Skema Umum Proses Kultivasi

  

KULTIVASI

MIKROORGANISME

  

Organisme Waktu Penggandaan sel

Bakteri dan khamir Kapang dan Alga Rumput Ayam Babi Sapi muda Manusia (muda)

  20-120 menit 2-6 jam 1-2 minggu 2-4 mingu 4-6 mingu 1-2 bulan 3-6 bulan

  Skema Umum Proses Kultivasi

  Pengembangan Inokulum Biomassa Pemisahan

  Cairan Labu Kultur

  Sel Bioreaktor Fermentasi

  Stok Kocok I nokulum

  Supernatan Sterilisasi Media Bebas Sel Formulasi Media

  Ekstraksi Produk Penanganan Pemurnian

  

Bioreaktor

Bahan Baku Media

  Limbah Cair Produk Pengemasan produk U T A U S A D

  I A R P T

  I S S U A D

  IV IN T L

  IO U B K

METODE KULTIVASI

  „

  „ Metode kultivasi berdasarkan cara operasi bioreaktor :

• nir sinambung/ curah (batch)
• sinambung (continuous)
• semi sinambung (fed- batch)

  Continuous

  

R

O

T

K

A

E

R

  

IO

B

H

O

T

  KULTUR CURAH/NIR SINAMBUNG Pelaksanaan kultivasi : „ Bioreaktor steril diisi dengan media segar steril lalu

  diinokulasi dengan inokulum KULTIVASI (merupakan

  Î sistem tertutup)

  „

  Pada akhir kultivasi, isi bioreaktor dikeluarkan untuk dilakukan pemanenan produk (proses hilir)

  

„ Bioreaktor selanjutnya dibersihkan dan disterilisasi untuk

  digunakan pada kultivasi berikutnya Penyiapan/pembersihan bioreaktor repot

  Kultur Curah :

  1. Kultur curah merupakan cara yang paling sederhana, sehingga menjadi titik awal untuk studi kinetika kultivasi

  2. Resiko kontaminasi rendah

  3. Konsentrasi produk akhir lebih tinggi

  4. Tidak perlu mikroba dengan kestabilan tinggi krn waktu kultivasinya pendek

  5. Dapat untuk fase fermentasi yang berbeda pada bioreaktor yang sama (Contoh : pertumbuhan sel pd fase eksponensial & pembentukan produk pd fase stasioner = metabolit sekunder

  6. Pada industri farmasi, semua bahan-bahan yang digunakan harus diketahui dengan tepat, sehingga lebih praktis dengan proses curah

  7. Dari aspek rekayasa bioproses, kultur curah lebih fleksibel dalam perencanaan produksi, terutama untuk memproduksi beragam produk dengan pasar kecil

  8. Kelemahan : Terakumulasi produk yang dapat menghambat pertumbuhan

  Kurva Pertumbuhan

  Bila sel ditumbuhkan pada kultur curah , maka sel akan tumbuh dengan melalui : fase lag, fase eksponensial (fase log), fase stasioner dan akhirnya fase kematian

  Lag Eksponensial Stasioner Kematian

  Waktu Log Jml Sel/ml Ln X (g/l)

  ‘Viable cell count’ dg lisis sel Lisis sel, diikuti pertumbuhan kriptik

  X = konsentrasi biomassa di dalam bioreaktor (g/l bobot kering) µ = laju pertumbuhan spesifik (jam

  „ Fase Eksponensial : „ Keterangan :

• -1

  ) t = waktu (jam)

  „ Model pertumbuhan mikrobial ini dikenal sebagai Î Model Pertumbuhan Eksponensial

  Plot antara ln[Sel] vs waktu

  

Î akan menghasilkan hubungan garis lurus pada fase

eksponensial (ingat pembelahan biner) (slope

  Î untuk menentukan μ)

  

„ Mengapa populasi sel meningkat dengan cara eksponensial ?

„ Perhatikan sel tunggal di dalam bioreaktor Î Sel ini

  membelah diri tiap jam ( pembelahan biner ).

  „ Populasi sel pada tiap waktu generasi dapat digambarkan sbb.

  Bila 1 sel membelah menjadi 2 sel Î 2 Î 4 Î 8 …. dst n

  1

  2 3 4 …………..

  1 Î 2 Î 2 Î 2 Î 2 Î 2 = N (jumlah sel)

  Pangkat ( ) eksponen n = jumlah generasi

  Laju pertumbuhan spesifik(µ) : - Menggambarkan kecepatan reproduksi sel.

• - Semakin tinggi nilainya, maka semakin cepat sel tumbuh. - Pada saat sel tidak tumbuh, maka laju spesifik pertumbuhan = 0

  Model Pertumb Eksponensial ¾

  Pada saat fase eksponensial, laju spesifik pertumbuhan relatif tetap

  ¾

  Hasil integrasi : Persamaan di atas menggambarkan hubungan eksponensial antara konsentrasi biomassa vs waktu

  „ Penentuan Laju Pertumbuhan Spesifik :

  Plot antara ln X vs t akan menghasilkan garus lurus

  Î Slope = μ

  

Hubungan antara Waktu Penggandaan (doubling time = t )

D dengan laju spesifik pertumbuhan ( μ)

  

„ t menggambarkan waktu yang diperlukan untuk menggandakan

d populasi sel

  Î menggambarkan laju pertumbuhan sel „

  Selama fase eksponensial t relatif konstan D „ Hubungan antara t dengan laju pertumbuhan spesifik

  D dua kali dari X menjadi Î bila konsentrasi biomassa menjadi

  X selama waktu penggandaan t (= t - t ) :

1 D

  1 t = 0,693 d

  : Aplikasi Kultur Curah

  Digunakan untuk memproduksi biomassa, metabolit primer dan • metabolit sekunder Untuk produksi biomassa Î digunakan kondisi kultivasi yang • mendukung pertumbuhan biomassa, sehingga mencapai maksimal Untuk prodiksi metabolit primer Î kondisi kultivasi harus dapat • memperpanjang fase eksponensial yang dibarengi dengan sintesis produk Untuk produksi metabolit sekunder Î kondisi kultivasi harus • dapat memperpendek fase eksponensial dan memperpanjang fase stasioner

KULTUR SINAMBUNG

  „ Media segar secara kontinyu ditambahkan ke dalam

  bioreaktor, dan pada saat yang bersamaan cairan kultivasi dikeluarkan ( Sistem Terbuka )

  „

  Sel mikroba secara kontinyu berpropagasi menggunakan media segar yang masuk, dan pada saat yang bersamaan produk, produk samping metabolisme dan sel dikeluarkan dari bioreaktor Î volume tetap

  „ Bioreaktor kultur sinambung membutuhkan lebih sedikit pembersihan dibandingkan sistem curah.

  „ Dapat menggunakan Sel mikroba imobil untuk

  memaksimumkan waktu tinggalnya (retensi), sehingga meningkatkan produktivitasnya.

  Imobilisasi sel : penempatan mikroba pada ruang/daerah

  tertentu, sehingga dapat mempertahankan kestabilannya & dapat digunakan berulang-ulang (contoh : menumbuhkan/melekatkan mikroba pada carrier )

  Kultur Sinambung Kelebihan :

  1. Produktivitas lebih tinggi, penyebab : - lebih sedikit waktu persiapan bioreaktor per satuan produk yang dihasilkan - laju pertumbuhan & konsentrasi sel dapat dikontrol

  Î dengan mengatur laju dilusi

• - pemasokan oksigen dan pembuangan panas dapat diatur Dengan demikian hanya butuh pabrik lebih kecil (pengurangan biaya modal untuk fasilitas baru)

  2. Dapat dijalankan pada waktu yang lama

  3. Cocok untuk proses yang resiko kontaminasinya rendah (contohnya penanganan limbah cair) & produk yang

  berasosiasi dengan pertumbuhan

  4. Pemantauan dan pengendalian proses lebih sederhana

  5. Tidak ada akumulasi produk yang menghambat

  Kultur Sinambung

  Dengan mengontrol laju dilusi Î dimungkinkan untuk mempertahankan laju pertumbuhan spesifik yang optimal untuk pembentukan produk

  Kelemahan : ‰ Aliran umpan yang lama

  Î resiko kontaminasi besar (operasi

  harus hati-hati & desain peralatan lebih baik)

  ‰ Peralatan untuk operasi dan pengendalian proses harus bisa

  tetap bekerja baik untuk waktu yang lama

  

‰ Memerlukan mikroba dengan kestabilan genetik tinggi, karena

  akan digunakan pada waktu yang lama

  Î Terjadinya degenerasi galur mikroba yang digunakan akibat

  mutasi spontan menyebabkan penurunan produk yang dihasilkan

  ‰ Sebaiknya ada konsumen/permintaan yang tetap terhadap

NERACA MASSA PADA KULTUR SINAMBUNG

  Biomassa :

  

Akumulasi = Sel masuk – Sel keluar + Pertumbuhan – Sel mati

dX F F X −

  X − + =

μX αX

dt

  V V Bila suplai medium steril (X = 0) dan μ >> α, maka dX F = −

  X μX dt

  V = − DX = − D

  X ( )

  μX μ dX dan μ = D Dalam keadaan setimbang (staedy state),

  = dt

  D ≈ μ crit max

  D mendekati D ⇒ tidak stabil crit

  D > μ ⇒ wash out max

  Substrat :

Akumulasi = nutrisi masuk – nutrisi keluar – konsumsi untuk tumbuh

• – konsumsi untuk pemeliharaan – konsumsi untuk sintesis produk

  ( ) ( )

  S S f

  

− = =

− − = <<

  S

  X S

  X f S

  X Y x sehingga , dt dS

  Saat setimbang, Y μX S S D dt dS

  , maka produk, n pembentuka ada dan tidak Y μX Bila mX ^{S P p S X f}

  Y X q mX Y

  μX S

  V F S

  V F dt dS

  − − − − =

  Kultur Sinambung : Start-Up ‰ Kultivasi sinambung diawali dengan kultivasi curah ‰ Setelah kultur mencapai fase eksponensial , lalu umpan

  dimasukkan

  ‰ Bila komposisi media saat start-up sama dengan umpan,

  perubahan dari curah ke sinambung menyebabkan konsentrasi sel atau produk berosilasi (A) Î penyebab : kultur mikroba mengalami hambatan oleh substrat)

  1/2 umpan Î dicegah dengan komposisi media saat start-up

  (B)

‰ Penambahan umpan dilakukan kira-kira setelah kons sel ½

kons sel saat “steady-state” (biomassa, substrat & produk

  tidak berubah dan laju metabolisme sel kontan)

  B A Kons Dimulai kultivasi sinambung Kons Sel Sel

  Kultur Sinambung : ‰ Model hubungan laju pertumbuhan sel dgn konsentrasi

  substrat pada kultivasi sinambung Î Model MONOD

  µ = S µ K + S maks S Keterangan :

• -1 µ = laju pertumbuhan spesifik (jam ) -1 µ = laju pertumbuhan spesifik maksimum (jam ) maks S = konsentrasi substrat pembatas (g/l)

  

K = kons substrat (g/l) pada saat ½ laju pertumbuhan spesifik

S maksimum Î menggambarkan efisiensi mikroba dalam

mengkonsumsi substrat

  Model yang menghubungkan X, S dan D

• =

• +

  = − =

  ( )

  X D

S K

.S μ

  X D μ dt dX s max

  ⎟⎟ ⎠ ⎞ ⎜⎜

  ⎝ ⎛ −

  S K .S μ μ s max

  

( )

( )

⎟⎟ ⎠ ⎞ ⎜⎜

• − − = − − =
• = = μ

  ⎝ ⎛

  S K .S μ Y

  X S S D Y μX S S D dt dS

  S max S

  X f S

  X f Persamaan Saat Tidak Setimbang (Non-Steady State) Biomassa Substrat

  D μ DK S maka , dt dS

  Bila

max

S

  − = = S K S .

  μ D D S max

  ( ) f max

  S f S

  X f S

  X S dan D dari fungsi

  X D dari fungsi S D μ

  DK S Y S S Y

  X ⎟⎟ ⎠ ⎞ ⎜⎜

  ⎝ ⎛ − − =

  − = Persamaan dalam Keadaan Setimbang (Steady State) Substrat

  Biomassa

  D kritis D kritis ⇒ D terendah saat mana wash out terjadi

• = = =

  S f f C max C f max

  S K S μ D

  S S dan μ D

  D C fungsi dari S f

  . Bila S

f

  >> K S

  , maka D C

  = μ max

  Aplikasi Kultur Sinambung : ‰ Digunakan untuk penelitian fisiologi dan biokimia mikroba, dikarenakan kondisinya mantap, laju pertumbuhan dapat diatur oleh laju alir dan laju pertumbuhan dibatasi oleh konsentrasi substrat pembatas Î dapat digunakan untuk penelitian pengaruh substrat pembatas thd kinerja mikroba, untuk perbaikan sistem curah/ semi sinambung

  ‰ Untuk isolasi dan seleksi mikroba penghasil enzim menggunakan media diperkaya

  

‰ Untuk produksi biomassa, contoh I CI (I mperial Chemical I ndustries,

  3 kapasitas bioreaktor 3000 m , substrat metanol)

  ‰ Untuk produksi bir menggunakan bioreaktor menara (tower bioreactor)

KULTUR SEMI SINAMBUNG (FED-BATCH)

  

„ Media segar ditambahkan ke dalam bioreaktor tanpa pengeluaran

isi bioreaktor.

  „ Pada kultur fed batch , media segar ditambahkan ke dalam

bioreaktor tanpa pengeluaran isi bioreaktor secara kontinyu.

  „ Harus disediakan ruang dalam bioreaktor untuk penambahan media

  „

Pada saat isi bioreaktor penuh, bioreaktor dikosongkan, baik

sebagian atau seluruhnya dan proses dimulai kembali.

  „ Dapat mengurangi efek represif sumber karbon akibat

penggunaan kons substrat yang tinggi dan mempertahankan

kapasitas aerasi dalam bioreaktor

  „ Dapat mencegah efek toksik komponen media

  Aplikasi Kultur Semi Sinambung (Fed-Batch) „

  Untuk produksi antibiotika penisilin (metabolit sekunder) Î - kultivasi 2 tahap : fase pertumbuhan sel cepat dan fase produksi yang diatur dengan mengatur umpan substrat glukosa

• Na-fenilasetat (prekursor) toksik thd Penicillium chrysogenum

  Î pengumpanan harus diatur „

  Untuk memproduksi enzim yang rentan thd represi katabolit Contohnya : selulase oleh Trichoderma reesei

  Perbandingan Berbagai Metode Kultivasi Kultur Curah Semi Kultur Sinambung Sinambung Aliran masuk F = F = 0 F > 0, F = 0 F = F > 0 in out in out in out (F ) in Aliran keluar (F ) out Volume kultur Konstan Meningkat Konstan Pengendalian Tdk mungkin Mungkin Mungkin kons substrat (menurun) (konstan) (konstan)

Konsentrasi Sel Rendah Kons. tertentu Kons. tertentu

  (<5 g/l) (> 100 g/l) Konsentrasi Meningkat s.d Meningkat s.d Konstan produk tk rendah tk tinggi Kemudahan bagi Mudah Agak mudah Sulit pengguna Bahaya Tidak serius Tidak serius Serius kontaminasi

  „

CONTOH PERHI TUNGAN KI NETI KA

  Kinetika Curah (Batch)

Produksi Etanol oleh bakteri Zymomonas mobilis

  Waktu (jam) Biomassa (g/l)

  Glukosa (g/l) Etanol (g/l) ln biomassa

  5 0,05 247 1,5 -2,99573 9 0,15 240 5 -1,89712 14 0,45 225

  12 -0,79851 18 1,2 195 22 0,182322 22 2,8 130 47 1,029619 24 3,4 100 63 1,223775 26 3,8

  75 74 1,335001 30 4,15 40 90 1,423108 35 4,2 25 100 1,435085

  kurva pertumbuhan

  2

  1 ) /L g ( -1

  5

  9

  14

  18

  22

  24

  26

  30

  35 X

• 2

  ln

• 3
• 4

  Waktu (jam ) Fase eksponensial = 5 – 22 jam

  Penent Laju Pertumb. Spesifik

  2 ) y = 0,2355x - 4,0992

  /l

  1 g ² R = 0,9984

  5

  10

  15

  20

  25 assa ( -1 m

• 2

  io B

• 3

  n L

• 4

  Waktu (jam ) -1 Laju Pertumb. Spesifik maks ( ) = 0,24 Jam μ maks Waktu

(jam) (X-Xo) (So-S) (P-Po)

5 9 0,1

  7 3,5 14 0,4 22 10,5 18 1,15 52 20,5

22 2,75 117 45,5

  

24 3,25 147 61,5

26 3,75 172 72,5

30 4,1 207 88,5

35 4,15 222 98,5

  Yp/s = 0,38 g etanol/g substrat Yp/s y = 0,3827x + 0,8447 R

  2 = 0,9983

  10

  20

  30

  40

  50 50 100 150 (So-S) g/l (P -P o ) g /l

  Yx/s

  4 l

  3 g/ o)

  2 y = 0,0273x + 0,4472

• -X

  2 R = 0,8583

  1 (X

  50 100 150 (So-S) g/l

  Yx/s = 0,03 g etanol/g substrat

  Yp/x

  60 l

  40 y = 12,047x - 2,4313 g/

2 R = 0,8615

  o)

  20

• -P (P

  1

  2

  3

  4

• 20

  (X-Xo) g/l Yp/x = 12,047 g etanol/g biomassa