitu C

  5 -C 12 (AlkB) yang

  dikode oleh klaster gen alkB dan alkana monooksigenase untuk rantai C panjang yaitu C >12 (AlkM) yang dikode oleh klaster gen alkM merupakan dua jenis enzim alkana monooksigenase yang telah berhasil dikarakterisasi. Klaster gen alkB pertama kali diamplifikasi dari strain Pseudomonas oleovorans Gpo1 dan terdiri dari 3 komponen enzim yaitu alkana monooksigenase (alkB), rubredoksin (alkG), dan rubredoksin reduktase (alkT). Homolog alkB telah banyak tersebar di alam pada sekitar 45 spesies bakteri (Chen, 2013). Klaster gen alkM pertama kali diamplifikasi dari strain Acinetobacter sp. ADP1 dan terdiri dari gen yang menyandi 3 komponen enzim yaitu alkana monooksigenase (alkM), rubredoksin (rubA), dan rubredoksin reduktase (rubB). Gen alkM telah berhasil dideteksi pada berbagai strain Acinetobacter, seperti Acinetobacter sp. M-1, A. calcoaceticus NCIMB 8250, A. calcoaceticus EB104, Acinetobacter sp. 2769A, dan A.

  calcoaceticus 69-V. Analisis filogenetik sekuens asam amino dari AlkM dan

  AlkB menunjukkan tingkat diversitas sekuens yang sangat tinggi sehingga gen

  alkM dapat dengan mudah dibedakan dari gen alkB. Gen alk juga memiliki

  diversitas cukup tinggi pada genus bakteri yang berbeda terutama antara bakteri Gram positif dan Gram negatif. Hal ini mengindikasikan jika probe DNA atau primer oligonukleotida spesifik dapat didesain untuk mendeteksi dan memonitor genotipe alkana monooksigenase secara spesifik menggunakan metode molekuler (Phrommanich et al., 2009; Whyte et al., 2002).

  2.5.2. Gen penyandi toluen dioksigenase