ISOLASI DAN UJI AKTIVITAS SITOTOKSIK SENYAWA MURNI DARI EKSTRAK ETIL ASETAT DAUN TUMBUHAN AKAR KAIK-KAIK Uncaria cordata (Lour.) Merr
ISOLASI DAN UJI AKTIVITAS SITOTOKSIK SENYAWA MURNI
DARI EKSTRAK ETIL ASETAT DAUN TUMBUHAN
AKAR KAIK-KAIK Uncaria cordata (Lour.) Merr
Noveri Rahmawati, Rahayu Utami, Azwendah
Sekolah Tinggi Ilmu Farmasi Riau
Email :
ABSTRAK
Uncaria cordata(Lour.)Merr merupakan salah satu tumbuhan dari genus Uncaria yang tumbuh di Indonesia. Ekstrak etil asetat dari tumbuhan ini mempunyai aktivitas sitotoksik yang sangat kuat sehingga perlu dilakukan isolasi dan uji aktivitas sitotoksik senyawa murninya. Ekstrak etil asetat diiisolasi dengan menggunakan kromatografi kolom dan uji aktivitas sitotoksik menggunakan metoda Brine Shrimp Lethality Test (BSLT) . Diperoleh senyawa murni Uc7 berupa amorf, bewarna putih sebanyak 65 mg dengan titik leleh 232-234 C serta memberikan warna merah muda pada uji pereaksi warna dengan Liebermann-Burchard. Berdasarkan hasil karakterisasi dengan spektroskopi UV dan IR serta perbandingan data dari literatur, senyawa Uc7 yang diperoleh kemungkinan berasal dari golongan terpenoid. Senyawa Uc7 memiliki nilai LC 50 sebesar 2,75µg/mL dan nilai ini menunjukkan bahwa senyawa ini mempunyai aktivitas sitotoksik yang sangat kuat.
Kata kunci: Isolasi, Sitotoksik, Terpenoid, Uncaria cordata
ABSTRACT
Uncaria cordata
(Lour.) Merr is one of the genus Uncaria plant that native to Indonesia. The ethyl acetate extract of this plant has a very strong cytotoxic activity so it is necessary to isolate and evaluate the cytotoxic activity of pure substance. Ethyl acetate extract was isolated by using column chromatography and cytotoxic activity was done by Brine Shrimp Lethality Test (BSLT) method. Uc7 pure compound was obtained in the form of amorphous, white coloured as much as 65 mg with a melting point of 232-2340C and give pink in color reagent test with the Liebermann-Burchard. Based on the results of characterization by UV and IR spectroscopy as well as a comparison of data from the literature, the Uc7 compound was suggested the group of terpenoids. Compounds Uc7 have LC 50 this value indicated that compound has a very strong cytotoxic activity.
Keywords: Isolation, Cytotoxic, Terpenoid, Uncaria cordata
tumbuhan obat penting bagi industri obat
PENDAHULUAN tradisional (Kusuma dan Zaky, 2005).
Kekayaan flora yang dimiliki oleh Salah satu tumbuhan obat yang Indonesia berpotensi untuk dikembangkan digunakan masyarakat di beberapa negara dalam pencarian obat baru. Diduga dari tropis ialah tumbuhan genus Uncaria. sekitar 30.000 jenis flora yang ada di dalam Beberapa penelitian terdahulu yang
Uncaria
hutan tropis Indonesia sekitar 9.600 spesies dilakukan terhadap genus telah diketahui berkhasiat obat, dari jumlah diantaranya Uncaria gambir dilaporkan kuat terhadap larva Artemia salina Leach menggunakan metode
Brine Shrimp Lethality Test
(BSLT).
Uji Sitotoksik Dengan Metode Brine Shrimp Lethality Test (BSLT)
Hasil pemisahan kromatografi kolom dilakukan uji KLT. Vial-vial yang akan diuji ini diambil secara acak setiap 5 vial. Vial yang mempunyai harga Rf yang sama dapat digabungkan menjadi satu fraksi. Fraksi yang mempunyai pemisahan yang cukup baik kemudian dimurnikan sehingga diperoleh senyawa murni. Senyawa murni yang diperoleh dilakukan uji sitotoksik, pengukuran titik leleh, uji Liebermann-Burchard serta karakterisasi menggunakan spektroskopi Ultraviolet (UV) dan spektroskopi Inframerah (IR).
Sebanyak 4 g ekstrak etil asetat dipreabsorbsi terlebih dahulu dengan menggunakan silika gel 60 sehingga menjadi serbuk. Dilakukan packing kolom dengan cara membuat bubur silika dengan pelarut organik yaitu n-heksana lalu dimasukkan ke dalam kolom dan kemudian dielusi sampai kerapatan silika dalam kolom maksimum. Ekstrak yang sudah dipreabsorbsi kemudian dimasukkan ke dalam kolom dan dielusi menggunakan metoda SGP (step gradient polarity) menggunakan pelarut n-heksan (non polar), etil asetat (semi polar), dan metanol (polar). Eluen akan ditingkatkan kepolarannya apabila pita yang turun dengan eluen sebelumnya telah terelusi semua dan ditampung dalam vial yang sudah diberi nomor.
Prosedur Kerja Isolasi Senyawa Murni
Leach dan dimetilsulfoksida (DMSO).
Artemia salina
Kromatografi Lapis Tipis (KLT), air laut, larva
Bahan-bahan yang digunakan adalah ekstrak etil asetat daun tumbuhan N, kloroform amoniak 0,05 N, reagen Mayer, FeCl 3 1%, logam Mg, HCl pekat, asam asetat anhidrat, H 2 SO 4 pekat, n- heksana, etil asetat, metanol, silika gel, plat
, lampu ultraviolet, spektrofotometer UV, spektrofotometer IR, alat pengukur titik leleh Fisher Johns, corong, tisu, spatel, timbangan analitik, aluminium foil, rak dan tabung reaksi, pipet mikro, plat tetes, pipet tetes, beker glass, gelas ukur, kapas,wadah akuarium, aerator, lampu dan vial uji.
chamber
Alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah kolom kromatografi,
METODE PENELITIAN Alat dan Bahan
Brine Shrimp Lethality Test
(BSLT) dengan LC 50 26,30 µg/mL dari fraksi etil asetat (Suminiati, 2013). Penelitian lainnya yang dilakukan oleh (Bacher, 2005) dengan metode MTT
dilakukan uji aktivitas sitotoksik dari ekstrak n-heksana, etil asetat, metanol dan diperoleh nilai LC 50 sebesar 7,46 µ g/mL, 6,66 µg/mL dan 7,83 µ g/mL. Berdasarkan nilai LC 50 di atas maka perlu dilakukan isolasi dan uji aktivitas sitotoksik senyawa murni hasil isolasi dari ekstrak etil asetat daun Uncaria cordata (Lour.) Merr dengan menggunakan metode
Uncaria cordata (Lour.) Merr. Telah
yang ditemukan di Indonesia khususnya di hutan Larangan Adat Kabupaten Kampar Propinsi Riau adalah
Uncaria
Salah satu tumbuhan genus
mampu mengurangi jumlah parasit dan terjadinya perubahan apoptosis pada kit deteksi kematian sel.
perrottetii
juga telah dilakukan (Vital dan Rivera, 2009) dengan menggunakan metode TUNEL dan menunjukkan hasil bahwa ekstrak Uncaria
Uncaria perrottetii
menyatakan bahwa kandungan kimia dari Uncaria tomentosa yaitu pteoropodin dan uncarin F mampu menghambat poliferasi sel leukemia limfoblastik akut. Penelitian terhadap
Uncaria tomentosa
terhadap
(3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5- difeniltetrazolium bromid)
Wadah disiapkan terlebih dahulu untuk penetasan larva udang, kemudian diberi sekat dan sebagian ditutup dengan menggunakan alumunium foil.Wadah yang sudah siap, diisi dengan air laut yang sudah disaring. Kista udang dimasukkan pada bagian wadah yang ditutup dengan alumunium foil dan diletakkan di bawah pencahayaan lampu, biarkan hingga 48 jam.
Vial uji yang dikalibrasi sebanyak 5mL. Sampel uji ditimbang sebanyak 20 mg, kemudian dilarutkan dengan 2 mL pelarut yang melarutkannya, sehingga diperoleh larutan induk 10000 µg/mL. Dari larutan induk dipipet sebanyak 0,5 mL dan ditambah pelarut hingga 5 mL ke dalam vial yang sebelumnya telah dikalibrasi sehingga diperoleh larutan dengan kosentrasi 1000 µ g/mL. larutan dengan kosentrasi 1000µ g/mL dipipet sebanyak 0,5 mL ke dalam 4 vial berbeda, dimana larutan uji di 3 vial diuapkan dan 1 vial lainnya ditambah dengan pelarut hingga 5 mL sehingga diperoleh larutan uji dengan kosentrasi 100 µg/mL. Perlakuan yang sama dilakukan hingga didapatkan larutan uji dengan kosentrasi 10 µg/mL.
Masing-masing vial berisi sampel uji yang telah diuapkan ditambahkan ke dalamnya dimetil sulfoksida sebanyak 50 µg/mL, lalu larva udang sebanyak 10 ekor dan ditambah air laut hingga 5 mL. Pengamatan dilakukan setelah 24 jam dengan menghitung jumlah larva yang mati.
Isolasi dari ekstrak etil asetat diawali dengan melakukan pemisahan menggunakan kromatografi kolom. Hasil kromatografi kolom ditampung dalam vial dan dibiarkan menguap. Sebanyak 467 vial diperoleh dari kromatografi kolom dan kemudian dilakukan pemeriksaan KLT dengan jarak 5 vial, pola nodanya diamati dibawah lampu UV dan ditandai menggunakan pensil tepat pada nodanya. Fraksi yang memiliki noda dan nilai Rf yang sama kemudian digabung sehingga didapat 11 fraksi gabungan yang hasilnya kemudian diperiksa kembali menggunakan KLT (Gambar 1). Semua fraksi diberi label Uc1-Uc11. Fraksi Uc1 (vial 67-77), fraksi Uc2 (vial 127-202), fraksi Uc3 (vial 222-242), fraksi Uc4 (252-272), fraksi Uc5 (vial 322-327), fraksi Uc6 (vial 337-342), fraksi Uc7 ( vial 347-352), fraksi Uc8 ( vial 387-392), fraksi Uc9 (vial 397-402), fraksi
Uc10 (vial 412-417), fraksi Uc11(vial 457- 462).
Gambar 1. Profil KLT Hasil
Penggabungan Fraksi Kolom dari Ekstrak Etil Asetat
Uncaria cordata
(Lour.) Merr Dengan Penampak Noda Anisaldehid
Fraksi Uc5, Uc6, dan Uc7 dipilih untuk dilakukan pencucian, karena ketiga fraksi ini berbentuk amorf bewarna putih kekuningan. Tujuan dari dilakukannya pencucian adalah untuk menghilangkan pengotornya, sehingga dengan dilakukannya pencucian diharapkan didapat amorf bewarna putih.Pencucian dilakukan berdasarkan perbedaan kelarutan antara zat yang akan dimurnikan dengan pengotor dalam suatu pelarut tunggal atau kombinasi dari beberapa pelarut yang cocok. Pencucian ini dilakukan dengan cara melarutkan amorf dengan sedikit pelarut yang melarutkannya yaitu etil asetat dan kemudian menambahkan lebih banyak pelarut yang tidak melarutkannya yaitu n- heksan. Apabila amorf sudah mengendap kembali kemudian pipet pelarut yang tersisa.Proses pencucian ini dapat dilakukan berulang-ulang sampai didapatkan senyawa murni. Dari ketiga fraksi yang dilakukan pencucian, fraksi Uc7 menunjukkan hasil yang lebih baik dari kedua fraksi lainnya, ditunjukkan dengan diperolehnya amorf bewarna putih sebanyak 65 mg
HASIL DAN PEMBAHASAN
(Gambar 2). Senyawa Uc7 diuji kembali untuk memastikan bahwa senyawa ini murni dengan pengujian titik leleh dan diperoleh nilai titik leleh 232-234 leleh yang sempit ini dapat dikatakan bahwa senyawa dalam keadaan murni (Fiesser dan Williamson 1992). Pengujian Kromatografi Lapis Tipis (KLT) dilakukan pada beberapa eluen yang berbeda menggunakan pereaksi warna anisaldehid. Tujuan pemberian pereaksi warna adalah untuk membantu memperjelas penampakan bercak noda pada plat KLT dikarenakan pada lampu UV 254 dan 366 nm tidak memberikan tampak noda yang jelas. Pereaksi warna anisaldehid biasanya digunakan untuk senyawa- senyawa terpenoid. Pereaksi warna anisaldehid akan membentuk kompleks sehingga menimbulkan warna yang spesifik dan jelas untuk senyawa-senyawa kimia. Adapun bercak warna yang ditunjukkan meliputi hijau, biru, coklat hingga merah (Matuszewska dan Jhon,2004). Pada pemeriksaan KLT didapatkan satu noda, maka senyawa tersebut bisa dikatakan sudah murni (Gambar 3).
Gambar 3. Profil KLT Senyawa Murni
Uc7 dengan Berbagai Perbandingan dan Penambahan Reagen Penampak Noda Anisaldehid
Senyawa murni Uc7 dikarakterisasi menggunakan spektroskopi UVdan
IR.Hasil pengukuran spektrofotometer UV senyawa Uc7 yang diukur dengan pelarut metanol pada rentang panjang gelombang 200-400 nm menunjukkan adanya serapan maksimum pada panjang gelombang 280 menunjukkan bahwa senyawa Uc7 memiliki gugus kromofor, diduga serapan ini diberikan oleh gugus C=O yang juga terlihat pada spektrum IR.
Gambar 4. Spektrum UV Senyawa Uc7
Pada spektrum IR pita serapan terdapat didaerah bilangan gelombang 1690 dan 1681 cm -1 yang berasal dari gugus C=O, untuk pita yang muncul pada bilangan gelombang 2964,72 cm
- -1 , 2927,10 cm -1
, 2904,92 cm -1 , dan 2871,17 cm -1 menunjukkan adanya gugus C-H hal ini memberikan petunjuk kemungkinan adanya gugus metil dan metilena, dugaan ini diperkuat oleh adanya serapan pada bilangan gelombang 1459,21 cm
- -1 yang disebabkan oleh gugus -CH 2 hali ini mengindikasikan adanya gugus gem dimetil yang merupakan ciri khas senyawa terpenoid (Supratman, 2010) (Gambar 5).
Gambar 5. Spektrum IR senyawa Uc7
Senyawa Uc7 dilakukan pengujian aktivitas sitotoksik menggunakan metode
Brine Shrimp Lethality Test
(BSLT) dengan kosentrasi 100, 10, 1 µg/mL dan dari masing-masing konsentrasi diperoleh persen kematian sebesar 90%, 80 % dan
30%. Nilai probit yang didapat yaitu 6,2816, 5,8416, dan 4,4756.
Senyawa Organik,
Kusuma, F.Rdan Zaky, B.M., 2005,
Dari perhitungan yang dilakukan didapatkan nilai LC 50 sebesar 2,57 µg/mL. Senyawa ini dapat dikategorikan memiliki aktivitas sitotoksik yang sangat kuat, karena suatu senyawa dikatakan bersifat sitotoksik jika nilai LC 50 kecil dari 30 µg/mL (Meyer
Possibilities of Thin Layer Chromatographic Analysis of The Molecular Phase of Balticamber and Other Natural Resins, Acta
Chromatographica.
Meyer, B.N.,Feerigni, N,R., Putnam, J.E., Jacobson, L,B., Nicholas, D,E., dan McLaughlin, J, L., 1982, Brine Shrimp: A convenient. General Bioasssay For Active Plant Constituens, Plant Medical, Vol 45, Hal. 31-34.
Suminiati, 2013, Skrining Aktivitas Antioksidan dan Sitotoksik dari Ekstrak dan Fraksi Daun Gambir (Uncaria gambir) ( Hunter) Roxb,
Skripsi
, Sekolah Tinggi Ilmu Farmasi Riau, Pekanbaru. Supratman, U., 2010, Elusidasi Struktur
Univeritas Padjajaran, Bandung. Vital, P. G., dan Rivera, W. L., 2009,
, Agromedia Pustaka, Jakarta. Matuszweska.A and Jhon.A., 2004, Some
Antimicrobial Activity and Cytotoxicity of
Chromlaena odorata
Senyawa yang diperoleh merupakan senyawa Uc7 golongan terpenoid dan mempunyai aktivitas sitotoksik kategori sangat kuat yaitu 2,57 pµg/mL.
KESIMPULAN
mampu menghambat phospolipase 50 berkisar antara 9,5 – 44,6 µM (Andre et al, 2013).
Uncaria rhynchphylla
, 1982). Aktivitas sitotoksik yang sangat kuat pada senyawa Uc7 ini diduga karena adanya senyawa golongan terpenoid di dalamnya. Hal ini didukung oleh beberapa penelitian dimana golongan senyawa terpenoid dari
et al
Tumbuhan Liar Berkhasiat Obat
DAFTAR PUSTAKA
Organic Experiments
Vol 123, Hal. 615- 622. Fiesser, L.F., Williamson, K.L., 1992
British Journal of Hematology,
Induce Apoptosis in Proliferating, G0/G1- Arrested and bcl-2-Expressing Acute Lymphoblastic Leukemia Cells,
Uncaria tomentosa
Stuppner, H., Ausserlechner, M. J., Kofler, R., dan Konwalinka, G., 2005, Oxindole alkaloids from
Vol 1, No. 4, Hal. 79-98. Bacher, N., Tiefenthaler, M., Sturm, S.,
Biomedical and life Sciences,
A., Liu, Y., 2013, A Review of the Occurrence of Non-Alkaloid Constituent in Uncaria Species and Their Structure-Activity Relationship, American Journal of
Andre, N., Wang, X., He, Y., Pan, G., kojo,
(L.f) King and Robinson and Uncaria perrottetii (A. Rich) Merr. Extracts,
Journal of Medicinal Plant Reasearch,
Vol 3, No 7, Hal. 511-518.
7 th Ed., D.C.Heath and Company,Toronto, Canada.