REGULASI PADA BAKTERIOFAGE DAN VIRUS
REGULASI EKSPRESI GEN PADA BAKTERI OFAGE DAN VI RUS
- Fage/ virus Æ memanfaatkan perangkat sel inang untuk sintesis DNA/ protein
- Strategi memanfaatkan sel inang Æ mensintesis 4 makromolekul:
1. RNA polimerase baru khusus mentranskripsi
Æ
kromosom virus
2. Subunit RNA pol baru Æ berasosiasi dengan polimerase sel inang, hanya mentranskripsi kromosom virus
3. Protein represor menghambat fungsi sel inang
Æ
4. Protein aktivator Æ mengatur ekspresi gen virus
Regulasi pada fage T7
2 kategori gen: Gen awal ( early genes ): Klas
I Æ diekspresikan pertama
Gen lambat ( late genes ):
Klas I I dan Klas I I I Æ diekspresikan bila produk gen awal tersedia
Regulasi pada fage T7
3 kelompok gen
1. Produk gen awal Æ menghambat sintesis RNA inang
2. Produk gen metabolisme DNA (enzim untuk replikasi kromosom virus & nuklease untuk degradasi kromosom sel inang Æ nt bebas)
3. Produk gen akhir (mantel, ekor & protein pembungkus kromosom virus). Produk terakhir: lisozim Æ lisis sel inang Æ + 250 fage
Ekspresi T7
1. Gen-gen klas I diekspresikan oleh RNA pol sel inang Æ transkrip panjang Æ dipotong oleh RNaseI I I dari sel inang Æ 5 mol mRNA Æ translasi oleh ribosom dari sel inang
Produk:
- antirestriksi (0.3) melindungi kromosom virus dari
Æ degradasi oleh enzim restriksi sel inang
- protein kinase (0.7) Æ modifikasi RNA pol sel inang, membatasi ekspresi gen klas I dan menjamin ekspresi gen klas I I dan I I I • RNA polimerase T7 (1) Æ transkripsi klas I I dan I I I (80% genom virus T7)
- Ligase (1.3) Æ menyambung fragmen DNA
2. Gen-gen klas I I diekspresikan oleh RNA pol T7
- replikasi DNA virus
3. Gen-gen klas I I I
- morfogenesis fage, pengemasan DNA, lisis sel inang
.2005. BTK505. IPB Suharsono
Regulasi pada SPO1
- SPO1: virus besar, menginfeksi Bacillus subtilis
- 3 kelompok gen: early , middle , late
1. Gen awal Æ RNA pol sel inang (menghasilkan produk
gen 28)
2. Gen tengah Æ
RNA pol sel I nang yang mengandung produk gen 28 pada posisi faktor σ
σ
- –Faktor
mengenali –35: TTGACA dan -10: TATAAT pada gen awal SPO1
- –Produk gen 28 mengenali –35: AGGAGA dan -10: TTTTTT pada gen tengah
- –Menghasilkan produk gen 33 dan 34
3. Gen akhir Æ RNA pol sel inang yang mengandung
produk gen 33 dan 34 Regulasi pada SPO1 (lanjutan) Transisi ekspresi gen awal ke gen tengah dan dari gen tengah ke gen akhir melibatkan modifikasi RNA polimerase (melalui penggantian salah satu subunitnya, yaitu posisi faktor σ )
Regulasi pada λ
Setelah menginfeksi , λ menempuh:
E.coli
1. Siklus litik Æ sel inang lisis Æ 100 fage
2. Siklus lisogenik Æ kromosom fage menyisip kedalam kromosom E.coli
Siklus litik atau lisogenik? Protein-protein regulator yang disandi λ
Regulasi selama siklus litik λ Fase litik meliputi 3 fase:
• Fase
I mmediate-early
- Fase Delayed-early
- Fase Late Fase I mmediate-early
Kromosom λ masuk, transkripsi oleh RNA pol sel inang. I nisiasi transkripsi dimulai dari P
R
(transkripsi ke kanan) Æ gen cro dan P (transkripsi ke kiri) gen
Æ L
N . Protein N diperlukan untuk
transisi dari immediate-early ke
delayed early (seperti produk
pada SPO1)
gen 28
λ
Regulasi selama siklus litik
Fase Delayed-early
Dimulai saat protein N menstimulasi transkripsi gen-gen
delayed- early , mengekspresikan
gen cI I dan cI I I (relevan untuk siklus lisogenik), gen O, P (untuk replikasi kromosom λ ) dan Q (untuk transisi dari delayed-early ke late, seperti produk gen 33 dan dari SPO1)
34 Fase Late
Dimulai saat protein Q menstimulasi transkripsi gen-gen
late spt gen penyandi kepala,
ekor dan faktor-faktor litik Transkripsi gen-gen immediate-early RNA polimerase sel inang:
Kanan: P
Æ cro R
Kiri: P Æ N L
Transkripsi delayed-early
δ
RNA polimerase sel inang (faktor diganti protein N) Kanan: P
Æ cI I , O, P, Q R
Kiri: P Æ CI I I L
Keadaan lisogeni
- Siklus lisogeni memerlukan :
1. Protein represor λ Æ menghambat ekspresi gen-gen
untuk siklus lisis
- – Disandi oleh gen cI di bawah kontrol P
RE
( promoter for repressor establishment )
λ
2. Protein I nt Æ integrasi ke kromosom
E. coli
- – Disandi oleh gen I nt di bawah promoter P
I NT
3. P dan P : sekuensi mirip, memerlukan protein cI I
RE
I NT
dan cI I I supaya RNA polimerase mengenalinya Æ cI I
dan cI I I diperlukan untuk siklus lisogeni
.2005. BTK505. IPB Suharsono
i n
Protein cI I dan cI I I
- Protein cI I Æ protein regulator (aktivator) seperti CAP mengikat daerah –35 dari P dan P
Æ Æ
RE
I NT
menstimulasi RNA pol menempel pada promoter sehingga kedua operon ditranskripsikan
- Protein cI I I Æ menonaktifkan protease yang dapat mendegradasi protein cI I ( menjaga stabilitas cI I )
Æ
- CI I dan cI I I memerlukan protein N
Mekanisme Lisogeni
λ Æ
- Represor mengikat operator (O dan O ),
L R mencegah transkripsi gen-gen yang dikontrol P dan P
R L yaitu: gen N dan cro
- N dan CRO tidak stabil Æ konsentrasi di dalam sel turun (rendah)
- N rendah menghambat transkripsi gen-gen delayed-
Æ early yang tergantung N, yaitu: O, P, Q
- Q rendah/ tidak ada Æ mencegah ekspresi gen-gen dan
late Æ tidak terjadi siklus lisis
- Protein I nt perantara rekombinasi situs spesifik
Æ antara attP dan attB sehingga kromosom λ terintegrasi kedalam kromosom
E. coli
Strategi λ dalam memilih siklus
1. Menghasilkan protein-protein N dan Q, yang berinteraksi dengan RNA pol dan mempengaruhi pembacaan terminator Æ lisis
2. Menghasilkan protein aktivator cI I yang mengikat daerah promoter dan memudahkan RNA pol menempel pada promoter Æ lisogeni
lisogeni
I nteraksi represor- operator
- Mutasi gen cI Æ plak jernih (WT Æ plak keruh: lisis & lisogeni)
- Mutasi cI I - dan cI I I - Æ plak jernih
- Represor: stabil, 26 kDa, berinteraksi dengan operator sebagai dimer
- Mutan operator (O dan O ) virulen (represor normal
Æ L R
tapi tidak dapat mengikat operator Æ tidak dapat
c
menempuh siklus lisogeni Æ plak jernih (~ lacO )
Operator
- Operator mempunyai 3 situs penempelan (O 1, 2, 3;
L
O 1, 2, 3)
R
- Operator tumpang tindih dengan promoter
- Setiap situs penempelan = 17 nt, dipisahkan dengan yang lain oleh daerah kaya AT
- Setiap mutasi pada situs penempelan virulen
Æ = mutasi Æ virulen
Lisis- Lisogeni
- Lisis/ lisogeni ditentukan oleh 6 protein regulator yang berkompetisi, yaitu: N, Q, cI I , cI I I , cI , dan cro
- Protein cro ( control of repressor and other things )
- – paling menentukan terjadinya siklus lisis atau lisogeni
- – diekspresikan segera setelah infeksi λ
- – tidak memerlukan protein N – ada sebelum produk cI (represor), cI I dan cI I I ada di dalam sel
- – represor, dapat mengikat O
R
dan O
L
seperti represor cI (tapi kurang efisien dan kurang stabil) Æ tidak dapat menghambat secara penuh ekspresi gen-gen
N dan cI I I (dibawah P L
) dan cro , cI I , O , P , dan Q (di bawah P
R
)
Mekanisme Lisis- Lisogeni
- Lisogeni memerlukan ekspresi gen cI Æ perlu cI I dan cI I I untuk mengaktifkan P
RE
- Lisis memerlukan ekspresi seluruh gen Æ perlu antiterminator N dan Q • Transkripsi cI lebih sensitif terhadap penurunan cI I / cI I I daripada transkripsi untuk gen-gen yang terlibat dalam siklus lisis terhadap penurunan N dan Q
Æ jika cro banyak Æ menempel pada O dan O Æ cI I R L
dan cI I I rendah Æ cI tidak diekspresikan Æ ekspresi seluruh gen λ Æ siklus lisis
Æ jika cro sedikit Æ tidak kuat menempel pada O dan
RO Æ ekspresi cI I dan cI I I normal Æ cI
L
diekspresikan Æ siklus lisogeni
- – tingkat produksi cro temperatur, keadaan
Æ
metabolit sel inang, genotipe sel inang, genotipe fage
Keadaan E. coli lisogeni
λ λ
- Bakteri lisogenik untuk (
E. coli ( )) kebal terhadap
superinfeksi (+ λ )
E. coli • ( λ ) + λ Æ DNA λ masuk tapi tidak terjadi lisis
pada bakteri
- Profage mensintesis represor cI pada tingkat rendah Æ menempel pada P O dan P O pada profage (menjaga
R R L L
kondisi lisogeni) dan P O dan P O pada λ yang masuk
R R L L
(mencegah replikasi dan integrasi kedalam kromosom E.
λ coli krn situs attB sudah ditempati) Æ kromosom
berada di sitosol jumlahnya berkurang (hilang) bila E.
Æ coli mengalami pembelahan sel
λ
- Transkripsi represor pada tingkat rendah di
E. coli ( )
dikontrol oleh P ( promoter for repressor maintenance )
RM
yang tidak memerlukan cI I dan cI I I (beda dengan P )
RE
- Transkripsi dari PRM dikontrol oleh protein cI :
Jika represor cI rendah Æ P dirangsang Æ transkripsi
RM
cI Jika represor cI tinggi Æ transkripsi dari P dihambat
RM
oleh represor cI ( Æ regulasi autogenous)
I nduksi lisis dari keadaan profage
- Lisis terjadi karena protein represor cI tidak dapat menghambat ekspresi operon dari profage λ
λ
- Kehilangan secara spontan profage dari kromosom
E. coli jarang terjadi
- Sel donor lisogenik Hfr x sel resipien non lisogenik
- – Jika kromosom yang mengandung profage masuk ke sel resipien Æ tidak menemui protein represor Æ transkripsi
P O P O dari dan Æ R R L L siklus lisis
- – Tidak terjadi lisis jika sel resipien adalah
E. coli ( λ)
- Mutan cI 857 Æ sintesis protein represor thermolabil
o o
(stabil pada 30
C, tidak aktif pada 42
C)
E. coli (cI 857) Æ dipanaskan Æ
E. coli • lisis
- Mekanisme: perbaikan DNA dengan sistem
- Bila DNA rusak dan tidak dapat diperbaiki dengan replikasi,
E. coli mensintesis protein RecA Æ
memudahkan sintesis enzim SOS termasuk untuk replikasi tanpa DNA cetakan. RecA adalah protease yang dapat merusak represor LexA (menekan enzim sistem perbaikan kesalahan), dan represor λ dalam
E. coli ( λ ).
- Jika DNA rusak Æ sinyal untuk mensintesis protein
RecA Æ merusak represor λ Æ profage terinduksi untuk mengalami lisis
Regulasi SV40 Produk gen early
- Antigen t (15kD)
- Antigen T (96 kD)
Æ Transkrip sama, beda splicing
Produk gen late
- Protein kapsid (VP1, VP2,
VP3) Æ beda splicing
- – mRNA late :
Æ splicing
- 16S mRNA Æ
VP1
- 19S mRNA:
- VP2
- VP3
Arah transkripsi gen-gen early Æ Krn 2 kodon AUG berbeda dengan gen-gen late
Regulasi sintesis protein SV40
- I nfeksi (8-10 jam) Æ gen early (gen A penyandi antigen T) ditranskripsikan oleh RNA pol dan ditranslasikan oleh ribosom sel inang
- Mutan tsA (antigen T thermolabile) tidak dapat
Æ
memulai replikasi kromosom virus & tidak dapat memulai transkripsi gen-gen late untuk protein kapsid virus
Antigen T Æ protein pengatur early yang esensial (~ protein N pada λ) Mekanisme
Promoter early (EI dan EII) dekat dengan ORI dan gen early A Situs penempelan antigen T (I, II,
III) bebas Æ transkripsi oleh RNA pol dari EI Melekatnya antigen T (tetramer) pada situs I Æ Inisiasi transkripsi dari situs EII Penempelan antigen T pada situs
II Æ transkripsi gen A berhenti Æ ekspresi gen-gen late
Regulasi SV40
Kromosom SV40 menginfeksi sel inang:
- RNA pol memilih promoter EI untuk memulai transkripsi genA sintesis antigen T
Æ
- Akumulasi antigen T (tetramer) Æ mengikat situs I Æ inisiasi transkripsi dari EI dihambat, sehingga RNA pol
menempel pada promoter EI I untuk melakukan transkripsi
antigen T Æ jumlah antigen T banyak Æ mengikat semua situs I , dan I I Æ transkripsi gen early berhenti, dan replikasi DNA SV40 dan transkripsi gen-gen late dimulai
Kenapa terjadi early/ late?
- Promoter EI dan EI I jauh lebih kuat daripada promoter pada gen-gen late sehingga transkripsi oleh RNA pol pada gen A sangat intensif Æ produk antigen T banyak
- Antigen T menghambat ekspresi gen-gen early , sehingga RNA pol memulai ekspresi gen-gen late
Sintesis antigen T Æ regulasi autogenous (~ represor λ
~ trp)
Mutan tsA Æ antigen T thermolabile didegradasi (situs I
dan I I bebas) Æ stimulasi 15x transkripsi gen early Æ overproduksi protein mutan T