Elisa
Elisa
Standar preparation
Apa itu elisa?
(ELISA) merupakan suatu teknik biokimia yang terutama digunakan dalam
bidang imunologi untuk m
endeteksi kehadiran antibodi atau antigen dalam suatu sampel. ELISA telah
digunakan sebagai alat diagnostik dalam bidang medis, patologi tumbuhan, dan
juga berbagai bidang industri. Dalam pengertian sederhana, sejumlah antigen
yang tidak dikenal ditempelkan pada suatu permukaan, kemudian antibodi
spesifik dicucikan pada permukaan tersebut, sehingga akan berikatan dengan
antigennya. Antibodi ini terikat dengan suatu enzim, dan pada tahap terakhir,
ditambahkan substansi yang dapat diubah oleh enzim menjadi sinyal yang dapat
dideteksi. Dalam ELISA fluoresensi, saat cahaya dengan panjang gelombang
tertentu disinarkan pada suatu sampel, kompleks antigen/antibodi akan
berfluoresensi sehingga jumlah antigen pada sampel dapat disimpulkan
berdasarkan besarnya fluoresensi.
Test elisa ini memiliki beberapa keunggulan seperti teknik pengerjaan yang relatif sederhana,
ekonomis, dan memiliki sensitivitas yang cukup tinggi.
Test ini juga memiliki beberapa kerugian, salah satu di antaranya adalah kemungkinan besar
terjadinya hasil positif palsu, karena adanya reaksi silang antara antigen yang satu dengan
antigen lain. Dan hasil negatif palsu dapat terjadi apabila uji ini dilakukan pada window
period, yaitu waktu pembentukan antibodi terhadap suatu virus baru dimulai sehingga jumlah
antibodi tersebut masih sedikit dan kemungkinan tidak dapat terdeteksi.
Bahan dan alat yang digunakan dalam Elisa
Alat yang digunakan
Prinsip dari masing-masing pemeriksaan
Direct???
Indirect ELisa
Tahap umum yang digunakan dalam indirect ELISA untuk menentukan konsentrasi
antibodi dalam serum adalah:
1. Suatu antigen yang sudah dikenal dan diketahui konsentrasinya ditempelkan pada
permukaan lubang plate mikrotiter. Antigen tersebut akan menempel pada permukaan
plastik dengan cara adsorpsi. Sampel dari konsentrasi antigen yang diketahui ini akan
menetapkan kurva standar yang digunakan untuk mengkalkulasi konsentrasi antigen
dari suatu sampel yang akan diuji.
2. Suatu larutan pekat dari protein noninteracting, seperti bovine serum albumin (BSA) atau
kasein, ditambahkan dalam semua lubang plate mikrotiter. Tahap ini dikenal
sebagai blocking, karena protein serum memblok adsorpsi non-spesifik dari protein lain
ke plate.
3. Lubang plate mikrotiter atau permukaan lain kemudian dilapisi dengan sampel serum
dari antigen yang tidak diketahui, dilarutkan dalam buffer yang sama dengan yang
digunakan untuk antigen standar. Karena imobilisasi antigen dalam tahap ini terjadi
karena adsorpsi non-spesifik, maka konsentrasi protein total harus sama dengan
antigen standar.
4. Plate dicuci, dan antibodi pendeteksi yang spesifik untuk antigen yang diuji
dimasukkan dalam lubang. Antibodi ini hanya akan mengikat antigen terimobilisasi pada
permukaan lubang, bukan pada protein serum yang lain atau protein yang terbloking.
5. Antibodi sekunder, yang akan mengikat sembarang antibodi pendeteksi, ditambahkan
dalam lubang. Antibodi sekunder ini akan berkonjugasi menjadi enzim d engan substrat
spesifik. Tahap ini bisa dilewati jika antibodi pendeteksi berkonjugasi dengan enzim.
6. Plate dicuci untuk membuang kelebihan konjugat enzim-antibodi yang tidak terikat.
7. Dimasukkan substrat yang akan diubah oleh enzim untuk mendapatkan sinyal
kromogenik/ fluorogenik/ elektrokimia.
8. Hasil dikuantifikasi dengan spektrofotometer, spektrofluorometer ata u alat optik/
elektrokimia lainnya.
Enzim bertindak sebagai amplifier, bahkan jika hanya sedikit antibodi terikat enzim yang
tetap terikat, molekul enzim akan memproduksi berbagai molekul sinyal. Kerugian utama
dari metode indirect ELISA adalah metode imobilisasi antigennya non-spesifik, sehingga
setiap protein pada sampel akan menempel pada lubang plate mikrotiter, sehingga
konsentrasi analit yang kecil dalam sampel harus berkompetisi dengan protein serum
lain saat pengikatan pada permukaan lubang. Mekanisme indirect ELISA dapat dilihat
pada gambar di bawah ini.
Sandwich elisa
Sandwich ELISA (untuk ujian besok pelajari yang ini saja)
Tahapan dalam Sandwich ELISA adalah sebagai berikut:
1.
2.
Disiapkan permukaan untuk mengikatkan antibodi ‘penangkap’
Semua non spesifik binding sites pada permukaan diblokir
3.
Sampel berisi antigen dimasukkan dalam plate
4.
Plate dicuci untuk membuang kelebihan antigen yang tidak terikat
5.
6.
7.
8.
9.
Antibodi primer ditambahkan, supaya berikatan secara spesifik
dengan antigen
Antibodi sekunder yang berikatan dengan enzim dimasukkan, yang
akan berikatan dengan antibodi primer
Plate dicuci, sehingga konjugat antibodi-enzim yang tidak terikat dapat
dibuang
Ditambahkan reagen yang dapat diubah oleh enzim menjadi sinyal
berwarna/ berfluoresensi/ elektrokimia
Diukur absorbansinya untuk menetukan kehadiran dan kuantitas dari
antigen
Keuntungan utama dari metode sandwich ELISA adalah kemampuannya menguji sampel
yang tidak murni, dan mampu mengikat secara selektif antigen yang dikehendaki. Tanpa
lapisan pertama antibodi penangkap, semua jenis protein pada sampel (termasuk
protein serum) dapat diserap secara kompetitif oleh permukaan lempeng, menurunkan
kuantitas antigen yang terimobilisasi. Prinsip kerja sandwich ELISA dapat dilihat pada
skema berikut ini:
Competitive
Elisa kompetitif
Tahapan pengerjaan ELISA kompetitif berbeda dari dua metode yang telah dibahas
1.
2.
3.
4.
5.
sebelumnya, yaitu:
Antibodi yang tidak berlabel diinkubasi dengan kehadiran antigennya
Komplek antigen-antibodi ini selanjutnya ditambahkan pada lubang
yang telah dilapisi antigen
Plate dicuci, sehingga kelebihan antibodi tercuci (semakin banyak
antigen dalam sampel, semakin sedikit antibodi yang dapat terikat pada
antigen yang menempel pada permukaan lubang, karena inilah disebut
kompetisi
Ditambahkan antibodi sekunder yang spesifik utnuk antibodi primer.
Antibodi sekunder ini berpasangan dengan enzim
Substrat ditambahkan, enzim akan mengubah substrat menjadi sinyal
kromogenik/ fluoresensi.
Dalam ELISA kompetitif, semakin tinggi konsentrasi antigen orisinal, semakin lemah
sinyal yang dihasilkan. Prinsip kerjanya dapat dilihat pada gambar berikut ini:
Standar preparation
Apa itu elisa?
(ELISA) merupakan suatu teknik biokimia yang terutama digunakan dalam
bidang imunologi untuk m
endeteksi kehadiran antibodi atau antigen dalam suatu sampel. ELISA telah
digunakan sebagai alat diagnostik dalam bidang medis, patologi tumbuhan, dan
juga berbagai bidang industri. Dalam pengertian sederhana, sejumlah antigen
yang tidak dikenal ditempelkan pada suatu permukaan, kemudian antibodi
spesifik dicucikan pada permukaan tersebut, sehingga akan berikatan dengan
antigennya. Antibodi ini terikat dengan suatu enzim, dan pada tahap terakhir,
ditambahkan substansi yang dapat diubah oleh enzim menjadi sinyal yang dapat
dideteksi. Dalam ELISA fluoresensi, saat cahaya dengan panjang gelombang
tertentu disinarkan pada suatu sampel, kompleks antigen/antibodi akan
berfluoresensi sehingga jumlah antigen pada sampel dapat disimpulkan
berdasarkan besarnya fluoresensi.
Test elisa ini memiliki beberapa keunggulan seperti teknik pengerjaan yang relatif sederhana,
ekonomis, dan memiliki sensitivitas yang cukup tinggi.
Test ini juga memiliki beberapa kerugian, salah satu di antaranya adalah kemungkinan besar
terjadinya hasil positif palsu, karena adanya reaksi silang antara antigen yang satu dengan
antigen lain. Dan hasil negatif palsu dapat terjadi apabila uji ini dilakukan pada window
period, yaitu waktu pembentukan antibodi terhadap suatu virus baru dimulai sehingga jumlah
antibodi tersebut masih sedikit dan kemungkinan tidak dapat terdeteksi.
Bahan dan alat yang digunakan dalam Elisa
Alat yang digunakan
Prinsip dari masing-masing pemeriksaan
Direct???
Indirect ELisa
Tahap umum yang digunakan dalam indirect ELISA untuk menentukan konsentrasi
antibodi dalam serum adalah:
1. Suatu antigen yang sudah dikenal dan diketahui konsentrasinya ditempelkan pada
permukaan lubang plate mikrotiter. Antigen tersebut akan menempel pada permukaan
plastik dengan cara adsorpsi. Sampel dari konsentrasi antigen yang diketahui ini akan
menetapkan kurva standar yang digunakan untuk mengkalkulasi konsentrasi antigen
dari suatu sampel yang akan diuji.
2. Suatu larutan pekat dari protein noninteracting, seperti bovine serum albumin (BSA) atau
kasein, ditambahkan dalam semua lubang plate mikrotiter. Tahap ini dikenal
sebagai blocking, karena protein serum memblok adsorpsi non-spesifik dari protein lain
ke plate.
3. Lubang plate mikrotiter atau permukaan lain kemudian dilapisi dengan sampel serum
dari antigen yang tidak diketahui, dilarutkan dalam buffer yang sama dengan yang
digunakan untuk antigen standar. Karena imobilisasi antigen dalam tahap ini terjadi
karena adsorpsi non-spesifik, maka konsentrasi protein total harus sama dengan
antigen standar.
4. Plate dicuci, dan antibodi pendeteksi yang spesifik untuk antigen yang diuji
dimasukkan dalam lubang. Antibodi ini hanya akan mengikat antigen terimobilisasi pada
permukaan lubang, bukan pada protein serum yang lain atau protein yang terbloking.
5. Antibodi sekunder, yang akan mengikat sembarang antibodi pendeteksi, ditambahkan
dalam lubang. Antibodi sekunder ini akan berkonjugasi menjadi enzim d engan substrat
spesifik. Tahap ini bisa dilewati jika antibodi pendeteksi berkonjugasi dengan enzim.
6. Plate dicuci untuk membuang kelebihan konjugat enzim-antibodi yang tidak terikat.
7. Dimasukkan substrat yang akan diubah oleh enzim untuk mendapatkan sinyal
kromogenik/ fluorogenik/ elektrokimia.
8. Hasil dikuantifikasi dengan spektrofotometer, spektrofluorometer ata u alat optik/
elektrokimia lainnya.
Enzim bertindak sebagai amplifier, bahkan jika hanya sedikit antibodi terikat enzim yang
tetap terikat, molekul enzim akan memproduksi berbagai molekul sinyal. Kerugian utama
dari metode indirect ELISA adalah metode imobilisasi antigennya non-spesifik, sehingga
setiap protein pada sampel akan menempel pada lubang plate mikrotiter, sehingga
konsentrasi analit yang kecil dalam sampel harus berkompetisi dengan protein serum
lain saat pengikatan pada permukaan lubang. Mekanisme indirect ELISA dapat dilihat
pada gambar di bawah ini.
Sandwich elisa
Sandwich ELISA (untuk ujian besok pelajari yang ini saja)
Tahapan dalam Sandwich ELISA adalah sebagai berikut:
1.
2.
Disiapkan permukaan untuk mengikatkan antibodi ‘penangkap’
Semua non spesifik binding sites pada permukaan diblokir
3.
Sampel berisi antigen dimasukkan dalam plate
4.
Plate dicuci untuk membuang kelebihan antigen yang tidak terikat
5.
6.
7.
8.
9.
Antibodi primer ditambahkan, supaya berikatan secara spesifik
dengan antigen
Antibodi sekunder yang berikatan dengan enzim dimasukkan, yang
akan berikatan dengan antibodi primer
Plate dicuci, sehingga konjugat antibodi-enzim yang tidak terikat dapat
dibuang
Ditambahkan reagen yang dapat diubah oleh enzim menjadi sinyal
berwarna/ berfluoresensi/ elektrokimia
Diukur absorbansinya untuk menetukan kehadiran dan kuantitas dari
antigen
Keuntungan utama dari metode sandwich ELISA adalah kemampuannya menguji sampel
yang tidak murni, dan mampu mengikat secara selektif antigen yang dikehendaki. Tanpa
lapisan pertama antibodi penangkap, semua jenis protein pada sampel (termasuk
protein serum) dapat diserap secara kompetitif oleh permukaan lempeng, menurunkan
kuantitas antigen yang terimobilisasi. Prinsip kerja sandwich ELISA dapat dilihat pada
skema berikut ini:
Competitive
Elisa kompetitif
Tahapan pengerjaan ELISA kompetitif berbeda dari dua metode yang telah dibahas
1.
2.
3.
4.
5.
sebelumnya, yaitu:
Antibodi yang tidak berlabel diinkubasi dengan kehadiran antigennya
Komplek antigen-antibodi ini selanjutnya ditambahkan pada lubang
yang telah dilapisi antigen
Plate dicuci, sehingga kelebihan antibodi tercuci (semakin banyak
antigen dalam sampel, semakin sedikit antibodi yang dapat terikat pada
antigen yang menempel pada permukaan lubang, karena inilah disebut
kompetisi
Ditambahkan antibodi sekunder yang spesifik utnuk antibodi primer.
Antibodi sekunder ini berpasangan dengan enzim
Substrat ditambahkan, enzim akan mengubah substrat menjadi sinyal
kromogenik/ fluoresensi.
Dalam ELISA kompetitif, semakin tinggi konsentrasi antigen orisinal, semakin lemah
sinyal yang dihasilkan. Prinsip kerjanya dapat dilihat pada gambar berikut ini: